ברצוננו להודות Amsale זוזו על סיועה הצילומים של מאמר זה וידאו. עבודה זו מומנה על ידי CIHR, NSERC ומענקים CRC כדי JDL.

חלק 1. הכנת פילה של הבטן תסיסנית מבוגר. ההליך המתואר להלן מיידית מכין את הבטן להסרת הבאות של oenocytes (ראה Part2 של פרוטוקול). ההליך אותו יכול לשמש גם להכנת ברקמות אחרות המצורפת המשטח הפנימי של לציפורן, כולל כלי הגבי (כלומר לב) ואת השומן בגוף. שים לב כי במאמר וידאו הטכניקה לנתיחה oenocyte מודגם על לטוס מבוגר (קנטון-S) wild-type זכר, שישה ימים של גיל. טכניקות זהים ניתן להשתמש כדי להסיר את oenocytes מפני זבובים ממין נקבה. הכנת פילה הבטן לוקח כ 5 דקות לבצע. לפני תחילת חשוב להיות מוכן כמה סיכות לנתיחה קנס (ראה להלן חלק 2) ו מחט דיסקציה (ראו חלק 2). סיכות לנתיחה זמין מסחרית ומחטים לעיתים גדול מדי עבור פרוטוקול זה, אז נקטנו כדי בודה שלנו במעבדה. כדי ליצור את המחט לנתיחה, תיל טונגסטן (0.005 &quot;) הוא מושחל הראשונה דרך הפיר של מחט המזרק (27G, אלומיניום רכזת). תיל נושא באמצעות קצה המחט של המזרק, כך עולה מן הרכזת. מסלסלים את חוט בולטות מהרכזת;. זה מונע את החוט מלהיות שלף את המחט של המזרק הבא, לחתוך את החוט בקצה השני של כאלה crimp כי כמה מילימטרים (~ 3-4 מ&quot;מ) של תיל בולטים קצה המחט של המזרק עובר. קצה טונגסטן נחשפים דרך להבה יהיה לחדד את החוט עד לנקודה טובה מאוד. פלסטיק חד פעמיות 5 מ&quot;ל פיפטה כאשר תקוע לרכזת המחט של המזרק משמש ידית נוחה כלי זה לנתיחה. סיכות לנתיחה בסדר מתקבלות דומה הדרך. לאחר השלב השחזה, לתפוס את קצה קצהו של חוט חזק עם מלקחיים כדי למנוע ממנה לזוז ולעשות חתך כ 3mm מהקצה לשחרר את הנצרה לנתיחה קטן. השתמש טיפול כדי למנוע סיכה מלהיות השליך מידיו של מלקחיים. פילה כדי להכין את הבטן מבוגר תסיסנית: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אבטח את לטוס הצלחת דיסקציה (Sylgard; Dow-Corning) על ידי הצבת סיכה לנתיחה בסדר למרות החזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את רגליים וכנפיים של זבוב. בעוד הסרת להגדיר האחורי ביותר של הרגליים, ליצור פתח לציפורן בנקודה קדמית רק למקום החזה פוגש את הבטן. פתח זה משמש מאוחר יותר נקודת גישה עבור ביצוע חתך על פני השטח הגחוני של הבטן (ראה שלב 5) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אבטח את הבטן של הזבוב במקום על ידי הצבת סיכה לנתיחה השנייה ועד במגזר באברי המין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את לעוף עם שילדס צונן סאנג M3 חרקים בינוני (Sigma). הסר את כל האוויר שנלכד על ידי ציור אותו עם פיפטה פסטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלקחיים שימוש לפתוח את הבטן על ידי ביצוע חתך לאורך קו האמצע הגחון מפתיחת ב לציפורן נוצר על ידי הסרת הרגליים למגזר באברי המין. הסר את האומץ ואת בלוטות המין מן הבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סבר העור המת tracheae המחבר את הבטן אל החזה. הרקמה היחידה שנותרה המחבר את הבטן אל החזה צריך להיות הלב. זה מספק את לציפורן בטן עם יציבות מסוימת, ומונעת ממנו סיבוב או פיתול במהלך לשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פין שטוח הקדמי פינות ביותר לציפורן הבטן. הסר את בית החזה. משיכת לציפורן מתוח, פין שטוח בפינות האחורי של לציפורן. סיכה במגזר המין ייתכן שיהיה צורך מיקומו לעשות לציפורן שכב. </li></ol> חלק 2. Oenocyte לנתיחה הכנת פילה הבטן חושף את פני השטח הפנימי של לציפורן הבטן וברקמות המצורף כולל הלב, שומן הגוף, tracheae, קיר שרירי הגוף, האפידרמיס, ואת oenocytes. הלב נמצא לאורך קו האמצע הגבי. גוף שומן (רקמת אטום) מכסה את רוב השטח cuticular פנימי. Tracheae (מבנים צינורי לבן) להאריך מן הפתחים spiracle לרוחב, ולעשות סניפים נרחבת אשר לחדור רקמות אלה. שוכבת מתחת רקמות אלו, oenocytes פיגמנטציה (בצבע ענבר תאים) מקרינים מן קו האמצע לקצה הלטרלי של לציפורן באזור האחורי של כל פלח. Oenocytes השקר ישירות מתחת האזורים שזוף של כל tergite (צלחות cuticular הגבי) והוא יכול להיות קשה לזהות ללא ידיעה מוקדמת של מיקומם. אוכלוסייה נוספת של oenocytes ממוקם ventrally המשויך sternites (צלחות cuticular הגחון); למרות שזה אפשרי לבודד תאים אלה, זה פרוטוקול וידאו רק להדגים את דיסקציה של oenocytes הגבי. בכל מגזר בטן, עלה הבולטים של רקמת השומן בגוף השקרים הקדמי של oenocytes; עלה פחות ברורים יותר של שומן גוף השקרים האחורי של oenocytes. העלה הבולטים של רקמת השומן בגוף לעיתים קרובות מכסה את oenocyteים של המגזר שקדמו לו. הספינה הגב ואת השומן בגוף יש להסיר תחילה כדי לחשוף את oenocytes. חשוב לציין כי הפיגמנטציה של ענבר oenocytes, שממנו נגזר שמם (oeno - מ oînos היווני, &quot;יין&quot;) 1, מבדיל בבירור בין תאים אלה הרקמות הסובבות, את עוצמת פיגמנטציה עולה עם הגיל של הזבוב. יתר על כן, basal lamina ensheathes oenocytes 2,3, מתן תמיכה צבירי תאים ומונעים את התאים מלהפוך ניתק במהלך הניתוח. Basal lamina גם מסייע להסרת רקמות דבק בקור, כגון רקמת השומן בגוף, על ידי יצירת נקודת התורפה שבו אלה הידבקויות יכולה להיות מופרת בקלות. ההליך המפורטים להלן מספק הוראות מפורטות להסרת oenocytes מן integument הבטן. Oenocytes ניתן להסיר בקלות מכל המגזרים בטן 2-5 (זכר) ו 2-6 (נקבה). Oenocytes מן המגזרים הבטן הראשונה והאחרונה (קטעים 1, 6 או 7 אצל זכרים אצל נקבות) הם שיבשו לעתים קרובות על ידי סיכות לנתיחה מחזיק בפינות לציפורן, ולכן נמנעים. הסרת oenocytes לוקח כ -10 דקות לביצוע. כדי לבודד את oenocytes מבוגר: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סבר הגזעים קנה הנשימה הנובעות spiracles באמצעות מחט לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הגוף הלב שומן על ידי ניתוק הקשרים על פני השטח הפנימי של לציפורן עם מחט לנתיחה. לשם כך, מקם את חוד המחט לנתיחה בין שומן הגוף ואת oenocytes, ולגרור אותו מהקצה לרוחב של לציפורן, דרך קו האמצע, נע מתחת הלב, ממשיך בצד הנגדי. מתקדמת מ האחורי אל הקדמי, להסיר את רקמת השומן בגוף ואת הלב מן לציפורן של כל פלח רצופים. אם מבוצע בקפידה oenocytes נשארים מחוברים לציפורן, והגוף לב שומן ניתן להסיר את כולו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קיר גוף רצועת השרירים oenocytes אל פני השטח הפנימי של לציפורן. באמצעות מחט לנתיחה לנתק קיר האורך שרירי הגוף של כל פלח. כדי לעשות זאת, גרור את המחט לנתיחה בצד האחורי של גדיל oenocyte, מרימים בעדינות אותם מפני השטח של לציפורן. סרט דמוי חוטים oenocyte צריך לבוא ממנו לציפורן, ניתן להניח בצד בעוד oenocytes שנותרו יוסרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסר לאחר מן לציפורן, שוכב על הצלחת לנתיחה ייתכן שיהיה צורך לנקות את כל דבק רקמות השומן בגוף מ oenocytes. זה נעשה פשוט על ידי הצבת מחט לנתיחה בין רקמת השומן בגוף ואת oenocytes, וניתוק הקשר על ידי דוחפים את המחט למטה על הצלחת הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את גדילי oenocyte פשוט על ידי תוקעת אותם בסופו של המחט לנתיחה. תקוע לאחר לסוף המחט לנתיחה oenocytes יכול להיות משך לאט על פני השטח של המדיום לתרבות. Oenocytes גזור יכול להיות ממוקם ישירות לתוך חוצץ התא תמוגה מתאים או RNA או מיצוי חלבון. שים לב oenocytes (קטעים בטן 2-5) מ זבוב זכר יחיד בדרך כלל מניבה 15-20ng של רנ&quot;א מוחלט. </li></ol> איור מקרא: <img src="/files/ftp_upload/2242/2242fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. הביטוי של הגנים desaturase, desat1 ו desatF, ב oenocytes זכר ונקבה של ד melanogaster. הגברה הפוך שעתוק-PCR של desat1 ו desatF מ cDNA נגזר oenocytes זכר ונקבה בוגרים. הגן desat1 מתבטא הן oenocytes זכר ונקבה; ביטוי desatF הוא דימורפית מינית, בא לידי ביטוי באופן בלעדי oenocytes הנשי. מקבילים להבדלים ביטוי גנים, desat1 נדרש לייצור תרכובות פחמימנים המשותפים לשני זכרים ונקבות 9, desatF עוסקת בייצור של נשים ספציפיות תרכובות פחמימנים 10,11. DesatF הוכח לידי ביטוי במיוחד ב oenocytes הנשי על ידי ב 12 הכלאה באתרה. שים לב כי בממוצע 15-20ng של רנ&quot;א הכל מתקבל oenocytes גזור מן לטוס אדם. RNA היה מבודד באמצעות RNeasy ערכת מיקרו (Qiagen); cDNA הופק באמצעות cDND qScript סינתזה הערכה (Quanta BioSciences)

<ol>
	<li>Wielowiejski, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ueber+das+blutgewebe+der+insekten.">Ueber das blutgewebe der insekten.</a> Zeit. Wiss. Zool. 43, 512-536 .</li><li>Krupp, J. J., Kent, C., Billeter, J. C., Azanchi, R., So, A. K., Schonfeld, J. A., Smith, B. P., Lucas, C., Levine, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Social+experience+modifies+pheromone+expression+and+mating+behavior+in+male+Drosophila+melanogaster.">Social experience modifies pheromone expression and mating behavior in male Drosophila melanogaster.</a> Curr. Biol. 18, 1373-1383 (2008).</li><li>Locke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+membranes,+Golgi+complexes,+and+vacuolar+systems.">Surface membranes, Golgi complexes, and vacuolar systems.</a> Annu. Rev. Entomol. 48, 1-27 (2003).</li><li>Billeter, J. C., Atallah, J., Krupp, J. J., Millar, J. G., Levine, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+cells+tag+sexual+and+species+identity+in+Drosophila+melanogaster.">Specialized cells tag sexual and species identity in Drosophila melanogaster.</a> Nature. 461, 987-991 (2009).</li><li>Gould, A. P., Elstob, P. R., Brodu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+oenocytes:+a+model+system+for+studying+cell-fate+specification+by+Hox+genes.">Insect oenocytes: a model system for studying cell-fate specification by Hox genes.</a> J. Anat. 199, 25-33 (2001).</li><li>Lawrence, P. A., Johnston, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lineage+of+the+Drosophila+abdomen:+the+epidermis,+oenocytes+and+ventral+muscles.">Cell lineage of the Drosophila abdomen: the epidermis, oenocytes and ventral muscles.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 72, 197-208 (1982).</li><li>Johnson, M. B., Butterworth, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+and+aging+of+adult+fat+body+and+oenocytes+in+Drosophila+as+revealed+by+light+microscopic+morphometry.">Maturation and aging of adult fat body and oenocytes in Drosophila as revealed by light microscopic morphometry.</a> J. Morphol. 184, 51-59 (1985).</li><li>Gutierrez, E., Wiggins, D., Fielding, B., Gould, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+hepatocyte-like+cells+regulate+Drosophila+lipid+metabolism.">Specialized hepatocyte-like cells regulate Drosophila lipid metabolism.</a> Nature. 445, 275-280 (2007).</li><li>Marcillac, F., Bousquet, F., Alabouvette, J., Savarit, F., Ferveur, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mutation+with+major+effects+on+Drosophila+melanogaster+sex+pheromones.">A mutation with major effects on Drosophila melanogaster sex pheromones.</a> Genetics. 171, 1617-1628 (2005).</li><li>Chertemps, T., Duportets, L., Labeur, C., Ueyama, M., Wicker-Thomas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+female-specific+desaturase+gene+responsible+for+diene+hydrocarbon+biosynthesis+and+courtship+behaviour+in+Drosophila+melanogaster.">A female-specific desaturase gene responsible for diene hydrocarbon biosynthesis and courtship behaviour in Drosophila melanogaster.</a> Insect Mol. Biol. 15, 465-473 (2006).</li><li>Legendre, A., Miao, X. X., Da Lage, J. L., Wicker-Thomas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+a+desaturase+involved+in+female+pheromonal+cuticular+hydrocarbon+biosynthesis+and+courtship+behavior+in+Drosophila.">Evolution of a desaturase involved in female pheromonal cuticular hydrocarbon biosynthesis and courtship behavior in Drosophila.</a> Insect. Biochem. Mol. Biol. 38, 244-255 (2008).</li><li>Shirangi, T. R., Dufour, H. D., Williams, T. M., Carroll, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+evolution+of+sex+pheromone-producing+enzyme+expression+in+Drosophila.">Rapid evolution of sex pheromone-producing enzyme expression in Drosophila.</a> PLoS Biol. 7, e1000168-e1000168 (2009).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

במאמר זה אנו מציגים וידאו פרוטוקול לנתיחה מפורט להכנת oenocytes מן הבוגרים ד melanogaster באופן מתאים לניתוח מולקולרית. מבוססי טקסט חשבון מקוצר של השיטה לנתיחה תוארה במקומות אחרים 2, והכנת oenocyte וכתוצאה מכך הודגמה להיות מתאים החילוץ של שניהם RNA וחלבון 2. באמצעות ...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Sylgard</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tungsten Wire</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ted Pella, Inc.</td>
<td>27-11</td>
<td>0.005&#x201D;/20&#x2019;</td>
</tr>
<tr>
<td>Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dumont</td>
<td>11252-30</td>
<td>#5</td>
</tr>
<tr>
<td>Shields and Sang M3 Insect Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S3652</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNeasy Micro Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>74004</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>qScript cDNA Synthesis Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Quanta Biosciences</td>
<td>95047-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Monoject Hypodermic Needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>722289</td>
<td>20G1 with aluminum hub</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

dissection of oenocytes from adult drosophila melanogaster

בתוך<em&gt; תסיסנית melanogaster</em&gt;, כמו חרקים אחרים, שכבת שעווה על המשטח החיצוני של לציפורן, המורכב בעיקר תרכובות פחמימנים, מספק הגנה מפני יובש אתגרים סביבתיים אחרים. כמה תרכובות פחמימנים אלה cuticular (CHC) מתפקדים גם אותות semiochemical, וככזה לתווך תקשורת המושכת בין בני אותו מין, או במקרים מסוימים בין מינים שונים, להשפיע על התנהגות. תאים מיוחדים המכונים oenocytes נחשבים האתר הראשי לסינתזה CHC. עם זאת, יחסית מעט מאוד ידוע על מעורבות של oenocytes בוויסות של biosynthetic, תחבורה מסלולים בתצהיר לתרום פלט CHC. בהתחשב תפקיד משמעותי כי CHCs לשחק במספר היבטים של הביולוגיה חרקים, כולל תקשורת כימית, עמידות התייבשות, חסינות, חשוב להשיג הבנה טובה יותר של התקנה מולקולרית הגנטי של ייצור CHC בתוך תאים מיוחדים אלה. Oenocytes הבוגרת<em&gt; ד melanogaster</em&gt; נמצאים בתוך integument הבטן, והם ערוכים metamerically בסרט כמו אשכולות מקרין על פני השטח cuticular הפנימי של כל פלח הבטן. במאמר זה אנו וידאו להפגין טכניקה לנתיחה להשתמש להכנת oenocytes מן הבוגרים<em&gt; ד melanogaster</em&gt;. במיוחד, אנו מספקים הפגנה מפורט צעד אחר צעד (1) איך להכין פילה מבוגר<em&gt; תסיסנית</em&gt; הבטן, (2) כיצד לזהות את oenocytes ו להבחין בינם לבין רקמות אחרות, ו (3) כיצד להסיר oenocyte אשכולות שלמים מן integument הבטן. האיור ניסיוני קצר של איך זה הכנה ניתן להשתמש כדי לבחון את הביטוי של גנים המעורבים סינתזה פחמימנים כלול. הכנת גזור הפגינו בזאת תאפשר ניתוח מולקולרי גנטי מפורט של הפונקציה oenocyte של זבוב הפירות הבוגרים.

Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster at JoVE.com

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

בשנת חרקים, oenocytes לייצר תרכובות פחמימנים cuticular. תרכובות אלו להגן מפני התייבשות ולאפשר תקשורת כימית. כאן אנו להפגין טכניקה לנתיחה להשתמש כדי לבודד את oenocytes מן הבוגרים<em&gt; תסיסנית melanogaster</em&gt;, וכן להדגים כיצד זה הכנה יכול להיות מנוצל ללימוד גנים המעורבים בסינתזה פחמימנים.

Dissection של Oenocytes מן למבוגרים תסיסנית melanogaster</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

dissection-of-oenocytes-from-adult-drosophila-melanogaster

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

20.3K Views.  University of Toronto. בשנת חרקים, oenocytes לייצר תרכובות פחמימנים cuticular. תרכובות אלו להגן מפני התייבשות ולאפשר תקשורת כימית. כאן אנו להפגין טכניקה לנתיחה להשתמש כדי לבודד את oenocytes מן הבוגרים תסיסנית melanogaster, וכן להדגים כיצד זה הכנה יכול להיות מנוצל ללימוד גנים המעורבים בסינתזה פח?...

Video: Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Dissection של מערכת העצבים המרכזית הזחל ב תסיסנית melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Dissection of Imaginal Discs from 3rd Instar Drosophila Larvae

This protocol demonstrates the dissection technique used for isolating imaginal discs from drosophila larvae at the 3rd instar stage. Methods for fixing the tissue after saying and removing the wing, leg, and eye discs are demonstrated directly on a microscope slide for subsequent visualization.

Dissection של דיסקים דמותי מן הזחלים 3 תסיסנית Instar

Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila

In this video, we demonstrate the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons. We begin by describing the dissecting solution and capture of the adult females used in our studies. The procedure for removing the whole brain intact, including both optic lobes, is illustrated. Dissection of the overlying trachea is also shown.  The isolated brain is not only small but needs special care in handling at this stage to prevent damage to the neurons, many of which are close to the outer surface of the tissue. We show how a special holder we developed is used to stabilize the brain in the recording chamber. A standard electrophysiology set up is used for recording from single neurons or pairs of neurons. A fluorescent image, viewed through the recording microscope, from a GAL4 line driving GFP expression (GH146) illustrates how projection neurons (PNs) are identified in the live brain. A high power Nomarski image shows a view of a single neuron that is being targeted for whole cell recording. When the brain is successfully removed without damage, the majority of the neurons are spontaneously active, firing action potentials and/or exhibiting spontaneous synaptic input. This in situ preparation, in which whole cell recording of identified neurons in the whole brain can be combined with genetic and pharmacological manipulations, is a useful model for exploring cellular physiology and plasticity in the adult CNS.

This video demonstrates the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons using standard whole cell technology. It includes images of GFP labeled cells and neurons viewed during recording.

תא הקלטות שלמות של המוח של מבוגרים תסיסנית

In this video, we demonstrate the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons. We begin by ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

וידאו ברזולוציה גבוהה של מעקב אחר תנועה של מבוגרים תסיסנית melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its remarkable neuronal cell plasticity, and its involvement in epilepsy, neurodegenerative diseases, and psychiatric disorders. The hippocampus is composed of distinct regions; the dentate gyrus, which comprises mainly granule neurons, and Ammon's horn, which comprises mainly pyramidal neurons, and the two regions are connected by both anatomic and functional circuits. Many different mRNAs and proteins are selectively expressed in the dentate gyrus, and the dentate gyrus is a site of adult neurogenesis; that is, new neurons are continually generated in the adult dentate gyrus. To investigate mRNA and protein expression specific to the dentate gyrus, laser capture microdissection is often used. This method has some limitations, however, such as the need for special apparatuses and complicated handling procedures. In this video-recorded protocol, we demonstrate a dissection technique for removing the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope. Dentate gyrus samples prepared using this technique are suitable for any assay, including transcriptomic, proteomic, and cell biology analyses. We confirmed that the dissected tissue is dentate gyrus by conducting real-time PCR of dentate gyrus-specific genes, tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO2) and desmoplakin (Dsp), and Ammon's horn enriched genes, Meis-related gene 1b (Mrg1b) and TYRO3 protein tyrosine kinase 3 (Tyro3). The mRNA expressions of TDO2 and Dsp in the dentate gyrus samples were detected at obviously higher levels, whereas Mrg1b and Tyro3 were lower levels, than those in the Ammon's horn samples. To demonstrate the advantage of this method, we performed DNA microarray analysis using samples of whole hippocampus and dentate gyrus. The mRNA expression of TDO2 and Dsp, which are expressed selectively in the dentate gyrus, in the whole hippocampus of alpha-CaMKII+/- mice, exhibited 0.037 and 0.10-fold changes compared to that of wild-type mice, respectively. In the isolated dentate gyrus, however, these expressions exhibited 0.011 and 0.021-fold changes compared to that of wild-type mice, demonstrating that gene expression changes in dentate gyrus can be detected with greater sensitivity. Taken together, this convenient and accurate dissection technique can be reliably used for studies focused on the dentate gyrus.

A dissection technique for removal of the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope was demonstrated in this video-recorded protocol.

Dissection של gyrus משוננת בהיפוקמפוס מתוך עכבר למבוגרים

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

Dissection של איברים מן דג הזברה למבוגרים

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

בידוד תסיסנית melanogaster האשכים

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function to maintain glucose homeostasis during developmental larval stages 1,2. Studies on largely post-mitotic adult flies have revealed perturbation of glucose homeostasis as the result of genetic ablation of insulin-like peptide (ILP) producing cells (IPCs) 3. Thus, adult fruit flies hold great promise as a suitable genetic model system for metabolic disorders including type II diabetes. To further develop the fruit fly system, comparable physiological assays used to measure glucose tolerance and insulin sensitivity in mammals must be established. To this end, we have recently described a novel procedure for measuring oral glucose tolerance response in the adult fly and demonstrated the importance of adult IPCs in maintaining glucose homeostasis 4,5. Here, we have modified a previously described procedure for insulin injection 6 and combined it with a novel hemolymph extraction method to measure peripheral insulin sensitivity in the adult fly. Uniquely, our protocol allows direct physiological measurements of the adult fly's ability to dispose of a peripheral glucose load upon insulin injection, a methodology that makes it feasible to characterize insulin signaling mutants and potential interventions affecting glucose tolerance and insulin sensitivity in the adult fly.

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Conserved insulin signaling pathways found in the fruit fly Drosophila melanogaster make this organism a potential tool for modeling metabolic disorders including type II diabetes. To this end, it is critical to establish physiological assays to effectively measure systemic insulin action in peripheral glucose disposal in the adult fly.

הזרקת אינסולין ו Extraction Hemolymph כדי למדוד את הרגישות לאינסולין אצל מבוגרים תסיסנית melanogaster</em

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

מדידה של תוחלת חיים ב<em&gt; דרוזופילה melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called imaginal discs. These discs give rise to a high percentage of adult structures that are found within the adult fly. Here we describe a protocol that has been optimized to recover these discs and prepare them for analysis with antibodies, transcriptional reporters and protein traps. This procedure is best suited for thin tissues like imaginal discs, but can be easily modified for use with thicker tissues such as the larval brain and adult ovary. The written protocol and accompanying video will guide the reader/viewer through the dissection of third instar larvae, fixation of tissue, and treatment of imaginal discs with antibodies. The protocol can be used to dissect imaginal discs from younger first and second instar larvae as well. The advantage of this protocol is that it is relatively short and it has been optimized for the high quality preservation of the dissected tissue. Another advantage is that the fixation procedure that is employed works well with the overwhelming number of antibodies that recognize Drosophila proteins. In our experience, there is a very small number of sensitive antibodies that do not work well with this procedure. In these situations, the remedy appears to be to use an alternate fixation cocktail while continuing to follow the guidelines that we have set forth for the dissection steps and antibody incubations.

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

נתיחה וImmunostaining של דמותי דיסקים מ<em&gt; Melanogaster דרוזופילה</em

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...