אנו מביעים את תודתנו לקבוצתו של ד"ר אריק אולסון במרכז הרפואי UT Southwestern על שיתוף נדיב של דגמי בעלי החיים. אנו מעריכים את כל ההערות הבונות שסופקו על ידי חברי החממה D ב- UT דאלאס. עבודה זו נתמכה על ידי NIH R00HL148493 (Y.D.), R01HL162635 (Y.D.) ותוכנית UT Dallas STARS (Y.D).

מיקרוסקופ יריעות אור וניקוי רקמות להדמיית לב מקיפה

למחברים אין ניגוד עניינים לחשוף.

התקדמות שיטות ההדמיה, החישוב וניקוי הרקמות סיפקה הזדמנות חסרת תקדים לחקור באופן נרחב את מבנה הלב ותפקודו. זה טומן בחובו פוטנציאל גדול להעמקת ההבנה שלנו של מורפוגנזה ופתוגנזה של הלב באמצעות מודל לב מכרסם שלם. בניגוד למחקרי in vivo של לב דג זברה בגישה דומה 40,41,42,43, השילוב של טכניקות LSM מתקדמ?...

אי ספיקת לב נותרה הגורם המוביל לתמותה ברחבי העולם, בעיקר בשל היעדר יכולת התחדשות של קרדיומיוציטים בוגרים1. הארכיטקטורה המורכבת של הלב ממלאת תפקיד מכריע בתפקודו ומספקת תובנות לגבי תהליכים התפתחותיים. הבנה מעמיקה של מבנה הלב חיונית להבהרת התהליכים הבסיסיים של מורפוגנזה לבבית ועיצוב מחדש בתגובה לאוטם שריר הלב. ההתקדמות האחרונה הוכיחה כי עכברים ילודים יכולים לשחזר את תפקוד הלב לאחר פציעה, בעוד עכברים בוגרים חסרים יכולת התחדשות כזו2. זה מבסס בסיס לחקר רמזים הקשורים לחריגות מבניות ותפקודיות במודלים של עכברים. לשיטות הדמיה מסורתיות, כגון מיקרוסקופיה קונפוקלית, יש מגבלות טכניות, כולל עומק חדירה מוגבל, סכמת סריקה נקודתית איטית ונזקי צילום כתוצאה מחשיפה ממושכת לאור לייזר. אלה מעכבים הדמיה תלת ממדית מקיפה (3D) של הלב השלם. בהקשר זה, מיקרוסקופ גיליון אור (LSM) מתגלה כפתרון רב עוצמה, המציע את היתרונות של הדמיה במהירות גבוהה, נזק מופחת לצילום ויכולות חתך אופטיות יוצאות דופן 3,4,5. התכונות הייחודיות של LSM מציבות אותו כשיטה מבטיחה להתגבר על מגבלות הטכניקות הקונבנציונליות, ומספקות תובנות חסרות תקדיםעל התפתחות הלב ותהליכי שיפוץ 6,7,8.
בפרוטוקול זה, אנו מציגים אסטרטגיית הדמיה המשלבת LSM מתקדם עם גישות מותאמות לניקוי רקמות9, ומאפשרת הדמיה של לבבות עכבר שלמים ללא צורך בתיוג ספציפי ובחתך מכני. אנו מציעים גם כי ניתן לשפר את הדמיית LSM קונבנציונלית באמצעות טכניקות multiview deconvolution10 או מיקרוסקופ גיליון אור (ASLM) 11,12,13,14,15 כדי לשפר את הרזולוציה הצירית. בנוסף, שילוב של תפירת תמונה עם כל אחת מהשיטות הללו יכול להתגבר ביעילות על הפשרה בין רזולוציה מרחבית לשדה ראייה (FOV), ובכך לקדם את ההדמיה של לבבות עכברים בוגרים. השילוב של גישות רבות לניקוי רקמות, כולל שיטות הידרופוביות, הידרופיליות ומבוססות הידרוג'ל, מאפשר חדירת אור עמוקה יותר ללכידת המורפולוגיה של הלב כולו 16,17,18,19.
בעוד שיטות ניקוי מרובות תואמות למערכות LSM הנוכחיות, המטרה היא למזער את פיזור הפוטונים ולהגביר את חדירת האור ברקמות, כמו הלב, על ידי החלפת שומנים בתווך התואם באופן הדוק את מקדם השבירה שלו. iDISCO נבחרה כמייצגת20,21 והותאמה לדימות אוטופלואורסצנטי בפרוטוקול זה הודות לעיבוד המהיר והשקיפות הגבוהה שלה (איור 1A). באופן קולקטיבי, השילוב של גישת LSM המתקדמת עם טכניקות ניקוי רקמות מציע מסגרת מבטיחה לפענוח אנטומיה לבבית מורכבת בלבבות מכרסמים, טומנת בחובה פוטנציאל משמעותי לקידום הבנתנו במורפוגנזה ופתוגנזה של הלב.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Agarose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting point agarose</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16520050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals for tissue clearing&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Amino-1,3,3-trimethylcyclohexanemethylamine, mixture of cis and trans</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>118184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D.E.R.&#8482; 332</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D.E.R.&#8482; 736</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibenzyl ether (DBE)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>33630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane (DCM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent beads</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>FP-0556-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide (H2O2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>439193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>47392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>79383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and algorithms</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2021.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BigStitcher</td>
			<td>H&#246;rl et al.22</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji-ImageJ</td>
			<td>Schindelin et al.20</td>
			<td>1.54f</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCImage Live</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>4.6.1.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW</td>
			<td>National Instruments Corporation</td>
			<td>2017 SP1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Key components of the customized light-sheet system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.63 - 6.3X Zoom body</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVX-ZB10&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Illumination objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRH00105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X detection objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MV PLAPO 1X/0.25&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>473nm DPSS Laser</td>
			<td>Laserglow Technologies</td>
			<td>LRS-0473-PFM-00100-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>532nm DPSS laser</td>
			<td>Laserglow Technologies</td>
			<td>LRS-0532-PFM-00100-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>589&#8201;nm DPSS laser</td>
			<td>Laserglow Technologies</td>
			<td>LRS-0589-GFF-00100-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BNC connector</td>
			<td>National Instrument</td>
			<td>BNC-2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cylindrical lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ACY254-050-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC-Motor Controller, 4 axes</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>C-884.4DC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETL</td>
			<td>Optotune</td>
			<td>EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETL Cable</td>
			<td>Optotune</td>
			<td>CAB-6-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETL Lens Driver</td>
			<td>Optotune</td>
			<td>EL-E-4i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET525/30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET585-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET645-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter wheel&#160;</td>
			<td>Shutter Instrument</td>
			<td>LAMBDA 10-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized translation stage</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>L-406.20DG10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized translation stage</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>L-406.40DG10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized translation stage</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>M-403.4PD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NI multifunction I/O</td>
			<td>National Instrument</td>
			<td>PCIe-6363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C13440-20CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stepper motor</td>
			<td>Pololu</td>
			<td>1474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVX-TLU</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-sheet imaging to reveal cardiac structure in rodent hearts

מיקרוסקופ יריעות אור (LSM) ממלא תפקיד מרכזי בהבנת המבנה התלת-ממדי (תלת-ממדי) המורכב של הלב, ומספק תובנות חיוניות לגבי פיזיולוגיה בסיסית של הלב ותגובות פתולוגיות. אנו מתעמקים בזאת בפיתוח ויישום טכניקת LSM כדי להבהיר את המיקרו-ארכיטקטורה של הלב במודלים עכבריים. המתודולוגיה משלבת מערכת LSM מותאמת אישית עם טכניקות ניקוי רקמות, הפחתת פיזור האור בתוך רקמות הלב לצורך הדמיה נפחית. השילוב של LSM קונבנציונלי עם תפירת תמונה וגישות deconvolution multiview מאפשר ללכוד את הלב כולו. כדי להתמודד עם הפשרה המובנית בין רזולוציה צירית לשדה ראייה (FOV), אנו מציגים גם שיטת מיקרוסקופ יריעות אור שנסחף באופן אקסיאלי (ASLM) כדי למזער אור מחוץ למיקוד ולהאיר באופן אחיד את הלב לאורך כיוון ההתפשטות. בינתיים, שיטות ניקוי רקמות כגון iDISCO לשפר את חדירת האור, להקל על הדמיה של מבנים עמוקים ולהבטיח בדיקה מקיפה של שריר הלב לאורך הלב כולו. השילוב של שיטות LSM וניקוי רקמות המוצעות מהווה פלטפורמה מבטיחה לחוקרים בפתרון מבנים לבביים של מכרסמים, טומנת בחובה פוטנציאל גדול להבנת מורפוגנזה לבבית ועיצובה מחדש.

Heart failure remains the leading cause of mortality worldwide, primarily due to the lack of regenerative capacity of mature cardiomyocytes1. The intricate architecture of the heart plays a crucial role in its function and provides insights into developmental processes. A profound understanding of cardiac structure is essential for elucidating the fundamental processes of cardiac morphogenesis and remodeling in response to myocardial infarction. Recent progress has demonstrated that neonatal mice can restore cardiac function following injury, while adult mice lack such regenerative capacity2. This establishes a foundation for investigating cues associated with structural and functional abnormalities in mouse models. Traditional imaging methods, such as confocal microscopy, have technical limitations, including restricted penetration depth, slow point-scanning scheme, and photo damage from prolonged exposure to laser light. These hinder comprehensive three-dimensional (3D) imaging of the intact heart. In this context, light-sheet microscopy (LSM) emerges as a powerful solution, offering the advantages of high-speed imaging, reduced photo damage, and exceptional optical sectioning capabilities3,4,5. The unique features of LSM position it as a promising method to overcome the limitations of conventional techniques, providing unprecedented insights into cardiac development and remodeling processes6,7,8.
In this protocol, we introduce an imaging strategy that combines advanced LSM with adapted tissue clearing approaches9, allowing for the imaging of entire mouse hearts without the need for specific labeling and mechanical sectioning. We further propose that conventional LSM imaging can be enhanced through multiview deconvolution10 or axially swept light-sheet microscopy (ASLM) techniques11,12,13,14,15 to improve axial resolution. Additionally, the integration of image stitching with either of these methods can effectively overcome the trade-off between spatial resolution and field of view (FOV), thereby advancing the imaging of adult mouse hearts. The incorporation of numerous tissue clearing approaches, including hydrophobic, hydrophilic, and hydrogel-based methods, enables deeper light penetration for capturing the morphology of the entire heart16,17,18,19.
While multiple clearing methods are compatible with current LSM systems, the goal is to minimize photon scattering and enhance light penetration in tissues, like the heart, by replacing lipids with a medium that closely matches its refractive index. iDISCO was chosen as the representative20,21 and adapted for autofluorescence imaging in this protocol due to its rapid processing and high transparency (Figure 1A). Collectively, the integration of the advanced LSM approach with tissue clearing techniques offers a promising framework to unravel intricate cardiac anatomy in rodent hearts, holding significant potential for advancing our understanding of cardiac morphogenesis and pathogenesis.

מחבר זרקור: הדמיית גיליון אור מותאמת אישית לחקר מבנים שריר הלב בלבבות מכרסמים

הדמיית יריעות אור לחשיפת מבנה הלב בלבבות מכרסמים

Our research aims at customizing a light-sheet imaging system to investigate the myocardial structures of the intact rodent heart at a cellular level. We have developed a workflow to explore the intact myocardium with isotropic resolution at the micron level from neonatal to adult rodent hearts. Our study fills a gap in investigating the intricate myocardial microstructures, such as trabeculation, inside the intact ventricles, with high spatial resolution.This imaging strategy provides an entry point to assess microstructure without physical slicing, leading to an enhanced understanding of cardiac development and remodeling. We will concentrate on exploring the structural changes of the myocardium in response to cardiac injury and remodeling.

LSM הוכח כמטפח מחקרי לב 31,32,33,34,35,36,37 בשל הסיכון המינימלי לנזק לצילום, רזולוציה מרחבית גבוהה וחתך אופטי בניגוד לשיטות הדמיה אופטיות אחרות כגון שדה בהיר וטכניקות סריקה נקודתית<su...

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Customized Light-Sheet Imaging for Investigating Myocardial Structures in Rodent Hearts at JoVE.com

הפרוטוקול משתמש במיקרוסקופ מתקדם של יריעות אור יחד עם שיטות מותאמות לניקוי רקמות כדי לחקור מבנים לבביים מורכבים בלבבות מכרסמים, טומן בחובו פוטנציאל גדול להבנת מורפוגנזה לבבית ועיצוב מחדש.

Light-sheet microscopy (LSM) plays a pivotal role in comprehending the intricate three-dimensional (3D) structure of the heart, providing crucial insights ...

מטרת המחקר שלנו היא להתאים אישית מערכת הדמיה של יריעות אור כדי לחקור את מבני שריר הלב של לב מכרסם שלם ברמה התאית. פיתחנו זרימת עבודה לחקר שריר הלב השלם ברזולוציה איזוטרופית ברמת המיקרון מלבבות יילודים למכרסמים בוגרים. המחקר שלנו ממלא פער בחקירת מיקרו-מבנים מורכבים של שריר הלב, כגון טרבקולציה, בתוך החדרים השלמים, ברזולוציה מרחבית גבוהה.אסטרטגיית הדמיה זו מספקת נקודת כניסה להערכת מיקרו-מבנה ללא חיתוך פיזי, מה שמוביל להבנה משופרת של התפתחות הלב ועיצובו מחדש. נתרכז בחקר השינויים המבניים של שריר הלב בתגובה לפגיעה לבבית ושיפוץ.

light-sheet-imaging-to-reveal-cardiac-structure-in-rodent-hearts

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Light-Sheet Imaging to Reveal Cardiac Structure in Rodent Hearts

582 Views.  The University of Texas at Dallas. מטרת המחקר שלנו היא להתאים אישית מערכת הדמיה של יריעות אור כדי לחקור את מבני שריר הלב של לב מכרסם שלם ברמה התאית. פיתחנו זרימת עבודה לחקר שריר הלב השלם ברזולוציה איזוטרופית ברמת המיקרון מלבבות יילודים למכרסמים בוגרים. המחקר שלנו ממלא פער בחקירת מיקרו-מבנים מורכבים של שריר ?...

Video: מחבר זרקור: הדמיית גיליון אור מותאמת אישית לחקר מבנים שריר הלב בלבבות מכרסמים

Light-sheet microscopy (LSM) plays a pivotal role in comprehending the intricate three-dimensional (3D) structure of the heart, providing crucial insights into fundamental cardiac physiology and pathologic responses. We hereby delve into the development and implementation of the LSM technique to elucidate the micro-architecture of the heart in mouse models. The methodology integrates a customized LSM system with tissue clearing techniques, mitigating light scattering within cardiac tissues for volumetric imaging. The combination of conventional LSM with image stitching and multiview deconvolution approaches allows for the capture of the entire heart. To address the inherent trade-off between axial resolution and field of view (FOV), we further introduce an axially swept light-sheet microscopy (ASLM) method to minimize out-of-focus light and uniformly illuminate the heart across the propagation direction. In the meanwhile, tissue clearing methods such as iDISCO enhance light penetration, facilitating the visualization of deep structures and ensuring a comprehensive examination of the myocardium throughout the entire heart. The combination of the proposed LSM and tissue clearing methods presents a promising platform for researchers in resolving cardiac structures in rodent hearts, holding great potential for the understanding of cardiac morphogenesis and remodeling.

The protocol utilizes advanced light-sheet microscopy along with adapted tissue clearing methods to investigate intricate cardiac structures in rodent hearts, holding great potential for the understanding of cardiac morphogenesis and remodeling.