Name: imaging cleared embryonic and postnatal hearts at single-cell resolution
Uploaded: 2016-10-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution at JoVE.com

We thank M.W. laboratory members for scientific discussion. This work is supported by AHA [13SDG16920099] to M.W., and by National Heart, Lung, and Blood Institute grants [R01HL121700] to M.W. Images were captured in the Imaging Core Facility at the Albany Medical College.

כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש (IACUC) Albany Medical College וביצע בהתאם למדריך NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. 1. הכנות פתרון הערה: 15 Rosa26Cre ERT2, R26R-קונפטי 16, αMHC-Cre 17, ו Rosa26-mTmG (mTmG) 20 קווי עכבר נרכשו מסחרית cTnT-Cre 18 היה מתנה ד&quot;ר ג&#39;יאו באוניברסיטת אלבמה Nfatc1-Cre.. היה מתנה ד&quot;ר בן ג&#39;ואו בבית אלברט איינשטיין קולג &#39;לרפואה 19. עכברים היו מורדמים משאיפת פחמן דו חמצני בתא סגור במשך 60 שניות לפחות ואחריו באמצעים פיזיים של אימות למוות על ידי פתיחת בית החזה בין שתי המדינות, עריפת ראש או נקע בצוואר הרחם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן טמוקסיפן. ממיסים 10 מ&quot;ג טמוקסיפן ב 10 מ&quot;ל של אוי זרעי חמניותl. ברגע שזה נמס לגמרי, aliquot ולאחסן ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן פוספט בופר (PBS). ממיסים 4 Na 2 HPO (1.41960 גרם), KH 2 PO 4 (0.24496 גרם), NaCl (8.0669 גרם) ו KCl (0.20129 גרם) ב 1 ליטר של מים מזוקקים ולהתאים את ה- pH ל -7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן PBST: 0.1% פתרון Tween-20 ב PBS על ידי המסת 100 μl של Tween-20 ב 100 מ&quot;ל של PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן חיץ חסימה. הפוך אלבומין 3% שור (BSA) פתרון חסימת ידי המסת 3 גרם של BSA ב 100 מ&quot;ל של PBST המכיל 0.2% Tween-20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן-1 מעוקב (מגיב 1). מערבבים 25% WT אוריאה, 25% WT N, N, N &#39;, N&#39;-tetrakis (2-Hydroxypropyl) ethylenediamine ו -15% WT טריטון X-100 ב DH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן-2 מעוקבים (מגיב 2). מערבבים 50% WT סוכרוז, 25% WT אוריאה, 10% WT 2, 2 &#39;, 2&#39; &#39;- nitrilotriethanol ו -0.1% (v / v) טריטון X-100 ב DH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן Sca le A2: 4 אוריאה M, 10% w / גליצרול נ ו -0.1% w / v טריטון X-100 ב DH 2 O. התאם את ה- pH ל -7.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן B4 Sca le: 8 אוריאה ז ו -0.1% w / v טריטון X-100 ב DH 2 O. התאם את ה- pH ל -8.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן Sca le 70: 4 אוריאה M, 70% w / גליצרול נ ו -0.1% w / v טריטון X-100 ב DH 2 O. </li></ol> 2. טמוקסיפן אינדוקציה, בידוד העובר קיבוע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טמוקסיפן אינדוקציה בידוד העובר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות פרוטוקול שאושר על צינורית הזנה מעוקלת (ACUP 13-12,007), gavage עכברי R26Cre ERT2 קונפטי הנקבה (פקוק על ידי עכברי זכרי R26Cre ERT2) עם 10 מיקרוגרם / g של טמוקסיפן ביום התפתחות עוברי E7.75 33. ביום העוברי 9.5 (E9.5) או E10.5, להרדים את העכברות עם CO 2 ו נקע בצוואר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר וידוא הריגה העכבר (ראה סעיף 1 הערה), לפתוח את חלל הבטן העכבר עם מספריים לנתח את קרן הרחם, להסיר את שכבות צינור הרחם בעזרת מספריים פינצטה, מחדשלחכור את העוברים מן 23,24 צינור הרחם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את העוברים על צלחת פטרי המכילה PBS (pH 7.4). תחת המיקרוסקופ לנתח, להסיר את השכבות הלא-עובריים (סיסית, שק החלמון ואת amnion) בעזרת פינצטה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פינצטה ומספריים, לאסוף את הזנב העכבר העובר נקבה דגימות עבור genotyping כפי שדווח בעבר 22. בעזרת פיפטה פלסטיק, להעביר את כל העובר אל באר צלחת 48 היטב המכיל 1 מ&quot;ל של 1x PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, לזהות את ה- GFP / RFP / עובר חיוב CFP באמצעות מיקרוסקופ הפוכה עם מצלמה. קלף את קרום הלב באמצעות פינצטה לסובב את העובר בלב / בעזרת פינצטה מעוקלת כדי לקבוע את מספר שיבוטי ניאון משני צידי הלב עם מסנני GFP / RFP / CFP. שום חתכים נדרשים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר זיהוי GFP / RFP / עובר חיוב CFP, ובמהירות לשטוף את העוברים פעמים (2 דקות כל אחד) עם PBS 1x ב הדואר 48 היטב צלחת על שייקר צלחת בטמפרטורת החדר (RT). פעולה זו תסיר דם עודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן בלב העובר / העוברי באמצעות paraformaldehyde 4% (PFA) ב RT. השעה קיבעון תלוי בגודל גיל רקמה עוברית. לקבלת E9.5 לתקן את העובר עבור שעה 2 ב RT. עובר בשלב העוברי מאוחר דורש זמן קיבעון יותר, אשר יכול גם להיות ממושך עד 24 שעות עבור לב לאחר לידה. זהירות: Paraformaldehyde רעיל, להימנע ממגע עם עור, עיני קרום רירי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קיבוע, לשטוף את העובר / לב ב -48 ההצלחה היטב פעמים (10 דקות כל אחד) עם PBS 1x על שייקר צלחת ב RT. פעולה זו מסירה את PFA עודף מעובר / הלב. עובר אז הם עיבוד נוסף עבור מכתים הר שלם וסליקת רקמות. </li></ol> 3. הר שלם מכתים הערה: לאחר קיבוע PFA העובר / הלב נתונה הר שלם מכתים כדלקמן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilize העובר / הלב בצלחת היטב 48 באמצעות 1 מ &#39;l של PBST 0.1% עבור 2 שעות על שייקר צלחת ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות permeabilization, לטבול את העובר / לב ב 1 מ&quot;ל של חיץ חסימת עבור 2 שעות או למשך הלילה על שייקר צלחת ב 4 ºC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את העובר / הלב אל PECAM נוגדנים ספציפיים תא האנדותל (CD31), מדולל (1: 100) ב 0.3 מ&quot;ל חסימת חיץ במשך 48 שעות על צלחת שייקר ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את העובר / הלב באמצעות PBST 5 פעמים, 30 דקות כל אחד ב RT על שייקר צלחת. פעולה זו מסירה את הנוגדן הראשוני כבול הלא ספציפית עודף מן הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את העובר / לב אלקסה פלואוריד 647 נוגדנים משני אנטי עכברוש עיזים, מדולל (1: 1,000) ב 1 מ&quot;ל חיץ חסימת במשך 48 שעות על צלחת שייקר ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 3.4 לשטוף את הנוגדנים משני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוסט לתקן את העובר / הלב עם 4% PFA עבור שעה 1 ב RT על שייקר צלחת ולשטוף פעמיים עם דק PBS 5 כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכתם העובר / לב עם גרעיני כתם 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (מדולל PBST בכל concentמנה של 0.01 מ&quot;ג / מ&quot;ל) במשך 10 דקות על שייקר צלחת ב RT. עקוב עם שני שוטף PBS 5 דקות כל אחד. </li></ol> 4. עובר / ניקוי לב עם Sca l e או שיטה מעוקבת הערה: לאחר מכתים הר שלם, העובר / לב נתונה גם את Sca le או שיטת סליקת רקמות מעוקבת. בחירת השיטה תלוי בגודל הרקמה וגיל עוברי. עבור E11.5 או קודם לכן עוברים גיל, שימוש Sca שיטת הסליקה l e רקמות, בעוד עוברי מבוגרים או לבבות לאחר הלידה שיטת הסליקה רקמות מעוקב הוא העדיף. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמות סולם שיטת הסליקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה העובר / לב עם 1 מ&quot;ל של תמיסת A2 דואר Sca l בבקבוקון נצנץ (עטוף בנייר כסף) עם רעד עדין מדי פעם (ביד) במשך 48 שעות ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר Sca הדגירה l e A2, דגירה העובר / לב עם 1 מ&quot;ל של תמיסת B4 דואר Sca l ב 4 ° C באותו בקבוקון עם רעד עדין מדי פעם עבור anot48 השעות שלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה העובר / הלב במשך 48 אחר שעה עם e 1 מ&quot;ל Sca l 70 ב 4 ° C עם רעד עדין מדי פעם. העובר הר באמצעות גליצרול 90% (ראה סעיף 5.1). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמות מעוקב שיטת הסליקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסליקה מעוקב עובר / בלב שלם, לטבול כל עובר / לב ב 1 מיליליטר של מעוקב-1 עם רעד עדין מדי פעם במשך 48 שעות ב 37 ºC 7. לאחר 48 שעות, להחליף את פתרון עם נפח זהה של מגיב מעוקב טרי 1, ו דגירה המדגם עבור 48 שעות נוספות על 37 מעלות צלזיוס עם רעד מדי פעם עם היד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את העובר בלב / מטופלים מעוקב-1 עם זמני 1x PBS כמה בטמפרטורת החדר עם רעד עדין עם היד. פעולה זו מסירה את הפתרון מעוקב-1 עודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השטיפה החוצה מעוקב-1 עם PBS, לטבול את העוברים / לבבות בתמיסה מעוקבת-2 (1 גרם לכל עובר / לב) למשך 48 שעות ב 37 ºC עם רעד עדין מדי פעם עם יד. זאת בעקבות עובר / לב גובר באמצעות גליצרול (ראה סעיף 5.2). </li></ol></li></ol> שמה והדמיה לדוגמא 5. הערה: עוברים או איברים שנסלקו Sca l e 70 או מעוקב-2 פתרון ניתן הדמיה ישירות עם סולם 70 ו מעוקב-2 פתרון כמדיום הדמיה, בהתאמה. עם זאת, בהתחשב בפגיעות של דגימות עובריות ריאגנטים סליקה, אם הדגימות הן לא להיות צלמו מייד, אבל מאוחסנות לטווח ארוך, לאחסן דגימות גליצרול 90% בעקבות הפרוטוקול להלן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ישירות לטבול את Sca le פינה מדגם ב 1 מ&quot;ל של גליצרול ולאחסן 90% ב 4 ° C עד הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את המדגם מעוקב שטופלו 1x PBS פעמיים, 5 דקות כל אחד ברצף דגירה המדגם עם 1 מ&quot;ל של 30%, 50%, 70% ו פתרון גליצרול 90% כל אחת למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הדמיה, להעביר את המדגם כדי צלחת תחתית זכוכית פטרי עם כמות מינימלית של שיבוטים גליצרול ותמונה 90% עם מיקרוסקופ confocal מצויד בשתי יכולות פוטון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה בלב או העובר גליצרול עם 10X / 0.3 NA, טבילה 25x / 0.8 NA, או עדשה אובייקטיבי מתקנת מים 40X / 1.2 NA. תמונה DAPI באמצעות עירור 2-פוטון מתוך טיטניום קוהרנטית: לייזר זיקית ספיר. הבחירה של המיקרוסקופ עדשה אובייקטיבית תהיה תלויה לצורך הניסויים, למשל עבור סופר-רזולוציה, מיקרוסקופ פלואורסצנטי אור גיליון יכול להיות מנוצל. </li></ol>

<ol>
	<li>Vincent, S. D., Buckingham, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+a+heart:+the+origin+and+regulation+of+cardiac+progenitor+cells.">How to make a heart: the origin and regulation of cardiac progenitor cells.</a> Curr Top Dev Biol. 90, 1-41 (2010).</li><li>Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+discoveries+in+cardiac+biology.">A decade of discoveries in cardiac biology.</a> Nat Med. 10, 467-474 (2004).</li><li>Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulatory+networks+in+the+evolution+and+development+of+the+heart.">Gene regulatory networks in the evolution and development of the heart.</a> Science. 313, 1922-1927 (2006).</li><li>Bruneau, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+genetics+of+congenital+heart+disease.">The developmental genetics of congenital heart disease.</a> Nature. 451, 943-948 (2008).</li><li>Mohun, T. J., Weninger, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embedding+embryos+for+high-resolution+episcopic+microscopy+(HREM).">Embedding embryos for high-resolution episcopic microscopy (HREM).</a> Cold Spring Harb Protoc. , 678-680 (2012).</li><li>Soufan, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+gene+expression+patterns+during+cardiac+development.">Three-dimensional reconstruction of gene expression patterns during cardiac development.</a> Physiol Genomics. 13, 187-195 (2003).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+Tissue+Clearing.">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162, 246-257 (2015).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis.">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157, 726-739 (2014).</li><li>Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+clearing+and+dehydration+of+GFP+expressing+mouse+brains.">Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains.</a> PLoS One. 7, e33916 (2012).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).</li><li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing.">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158, 945-958 (2014).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li><li>Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+noninvasive+genetic/pharmacologic+strategy+for+visualizing+cell+morphology+and+clonal+relationships+in+the+mouse.">A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse.</a> J Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).</li><li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450, 56-62 (2007).</li><li>Agah, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+recombination+in+postmitotic+cells.+Targeted+expression+of+Cre+recombinase+provokes+cardiac-restricted,+site-specific+rearrangement+in+adult+ventricular+muscle+in+vivo.">Gene recombination in postmitotic cells. Targeted expression of Cre recombinase provokes cardiac-restricted, site-specific rearrangement in adult ventricular muscle in vivo.</a> J Clin Invest. 100, 169-179 (1997).</li><li>Jiao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+role+of+Bmp4+in+the+atrioventricular+septation+of+the+mouse+heart.">An essential role of Bmp4 in the atrioventricular septation of the mouse heart.</a> Genes Dev. 17, 2362-2367 (2003).</li><li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+cells+form+the+coronary+arteries+by+angiogenesis+through+myocardial-endocardial+VEGF+signaling.">Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling.</a> Cell. 151, 1083-1096 (2012).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li><li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardial+spindle+orientation+controls+cell+entry+into+the+myocardium.">Epicardial spindle orientation controls cell entry into the myocardium.</a> Dev Cell. 19, 114-125 (2010).</li><li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numb+family+proteins+are+essential+for+cardiac+morphogenesis+and+progenitor+differentiation.">Numb family proteins are essential for cardiac morphogenesis and progenitor differentiation.</a> Development. 141, 281-295 (2014).</li><li>Kaufman, M. H., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The atlas of mouse development. , (1992).</li><li>Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual. , (2003).</li><li>Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+the+mammalian+heart+from+two+sources+of+myocardial+cells.">Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells.</a> Nat Rev Genet. 6, 826-835 (2005).</li><li>Kelly, R. G., Buckingham, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anterior+heart-forming+field:+voyage+to+the+arterial+pole+of+the+heart.">The anterior heart-forming field: voyage to the arterial pole of the heart.</a> Trends Genet. 18, 210-216 (2002).</li><li>Verzi, M. P., McCulley, D. J., De Val, S., Dodou, E., Black, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+right+ventricle,+outflow+tract,+and+ventricular+septum+comprise+a+restricted+expression+domain+within+the+secondary/anterior+heart+field.">The right ventricle, outflow tract, and ventricular septum comprise a restricted expression domain within the secondary/anterior heart field.</a> Dev Biol. 287, 134-145 (2005).</li><li>Ward, C., Stadt, H., Hutson, M., Kirby, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+the+secondary+heart+field+leads+to+tetralogy+of+Fallot+and+pulmonary+atresia.">Ablation of the secondary heart field leads to tetralogy of Fallot and pulmonary atresia.</a> Dev Biol. 284, 72-83 (2005).</li><li>Echelard, Y., Vassileva, G., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cis-acting+regulatory+sequences+governing+Wnt-1+expression+in+the+developing+mouse+CNS.">Cis-acting regulatory sequences governing Wnt-1 expression in the developing mouse CNS.</a> Development. 120, 2213-2224 (1994).</li><li>Jiang, X., Rowitch, D. H., Soriano, P., McMahon, A. P., Sucov, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+of+the+mammalian+cardiac+neural.">Fate of the mammalian cardiac neural.</a> Developement. 127, 1607-1616 (2000).</li><li>Viragh, S., Challice, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+the+epicardium+and+the+embryonic+myocardial+circulation+in+the+mouse.">The origin of the epicardium and the embryonic myocardial circulation in the mouse.</a> Anat Rec. 201, 157-168 (1981).</li><li>Wu, M., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numb+family+proteins:+novel+players+in+cardiac+morphogenesis+and+cardiac+progenitor+cell+differentiation.">Numb family proteins: novel players in cardiac morphogenesis and cardiac progenitor cell differentiation.</a> Biomolecular concepts. 6, 137-148 (2015).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Lineage+Tracing+Reveals+that+Oriented+Cell+Division+Contributes+to+Trabecular+Morphogenesis+and+Regional+Specification.">Single-Cell Lineage Tracing Reveals that Oriented Cell Division Contributes to Trabecular Morphogenesis and Regional Specification.</a> Cell reports. 15, 158-170 (2016).</li><li>Alkaabi, K. M., Yafea, A., Ashraf, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+on+thermal-+and+chemical-induced+denaturation+of+GFP.">Effect of pH on thermal- and chemical-induced denaturation of GFP.</a> Appl Biochem Biotechnol. 126, 149-156 (2005).</li><li>Captur, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+myocardial+trabeculae+in+the+mouse+embryo.">Morphogenesis of myocardial trabeculae in the mouse embryo.</a> J Anat. , (2016).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

הבידוד העובר הוא צעד מאוד קריטי. עובר E9.5 הם שבירים מאוד קטנים בגודלם, כך משנת זהירות יש לנקוט לא לפגוע מבנים עוברים / לב במהלך בידוד. שני הרבדים הנוספים שאינם עובריים העוטף את העובר / הלב צריך להסיר בזהירות במיוחד כאשר הדמיה העובר כולו. זה מאפשר חדירת תערובת נוגדנים וסל...

המורפוגנזה לב היא אירוע רציף הדורש ארגון spatiotemporal של ארבעה סוגים שונים של ובתאים לב למגזרים ברורים של הלב, וגם דורשת רשתות רגולטוריות גנטיות מרובות לתזמר את התהליך הזה כדי ליצור את 1,2 הלב הפונקציונלי. מפרט, בידול, דפוסי לב, והתבגרות קאמרית מוסדרים 3 גורמי שעתוק קרדיוגני. מוטציה גנטית או סטיית posttranscriptional של גורמים אלה ובתאי לב יכולה לגרום גם קטלני עובריים או מומי לב מולדים (CHD) 4. המחקר של המורפוגנזה לב דורש הבנה של פרטים מבניים טמונים בשלושה ממדים (3D) ואת שושלת תא אב לב יחידה שכותרתו התחקות במהלך התפתחות לב יקדם את ההבנה של המורפוגנזה לב. מספר שיטות טומוגרפיה מבוסס סעיף ברזולוציה גבוהה פותחו הדואר האחרונים עשרות שנים מבנה האיבר תמונה 5,6; עם זאת, שיטות אלו דורשות מכשירים יקרים, מיוחדים, עבודה רבה, ועל חוסר ארגון מבני מפורט ברזולוצית תא בודדת בתוך הנפח הסופי משוחזר תמונה 7,8. הדמית נפח 3D ברמת התא הבודדה מספקת אמצעי ללמוד התמיינות תאים ובתאים והתנהגות הסלולר in vivo 7. עם זאת, פיזור אור הרקמות נשאר המכשול העיקרי הדמית תאים ומבני 3D עמוק בתוך הלב ללא פגע. ליפידים הם מקור עיקרי של פיזור אור, והסרת שומנים ו / או התאמה של ההבדל מקדם השבירה בין שומנים בסביבותיה שלהם גישות פוטנציאל להגדלת רקמת שקיפות 8. בשנים האחרונות, מספר שיטות סליקה רקמות פותחו, המקטינים אטימות רקמות פיזור אור, כמו באב (בנזיל אלכוהול ו benzoat בנזילתערובת ה) ו- DBE (tetrahydrofuran ו dibenzylether); אבל בשיטות האלה, מרווה הקרינה נשארת בעיה 8-10. הממס מבוסס שיטות הידרופילי, כגון SeeDB (פרוקטוז / thioglycerol) ו 3DISCO (dichloromethane / dibenzylether), לשמר אותות ניאון, אבל לא להפוך כל האיבר 7,8,11 שקוף. לשם השוואה, שיטת רקמות סליקת CLARITY הופכת את האיבר שקוף, אבל זה דורש מכשיר אלקטרופורזה מיוחד כדי להסיר שומנים 8,12, כפי שעושה PACT (טכניקת בהירות פסיבית), אשר גם דורשת הידרוג&#39;ל הטבעת 7,13. לקבלת מידע מפורט לגבי כל שיטות ניקוי הרקמות הזמינות, עיין בטבלת 1 ב ריצ&#39;רדסון ליכטמן, et al. 7. בשנת 2011, חאמה et al. גילה serendipitously תערובת הידרופילי &#39;Sca le&#39; (אוריאה, גליצרול טריטון תערובת X-100) אשר משבש את המוח העכבר transpar העובראף אוזן גרון תוך שמירת פלורסנט אותות לחלוטין שיבוטים שכותרתו 14. זה מאפשר הדמיה של המוח ללא פגע בעומק של כמה מילימטרים ושחזור בקנה מידה גדול של אוכלוסיות נוירונים ותחזיות ברזולוציה subcellular. Susaki et al. נוספים שיפרו Sca le ידי הוספת aminoalcohols ופיתח את &#39;מעוקב&#39; (ברור, קוקטיילים הדמיה מוחית בלא הפרעה וניתוח חישובית) שיטת הסליקה רקמות, שהגדילה solubilization פוספוליפידים, זמן סליקה מופחת, ואיפשר פלורסנט ססגוניות הדמיה 8. במחקר הנוכחי, מנצל את Sca le וטכניקות סליקת רקמות מעוקבות חתך אופטי 3D ברזולוציה גבוהה, שיבוטי פרט בתוך הלב במהלך cardiogenesis אותר באמצעות Rosa26Cre ERT2 15, R26R-קונפטי 16, αMHC-Cre 17, cTnT-Cre 18, </strong&gt; Nfatc1-Cre 19, ו Rosa26-mTmG (mTmG) 20 קווי עכבר. השילוב של מכתים הר השלם (WMS) השיטה שפותח בעבר 21,22 עם שיטות סליקת רקמות מותרות נוסף עבור המכתים של חלבונים אחרים שיבוטי שכותרתו לחקר התנהגותם בהקשר נפח 3D. השילוב של סליקת רקמות WMS מאפשר הבנה טובה יותר של התפקידים של גנים וחלבונים שונים במהלך התפתחות של לב, ואת האטיולוגיה של מומי לב מולדים. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם ללמוד התמיינות תאים ובתאים אחרות, התנהגות הסלולר, ואירועי morphogenesis האיבר במהלך פיתוח.

<table><tbody><tr><td>2,2&amp;prime;,2&amp;prime;&amp;rsquo;-nitrilotriethanol&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>90279</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyde in PBS</td><td>Affymetrix</td><td>19943</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fischer Scientific&amp;nbsp;</td><td>BP16000</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&amp;rsquo;,N&amp;rsquo;-tetrakis(2-hydroxypropyl) ethylenediamine&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>122262</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffer Saline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>Triton&amp;nbsp;X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U-1250</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8773</td><td></td></tr><tr><td>Tamoxifen</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T5648</td><td></td></tr><tr><td>Sunflower seed oil</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5007</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>PECAM (CD31)</td><td>BD Pharmingen&amp;nbsp;</td><td>550274</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-21247</td><td></td></tr><tr><td>DAPI nuclear stain</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>37&lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C Incubator</td><td>Thermoscientific Fischer</td><td>Heratherm, Compact Microbiological Incubators</td><td></td></tr><tr><td>48 well plates</td><td>Cell Treat</td><td>229148</td><td></td></tr><tr><td>Analytical Balance</td><td>Metler Toledo</td><td>PB153-S/FACT</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss 510 confocal microscope</td><td></td></tr><tr><td>Disecting Microscope</td><td>Unitron</td><td>Z850</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent microscope</td><td>Zeiss</td><td>Observer. Z1</td><td></td></tr><tr><td>Germinator 500 Glass Bead Sterilizer</td><td>CellPoint Scientific</td><td>GER-5287-120V</td><td></td></tr><tr><td>Light Source</td><td>SCHOTT</td><td>ACE I</td><td></td></tr><tr><td>Pair of Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 60 mm x15 mm&amp;nbsp;</td><td>TPP Techno Plastic Products AG</td><td>93060</td><td></td></tr><tr><td>Rocker II&amp;nbsp; Platform Rocker</td><td>Boekel Scientific</td><td>260350</td><td></td></tr><tr><td>Scintillating tubes</td><td>Fischer Scientific&amp;nbsp;</td><td>03-337-26</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipette</td><td>Samco Scientific</td><td>202</td><td></td></tr><tr><td>Tweezers</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging cleared embryonic and postnatal hearts at single-cell resolution

מעקב וניתוח המשובטים יחיד ברמה השלמה-לב יכולים לקבוע התנהגות תא ובתאי לב והבחנה במהלך התפתחות של לב, ולאפשר לחקר הבסיס התאי והמולקולרי של המורפוגנזה לב נורמלית נורמלית. טכנולוגיות מתפתחות אחרונות של ניתוחים משובטים יחיד רטרוספקטיבית לעשות לחקר המורפוגנזה לב ברזולוצית תא בודד ריאלית. עם זאת, אטימות רקמות אור פיזור של הלב כעומק הדמיה הוא גדל הדמיה כולו-לב לעכב ברזולוציה תא בודד. כדי להתגבר על המכשולים הללו, מערכת סליקת מחיטה עוברת שיכול להפוך בלב מאוד שקוף לתאורה וזיהוי שניהם חייבים להיות מפותח. למרבה המזל, בשנים האחרונות, מתודולוגיות רבות למערכות סליקה כל-אורגניזם כגון CLARITY, SCA le, SeeDB, ClearT, 3DISCO, מעוקב, DBE, באב ו PACT דווחו. מעבדה זו מעוניינת המנגנונים התאיים ומולקולריים של כרטיסmorphogenesis IAC. לאחרונה, הקמנו שושלת תא בודדת התחקות דרך ROSA26-Cre ERT2; ROSA26-קונפטי מערכת לתאי תווית בדלילות במהלך התפתחות של לב. התאמנו מספר מתודולוגיות כולו סליקה-העובר כולל Sca le ו מעוקב (ברור, קוקטיילי הדמיה מוחית בלא הפרעה וניתוח חישובית) כדי לנקות את העובר בשילוב עם מכתים הר שלם כדי שיבוטים יחידים תמונה בתוך הלב. הלב היה צלם בהצלחה ברזולוצית תא בודדת. מצאנו כי Sca le יכול לנקות את הלב העוברי, אך לא ניתן לנקות את הלב לאחר הלידה ביעילות, תוך מעוקב יכול לנקות את הלב לאחר הלידה, אך נזקים בלב העוברית על ידי המסת רקמות. השיטות שתוארו כאן תאפשרנה המחקר של תפקוד גן ברזולוצית שיבוט אחד במהלך המורפוגנזה לב, אשר, בתורו, יכול לחשוף את הבסיס התאי ומולקולרי של מומי לב מולדים.

הדמיה בלב העוברי הפינה היווצרות לב החולייתנים היא תהליך morphogenic מוסדר spatiotemporally ותלוי הארגון וההבחנה של ובתאים מארבעה מקורות שונים 1. תאים משדה הלב הראשון של סהר הלב יתקפלו לכיוון קו אמצע ה...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution at JoVE.com

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

We describe a protocol to volumetrically image fluorescent protein labeled cells deep inside intact embryonic and postnatal hearts. Utilizing tissue-clearing methods in combination with whole mount staining, single fluorescent protein-labeled cells inside an embryonic or postnatal heart can be imaged clearly and accurately.

הדמיה הותרה עוברית ולבבות אחרי לידה ברזולוצית תא בודד

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

imaging-cleared-embryonic-postnatal-hearts-at-single-cell

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.1K Views.  Albany Medical College. We describe a protocol to volumetrically image fluorescent protein labeled cells deep inside intact embryonic and postnatal hearts. Utilizing tissue-clearing methods in combination with whole mount staining, single fluorescent protein-labeled cells inside an embryonic or postnatal heart can be imaged clearly and accurately. 

Video: Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated discs, and costameres requires the coordinated assembly of multiple components in time and space. Disruption in assembly of these components leads to developmental heart defects. Immunofluorescent staining techniques are used commonly in cultured cardiomyocytes to probe myofibril maturation, but this ex vivo approach is limited by the extent to which myocytes will fully differentiate in culture, lack of normal in vivo mechanical inputs, and absence of endocardial cues. Application of immunofluorescence techniques to the study of developing mouse heart is desirable but more technically challenging, and methods often lack sufficient sensitivity and resolution to visualize sarcomeres in the early stages of heart development. Here, we describe a robust and reproducible method to co-immunostain multiple proteins or to co-visualize a fluorescent protein with immunofluorescent staining in the embryonic mouse heart and use this method to analyze developing myofibrils, intercalated discs, and costameres. This method can be further applied to assess cardiomyocyte structural changes caused by mutations that lead to developmental heart defects.

Mutations that lead to congenital heart defects benefit from in vivo investigation of cardiac structure during development, but high-resolution structural studies in the mouse embryonic heart are technically challenging. Here we present a robust immunofluorescence and image analysis method to assess cardiomyocyte-specific structures in the developing mouse heart.

ניתוח של Cardiomyocyte פיתוח באמצעות Immunofluorescence בלב העכבר עוברי

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard microscopy techniques, due to the scattering of imaging light by the thick heart tissue, as these vessels are localized deep within the walls of the developing heart. As optical clearing of tissues using organic solvents such as BABB (1 part benzyl alcohol to 2 parts benzyl benzoate) has been shown to greatly improve the optical penetration depth that can be achieved, we combined clearance of whole, PECAM1-immunostained hearts, with laser-scanning confocal microscopy, in order to obtain high-resolution images of vessels throughout the entire heart. BABB clearance of embryonic hearts takes place rapidly and also acts to preserve the fluorescent signal for several weeks; in addition, samples can be imaged multiple times without loss of signal. This straightforward method is also applicable to imaging other types of blood vessels in whole embryos.

We present a protocol for the analysis of coronary vessels in whole embryonic murine hearts up to E15.5, using standard immunological staining methods followed by optical clearance and confocal microscopy. This technique enables visualization of blood vessels throughout the entire heart without the need for time-consuming analysis of serial sections.

ניתוח של כלי דם כליליים ב הותרו עוברי לבבות

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development and organogenesis are two areas of research that have benefitted greatly from these advances, due to the high quality of data that can be obtained directly from imaging pre-implantation embryos or ex vivo organs. While pre-implantation embryos have yielded data with especially high spatial resolution, later stages have been less amenable to three-dimensional reconstruction. Obtaining high-quality 3D or volumetric data for known embryonic structures in combination with fate mapping or genetic lineage tracing will allow for a more comprehensive analysis of the morphogenetic events taking place during embryogenesis.
This protocol describes a whole-mount immunofluorescence approach that allows for the labeling, visualization, and quantification of progenitor cell populations within the developing cardiac crescent, a key structure formed during heart development. The approach is designed in such a way that both cell- and tissue-level information can be obtained. Using confocal microscopy and image processing, this protocol allows for three-dimensional spatial reconstruction of the cardiac crescent, thereby providing the ability to analyze the localization and organization of specific progenitor populations during this critical phase of heart development. Importantly, the use of reference antibodies allows for successive masking of the cardiac crescent and subsequent quantitative measurements of areas within the crescent. This protocol will not only enable a detailed examination of early heart development, but with adaptations should be applicable to most organ systems in the gastrula to early somite stage mouse embryo.

Here, we describe a protocol for whole mount immunofluorescence and image-based quantitative volumetric analysis of early stage mouse embryos. We present this technique as a powerful approach to qualitatively and quantitatively assess cardiac structures during development, and propose that it may be widely adaptable to other organ systems.

ניתוח כמותי Immunofluorescence כולה-הר של אוכלוסיות לב ב העכבר עוברי

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

Microinjection-מערכת מבוססת עבור-Vivo השרשת Cardiomyocytes עובריים בתוך העובר העופות

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Live Imaging of Early Cardiac Progenitors in the Mouse Embryo

The first steps of heart development imply drastic changes in cell behavior and differentiation. While analysis of fixed embryos allows studying in detail specific developmental stages in a still snapshot, live imaging captures dynamic morphogenetic events, such as cell migration, shape changes, and differentiation, by imaging the embryo as it develops. This complements fixed analysis and expands the understanding of how organs develop during embryogenesis. Despite its advantages, live imaging is rarely used in mouse models because of its technical challenges. Early mouse embryos are sensitive when cultured ex vivo and require efficient handling. To facilitate a broader use of live imaging in mouse developmental research, this paper presents a detailed protocol for two-photon live microscopy that allows long-term acquisition in mouse embryos. In addition to the protocol, tips are provided on embryo handling and culture optimization. This will help understand key events in early mouse organogenesis, enhancing the understanding of cardiovascular progenitor biology.

We present a detailed protocol for mouse embryo culture and imaging that enables 3D + time imaging of cardiac progenitor cells. This video-toolkit addresses the key skills required for successful live imaging otherwise hard to acquire from text-only publications.

הדמיה חיה של אבות לב מוקדמים בעובר העכבר

The first steps of heart development imply drastic changes in cell behavior and differentiation. While analysis of fixed embryos allows studying in detail ...

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart 

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology and genetics 1,2. About 100-200 embryos are readily available every week from a single pair of adult fish. The transparent embryos that develop ex utero make them ideal for assessing cardiac defects 3. The expression of any gene can be manipulated via morpholino technology or RNA injection 4. Moreover, forward genetic screens have already generated a list of mutants that affect different perspectives of cardiogenesis 5. 
Whole mount immunostaining is an important technique in this animal model to reveal the expression pattern of the targeted protein to a particular tissue 6. However, high resolution images that can reveal cellular or subcellular structures have been difficult, mainly due to the physical location of the heart and the poor penetration of the antibodies. 
 Here, we present a method to address these bottlenecks by dissecting heart first and then conducting the staining process on the surface of a microscope slide. To prevent the loss of small heart samples and to facilitate solution handling, we restricted the heart samples within a circle on the surface of the microscope slides drawn by an immEdge pen. After the staining, the fluorescence signals can be directly observed by a compound microscope. 
Our new method significantly improves the penetration for antibodies, since a heart from an embryonic fish only consists of few cell layers. High quality images from intact hearts can be obtained within a much reduced procession time for zebrafish embryos aged from day 2 to day 6. Our method can be potentially extended to stain other organs dissected from either zebrafish or other small animals.

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart

A rapid way to conduct immunostaining of zebrafish embryonic heart is described. Compared to the whole mount immunostaining approach, this method dramatically increases the penetration of the antibodies, which allows obtaining high resolution images that reveal cellular/subcellular structures in the heart within a much reduced processing time.

Immunostaining הלב גזור עוברי דג הזברה

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology ...

Biology

מיקרוסקופ יריעות אור וניקוי רקמות להדמיית לב מקיפה

Light-Sheet Imaging to Reveal Cardiac Structure in Rodent Hearts

Light-sheet microscopy (LSM) plays a pivotal role in comprehending the intricate three-dimensional (3D) structure of the heart, providing crucial insights into fundamental cardiac physiology and pathologic responses. We hereby delve into the development and implementation of the LSM technique to elucidate the micro-architecture of the heart in mouse models. The methodology integrates a customized LSM system with tissue clearing techniques, mitigating light scattering within cardiac tissues for volumetric imaging. The combination of conventional LSM with image stitching and multiview deconvolution approaches allows for the capture of the entire heart. To address the inherent trade-off between axial resolution and field of view (FOV), we further introduce an axially swept light-sheet microscopy (ASLM) method to minimize out-of-focus light and uniformly illuminate the heart across the propagation direction. In the meanwhile, tissue clearing methods such as iDISCO enhance light penetration, facilitating the visualization of deep structures and ensuring a comprehensive examination of the myocardium throughout the entire heart. The combination of the proposed LSM and tissue clearing methods presents a promising platform for researchers in resolving cardiac structures in rodent hearts, holding great potential for the understanding of cardiac morphogenesis and remodeling.

מחבר זרקור: הדמיית גיליון אור מותאמת אישית לחקר מבנים שריר הלב בלבבות מכרסמים

The protocol utilizes advanced light-sheet microscopy along with adapted tissue clearing methods to investigate intricate cardiac structures in rodent hearts, holding great potential for the understanding of cardiac morphogenesis and remodeling.

הדמיית יריעות אור לחשיפת מבנה הלב בלבבות מכרסמים

Light-sheet microscopy (LSM) plays a pivotal role in comprehending the intricate three-dimensional (3D) structure of the heart, providing crucial insights ...

Bioengineering

Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect their in vivo potential. Preferably, these cells should be placed in a proper embryonic environment in order to acquire their definite phenotype. Furthermore, cell lineage tracing studies in the mouse after labeling cells with dyes or retroviral vectors has remained mostly limited to early stage mouse embryos with still poorly developed organs. To overcome these limitations, we designed standard and ultrasound-mediated microinjection protocols to inject various agents in targeted regions of the heart in mouse embryos at E9.5 and later stages of development. &#160;Embryonic explant or embryos are then cultured or left to further develop in utero. These agents include fluorescent dyes, virus, shRNAs, or stem cell-derived progenitor cells. Our approaches allow for preservation of the function of the organ while monitoring migration and fate of labeled and/or injected cells. These technologies can be extended to other organs and will be very helpful to address key biological questions in biology of development.

We describe a series of methods to inject dyes, DNA vectors, virus, and cells in order to monitor both cell fate and phenotype of endogenous and grafted cells derived from embryonic or pluripotent cells within mouse embryos at embryonic day (E)9.5 and later stages of development.

תיוג תא והזרקה בפיתוח לבבות עכבר עוברי

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect ...

הדמיה הותרה עוברית ולבבות אחרי לידה ברזולוצית תא בודד

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

ניתוח של Cardiomyocyte פיתוח באמצעות Immunofluorescence בלב העכבר עוברי

ניתוח של כלי דם כליליים ב הותרו עוברי לבבות

ניתוח כמותי Immunofluorescence כולה-הר של אוכלוסיות לב ב העכבר עוברי

Microinjection-מערכת מבוססת עבור-Vivo השרשת Cardiomyocytes עובריים בתוך העובר העופות

הדמיה חיה של אבות לב מוקדמים בעובר העכבר

Immunostaining הלב גזור עוברי דג הזברה

הדמיית יריעות אור לחשיפת מבנה הלב בלבבות מכרסמים

הדמיית יריעות אור לחשיפת מבנה הלב בלבבות מכרסמים

הדמיית יריעות אור לחשיפת מבנה הלב בלבבות מכרסמים

תיוג תא והזרקה בפיתוח לבבות עכבר עוברי