Name: measurement of carbon dioxide production from radiolabeled substrates in drosophila melanogaster
Uploaded: 2016-06-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster at JoVE.com

The author thanks Drs. Mingjian Lu and Morris Birnbaum for helpful advice and funding support from NIDDK (R21DK089391).

1. إعداد يطير الأغذية التي تحتوي على رديولبلد الاستقلابية ركائز <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في أنبوب microfuge، مزيج 1-2 μCi الركيزة رديولبلد (د [6- 14 C] -glucose، د [1- 14 C] -glucose أو [1- 14 C] حامض -palmitic، 40 - 60 MCI / ملمول) مع 15 ميكرولتر FD &amp; C رقم 1 أزرق صبغة الطعام وH 2 O ليعادل إجمالي حجم 25 ميكرولتر. تنبيه: الكربون 14 هو بيتا باعث للطاقة المنخفضة ويبلغ مداه قصير في الهواء. ومع ذلك، ورعاية لمنع تسرب جزيئات أو رديولبلد ابتلاع عرضي من قبل المجرب. يطير قارورة الغذاء أكثر من طرف بسهولة. مما لا شك فيه لإيوائهم في وعاء من شأنها منعهم من التحول، وخصوصا عندما radiolabel في شكل سائل (الخطوة 1.2) أو في الغذاء unsolidified (الخطوة 1.4). الذباب التي يتم تغذيتها أو تم تغذيتها ركائز رديولبلد سوف تبدأ في الزفير كميات صغيرة من ثاني أكسيد الكربون رديولبلد 2. يجب أن تبقى هذه الذباب في صناديق الاكريليك في كمة الدخان، وصحن صغير من كوه كاليفورنيان يتم تعيين في مربع لاستخدامها بوصفها الغسيل CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الماصة كل من الركيزة رديولبلد ومزيج صبغة زرقاء في الجزء السفلي من ذبابة القارورة الغذاء فارغة (الطول: 9.4 سم، العرض: 2.2 سم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معيار الحرارة يطير الطعام في المايكرويف حتى يتم المسال الطعام فقط (15-20 ثانية في مستوى طاقة عالية لقنينة واحدة تحتوي على 10 مل من المواد الغذائية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة المواد الغذائية 975 ميكرولتر المنصهر إلى / مزيج صبغة زرقاء رديولبلد الركيزة وبسرعة دوامة والرصد توحيد اللون الأزرق لضمان خلط كاملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح الطعام لتبرد وتتصلب تماما على RT لمدة 20 - 30 دقيقة. </li></ol> 2. تغذية ركائز رديولبلد الأيضية لالذباب الكبار الفاكهة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الكبار الذباب باستخدام أجهزة التخدير CO 2 مكون من البولي ايثلين التي يسهل اختراقها تنصهر إلى قاعدة الاكريليك وتوصيلها إلى خزان CO 2 مع منظم ضغط. تدفق CO 2 في جهاز التخدير في 5 لتر / دقيقة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل تخديرد الذباب إلى قارورة تحتوي رديولبلد والغذاء مصبوغة الزرقاء (ن = 15-30 الذباب في القارورة). قارورة كاب مع سدادة رغوة، وراحة أفقيا حتى يستيقظ الذباب فوق. قارورة نقل إلى حاوية الاكريليك بغطاء (180 سم × 180 سم × 240 سم ارتفاع). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بالنسبة للتغذية على المدى القصير، تجويع الذباب لمدة 18 - 24 ساعة قبل نقل الذباب إلى الطعام رديولبلد ل2 - خطوة التغذية 3 ساعات تي انه الجوع خطوة مهمة لأن الذباب تغذية لا يأكل موثوق مصدرا جديدا من المواد الغذائية المقدمة لهم . بالنسبة للتغذية على المدى الطويل على مدى 5-7 أيام، الذباب لا يلزم أن يكون جوعا، ولكن المجرب أن ترصد محتوى الماء من الطعام رديولبلد في قارورة ويعيش الذباب في واستخدام الإبر والمحاقن إلى إضافة الماء إلى قارورة مع الأغذية الجافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الذباب في الغذاء الخالي من الملصقات التي كتبها &quot;التنصت&quot; لهم في قارورة جديدة. فترة مطاردة الأولية من 2-4 ساعة يسمح الذباب لتنظيف جزيئات الطعام رديولبلد من البشرة ويسمح هضم radiolabelإد الأغذية المتبقية في الأمعاء. رصد التقدم المحرز الطعام من خلال الأمعاء عن طريق التفتيش البصري من الذباب للبحث عن بطون الزرقاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وفي وقت لاحق، ونقل الذباب لأنواع الغذاء المختلفة (12-24 ساعة على الغذاء القياسية أو 1٪ أجار لقياس آثار تغذية مقابل دولة صام على التنفس) أو درجات الحرارة المحيطة (12-96 ساعة عند 18 مئوية أو 30 مئوية لمدة الوراثية التلاعب باستخدام GAL80 حساسة للحرارة (GAL80 نهاية الخبر)، على سبيل المثال). ملاحظة: سيكون طول هذه الفترة مطاردة تختلف مع التجربة التي يتم تنفيذها. لمثل مطاردة 96 ساعة على 30 درجة مئوية قد يكون ضروريا في التجارب باستخدام GAL80 نهاية الخبر من أجل تفعيل تماما التعبير التحوير GAL4 التي تعتمد على. </li></ol> 3. إعداد جهاز CO 2 -Collection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع المواد اللازمة لبناء &quot;يطير القرون&quot;، وأنابيب المغطاة شبكة التي سوف تحتوي على الذباب وصفت مع 14 C-الجلوكوز أو 14 حمض البالمتيك وC-ثار ستبقى مفتوحة إلى الغلاف الجوي. قطع رأس 50 ملم 12 ملم × 75 ملم أنابيب البولي بروبلين، وترك 25، أنابيب القاع ذهابا واستمرت ملم. إعداد 35 ملم × 35 ملم الساحات من 130 ميكرون شبكة من النايلون. أيضا، الحصول على الشريط الشفاف في موزع الشريط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع المواد لأجهزة -collection CO 2. لكل يطير جراب، تجميع 20 مل الزجاج التلألؤ القارورة، وهو أعلى المطاط سدادة مع ثقب خارج المركز، مركزا جيدا لإدراجها من خلال ثقب في السدادة العليا، الصف GF / B ستوكات الزجاج ورقة فلتر (2.1 سم قطر دائرة، 1 ميكرون المسام). يستخدم GF ورق الترشيح / B بسبب قوة الرطب عالية وقدرة التحميل العالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 5٪ KOH جديدة في يوم من الاستخدام. قبل الخطوة 3.4، أضعاف، ووضع GF / B مرشح ورقة دائرية في وسط جيدا أن ومترابطة من خلال ثقب في أعلى المطاط سدادة وتشبع مع 100 ميكرولتر من 5٪ KOH. انظر الشكل 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وبعد الحضانة (ق) على وسائل الإعلام الخالي من الملصقات، وnesthetize الذباب مع CO 2. فرشاة يطير في أنبوب قطع البولي بروبلين، وكأب مع شبكة من النايلون، واستخدام الشريط الشفاف التمسك شبكة لأنبوب. العمل بسرعة لتجنب الذباب الاستيقاظ والهروب قبل شبكة تم اضافته آمن للأنبوب. عدد متساو من الذباب ينبغي أن تستخدم في كل جراب الطيران لإجراء تجربة معينة؛ 10-20 الذباب في جراب ذبابة تنتج ما يكفي من رديولبلد-CO 2 لقياس بواسطة عد التلألؤ (الخطوة 4.1 أدناه). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل جراب يطير إلى 20 مل الزجاج التلألؤ القارورة. تتويج قنينة زجاجية مع المطاط أعلى سدادة يمسك مركز تحتوي أيضا المشبعة KOH ورقة الترشيح GF / B. أضعاف أعلى واسعة من المطاط أعلى سدادة فوق الشفاه من قارورة زجاجية التلألؤ. انظر الشكل 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قوارير الزجاج مجموعة تحتوي على الذباب في بغطاء، والحاويات الاكريليك، واحتضان لفترات متفاوتة من الزمن (2-12 ساعة يعمل بشكل جيد). </li></ol> 4. تحليل النتائج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فينهاية الحضانة، وقوارير زجاجية إرفع قبعة، ونقل المشبعة كوه ورق الترشيح GF / B إلى 6 مل البلاستيك التلألؤ قارورة تحتوي على 4 مل التلألؤ كوكتيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا لزم الأمر، وتجميد الذباب في القرون ذبابة على الثلج الجاف ومخزن في -80 مئوية لتقرير لاحق من ركائز المخزنة. لاحظ أن هذه العينات المشعة ويجب أن يتم تخزينها وفقا لذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد قارورة التلألؤ إضافية: واحدة تحتوي على غير المستخدمة GF / B رقة الترشيح لتكون بمثابة الخلفية و01:59 الآخرين تحتوي على 0،1-0،5 μCi الركيزة رديولبلد لتحديد التدوير / μCi. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس التدوير لكل عينة باستخدام عداد التلألؤ وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب بمول 14 CO 2 / نسخة في الدقيقة و بمول 14 CO 2 في الطيران في الساعة. طرح نسخة في الدقيقة الخلفية من قيمة التدوير لكل عينة. من البيانات الركيزة رديولبلد أنيق، وحساب التدوير / μCi من عينة لتصحيح الخلفية حساب. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدم النشاط معين والتركيز الإشعاعية الركيزة رديولبلد (على سبيل المثال، 50 μCi / مكرومول و 0.1 μCi / ميكرولتر، على التوالي) لحساب بمول / نسخة في الدقيقة قدمت الشركة المصنعة. استخدام هذا العامل لتحويل البيانات جراب يطير تصحيح الخلفية من نسخة في الدقيقة 14 CO 2 / عينة لبمول 14 CO 2 / عينة. ثم القسمة على عدد من الذباب وعدد من ساعة في جراب الطاير. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fruit+flies+in+biomedical+research.">Fruit flies in biomedical research.</a> Genetics. 199 (3), 639-653 (2015).</li><li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila,+the+golden+bug,+emerges+as+a+tool+for+human+genetics.">Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics.</a> Nat Rev Genet. 6 (1), 9-23 (2005).</li><li>Owusu-Ansah, E., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+metabolic+homeostasis+and+nutrient+sensing+in+Drosophila:+implications+for+aging+and+metabolic+diseases.">Modeling metabolic homeostasis and nutrient sensing in Drosophila: implications for aging and metabolic diseases.</a> Dis Model Mech. 7 (3), 343-350 (2014).</li><li>Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+studying+metabolism+in+Drosophila.">Methods for studying metabolism in Drosophila.</a> Methods. 68 (1), 105-115 (2014).</li><li>Deshpande, S. A., Carvalho, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+Drosophila+food+intake:+comparative+analysis+of+current+methodology.">Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology.</a> Nat methods. 11 (5), 535-540 (2014).</li><li>Bland, M. L., Lee, R. J., Magallanes, J. M., Foskett, J. K., Birnbaum, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPK+supports+growth+in+Drosophila+by+regulating+muscle+activity+and+nutrient+uptake+in+the+gut.">AMPK supports growth in Drosophila by regulating muscle activity and nutrient uptake in the gut.</a> Dev biol. 344 (1), 293-303 (2010).</li><li>Hulbert, A. J., Clancy, D. J., Mair, W., Braeckman, B. P., Gems, D., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+rate+is+not+reduced+by+dietary-restriction+or+by+lowered+insulin/IGF-1+signalling+and+is+not+correlated+with+individual+lifespan+in+Drosophila+melanogaster.">Metabolic rate is not reduced by dietary-restriction or by lowered insulin/IGF-1 signalling and is not correlated with individual lifespan in Drosophila melanogaster.</a> Exp Geront. 39 (8), 1137-1143 (2004).</li><li>Van Voorhies, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+function+in+Drosophila+melanogaster+in+response+to+hypoxia+and+pure+oxygen.">Metabolic function in Drosophila melanogaster in response to hypoxia and pure oxygen.</a> J. Exp. Biol. 212 (19), 3132-3141 (2009).</li><li>Montooth, K. L., Marden, J. H., Clark, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+determinants+of+variation+in+energy+metabolism,+respiration+and+flight+in+Drosophila.">Mapping determinants of variation in energy metabolism, respiration and flight in Drosophila.</a> Genetics. 165 (2), 623-635 (2003).</li><li>Yatsenko, A. S., Marrone, A. K., Kucherenko, M. M., Shcherbata, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+metabolic+rate+in+Drosophila+using+respirometry.">Measurement of metabolic rate in Drosophila using respirometry.</a> JoVE. (88), e51681 (2014).</li><li>Icreverzi, A., de la Cruz, A. F., Van Voorhies, W. A., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+cyclin+D/Cdk4+regulates+mitochondrial+biogenesis+and+aging+and+sensitizes+animals+to+hypoxic+stress.">Drosophila cyclin D/Cdk4 regulates mitochondrial biogenesis and aging and sensitizes animals to hypoxic stress.</a> Cell cycle. 11 (3), 554-568 (2012).</li><li>Tuttle, S., Muschel, R., Bernhard, E., McKenna, W. G., Biaglow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+ability+of+cells+overexpressing+MYC+proteins+to+reduce+peroxide+and+hydroperoxides.">Decreased ability of cells overexpressing MYC proteins to reduce peroxide and hydroperoxides.</a> Br J Cancer. 27, 140-144 (1996).</li><li>Ontko, J. A., Jackson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+the+rate+of+oxidation+of+fatty+acids+in+animal+tissues.+Effect+of+substrate+concentration,+pH,+and+coenzyme+a+in+rat+liver+preparations.">Factors affecting the rate of oxidation of fatty acids in animal tissues. Effect of substrate concentration, pH, and coenzyme a in rat liver preparations.</a> J Biol Chem. 239, 3674-3682 (1964).</li><li>Vincent, A., Briggs, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=parkin-induced+defects+in+neurophysiology+and+locomotion+are+generated+by+metabolic+dysfunction+and+not+oxidative+stress.">parkin-induced defects in neurophysiology and locomotion are generated by metabolic dysfunction and not oxidative stress.</a> Hum Mol Gen. 21 (8), 1760-1769 (2012).</li><li>Katz, J., Abraham, S., Hill, R., Chaikoff, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+occurrence+and+mechanism+of+the+hexose+monophosphate+shunt+in+rat+liver+slices.">The occurrence and mechanism of the hexose monophosphate shunt in rat liver slices.</a> J Biol Chem. 214 (2), 853-868 (1955).</li><li>Katz, J., Wood, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+glucose-C14+for+the+evaluation+of+the+pathways+of+glucose+metabolism.">The use of glucose-C14 for the evaluation of the pathways of glucose metabolism.</a> J Biol Chem. 235 (8), 2165-2177 (1960).</li><li>Piper, M. D. W., Blanc, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+holidic+medium+for+Drosophila+melanogaster.">A holidic medium for Drosophila melanogaster.</a> Nat methods. 11 (1), 100-105 (2014).</li><li>Sang, J. H., King, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+Requirements+of+Axenically+Cultured+Drosophila+Melanogaster+Adults.">Nutritional Requirements of Axenically Cultured Drosophila Melanogaster Adults.</a> J Exp Biol. , (1961).</li><li>Chernick, S. S., Chaikoff, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+and+hepatic+utilization+of+glucose+for+lipogenesis.">Insulin and hepatic utilization of glucose for lipogenesis.</a> J Biol Chem. 186 (2), 535-542 (1950).</li><li>Van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testing+the+"rate+of+living"+model:+further+evidence+that+longevity+and+metabolic+rate+are+not+inversely+correlated+in+Drosophila+melanogaster.">Testing the "rate of living" model: further evidence that longevity and metabolic rate are not inversely correlated in Drosophila melanogaster.</a> J Appl Phys. 97 (5), 1915-1922 (2004).</li></ol>

The author declares no competing financial interests.

يصف هذا البروتوكول وسيلة لقياس أكسدة ركائز رديولبلد محددة في الكبار ذبابة الفاكهة. هذه التقنية هي واضحة، الكمية، يمكن استنساخه وحساسة، ومكملة لطرق الحالية التي تقيس مجموع CO 2 الإنتاج والاستهلاك O 2 لأنها يمكن أن تستخدم لتحديد المغذيات (ق) التي تتأكسد لإنتاج ATP. قياس ثاني أكسيد الكربون 2 تتحرر من أكسدة ركائز رديولبلد محددة باستخدام الطريقة الموصوفة هنا هو مكمل لتقنيات قياس مجموع CO 2 الإنتاج. إجمالي CO 2 إنتاج (V CO2) يسمح تقدير معدل الأيض، وعندما يعرف الكلي O 2 استهلاك (V O2)، ويمكن حساب معدل الأيض ومصدر الوقود للأكسدة يمكن أن يقدر على أساس نسبة التبادل التنفسي (V CO2 / V O2 = RER). متىالكربوهيدرات هي الركيزة حصرية، RER = 1، ولكن عندما الأحماض الدهنية هي المصدر الوحيد، RER = 0.7، نظرا للرياضيات الكيمياء من ردود فعل الجلوكوز وأكسدة الدهون. في حالة عدم وجود معدات لقياس استهلاك الأوكسجين في ذبابة الفاكهة 14، لا يمكن تحديد مصدر وقود الأكسدة. ومع ذلك، من خلال وضع العلامات الذباب مع كميات ضئيلة من الركيزة المشعة أو بأخرى ومعدلات قياس رديولبلد إنتاج CO 2، يمكن للمرء استخلاص استنتاجات حول قدرة الذباب على أكسدة ركيزة بالنظر في نقاط زمنية مختلفة خلال التحفيز أو عن آثار نظرا طفرة على أكسدة الوقود. وهناك عدد من الخطوات الهامة في هذا البروتوكول. أولا، ينبغي توخي الحذر عند استخدام المواد المشعة لتجنب تسرب وتلوث من المجالات البحثية. ثانيا، عندما التخدير الذباب خلال الخطوات 2.1 و 3.4، يجب المجرب العمل بسرعة لتجنب الآثار من ثاني أكسيد الكربون لفترة طويلة 2تعرض على عملية التمثيل الغذائي والسلوك. مجموعة من 20 الذباب يمكن تخدير ونقل إلى قارورة جديدة أو في جراب ذبابة في 20 ثانية أو أقل. عند نقلها من جهاز التخدير إلى قارورة الغذاء، يجب أن استراح في قارورة من جانبها لمنع الذباب تخدير من أن يعلقوا على سطح الطعام. عندما الذباب هي الغذاء رديولبلد بتغذية على مدى عدة أيام كما في الخطوة 2.2، يجب المجرب تأكد من أن الغذاء لا تجف كما الذباب حساسة للجفاف. بنك الاحتياطي الفيدرالي أو الدولة صام قبل وضع العلامات، واختيار التسمية، وطول الوقت وضع العلامات، وطول الوقت في جراب الطاير، وطريقة التخدير والمعلمات التي يمكن أن تتعرض لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها وتعديل عند استخدام هذه التقنية. أولا، الذباب تعرض لفترات وضع العلامات قصيرة (2-3 ساعة) من غير المرجح أن تستهلك كميات كبيرة من المواد الغذائية رديولبلد إلا إذا تعرض لفترة الصيام مسبقا. الثاني، واختيار التسمية جوتؤثر على استنتاجات واحد قادر على رسم حول الظواهر الأيضية. على سبيل المثال، رديولبلد CO 2 الإنتاج من د- [1- 14 C] -glucose يمكن أن تعكس الأكسدة من خلال دورة حمض الستريك أو تحويلة الفوسفات البنتوز، في حين رديولبلد CO 2 الإنتاج من د- [6- 14 C] -glucose يعكس الأكسدة خلال دورة حمض الستريك فقط 12،15،16. أن تغذية الذباب مع التتبع رديولبلد لمن الأحماض الأمينية الأساسية 17،18 تكون الإستراتيجية الجيدة لتقييم أكسدة الأحماض الأمينية المستمدة من البروتينات. وأخيرا، وفترات وضع العلامات مطولة مع الجلوكوز رديولبلد تثير أيضا إمكانية إدراج هذه السلائف إلى فئات أخرى من الجزيئات مثل الدهون الثلاثية 19 والأحماض الأمينية مثل ألانين، التي interconverts بسهولة مع البيروفات. ويمكن تقييم ذلك من خلال قياس النشاط الإشعاعي تدمج في هذه فئات مختلفة من الجزيئات 6. راد في الواقع، الأفواج منفصلة من الذباب يمكن تغذيةiolabeled ركائز بنفس الطريقة وتستخدم بعد ذلك لإجراء التجارب جراب ذبابة أو قياس radiolabel التي يتم تخزينها ويبقى في الجليكوجين والدهون الثلاثية في تغذية وصام الظروف 6، على سبيل المثال. استراتيجية أخرى هي استخدام فترات قصيرة وضع العلامات التي من المرجح أن تكشف أكسدة المواد الغذائية الغذائية رديولبلد أنفسهم وليس أشكال تخزين هذه المواد المغذية. ثالثا، من الممكن أيضا أن مجموعتين من الذباب يمكن أن يكون معدلات مماثلة من 14 CO 2 إنتاج أكثر من كمية معينة من الوقت، ولكن بنسب مختلفة جدا في البداية. لذلك، تفاوت مقدار الوقت الذي يتجه قضاء في جراب الطيران قد يكون معيارا هاما لتغيير عند تقييم التباين المظهري. وأخيرا، يدعو هذا البروتوكول للاستخدام خلال فترة قصيرة من CO 2 التخدير عند وضع الذباب في الجهاز جراب الطاير. ومن الممكن أن التخدير CO 2 قد تؤثر على وظيفة التمثيل الغذائي على مدى التجربة جراب الطاير. وعلى البديلpproach هو استخدام التخدير النيتروجين الذي لا يؤثر على معدل الأيض (20). كما هو الحال مع أي أسلوب الذي يقيس مثل هذا النظام المعقد كما أكسدة الوقود ومعدل الأيض، وطريقة وصفها هنا له حدود. أولا، فمن الممكن أن تسير في مجموعات مختلفة يمكن أن تستهلك كميات مختلفة من المواد الغذائية رديولبلد وبالتالي ستدخل مرحلة جمع CO 2 للمقايسة مع كميات مختلفة بدءا من الركيزة. هذا ويمكن للرقابة لإلى حد ما عن طريق إجراء التجربة على عينات كبيرة الحجم وعن طريق تغذية الذباب بشكل جماعي. لفترات قصيرة وضع العلامات، والذباب مع الشجاعة مماثلة أزرق اللون سيكون قد استهلك radiolabel ويمكن ان يتم تطويرها إلى الجزء مطاردة من التجربة. كما يمكن قياس كمية radiolabel المتبقية في مجموعة من الذباب في نهاية التجربة وفي الأفواج منفصلة من الذباب بعد نهاية التغذية وفترة مطاردة الأولية. الثانية، ومستويات النشاط بينقد تختلف مجموعات من الذباب في القرون الطاير. وهذا يجب أن يكون تجريبيا وأخذها في الاعتبار عند تفسير البيانات. ثالثا، هذه التقنية لا يقيس إجمالي CO 2 الإنتاج، والإنتاج فقط من المغذيات غذائية معينة أو شكل التخزين (ق) من تلك المواد الغذائية. هذا البروتوكول ليست بديلا للبل هو مكمل لقياسات VCO 2 لأنه يوفر معلومات مختلفة وإضافية. الطريقة الموصوفة هنا يقيس الزفير، CO رديولبلد 2 الذي هو نتاج أكسدة كميات ضئيلة من ركائز المحددة للتمثيل الغذائي. من خلال تغيير التسمية المستخدمة - الجلوكوز، والأحماض الدهنية، أو الأحماض الأمينية - يمكن للمرء أن تصميم تجارب متطورة على نحو متزايد لتقييم المساهمات من ركائز مختلفة لعملية التمثيل الغذائي في ظل الظروف الفسيولوجية المختلفة مثل الجوع وعلى خلفيات وراثية مختلفة. وتشمل التطبيقات المستقبلية لهذه التقنية قياس metabolisم في مراحل اليرقات والعذارى للتنمية، واثنين من مراحل دورة حياة ذبابة الفاكهة التي تتميز بها اقصى تخزين المواد الغذائية وانهيار، على التوالي.

وقد ساهم العمل في الكائن الحي نموذج ذبابة الفاكهة إلى حد كبير في فهم الأسس الوراثية، والعمليات التنموية، والنمو، والشيخوخة، والسلوك، والحصانة والأمراض التي تصيب البشر 1،2. وأدى عدد لا يحصى من النهج البيولوجية الوراثية والخلايا في ذبابة الفاكهة تقدم في هذه المجالات. ومع ذلك، وضعت دراسة التمثيل الغذائي في ذبابة الفاكهة ببطء أكثر، ويرجع ذلك في جزء كبير منه إلى الصعوبات في قياس المعلمات الأيض في مثل هذه الحيوانات الصغيرة. دفعت اهتماما باستخدام ذبابة الفاكهة كنموذج لدراسة الأمراض التي تصيب الإنسان مثل السكري ولفهم المساهمات التمثيل الغذائي للنمو ومختلف الأمراض الميدان لتطوير وتكييف تقنيات التمثيل الغذائي لهذا الكائن الحي 3،4. وسائل موثوق بها تتوفر لقياس عدد من المعلمات الأيض في ذبابة الفاكهة الآن. على سبيل المثال، فإنه واضح ومباشر لتقييم الاستهلاك الغذائي <sتصل&gt; 5، ومستويات الدهون الثلاثية المخزنة والجليكوجين، وكذلك تعميم مستويات الدملمف الجلوكوز والسكر تعميم كبير في الطيران، طرهالوز، وهو ديساكهارايد تتألف من اثنين من جزيئات الجلوكوز 4. وقد مكن استخدام استشفاف الأيض دراسة امتصاص العناصر الغذائية من النظام الغذائي وتحويل العناصر الغذائية الممتصة مثل الجلوكوز إلى جليكوجين أشكال التخزين والدهون الثلاثية 6. ويمكن تقييم معدلات التمثيل الغذائي في ذبابة الفاكهة من خلال قياس استهلاك الأوكسجين 7،8 وثاني أكسيد الكربون (CO 2) الإنتاج. دورة حمض الستريك يتأكسد الوحدتين الكربون التي يمكن أن تدخل دورة كما أسيتيل التميم A (لجنة الزراعة)، وهي مشتقة من استقلاب الكربوهيدرات الغذائية وتخزينها والأحماض الدهنية. كل منعطف دورة يولد جزيء واحد كل من GTP (أو ATP) والجهة المانحة الإلكترون القوات المسلحة الهايتية 2، ثلاثة جزيئات NADH، وجزيئين من ثاني أكسيد الكربون الناتج من النفايات 2. CO 2 إنتاج يمكنأن تستخدم لتقدير معدل الأيض القاعدي. إجمالي إنتاج CO 2 يمكن قياسها كميا في ذبابة الفاكهة من خلال استخدام قياس التنفس المتاحة تجاريا أو المصنوعة يدويا 9-10،11. قياس إجمالي إنتاج CO 2، وخصوصا عندما يقترن قياس استهلاك O 2، ويوفر معلومات قيمة حول كامل الجسم استقلاب الطاقة. ومع ذلك، فإن هذا الإجراء لا تحديد المواد الغذائية التي تتأكسد لإنتاج أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP). يمكن ثلاث فئات رئيسية من المواد المغذية يدخل الليمون الحامض دورة التحويل التالية إلى الاسيتيل جنة الزراعة: الكربوهيدرات والأحماض الدهنية، والبروتينات. الجلوكوز 6 فوسفات، والمستمدة من الجلوكوز الغذائية أو تخزين الجليكوجين، يمكن تحويلها إلى البيروفات التي decarboxylated بواسطة نازعة البيروفات لتشكيل الاسيتيل جنة الزراعة. انهيار الأحماض الدهنية المستمدة من الغذاء أو من الدهون الثلاثية المخزنة بواسطة عائدات ß للأكسدة أسيتيل التميم أن ثم يدخل دورة حمض الستريك. أخيراوالغالبية العظمى من الأحماض الأمينية يمكن أن تدخل دورة حمض الستريك بعد أن تحول إلى البيروفات، أسيتيل التميم أو حمض الستريك وسيطة دورة مثل ألفا كيتوغلوتارات. يمكن رصد مساهمة بالمغذيات محددة لاستقلاب الطاقة خلال القاعدية والشروط حفز من خلال استخدام استشفاف المشعة. ويتم تكييف بروتوكول المعروضة هنا للاستخدام في ذبابة الفاكهة من بروتوكول يستخدم لتقييم الأكسدة في الخلايا المزروعة في الثقافة 12،13. في هذا النهج، ذباب الفاكهة ويتم تغذية 14 ركائز C-رديولبلد الأيض (الكربوهيدرات والأحماض الدهنية، أو الأحماض الأمينية) في النظام الغذائي لفترة قصيرة (ساعة) أو طويلة (أيام) نبض، طاردت على الطعام الخالي من الملصقات، وبعد ذلك تعرضت ل غرفة تحتوي على هيدروكسيد البوتاسيوم (KOH) ورقة مرشح -saturated لمحاصرة الزفير CO 2، والبيكربونات. بيكربونات رديولبلد يمكن قياسها عن طريق عد التلألؤ. الاختلافات في رديولبلد-CO 2 إنتاج بين التجربةقد تعكس مجاميع كتائب من الذباب استخدام أنواع مختلفة من الوقود لإنتاج ATP على مدار فروق سريعة أو الجوهرية طويلة في التمثيل الغذائي الوقود بين التراكيب الوراثية، على سبيل المثال.

<table><tbody><tr><td>PALMITIC ACID, [1-14C]-, 50 &amp;micro;Ci</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC075H050UC</td><td></td></tr><tr><td>GLUCOSE, D-[6-14C]-, 50 &amp;micro;Ci</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC045X050UC</td><td></td></tr><tr><td>Glucose, D-[1-14C]-, 50&amp;micro;Ci</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC043X050UC</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila Vials, Narrow, Polystyrene</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-116</td><td></td></tr><tr><td>Round-Bottom Polypropylene Tubes, 12 x 75 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959AA</td><td></td></tr><tr><td>Mesh, nitex nylon, 120 &amp;micro;m</td><td>Genesee Scientific</td><td>57-102</td><td></td></tr><tr><td>20 ml borosilicate glass scintillation vials</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-15</td><td></td></tr><tr><td>Flask top stopper with off-center hole</td><td>Fisher Scientific</td><td>K882310-0000</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylene center well</td><td>Fisher Scientific</td><td>K882320-0000</td><td></td></tr><tr><td>Whatman GF/B glass microfiber filter paper, circle, 2.1cm diameter</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-874-20</td><td></td></tr><tr><td>Ecoscint A</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-273</td><td></td></tr><tr><td>6 ml Scintillation Vials with Push-On/Twist-Off Caps</td><td>National Diagnostics</td><td>SVC-06</td><td></td></tr></tbody></table>

measurement of carbon dioxide production from radiolabeled substrates in drosophila melanogaster

ويتزايد تطبيق قوة الوراثة ذبابة الفاكهة على أسئلة من الإشارات الهرمونية والتمثيل الغذائي، وتطوير نماذج من الأمراض التي تصيب البشر في هذا الحي. وهناك حاجة إلى طرق حساسة لقياس المعلمات مثل معدلات التمثيل الغذائي لدفع فهم علم وظائف الأعضاء والمرض في الحيوانات الصغيرة مثل ذبابة الفاكهة. الطريقة الموصوفة هنا يقيم أكسدة الوقود في أعداد صغيرة من الذباب الكبار تغذية الأغذية التي تحتوي على كميات ضئيلة من 14 ركائز المسمى C مثل الجلوكوز أو الأحماض الدهنية. بعد فترة التغذية وأي التلاعب التجريبية إضافية، يتم نقل الذباب لأنابيب قصيرة توج مع شبكة، والتي يتم وضعها في قوارير زجاجية تحتوي على ورق الترشيح المشبعة كوه التي الفخاخ الزفير، CO رديولبلد 2 لدت من أكسدة ركائز رديولبلد كما بيكربونات البوتاسيوم، KHCO 3. ويقاس هذا بيكربونات رديولبلد من التلألؤ العد. هذا هو عبد القديرنهج uantitative، قابلة للتكرار، وبسيطة لدراسة أكسدة الوقود. استخدام الجلوكوز رديولبلد والأحماض الدهنية والأحماض الأمينية أو يسمح بتحديد مساهمة هذه المصادر الوقود المختلفة لاستقلاب الطاقة في ظل ظروف مختلفة مثل التغذية والصيام وخلفيات وراثية مختلفة. ويكمل هذا النهج الأخرى المستخدمة لقياس في استقلاب الطاقة في الجسم الحي، وينبغي تعزيز فهم تنظيم الأيض.

كمية الزفير والمحاصرين CO رديولبلد 2 الذي يتم انتاجه من عملية التمثيل الغذائي للركيزة المشعة يجب أن تتطابق مع عدد من الذباب في جراب ذبابة فضلا عن مقدار الوقت الحيوانات تنفق في جهاز جمع CO 2. لاختبار هذا، تم تغذية الذباب التي تم صام لمدة 18 ساعة حمض البالمتيك رديولبلد (0.02 μCi / ميكرولتر الغذاء) لمدة 2 ساعة ثم اختبار لإنتاج رديولبلد CO 2 في مجموعات من 12 أو 25 الحيوانات لمدة 3 أو 6 حضانات ساعة. وكانت كمية CO 2 التي تنتجها 25 الذباب تقريبا ضعف الكمية المنتجة بنسبة 12 الذباب، وكمية لكل مجموعة تضاعف عندما تمت زيادة فترة حضانة من 3 ساعات إلى 6 ساعات (الشكل 2A). كانت بمول 14 CO 2 / الذبابة / ساعة أي ما يعادل تقريبا في كل مجموعة. الصوم يحفز انهيار الأحماض الدهنية التي كتبها ss سxidation. لذا CO 2 الإنتاج من أكسدة الأحماض الدهنية يجب أن تكون مرتفعة في الحيوانات صام مقارنة مع الحيوانات التي تتغذى. لتحديد ما إذا كان هذا هو الحال، طلب منهن الصيام لمدة 18 ساعة الذباب التي غذيت على حمض البالمتيك رديولبلد لمدة 2 ساعة. وبعد هذا النبض التغذية قصيرة، تم تقسيم الذباب إلى مجموعتين ونقل إلى الغذاء ذبابة الخالي من الملصقات أو 1٪ أجار لمدة 3 ساعة ثم ينقل ليطير القرون لمدة 2 ساعة. في تجربتين منفصلتين، الذباب مطاردة على أجار تنتج ثاني أكسيد الكربون بشكل ملحوظ أكثر رديولبلد 2 مقارنة مع الذباب مطاردة على الغذاء (الشكل 2B)، مشيرا إلى أن الأكسدة şş تم زيادة في الحيوانات صام. <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/54045/54045fig1.jpg" /> الشكل 1. جهاز لجمع الزفير، رديولبلد CO 2. الذباب الذي قد استهلكت ركائز التمثيل الغذائي رديولبلد هيوضع في &quot;يطير جراب&quot; (FP)، أنبوب قطع أجهزة الطرد المركزي توج مع شبكة (M). يتم وضع جراب يطير الى 20 مل الزجاج التلألؤ القارورة وتوج مع سدادة مطاطية أعلى (S) التي تحتوي على ثقب خارج المركز، التي من خلالها يتم وضع مركز جيد (CW) الذي يحتوي على GF / B رقة الترشيح المشبعة مع 100 ميكرولتر 5٪ KOH. الزفير CO 2 يتفاعل مع KOH ومحصور على ورقة الترشيح كما بيكربونات. المحاصرين، رديولبلد CO 2 يمكن قياسها كميا بواسطة التلألؤ العد من ورقة الترشيح المشبعة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54045/54045fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/54045/54045fig2.jpg" /> الشكل 2. 14 CO 2 الإنتاج الاقتران مع الوقت وعدد الذباب فيذبابة قرنة ويستجيب لبنك الاحتياطي الفيدرالي والشروط صام. (أ) بمبلغ 14 CO 2 تنتج في الذباب يتغذى بالميتات رديولبلد يرتبط مع عدد من الذباب اختبار (ن ​​= 12 (الحانات مفتوحة) أو 25 (الحانات مغلقة)) والوقت الذي يقضيه في جراب الطيران (3 أو 6 ساعات ). على أساس لكل الطيران، أنتجت الذباب 0.99، 1.13، 1.10 و 1.01 بمول 14 CO 2 / ساعة (البيانات الواردة في نفس اليسار إلى الترتيب الصحيح عن بيانات الرسم البياني). (ب) الذباب التي طاردت على أجار أكسدة أكثر بالميتات رديولبلد من الذباب التي طاردت على الغذاء. البيانات هي من تجربتين وذكرت كوسيلة الانحراف المعياري، ن = 16-17 الذباب / مجموعة (التجربة 1)؛ ن = 10 الذباب / مجموعة (تجربة 2). * ع = 0.017، الطالب اختبار t. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54045/54045fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster at JoVE.com

Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster

This paper describes a method for the measurement of fuel oxidation in Drosophila melanogaster in which trace amounts of specific radiolabeled metabolic substrates are fed to flies. The exhaled radiolabeled CO2 that is a produced from fuel oxidation is collected and measured.

قياس إنتاج ثاني أكسيد الكربون من رديولبلد ركائز في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em

The power of Drosophila genetics is increasingly being applied to questions of hormone signaling and metabolism and to the development of models of human ...

measurement-carbon-dioxide-production-from-radiolabeled-substrates

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster

9.1K Views.  University of Virginia. This paper describes a method for the measurement of fuel oxidation in Drosophila melanogaster in which trace amounts of specific radiolabeled metabolic substrates are fed to flies. The exhaled radiolabeled CO2 that is a produced from fuel oxidation is collected and measured.

Video: Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

تشريح الجهاز العصبي المركزي اليرقات في Melanogaster ذبابة الفاكهة

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human organs, possess highly conserved metabolic pathways and have a relatively short lifespan that allows the study of different fundamental mechanisms in a short period of time. It is, however, surprising that one of the mechanisms essential for cellular metabolism, the mitochondrial respiration, has not been thoroughly investigated in this model. It is likely because the measure of the mitochondrial respiration in Drosophila usually requires a very large number of individuals and the results obtained are not highly reproducible. Here, a method allowing the precise measurement of mitochondrial oxygen consumption using minimal amounts of tissue from Drosophila is described. In this method, the thoraxes are dissected and permeabilized both mechanically with sharp forceps and chemically with saponin, allowing different compounds to cross the cell membrane and modulate the mitochondrial respiration. After permeabilization, a protocol is performed to evaluate the capacity of the different complexes of the electron transport system (ETS) to oxidize different substrates, as well as their response to an uncoupler and to several inhibitors. This method presents many advantages compared to methods using mitochondrial isolations, as it is more physiologically relevant because the mitochondria are still interacting with the other cellular components and the mitochondrial morphology is conserved. Moreover, sample preparations are faster, and the results obtained are highly reproducible. By combining the advantages of Drosophila as a model for the study of metabolism with the evaluation of mitochondrial respiration, important new insights can be unveiled, especially when the flies are experiencing different environmental or pathophysiological conditions.

In this paper, a method to measure oxygen consumption using high-resolution respirometry in permeabilized thoraxes of Drosophila is described. This technique requires a minimal amount of tissue compared to the classic mitochondrial isolation technique and the results obtained are more physiologically relevant.

قياس استهلاك الأوكسجين المتقدرية في ألياف بيرميبيليزيد من المورفولوجية استخدام كميات ضئيلة من الأنسجة

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

Biochemistry

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

عالية الدقة تعقب الفيديو للتنقل في الكبار ذبابة الفاكهة السوداء البطن

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained and restrained whole larvae. For direct control of the environment around the heart another approach utilizes the dissected larvae and removal of the internal organs in order to bathe the heart in desired compounds. The exposed heart also allows membrane potentials to be monitored which can give insight of the ionic currents generated by the myocytes and for electrical conduction along the heart tube. These approaches have various advantages and disadvantages for future experiments that are discussed. The larval heart preparation provides an additional model besides the Drosophila skeletal NMJ to investigate the role of intracellular calcium regulation on cellular function. Learning more about the underlying ionic currents that shape the action potentials in myocytes in various species, one can hope to get a handle on the known ionic dysfunctions associated to specific genes responsible for various diseases in mammals.

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various ways to monitor heart function in the larva of Drosophila for assessing questions dealing with the function of gap junctions, ion channel mutations, modulation of pacemaker activity and pharmacological studies.

رصد وظيفة القلب في اليرقات ذبابة الفاكهة السوداء البطن للدراسات فسيولوجية

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

يعيش تصوير ذبابة الفاكهة السوداء البطن هجرات كرية دموية الجنينية

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides protection against desiccation and other environmental challenges. Several of these cuticular hydrocarbon (CHC) compounds also function as semiochemical signals, and as such mediate pheromonal communications between members of the same species, or in some instances between different species, and influence behavior. Specialized cells referred to as oenocytes are regarded as the primary site for CHC synthesis. However, relatively little is known regarding the involvement of the oenocytes in the regulation of the biosynthetic, transport, and deposition pathways contributing to CHC output. Given the significant role that CHCs play in several aspects of insect biology, including chemical communication, desiccation resistance, and immunity, it is important to gain a greater understanding of the molecular and genetic regulation of CHC production within these specialized cells. The adult oenocytes of D. melanogaster are located within the abdominal integument, and are metamerically arrayed in ribbon-like clusters radiating along the inner cuticular surface of each abdominal segment. In this video article we demonstrate a dissection technique used for the preparation of oenocytes from adult D. melanogaster. Specifically, we provide a detailed step-by-step demonstration of (1) how to fillet prepare an adult Drosophila abdomen, (2) how to identify the oenocytes and discern them from other tissues, and (3) how to remove intact oenocyte clusters from the abdominal integument. A brief experimental illustration of how this preparation can be used to examine the expression of genes involved in hydrocarbon synthesis is included. The dissected preparation demonstrated herein will allow for the detailed molecular and genetic analysis of oenocyte function in the adult fruit fly.

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In insects, the oenocytes produce cuticular hydrocarbon compounds. These compounds protect against desiccation and facilitate chemical communication. Here we demonstrate a dissection technique used to isolate the oenocytes from adult Drosophila melanogaster, and illustrate how this preparation can be utilized to study genes involved in hydrocarbon synthesis.

تشريح Oenocytes من الكبار ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

عزلة ذبابة الفاكهة السوداء البطن الخصيات

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

التحليل الأيضي اليرقات melanogaster المورفولوجية و "العقول الكبار"

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

Neuroscience

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

قياس معدل الأيض في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; باستخدام قياس التنفس

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

تكييف قياس التنفس الدقيق لذبابة الفاكهة - رؤى حول التمثيل الغذائي الطافر CASK

Measuring O2 Consumption in Drosophila melanogaster Using Coulometric Microrespirometry

Coulometric microrespirometry is a straightforward, inexpensive method for measuring the O2 consumption of small organisms while maintaining a stable environment. A coulometric microrespirometer consists of an airtight chamber in which O2 is consumed and the CO2 produced by the organism is removed by an absorbent medium. The resulting pressure decrease triggers electrolytic O2 production, and the amount of O2 produced is measured by recording the amount of charge used to generate it. In the present study, the method has been adapted to Drosophila melanogaster tested in small groups, with the sensitivity of the apparatus and the environmental conditions optimized for high stability. The amount of O2 consumed by wildtype flies in this apparatus is consistent with that measured by previous studies. Mass-specific O2 consumption by CASK mutants, which are smaller and known to be less active, was not different from congenic controls. However, the small size of CASK mutants resulted in a significant reduction in O2 consumption on a per-fly basis. Therefore, the microrespirometer is capable of measuring O2 consumption in D. melanogaster, can distinguish modest differences between genotypes, and adds a versatile tool for measuring metabolic rates.

تسليط الضوء على المؤلف: تأثير درجة الحرارة على ذبابة الفاكهة والخنافس المتكيفة مع الصحراء 

Coulometric respirometry is ideal for measuring the metabolic rate of small organisms. When adapted for Drosophila melanogaster in the present study, measured O2 consumption was within the range reported for wildtype D. melanogaster by previous studies. Per-fly O2 consumption by CASK mutants, which are smaller and less active, was significantly lower than the wildtype.

قياس استهلاك O2 في ذبابة الفاكهة الميلانية باستخدام قياس التنفس المجهري بقياس الكولوم

Coulometric microrespirometry is a straightforward, inexpensive method for measuring the O2 consumption of small organisms while maintaining a stable ...

قياس إنتاج ثاني أكسيد الكربون من رديولبلد ركائز في

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video