Name: measurement of carbon dioxide production from radiolabeled substrates in drosophila melanogaster
Uploaded: 2016-06-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster at JoVE.com

The author thanks Drs. Mingjian Lu and Morris Birnbaum for helpful advice and funding support from NIDDK (R21DK089391).

Radyoaktif Metabolik Alt Tabakalar İçeren Fly Gıda 1. Hazırlık <ol><li> 2 uCi radyo işaretli substrat (D -glükoz [6- 14C] -glükoz, D [1- 14C] ya da [1- 14C] -palmitic asit, 40 - - 60 mCi / mikrofüj tüpüne, 1 karıştırın 15 ul FD &amp; C 1 numaralı mavi gıda boyası ile mmol) ve H2O 25 ul toplam hacim eşit. DİKKAT: Karbon-14 düşük enerji beta yayıcı ve havada kısa bir yelpazesine sahiptir. Ancak, radyoaktif işaretli moleküller veya deneyci tarafından kazara yutulması dökülmesi önlemek için özen gösterin. Gıda şişeler kolayca devrilebilir uçmak; radyo-sıvı formdadır, özellikle devrilme engellemek bir kap içinde barındırmak için emin (1.2 aşama) ya da unsolidified gıda (adım 1.4) de olabilir. Beslenen ediliyor ya da radyo CO 2 küçük miktarlarda nefes başlayacak radyoaktif işaretli substratlar beslenmiş Sinekler. Bu sinekler duman davlumbaz akrilik kutularda muhafaza ve küçük bir tabak KOH ca olmalıdırn CO 2 gaz yıkayıcı olarak kullanılmak üzere kutuya ayarlanmalıdır. </li><li> Pipetleyin boş sinek gıda şişenin dibine radyo-etiketli substrat ve mavi boya karışımı tüm (yükseklik: 9.4 cm, genişlik: 2.2 cm). </li><li> (- Gıda 10 ml içeren bir flakon için yüksek güç seviyesinde 20 saniye 15) gıda sadece sıvılaştırılmış kadar ısı standart bir mikrodalga fırında yemek uçmak. </li><li> Mavi rengin tekdüzelik izleme sıyırınız, girdap hızla radyoaktif işaretli substrat / mavi boya karışımına 975 ul erimiş gıda ekleyin. </li><li> 30 dakika - Gıda soğutmak ve 20 RT&#39;de tamamen katılaşmaya izin verin. </li></ol> Yetişkin Meyve Sinekler 2. Besleme Radyoaktif Metabolik Substratları <ol><li> Yetişkin anestezisi bir basınç regülatörü ile bir CO2 tankına akrilik bir baza kaynaştırılmış ve bağlı olan, gözenekli poli etilen CO2 anestezi cihazı kullanılarak uçar. / Dk 5 L anestezi cihazının içine CO 2 akış. <ol><li> aktarım anestezisi(- Şişe başına 30 sinekler n = 15) d radyoaktif işaretli, mavi boyalı gıda içeren flakon uçar. Cap köpük tıpa ile şişeler ve sinekler uyanmak kadar yatay dinlenme. Bir kapaklı akrilik bir kaba aktarın şişeler (180 cm x 180 cm x 240 cm yüksekliğinde). </li></ol></li><li> 2 için radyoaktif işaretli gıda sinekler aktarmadan önce 24 saat - - Kısa vadeli beslenmesi için, 18 için sinekleri açlıktan. 3 saat besleme adımı T o açlık adım önemlidir beslenen sinekler güvenilir kendilerine sunulan yiyecek yeni bir kaynak yemem çünkü . 5 boyunca uzun bir dönem için - 7 gün, sineklerin aç olmak zorunda değildir, ama deneyi sinek yerleştirilmiştir şişelerde radyo-etiketli gıda su içeriği kontrol ve şişeler su eklemek için bir iğne ve şırınga kullanmalıdır kuru gıda ile. </li><li> Aktarım, yeni bir şişenin içine &quot;dokunarak&quot; tarafından etiketsiz gıda uçar. 2 Bir başlangıç ​​kovalamaca dönemi - 4 saat sinekleri cuticles gelen radyoaktif işaretli gıda parçacıkları temizlemek için verir ve radyoaktif sindirimini sağlargut kalan Ed yiyecek. Mavi karınlarının aramak için sinek görsel muayene ile bağırsak yoluyla gıda ilerlemeyi izlemek. </li><li> Daha sonra, transfer, farklı yiyecek türleri uçan 96 saat genetik 18 ˚C veya 30 ° C&#39;de - - ya da ortam sıcaklıklarında (12 (12 etkilerinin ölçümü için standart yiyecek ya da% 1 agar üzerinde 24 saat solunum üzerinde açlık durumuna karşı beslenen) manipülasyonlar için, örneğin, ısıya duyarlı GAL80 (GAL80 ts) kullanılarak). Not: Bu takip süresinin uzunluğu deney gerçekleştirilmiştir ve tecrübesi dahilinde,. Örneğin için, 30 ° C&#39;de 96 saat takip amacıyla GAL80 ts kullanıldığı deneylerde gerekli olabilir, tam GAL4 bağımlı transgen ekspresyonu aktive etmek için. </li></ol> CO 2 -Collection Aparatı 3. hazırlanması <ol><li> 14 C-glikoz ya da 14 C-palmitik asit ve tha ile etiketlenmiş sinekler içerecektir inşa &quot;bakla fly&quot; malzemeleri, örgü kaplı tüpler birleştirint atmosfere açık kalacaktır. 25 mm uzunluğunda, yuvarlak dipli tüpler bırakarak, 12 mm x 75 mm polipropilen borular üst 50 mm kesti. 130 mikron naylon mesh 35 mm x 35 mm kareler hazırlayın. Ayrıca, bir teyp dispanser saydam bandı edinin. </li><li> CO 2 -Collection aparatları için malzeme birleştirin. Her bölmeyi sinek için 20 ml&#39;lik cam sintilasyon flakon, bir off-orta deliği olan kauçuk üst stoper, iyi üst stoper delikten eklenecek bir merkez, sınıf GF / B cam mikrofiber filtre kağıdı (2.1 cm çapında bir araya daire, 1 mikron gözenek). GF / B filtre kağıdı nedeniyle yüksek ıslak mukavemet ve yüksek yükleme kapasitesi kullanılmaktadır. </li><li> Kullanılacağı gün% 5 KOH taze hazırlayın. Sadece adım 3.4 önce katlamak ve de bu lastik En durdurucunun delikten geçirilir merkezine dairesel GF / B filtre kağıdı yerleştirin ve% 5 KOH 100 ul ile doyurulması. Şekil 1&#39;e bakınız. </li><li> etiketsiz medya, bir üzerinde inkübasyon (ler) aşağıdakinesthetize CO 2 ile uçar. Fırça naylon mesh ile kesme polipropilen tüpe, kap içine uçar, ve tüp örgü uymak için saydam bandı kullanın. sinekler uyanma ve örgü güvenli tüp yapıştırılmış edilmeden önce kaçan önlemek için hızlı bir şekilde çalışın. Sinekler eşit sayıda belirli bir deney için her sinek bölmesinde kullanılmalıdır; 10 - Sinek baklada 20 sinekler sintilasyon sayımı (aşağıda adım 4.1) ile ölçüm için yeterli radyoetiketli-CO 2 üretirler. </li><li> 20 ml&#39;lik bir cam sintilasyon şişesi uçucu bölmesini aktarın. kauçuk üst tıpa iyi KOH doymuş GF / B filtre kağıdı içeren bir merkez tutan cam şişe kap. cam sintilasyon şişenin dudak üzerinde lastik top stoper geniş üst katlayın. Şekil 1&#39;e bakınız. </li><li> Set cam kapaklı, akrilik kap içinde sinekler içeren şişeler ve zaman (2 ila 12 saat iyi çalışıyor) değişen sürelerle inkübe. </li></ol> Sonuçların 4. Analizi <ol><li> at4 ml sintilasyon kokteyli ihtiva eden bir 6 ml plastik ışınlama şişeye inkübasyon uncap cam şişeler ve aktarım KOH doymuş GF / B filtre kağıdı sonu. </li><li> Gerekirse, depolanan yüzeylerde daha sonra belirlenmesi için -80 ° C&#39;de kuru buz ve mağaza sinek bakla sinekler dondurma. Bu örnekler, radyoaktif ve buna uygun olarak saklanmalıdır unutmayın. </li><li> / UCi cpm belirlemek için 0.5 uCi radyoaktif işaretli substrat - arka plan olarak hizmet vermeye kullanılmayan GF / B filtre kağıdı içeren bir ve 0.1 içeren bir iki diğerleri: Ek sintilasyon şişeleri hazırlayın. </li><li> üreticinin protokolüne uygun olarak bir parıldama sayacı kullanılarak her numune için cpm ölçün. </li><li> Saatte sinek başına pmol 14 CO 2 / bgbm ve pmol 14 CO 2 hesaplayın. Her numune için cpm değeri arka plan cpm çıkarın. düzgün radyoaktif işaretli substrat verilerinden, arka plan düzeltilmiş cpm / numunenin uCi sayılır hesaplayın. <ol><li> Kullanİmalatçı tarafından sağlanan spesifik aktivite ve radyoaktif olarak işaretlenmiş alt-tabaka radyokimyasal konsantrasyonu (örneğin, 50 uCi / umol ve 0.1 uCi / ml, sırasıyla) pmol / cpm hesaplamak için kullanılır. Pmol 14 CO 2 / numune 14 CO 2 / numune cpm arka plan düzeltilmiş sinek pod verileri dönüştürmek için bu faktör kullanın. Sonra sinek sayısı ve sinek bölmesinde saat sayısına göre bölün. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fruit+flies+in+biomedical+research.">Fruit flies in biomedical research.</a> Genetics. 199 (3), 639-653 (2015).</li><li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila,+the+golden+bug,+emerges+as+a+tool+for+human+genetics.">Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics.</a> Nat Rev Genet. 6 (1), 9-23 (2005).</li><li>Owusu-Ansah, E., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+metabolic+homeostasis+and+nutrient+sensing+in+Drosophila:+implications+for+aging+and+metabolic+diseases.">Modeling metabolic homeostasis and nutrient sensing in Drosophila: implications for aging and metabolic diseases.</a> Dis Model Mech. 7 (3), 343-350 (2014).</li><li>Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+studying+metabolism+in+Drosophila.">Methods for studying metabolism in Drosophila.</a> Methods. 68 (1), 105-115 (2014).</li><li>Deshpande, S. A., Carvalho, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+Drosophila+food+intake:+comparative+analysis+of+current+methodology.">Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology.</a> Nat methods. 11 (5), 535-540 (2014).</li><li>Bland, M. L., Lee, R. J., Magallanes, J. M., Foskett, J. K., Birnbaum, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPK+supports+growth+in+Drosophila+by+regulating+muscle+activity+and+nutrient+uptake+in+the+gut.">AMPK supports growth in Drosophila by regulating muscle activity and nutrient uptake in the gut.</a> Dev biol. 344 (1), 293-303 (2010).</li><li>Hulbert, A. J., Clancy, D. J., Mair, W., Braeckman, B. P., Gems, D., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+rate+is+not+reduced+by+dietary-restriction+or+by+lowered+insulin/IGF-1+signalling+and+is+not+correlated+with+individual+lifespan+in+Drosophila+melanogaster.">Metabolic rate is not reduced by dietary-restriction or by lowered insulin/IGF-1 signalling and is not correlated with individual lifespan in Drosophila melanogaster.</a> Exp Geront. 39 (8), 1137-1143 (2004).</li><li>Van Voorhies, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+function+in+Drosophila+melanogaster+in+response+to+hypoxia+and+pure+oxygen.">Metabolic function in Drosophila melanogaster in response to hypoxia and pure oxygen.</a> J. Exp. Biol. 212 (19), 3132-3141 (2009).</li><li>Montooth, K. L., Marden, J. H., Clark, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+determinants+of+variation+in+energy+metabolism,+respiration+and+flight+in+Drosophila.">Mapping determinants of variation in energy metabolism, respiration and flight in Drosophila.</a> Genetics. 165 (2), 623-635 (2003).</li><li>Yatsenko, A. S., Marrone, A. K., Kucherenko, M. M., Shcherbata, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+metabolic+rate+in+Drosophila+using+respirometry.">Measurement of metabolic rate in Drosophila using respirometry.</a> JoVE. (88), e51681 (2014).</li><li>Icreverzi, A., de la Cruz, A. F., Van Voorhies, W. A., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+cyclin+D/Cdk4+regulates+mitochondrial+biogenesis+and+aging+and+sensitizes+animals+to+hypoxic+stress.">Drosophila cyclin D/Cdk4 regulates mitochondrial biogenesis and aging and sensitizes animals to hypoxic stress.</a> Cell cycle. 11 (3), 554-568 (2012).</li><li>Tuttle, S., Muschel, R., Bernhard, E., McKenna, W. G., Biaglow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+ability+of+cells+overexpressing+MYC+proteins+to+reduce+peroxide+and+hydroperoxides.">Decreased ability of cells overexpressing MYC proteins to reduce peroxide and hydroperoxides.</a> Br J Cancer. 27, 140-144 (1996).</li><li>Ontko, J. A., Jackson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+the+rate+of+oxidation+of+fatty+acids+in+animal+tissues.+Effect+of+substrate+concentration,+pH,+and+coenzyme+a+in+rat+liver+preparations.">Factors affecting the rate of oxidation of fatty acids in animal tissues. Effect of substrate concentration, pH, and coenzyme a in rat liver preparations.</a> J Biol Chem. 239, 3674-3682 (1964).</li><li>Vincent, A., Briggs, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=parkin-induced+defects+in+neurophysiology+and+locomotion+are+generated+by+metabolic+dysfunction+and+not+oxidative+stress.">parkin-induced defects in neurophysiology and locomotion are generated by metabolic dysfunction and not oxidative stress.</a> Hum Mol Gen. 21 (8), 1760-1769 (2012).</li><li>Katz, J., Abraham, S., Hill, R., Chaikoff, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+occurrence+and+mechanism+of+the+hexose+monophosphate+shunt+in+rat+liver+slices.">The occurrence and mechanism of the hexose monophosphate shunt in rat liver slices.</a> J Biol Chem. 214 (2), 853-868 (1955).</li><li>Katz, J., Wood, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+glucose-C14+for+the+evaluation+of+the+pathways+of+glucose+metabolism.">The use of glucose-C14 for the evaluation of the pathways of glucose metabolism.</a> J Biol Chem. 235 (8), 2165-2177 (1960).</li><li>Piper, M. D. W., Blanc, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+holidic+medium+for+Drosophila+melanogaster.">A holidic medium for Drosophila melanogaster.</a> Nat methods. 11 (1), 100-105 (2014).</li><li>Sang, J. H., King, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+Requirements+of+Axenically+Cultured+Drosophila+Melanogaster+Adults.">Nutritional Requirements of Axenically Cultured Drosophila Melanogaster Adults.</a> J Exp Biol. , (1961).</li><li>Chernick, S. S., Chaikoff, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+and+hepatic+utilization+of+glucose+for+lipogenesis.">Insulin and hepatic utilization of glucose for lipogenesis.</a> J Biol Chem. 186 (2), 535-542 (1950).</li><li>Van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testing+the+"rate+of+living"+model:+further+evidence+that+longevity+and+metabolic+rate+are+not+inversely+correlated+in+Drosophila+melanogaster.">Testing the "rate of living" model: further evidence that longevity and metabolic rate are not inversely correlated in Drosophila melanogaster.</a> J Appl Phys. 97 (5), 1915-1922 (2004).</li></ol>

The author declares no competing financial interests.

Bu protokol, yetişkin Drosophila melanogaster spesifik radyo-etiketli substratlar oksidasyonunun ölçülmesi için bir yöntem tarif eder. Bu teknik, basit kantitatif, tekrarlanabilir ve hassas olduğunu ve bunun ATP üretimi için okside besin (ler) tanımlamak için kullanılabilir, çünkü toplam CO2 üretimi ve O 2 tüketimi ölçmek mevcut yöntemleri tamamlar. Burada tarif edilen yöntem kullanılarak, belirli radyo-etiketli substratlar oksidasyonu sonucunda serbest CO2 ölçümü toplam CO2 üretimini ölçmek teknikleri tamamlayıcıdır. Toplam CO2 üretimi (V CO2) ve toplam O 2 tüketimi (V O2) bilindiği zaman, metabolizma hızı hesaplanabilir ve oksidasyon yakıt kaynağı solunum değişim oranına göre tahmin edilebilir (V metabolizma hızı tahmin edilebilir CO2 / V O2 = RER). Ne zamankarbonhidratlar özel alt tabaka, rer = 1, ama yağ asitleri özel kaynak, YEK = 0.7, glikoz ve lipit oksidasyon reaksiyonlarının stokiyometri nedeniyle zaman. Drosophila 14 oksijen tüketimini ölçmek için ekipman yokluğunda, oksidatif yakıt kaynağı tespit edilemez. Etiketleme iz bir radyoaktif substrat veya başka miktarları ve radyoaktif olarak işaretlenmiş CO2 üretimi ölçüm oranları ile uçar tarafından Ancak, bir uyaranın sırasında veya etkileri ile ilgili farklı zaman noktalarında belirli bir alt tabakayı okside sineklerin yeteneği hakkında sonuçlar çıkarabiliriz yakıt oksidasyonu üzerindeki mutasyon verilen. Bu protokol kritik adımlar vardır. dökülmelerini ve araştırma alanlarının kirlenmesini önlemek için radyoaktif maddeleri kullanırken Birincisi, dikkatli olunmalıdır. Adımlarda 2.1 ve 3.4 sırasında sinekler anestezi İkincisi, deneyci uzun süreli CO 2 etkilerinden kaçınmak için hızlı bir şekilde çalışması gerekirmetabolizma ve davranışları üzerindeki poz. 20 sinek bir grup anestezi ve yeni bir şişeye ya da 20 saniye ya da daha az bir uçucu bölmesine aktarılabilir. Bir gıda flakon bir anestezi cihazının transfer olduğunda, şişe gıda yüzeyine yapışmış getting anestezi sinekler önlemek için, yan dinlenmiş olmalıdır. sinekler adım 2.2 olarak birkaç gün boyunca beslenen radyoaktif işaretli gıda olduğunda, deneyci sinekler dehidrasyon duyarlı gıda kurumasına olmadığını sigorta gerekir. beslenen veya aç karnına önce etiketleme, etiketin seçimi, etiketleme süresi uzunluğu, uçucu bölmesinde süre ve anestezi yöntemi, bu yöntem kullanıldığında sorun giderme ve değişikliğe tabi tutulabilir parametrelerdir. (- 3 saat 2) önceden açlık süresi tabi olmadıkça radyoaktif işaretli gıda önemli miktarlarda tüketmek olası değildir Birincisi, kısa etiketleme dönemlerine tabi sinekler. Etiket c İkincisi, seçimBir tek metabolik fenotipleri hakkında çizebilir sonuçları etkiler. Örneğin, d-radyo işaretli CO2 üretimi [1- 14C] -glükoz, sitrik asit döngüsü ve pentoz fosfat şant vasıtasıyla oksidasyon yansıtabilir D- radyo işaretli CO2 üretimi ise [6- 14C] -glükoz oksidasyon yansıtır sitrik asit döngüsü boyunca sadece 12,15,16. Temel bir amino asit 17,18 için bir radyo-etiketli izleyici ile sinekler besleme proteinlerden türetilen amino asitlerin oksidasyonu değerlendirmek için bir strateji olabilir. Son olarak, radyo işaretli glukoz ile uzun etiketleme süreleri de trigliseritler 19 ve hali hazırda piruvat ile interconverts alanin gibi amino asitler gibi moleküllerin diğer sınıflarına Bu ön-maddesinin dahil olma ihtimalini artırır. Bu moleküllerin 6, bu farklı sınıflara dahil radyoaktivite ölçümü ile değerlendirilebilir. Gerçekten de, sinekler ayrı kohortlar beslenebilir radAynı şekilde alt tabakaların iolabeled ve daha sonra, örneğin, koşullar 6 saklanır ve beslenen glikojen ve trigliserid kalır ve aç bırakılmış olan uçucu bölmesi deneyler ya da radyo-ölçümü için de kullanılır. Başka bir strateji radyoaktif işaretli diyet besin oksidasyonunu kendileri ve bu besinlerin değil depolama biçimlerini ortaya çıkarmak için muhtemel kısa etiketleme dönemlerini kullanmaktır. Üçüncü olarak, sinekler iki grup, ilk zaman belirli bir miktar üzerinden 14 CO 2 üretimi benzer oranları, ama çok farklı oranlarda sahip olabilmesi de mümkündür. Bu nedenle, sinek bölmesine harcamak uçar süreyi değişen fenotipik varyasyon değerlendirirken değiştirmek için önemli bir parametre olabilir. Son olarak, bu protokol CO 2 anestezi sinek pod cihazı içine sinekler koyarak kısa bir süre kullanımı için çağırır. CO 2 anestezi sinek pod deney boyunca metabolik fonksiyonu etkileyebilir mümkündür. Alternatif birpproach metabolizma hızı 20 etkilemez azot anestezi kullanmaktır. Yakıt oksidasyon ve metabolizma hızı gibi karmaşık bir sistemi ölçen herhangi tekniği ile olduğu gibi, burada anlatılan yöntem sınırlamaları vardır. Birincisi, alt tabakanın farklı başlangıç ​​miktarları ile testinin CO2 toplama safhasına girecek ve böylece radyoaktif işaretli gıda farklı miktarlarda tüketmek olabilir farklı gruplarda uçar ve mümkündür. Bu büyük örneklem büyüklüğü ile deney yaparak ve topluca sinekler beslenerek bir ölçüde kontrol edilebilir. benzer mavi renkli bağırsaklar radyoetiket tüketilen ve deney kovalamaca kısmına taşınabilirler kısa etiketleme süreler için, uçar. sinekler grupta geri kalan radyo-miktarı da deneyin sonunda ve besleme ve ilk takip süresinin sona ermesinden sonra sinekler ayrı gruplar halinde ölçülebilir. arasında ikinci, aktivite düzeylerisinek bakla sinek grupları farklı olabilir. Bu deneysel olarak belirlenen ve veri yorumlanırken dikkate alınması gerekecektir. Üçüncü olarak, bu teknik, toplam CO2 üretimi, belirli bir beslenme besin veya besin depolama form (lar) sadece üretimini ölçmek değildir. Bu protokol için bir yedek değil ama farklı ve ek bilgi sağlar, çünkü yerine VCO 2 ölçümlerine tamamlayıcıdır. Burada tarif edilen yöntem, belirli bir metabolik maddelerin eser miktarlarda oksidasyon ürünü olan, radyo-etiketli CO2 nefes verme ölçer. glikoz, yağ asitleri, ya da amino asit - - kullanılan etiket değiştirerek tarafından böyle bir açlık olarak ve farklı genetik geçmişleri farklı fizyolojik koşullar altında metabolizma farklı yüzeylerde katkılarını değerlendirmek için giderek sofistike deneyler tasarlayabilirsiniz. Bu tekniğin gelecekte uygulamaları metabolis ölçülmesini içerirgelişme larva ve pupa aşamaları sırasıyla besin depolama ve arıza, aşırı ile karakterize edilir Drosophila yaşam döngüsü, iki kademeli m.

Model organizma Drosophila melanogaster çalışma genetik ilkeleri, gelişim süreçleri, büyüme, yaşlanma, davranış, bağışıklık ve insan hastalığı 1,2 anlaşılmasına büyük katkıda bulunmuştur. Drosophila genetik ve hücre biyolojik yaklaşımlar sayısız Bu alanlarda ilerleme sürdü. Bununla birlikte, meyve sineği metabolizma çalışması, daha yavaş gelişmiş bir küçük bir hayvan metabolik parametreleri ölçmek zorluklara büyük oranda yer alır. Diyabet gibi insan hastalıklarının araştırılmasında bir model olarak Drosophila kullanarak büyüme ve çeşitli patolojiler için metabolizma katkıları anlamak için ilgi geliştirmek ve bu organizma 3,4 metabolik teknikleri adapte alan itti. Güvenilir yöntemler artık meyve sineğinin metabolik parametrelerin bir dizi ölçümü için kullanılabilir. Örneğin, gıda alımını değerlendirmek basittir <s&gt; 5 kadar, depolanan trigliseridler ve glikojen, hem de glikoz dolaşımdaki hemolimf düzeyleri ve glukoz 4 iki molekül oluşan bir disakkarittir sinek, trehaloz, büyük sirkülasyon şeker seviyeleri. Metabolik izleyiciler kullanılması gibi depolama formları glikojen ve trigliserid 6 glukoz gibi diyet ve emilen besinlerin dönüşümünden besin emilimi çalışma sağladı. Metabolik oranları meyve oksijen tüketimi 7,8 ve karbondioksit ölçümü üzerinden uçmak (CO 2) üretiminde değerlendirilebilir. sitrik asit döngüsü, diyet ve depolanmış karbonhidrat ve yağ asitlerinin metabolizması türetilir asetil koenzim A (CoA) gibi döngüsü girebilir iki karbon birimleri okside eder. Döngüsünün her turlu bir GTP (veya ATP) her molekülü ve elektron donör FADH 2, NADH üç molekülleri ve atık ürün CO 2 iki molekülleri üretir. CO 2 üretimi canBazal metabolizma hızı tahmin etmek için kullanılabilir. Toplam CO2 üretimi ticari olarak temin edilebilen ya da el yapımı respirometers 9-10,11 kullanımı yoluyla Drosophila belirlenebilir. Özellikle O 2 tüketimi ölçümü ile birleştiğinde, toplam CO2 üretiminin ölçümü, tüm vücut enerji metabolizmasında değerli bilgiler sağlar. Bununla birlikte, besin tanımlamaz bu önlem adenosin trifosfat (ATP) üretilmesi için oksitlenmektedir. karbonhidratlar, yağlı asitler ve proteinler: besin maddelerinin üç önemli sınıfı asetil CoA sitrik asit döngüsü, aşağıdaki dönüştürme girebilir. Glukoz-6-fosfat, diyet glukoz veya depolanan glikojen türetilen, asetil CoA oluşturur piruvat dehidrojenaz ile dekarboksile edilir piruvata dönüştürülebilir. daha sonra sitrik asit döngüsü girer asetil CoA SS-oksidasyon verimleri ile diyet veya hafızaya trigliseridlerden türetilen yağ asitlerinin dağılımı. En sonundaAmino asitlerin bir kısmı alfa-ketoglutarat CoA ya ​​da sitrik asit döngüsü ara-asetil, piruvata dönüşümü takip sitrik asit döngüsü girebilir. bazal ve uyarılmış koşullarında enerji metabolizması Besin özel katkı radyoaktif izleyiciler kullanılarak izlenebilir. Burada sunulan protokol kültür 12,13 yetiştirilen hücrelerde oksidasyon değerlendirmek için kullanılan bir protokol Drosophila kullanım için uyarlanmıştır. Bu yaklaşımda, meyve sinekleri beslenen 14C-radyo işaretli metabolik substratlar (karbonhidratlar, yağlı asitler ya da amino asit) kısa bir süre (saat) diyet ya da uzun süre (gün) darbe, etiketlenmemiş gıda takip ve sonra maruz bırakılmıştır odası bikarbonat gibi solunan CO2 yakalama için potasyum hidroksit (KOH) -saturated filtre kağıdı ihtiva etmektedir. Radyo-işaretli bikarbonat sintilasyon sayımı ile tayin edilebilir. Deney arasındaki radyo etiketli-CO2 üretimi farklılıklarsinekler ark grupları, örneğin genotip arasındaki yakıt metabolizmasında uzun bir hızlı veya içsel farkları boyunca ATP üretimi için farklı yakıt kullanımını yansıtabilir.

<table><tbody><tr><td>PALMITIC ACID, [1-14C]-, 50 &amp;micro;Ci</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC075H050UC</td><td></td></tr><tr><td>GLUCOSE, D-[6-14C]-, 50 &amp;micro;Ci</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC045X050UC</td><td></td></tr><tr><td>Glucose, D-[1-14C]-, 50&amp;micro;Ci</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC043X050UC</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila Vials, Narrow, Polystyrene</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-116</td><td></td></tr><tr><td>Round-Bottom Polypropylene Tubes, 12 x 75 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959AA</td><td></td></tr><tr><td>Mesh, nitex nylon, 120 &amp;micro;m</td><td>Genesee Scientific</td><td>57-102</td><td></td></tr><tr><td>20 ml borosilicate glass scintillation vials</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-15</td><td></td></tr><tr><td>Flask top stopper with off-center hole</td><td>Fisher Scientific</td><td>K882310-0000</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylene center well</td><td>Fisher Scientific</td><td>K882320-0000</td><td></td></tr><tr><td>Whatman GF/B glass microfiber filter paper, circle, 2.1cm diameter</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-874-20</td><td></td></tr><tr><td>Ecoscint A</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-273</td><td></td></tr><tr><td>6 ml Scintillation Vials with Push-On/Twist-Off Caps</td><td>National Diagnostics</td><td>SVC-06</td><td></td></tr></tbody></table>

measurement of carbon dioxide production from radiolabeled substrates in drosophila melanogaster

Drosophila genetiği gücü giderek hormon sinyalizasyon ve metabolizma soruların ve bu organizmanın insan hastalık modellerinin geliştirilmesi için uygulanmaktadır. Böyle metabolik oranları gibi parametrelerin ölçümleri için hassas metotlar, meyve sineği gibi küçük hayvanlarda fizyoloji ve hastalığın daha iyi anlaşılmasını götürmek için gereklidir. Burada anlatılan yöntem, glikoz veya yağ asidi olarak 14 C-etiketli yüzeylerde eser miktarda içeren yiyecekleri beslenen yetişkin sineklerin az sayıda yakıt oksidasyonu değerlendirir. Besleme süresi ve herhangi bir ek deneysel manipülasyon sonra, sineklerin, radyo-etiketli CO2 potasyum bikarbonat gibi radyo-etiketli substratlar oksidasyonu sonucunda elde sonra trans nefes verme KOH doymuş filtre kağıdı içeren cam şişelere yerleştirilir mesh başlıklı kısa tüpler aktarılır KHCO 3. Bu radyo-etiketli bikarbonat, sintilasyon sayımı ile ölçülür. Bu aq olduğunuYakıt oksidasyon çalışmaları için, uantitative tekrarlanabilir ve basit bir yaklaşım. Radyo-etiketli glükoz, yağlı asitlerin ya da amino asitlerin kullanılması, besleme ve aç kalma gibi, farklı genetik geçmişlerde, farklı koşullar altında bir enerji metabolizması için bu farklı yakıt kaynaklarının katkı belirlenmesini sağlar. Bu in vivo enerji metabolizmasında ölçmek için kullanılan diğer yaklaşımları tamamlamaktadır ve metabolik regülasyon anlayışı ilerletmek gerekir.

Bir radyoaktif substrat metabolizmasında üretilen nefesle ve tuzak radyoaktif işaretli CO2 miktarı bir sinek bölmesinde sineklerin sayısı yanı sıra hayvanlar CO2 toplama aparatı geçirdikleri zamanın miktarı ile ilişkili olmalıdır. Bunu test etmek için, 18 saat aç bırakıldı gerçekleştirilen 2 st için radyo-etiketli palmitik asit (0.02 uCi / ul Gıda) beslenir ve daha sonra 3 veya 6 saat inkubasyon için 12 ya da 25 hayvan gruplarında radyo işaretli CO2 üretimi için test edildi. 25 sinekler tarafından üretilen CO 2 miktarının 12 sinekler tarafından üretilen neredeyse iki katı miktarı oldu, ve her bir grup için miktar inkübasyon süresi 6 saat (Şekil 2A) 3 saat çıkarılmıştır zaman ikiye katlandı. Pmol 14 CO 2 / sinek / saat her grupta neredeyse eşdeğer oldu. Oruç ß o tarafından yağ asitlerinin parçalanmasını uyarırxidation; Bu nedenle, yağ asidi oksidasyon CO2 üretimi beslenen hayvanlara kıyasla aç bırakılmış olan hayvanlarda yüksek olmalıdır. Bu durumda olup olmadığını belirlemek için, 18-saat gerçekleştirilen 2 st için radyo-etiketli palmitik asit beslenmiştir aç. Bu kısa besleme puls sonrasında sinekleri, iki gruba ayrıldı ve 3 saat etiketlenmemiş sinek yiyecek ya da% 1 agar aktarılır ve daha sonra 2 saat boyunca bölmeleri kalkan aktarılır. Iki ayrı deneylerde, ß oksitleme aç bırakılmış hayvanlarda artmıştır gösteren gıda (Şekil 2B) üzerindeki takip sinekler kıyasla agar üretilen önemli ölçüde daha radyo-etiketli CO 2 takip sinekler. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54045/54045fig1.jpg" /> Şekil 1. Ekshale Toplama için cihaz, Radyoaktif CO 2. radyoaktif işaretli metabolik substratlar tüketilen Sinekler vardırBir &quot;sinek pod&quot; (FP), örgü (M) ile şapkalı bir kesim santrifüj tüpü içine yerleştirilmiş. Uçucu bölmesi 100 ul, doymuş GF / B filtre kağıdı içeren bir merkez de (CW) yerleştirilmesi yoluyla grimsi merkez deliği içeren bir lastik En durdurucu, (S), bir 20 ml&#39;lik bir cam sintilasyon şişesi içine yerleştirilir ve kapatılmış olan % 5 KOH. Nefes verme CO2 KOH ile reaksiyona girer ve bikarbonat gibi filtre kağıdı üzerinde tutulur. Trapped, radyoaktif işaretli CO2 doymuş filtre kağıdının sintilasyon sayımı ile tayin edilebilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54045/54045fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54045/54045fig2.jpg" /> Şekil 2. Zaman ile 14 CO 2 Üretim İlişkileri ve içinde Sineklerin sayısıFed ve oruç Koşullarına Fly Pod ve Tepki. (A), radyo etiketli palmitat beslenen sinekler üretilen 14 CO 2 miktarı (n = 12 (açık çubuklar) ya da 25 (kapalı barlar)) bir sinek bölmesine geçirdi ve zaman (3 veya 6 saat test edilen sineklerin sayısı ile ilişkilidir ). Başına sinek temelinde, sinekler 0.99, 1.13, 1.10 ve 1.01 pmol 14 CO 2 / hr (grafik veri olarak doğru sıralamayla aynı sol listelenen veriler) üretti. (B) gıda kovaladı sinekler daha palmitat daha radyoaktif işaretli okside agarda kovalanan Sinekler. Veriler, iki deneyden ve standart sapma olarak rapor edilir, n = 16-17 sinekler / grup (deney 1); n = 10 sinekler / grup (deney 2). * P = 0.017, Student t-testi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54045/54045fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster at JoVE.com

Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster

This paper describes a method for the measurement of fuel oxidation in Drosophila melanogaster in which trace amounts of specific radiolabeled metabolic substrates are fed to flies. The exhaled radiolabeled CO2 that is a produced from fuel oxidation is collected and measured.

Radyoaktif Yüzeyler Karbon Dioksit Üretimi ölçümü<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The power of Drosophila genetics is increasingly being applied to questions of hormone signaling and metabolism and to the development of models of human ...

measurement-carbon-dioxide-production-from-radiolabeled-substrates

Research

JoVE Journal

Biology

Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster

9.1K Görüntüleme.  University of Virginia. This paper describes a method for the measurement of fuel oxidation in Drosophila melanogaster in which trace amounts of specific radiolabeled metabolic substrates are fed to flies. The exhaled radiolabeled CO2 that is a produced from fuel oxidation is collected and measured.

Video: Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Drosophila melanogaster Larvaların MSS diseksiyonu

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Biyoloji

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human organs, possess highly conserved metabolic pathways and have a relatively short lifespan that allows the study of different fundamental mechanisms in a short period of time. It is, however, surprising that one of the mechanisms essential for cellular metabolism, the mitochondrial respiration, has not been thoroughly investigated in this model. It is likely because the measure of the mitochondrial respiration in Drosophila usually requires a very large number of individuals and the results obtained are not highly reproducible. Here, a method allowing the precise measurement of mitochondrial oxygen consumption using minimal amounts of tissue from Drosophila is described. In this method, the thoraxes are dissected and permeabilized both mechanically with sharp forceps and chemically with saponin, allowing different compounds to cross the cell membrane and modulate the mitochondrial respiration. After permeabilization, a protocol is performed to evaluate the capacity of the different complexes of the electron transport system (ETS) to oxidize different substrates, as well as their response to an uncoupler and to several inhibitors. This method presents many advantages compared to methods using mitochondrial isolations, as it is more physiologically relevant because the mitochondria are still interacting with the other cellular components and the mitochondrial morphology is conserved. Moreover, sample preparations are faster, and the results obtained are highly reproducible. By combining the advantages of Drosophila as a model for the study of metabolism with the evaluation of mitochondrial respiration, important new insights can be unveiled, especially when the flies are experiencing different environmental or pathophysiological conditions.

In this paper, a method to measure oxygen consumption using high-resolution respirometry in permeabilized thoraxes of Drosophila is described. This technique requires a minimal amount of tissue compared to the classic mitochondrial isolation technique and the results obtained are more physiologically relevant.

Doku çok az miktarda kullanarak Drosophila Permeabilized liflerinin mitokondrial oksijen harcama ölçme noktalar

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

Biyokimya

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

Yetişkin Drosophila melanogaster Locomotion Yüksek Çözünürlüklü Video Takip

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained and restrained whole larvae. For direct control of the environment around the heart another approach utilizes the dissected larvae and removal of the internal organs in order to bathe the heart in desired compounds. The exposed heart also allows membrane potentials to be monitored which can give insight of the ionic currents generated by the myocytes and for electrical conduction along the heart tube. These approaches have various advantages and disadvantages for future experiments that are discussed. The larval heart preparation provides an additional model besides the Drosophila skeletal NMJ to investigate the role of intracellular calcium regulation on cellular function. Learning more about the underlying ionic currents that shape the action potentials in myocytes in various species, one can hope to get a handle on the known ionic dysfunctions associated to specific genes responsible for various diseases in mammals.

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various ways to monitor heart function in the larva of Drosophila for assessing questions dealing with the function of gap junctions, ion channel mutations, modulation of pacemaker activity and pharmacological studies.

Larvaların olarak izlenmesi Kalp Fonksiyonu Drosophila melanogaster Fizyolojik Çalışmaları

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Uygulamalarda Canlı Görüntüleme Drosophila melanogaster Embriyonik Hemocyte Göçler

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides protection against desiccation and other environmental challenges. Several of these cuticular hydrocarbon (CHC) compounds also function as semiochemical signals, and as such mediate pheromonal communications between members of the same species, or in some instances between different species, and influence behavior. Specialized cells referred to as oenocytes are regarded as the primary site for CHC synthesis. However, relatively little is known regarding the involvement of the oenocytes in the regulation of the biosynthetic, transport, and deposition pathways contributing to CHC output. Given the significant role that CHCs play in several aspects of insect biology, including chemical communication, desiccation resistance, and immunity, it is important to gain a greater understanding of the molecular and genetic regulation of CHC production within these specialized cells. The adult oenocytes of D. melanogaster are located within the abdominal integument, and are metamerically arrayed in ribbon-like clusters radiating along the inner cuticular surface of each abdominal segment. In this video article we demonstrate a dissection technique used for the preparation of oenocytes from adult D. melanogaster. Specifically, we provide a detailed step-by-step demonstration of (1) how to fillet prepare an adult Drosophila abdomen, (2) how to identify the oenocytes and discern them from other tissues, and (3) how to remove intact oenocyte clusters from the abdominal integument. A brief experimental illustration of how this preparation can be used to examine the expression of genes involved in hydrocarbon synthesis is included. The dissected preparation demonstrated herein will allow for the detailed molecular and genetic analysis of oenocyte function in the adult fruit fly.

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In insects, the oenocytes produce cuticular hydrocarbon compounds. These compounds protect against desiccation and facilitate chemical communication. Here we demonstrate a dissection technique used to isolate the oenocytes from adult Drosophila melanogaster, and illustrate how this preparation can be utilized to study genes involved in hydrocarbon synthesis.

Yetişkin gelen Oenocytes diseksiyonu Drosophila melanogaster</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

İzolasyonu Drosophila melanogaster Testisler

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

Drosophila melanogaster Larval ve yetişkin beyin metabolik Analizi

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

Nörobilim

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

Metabolik Oranı Ölçümü<em&gt; Drosophila</em&gt; Respirometrik kullanarak

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Drosophila için Mikrorespirometrinin Uyarlanması - CASK Mutant Metabolizmasına İlişkin Görüşler

Measuring O2 Consumption in Drosophila melanogaster Using Coulometric Microrespirometry

Coulometric microrespirometry is a straightforward, inexpensive method for measuring the O2 consumption of small organisms while maintaining a stable environment. A coulometric microrespirometer consists of an airtight chamber in which O2 is consumed and the CO2 produced by the organism is removed by an absorbent medium. The resulting pressure decrease triggers electrolytic O2 production, and the amount of O2 produced is measured by recording the amount of charge used to generate it. In the present study, the method has been adapted to Drosophila melanogaster tested in small groups, with the sensitivity of the apparatus and the environmental conditions optimized for high stability. The amount of O2 consumed by wildtype flies in this apparatus is consistent with that measured by previous studies. Mass-specific O2 consumption by CASK mutants, which are smaller and known to be less active, was not different from congenic controls. However, the small size of CASK mutants resulted in a significant reduction in O2 consumption on a per-fly basis. Therefore, the microrespirometer is capable of measuring O2 consumption in D. melanogaster, can distinguish modest differences between genotypes, and adds a versatile tool for measuring metabolic rates.

Yazar Spot Işığı: Sıcaklığın Drosophila melanogaster ve Çöle Adapte Böcekler Üzerindeki Etkisi 

Coulometric respirometry is ideal for measuring the metabolic rate of small organisms. When adapted for Drosophila melanogaster in the present study, measured O2 consumption was within the range reported for wildtype D. melanogaster by previous studies. Per-fly O2 consumption by CASK mutants, which are smaller and less active, was significantly lower than the wildtype.

Kulometrik Mikrorespirometri Kullanılarak Drosophila melanogaster'de O2 Tüketiminin Ölçülmesi

Coulometric microrespirometry is a straightforward, inexpensive method for measuring the O2 consumption of small organisms while maintaining a stable ...

Radyoaktif Yüzeyler Karbon Dioksit Üretimi ölçümü

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler