Name: imaging cleared embryonic and postnatal hearts at single-cell resolution
Uploaded: 2016-10-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution at JoVE.com

We thank M.W. laboratory members for scientific discussion. This work is supported by AHA [13SDG16920099] to M.W., and by National Heart, Lung, and Blood Institute grants [R01HL121700] to M.W. Images were captured in the Imaging Core Facility at the Albany Medical College.

Alle Tierversuche wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) at Albany Medical College und ausgeführt zugelassen nach dem NIH Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren. 1. Lösung Vorbereitungen HINWEIS: Die Rosa26Cre ERT2 15, R26R-Confetti 16, &amp; alpha; MHC-Cre 17 und Rosa26-mTmG (mTmG) 20 Mauslinien wurden im Handel erworben cTnT-Cre 18 ein Geschenk von Dr. Jiao an der Universität von Alabama war NFATc1-Cre.. war 19 am Albert Einstein College of Medicine ein Geschenk von Dr. Bin Zhou. Mäuse wurden für mindestens 60 Sekunden durch Kohlendioxidinhalation in einer geschlossenen Kammer euthanasiert gefolgt durch physikalische Mittel Todes Überprüfung durch bilaterale Thorakotomie, Enthauptung oder zervikale Dislokation. <ol><li> Bereiten Sie Tamoxifen. Man löst 10 mg Tamoxifen in 10 ml Sonnenblumenkerne oil. Sobald es vollständig gelöst ist, aliquotieren und bei -20 ° C. </li><li> Bereiten phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Auflösen Na 2 HPO 4 (1,41960 g), KH 2 PO 4 (0,24496 g), NaCl (8,0669 g) und KCl (0,20129 g) in 1 l destilliertem Wasser und Einstellen des pH - Werts auf 7,4. </li><li> Bereiten PBST: 0,1% Tween-20-Lösung in PBS durch Auflösen von 100 &amp; mgr; l Tween-20 in 100 ml PBS. </li><li> Bereiten Sie Puffer blockiert. Machen 3% Rinderserumalbumin (BSA) Blockierungslösung durch Lösen von 3 g BSA in 100 ml PBST, enthaltend 0,2% Tween-20. </li><li> Bereiten Sie CUBIC-1 (Reagenz 1). Mischungs 25 wt% Harnstoff, 25 Gew% N, N, N &#39;, N&#39;-Tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylendiamin und 15 Gew% Triton X-100 in dH 2 O. </li><li> Bereiten Sie CUBIC-2 (Reagenz 2). Mischungs 50 Gew% Saccharose, 25 Gew% Harnstoff, 10 Gew% 2, 2 &#39;, 2&#39; &#39;- Nitrilotriethanol und 0,1% (v / v) Triton X-100 in dH 2 O. </li><li> Bereiten Sca le A2: 4 M Harnstoff, 10% w / v Glycerin und 0,1% w / v Triton X-100 in dH 2 O. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,7. </li><li> Bereiten Sca le B4: 8 M Harnstoff und 0,1% w / v Triton X-100 in dH 2 O. Stellen Sie den pH-Wert auf 8,7. </li><li> Bereiten Sca le 70: 4 M Harnstoff, 70% w / v Glycerin und 0,1% w / v Triton X-100 in dH 2 O. </li></ol> 2. Tamoxifen Induktion, Embryo Isolierung und Fixierung <ol><li> Tamoxifen Induktion und Embryo Isolation <ol><li> Mit Hilfe eines gekrümmten Ernährungsschlauch genehmigten Protokoll (ACUP 13-12007), Schlundsonde die weiblichen R26Cre ERT2 Confetti Mäuse (gesteckt von R26Cre ERT2 männliche Mäuse) mit 10 ug / g Tamoxifen an embryonalen Entwicklungs Tag E7.75 33. Bei embryonalen Tag 9,5 (E9.5) oder E10,5, einschläfern die weibliche Mäuse mit CO 2 und Genickbruch. </li><li> Nach Überprüfung der Maus Tod, öffnen Sie die Maus Bauchhöhle mit einer Schere (Abschnitt 1 Hinweis sehen) und das Uterushorn sezieren aus, die Eileiter Schichten mit Hilfe von Schere und Pinzette entfernen und wiederleasen die Embryonen aus dem Eileiter 23,24. <ol><li> Transfer der Embryonen auf eine Petrischale mit PBS (pH 7,4). Unter dem Binokular, entfernen Sie die nicht-embryonale Schichten (Chorion, Dottersack und Amnion) mit Hilfe einer Pinzette entfernen. </li></ol></li><li> Mit einer Pinzette und Schere, sammeln die weibliche Maus und Embryo Schwanz Proben für die Genotypisierung wie zuvor 22 berichtet. Mit Hilfe einer Plastikpipette, übertragen jeden Embryo in eine Vertiefung einer 48-Well-Platte mit 1 ml 1x PBS. </li><li> Unter einem Fluoreszenzmikroskop, identifizieren die GFP / RFP / GFP positive Embryonen über ein inverses Mikroskop mit einer Kamera. Schälen Sie die Herzbeutel mit einer Pinzette entfernt und drehen Sie das Herz / Embryo mit Hilfe von gebogenen Pinzette, um die Anzahl von fluoreszierenden Klone auf beiden Seiten des Herzens mit den GFP / RFP / CFP Filter zu bestimmen. Keine Schnitte erforderlich sind. </li></ol></li><li> GFP / RFP / GFP positive Embryonen Nach der Identifizierung, schnell die Embryonen waschen zweimal (je 2 min) mit 1x PBS in the 48 Well-Platte auf einem Plattenschüttler bei Raumtemperatur (RT). Dies wird überschüssiges Blut zu entfernen. </li><li> Befestigen Sie den Embryo / embryonale Herz mit 4% Paraformaldehyd (PFA) bei RT. Die Fixierungszeit ist abhängig von der embryonalen Alter und Gewebegröße. Für E9.5 fixieren den Embryo für 2 h bei RT. Die späten embryonalen Stadium Embryonen erfordern längere Fixierungszeit, die sogar bis 24 Stunden für die postnatale Herz verlängert werden kann. ACHTUNG: Paraformaldehyd ist giftig, sollte der Kontakt mit Haut, Augen und Schleimhäute. </li><li> Nach der Fixierung, waschen Sie den Embryo / Herz in der 48-Well-Platte zweimal (jeweils 10 Minuten) mit 1x PBS auf einem Plattenschüttler bei RT. Dies entfernt die überschüssige PFA aus dem Embryo / Herz. Die Embryonen werden dann weiter verarbeitet für ganze Berg Färbung und Gewebe Lichtung. </li></ol> 3. Ganze Berge Färbung HINWEIS: Nach dem PFA Fixierung der Embryo / Herz ganze Berg-Färbung wird wie folgt. <ol><li> Permeabilisierung den Embryo / Herz in einer 48-Well-Platte mit 1 ml von 0,1% PBST für 2 Stunden auf Plattenschüttler bei RT. </li><li> Nach Permeabilisierung, tauchen Sie den Embryo / Herz in 1 ml Blockierungspuffer, für 2 Stunden oder über Nacht auf einem Plattenschüttler bei 4 ºC. </li><li> Tauchen Sie den Embryo / Herz in die Endothelzellen-spezifischen Antikörper PECAM (CD31), verdünnt (1: 100) in 0,3 ml Puffer für 48 Stunden auf einem Plattenschüttler bei 4 ° C blockiert. </li><li> Waschen Sie den Embryo / Herz mit PBST 5-mal, jeweils 30 min bei RT auf einem Plattenschüttler. Dies entfernt den Überschuß unspezifische gebundenen primären Antikörpers aus dem Gewebe. </li><li> Tauchen Sie den Embryo / Herz in Alexa Fluor 647 Ziege anti-Ratte-Sekundär-Antikörper, verdünnt (1: 1000) in 1 ml Puffer für 48 Stunden auf einem Plattenschüttler bei 4 ° C blockiert. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 3.4 den sekundären Antikörper zu waschen. </li><li> Post-fix den Embryo / Herz mit 4% PFA für 1 h bei RT auf einem Plattenschüttler und waschen zweimal mit PBS jeweils 5 Minuten. </li><li> Stain den Embryo / Herz mit der Kernfärbung 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (verdünnt in PBST bei einer concentVerhältnis von 0,01 mg / ml) für 10 min auf Plattenschüttler bei RT. Folgen Sie mit zwei PBS Waschungen von jeweils 5 Minuten. </li></ol> 4. Embryo / Herz Clearing mit Sca l e oder CUBIC - Methode HINWEIS: Nach der ganze Berg Färbung der Embryo / Herz entweder auf die Sca le oder CUBIC Gewebe Clearing - Verfahren unterzogen wird. Die Wahl des Verfahrens hängt von der Gewebegröße und embryonalen Alter. Für E11,5 oder früheren Alter Embryonen, l e Gewebe Clearing- Verfahren Verwendung Sca, während für ältere Embryonen oder postnatale Herzen der CUBIC Gewebe Clearing- Verfahren wird bevorzugt. <ol><li> Scale-Tissue Clearing-Methode <ol><li> Inkubieren Sie den Embryo / Herz mit 1 ml Sca l e A2 - Lösung in einem Szintillationsphiole (eingewickelt in Alufolie) mit gelegentlichen sanften (von Hand) für 48 Stunden bei 4 ° C schütteln. </li><li> L e A2 Inkubation Nach Sca, Inkubation des Embryos / Herz mit 1 ml Sca l e B4 Lösung bei 4 ° C in der gleichen Fläschchen mit gelegentlichen sanften für anot Schüttelnsie 48 Stunden. </li><li> Inkubieren Sie den Embryo / Herz für weitere 48 Stunden mit 1 ml Sca l e 70 bei 4 ° C mit gelegentlichen leichtem Schütteln. Berg Embryo 90% Glycerin (siehe Abschnitt 5.1). </li></ol></li><li> CUBIC Tissue Clearing-Methode <ol><li> Für ganze Embryo / Herz CUBIC Lichtung, tauchen jeden Embryo / Herz in 1 ml CUBIC-1 mit gelegentlichen leichtem Schütteln für 48 Stunden bei 37 ºC 7. Nach 48 Stunden, um die Lösung mit dem gleichen Volumen an frischem CUBIC Reagenz 1, zu ersetzen und die Probe für weitere 48 Stunden bei 37 ° C mit gelegentlichem Schütteln mit der Hand inkubiert. </li><li> Waschen Sie die CUBIC-1 behandelt Herz / Embryo mit 1x PBS mehrmals bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln mit der Hand. Dies entfernt die überschüssige CUBIC-1-Lösung. </li><li> Nach CUBIC-1 mit PBS ausgewaschen, tauchen die Embryonen / Herzen in CUBIC-2-Lösung (1 g pro Embryo / Herz) für 48 Stunden bei 37 ° C mit gelegentlichen sanft mit der Hand schütteln. Dies folgt Embryo / Herz Montage Glycerin (siehe Abschnitt 50,2). </li></ol></li></ol> 5. Proben Montage und Imaging HINWEIS: Die geräumten Embryonen oder Organe in Sca l e 70 oder CUBIC-2 - Lösung kann mit Skala 70 und CUBIC-2 - Lösung als Abbildungsmedium direkt abgebildet werden, beziehungsweise. Betrachtet man jedoch die Anfälligkeit der embryonalen Proben Clearing Reagenzien, wenn die Proben nicht unmittelbar abgebildet werden, sondern langfristige, speichern Sie die Proben in 90% Glycerin nach dem Protokoll unten gespeichert. <ol><li> Direkt die Sca le in 1 ml 90% Glycerin und lagern bei 4 ° C bis zur Bildgebung gelöscht Probe tauchen. </li><li> Waschen Sie die CUBIC behandelte Probe mit 1x PBS zweimal, jeweils 5 min und Inkubation sequentiell die Probe mit 1 ml 30%, 50%, 70% und 90% Glycerin-Lösung jeweils für 30 min. </li><li> Zur Bebilderung, Transfer der Probe auf Glasboden Petrischale mit einer minimalen Menge von 90% Glycerin und Bild Klone mit einem konfokalen Mikroskop mit zwei Photonen-Fähigkeiten ausgestattet. </li><li> Bild das Herz oder Embryo im Glycerin mit einer 10X / 0.3 NA, ein 25X / 0,8 NA Tauch-, oder ein 40X / 1.2 NA Wasser Korrekturobjektivlinse. Bild DAPI unter Verwendung von 2-Photonen-Anregung von einer kohärenten Titan: Saphir-Laser-Chamäleon. Die Wahl des Mikroskops und die Objektivlinse von dem Zweck der Experimente abhängen wird, beispielsweise für Superauflösung, ein Lichtbogen Fluoreszenzmikroskop verwendet werden könnten. </li></ol>

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The authors declare no competing financial interests.

Der Embryo Isolation ist ein sehr wichtiger Schritt. E9.5 Embryonen sind sehr zerbrechlich und klein, so besonders darauf geachtet werden, sollten nicht die Embryo / Herzstrukturen während der Isolierung nicht zu beschädigen. Die nicht-embryonale zusätzliche Schichten des Embryos / Herz umhüllt sollte sorgfältig besonders entfernt werden, wenn die gesamte Embryo-Bildgebung. Auf diese Weise können Antikörper und Clearing-Mischung Eindringen tief in den embryonalen Geweben und hilft auch das Hintergrundsignal bei d...

Cardiac Morphogenese ist eine sequenzielle Ereignis, das die räumlich - zeitliche Organisation von vier verschiedenen Arten von Herzvorläuferzellen in verschiedene Sektoren des Herzens erforderlich ist , und erfordert auch mehrere Genregulationsnetzwerken diesen Prozess zu dirigieren die funktionelle Herz 1,2 zu bilden. Cardiac Spezifikation, Differenzierung, Strukturierung und Kammer Reifung werden von kardiogenem Transkriptionsfaktoren 3 geregelt. Genetische Mutation oder posttranskriptionalen Aberration dieser Faktoren in Herzvorläuferzellen in entweder embryonale Letalität oder angeborene Herzfehler (CHD) 4 führen könnte. Die Studie von Herzmorphogenese erfordert ein Verständnis der inhärenten strukturellen Details in drei Dimensionen (3D) und einzelne Linie Herzvorläufer markierte Zelle während der Herzentwicklung verfolgt wird das Verständnis der Herzmorphogenese fördern. Eine Reihe von hochauflösenden Abschnitt basierte Tomographieverfahren wurden in th entwickelte vergangenen Jahrzehnten zu Bild Organstruktur 5,6; Allerdings erfordern diese Verfahren teuer, spezialisierte Instrumente, umfangreiche Arbeit, und es fehlt ihnen detaillierte strukturelle Organisation auf Einzelzellauflösung in das endgültige Volumen rekonstruiert Bild 7,8. 3D volumetrischen Bildgebung auf Einzelzellebene stellt ein Mittel Vorläuferzelldifferenzierung und Zellverhalten in vivo 7 zu untersuchen. Allerdings bleibt Gewebe Lichtstreuung das primäre Hindernis Zellen und Strukturen in 3D tief im Inneren des intakten Herzens Bildgebung. Lipide sind eine Hauptquelle der Lichtstreuung, und die Entfernung von Lipiden und / oder Einstellung des Brechungsindexunterschied zwischen Lipiden und deren Umgebung sind mögliche Ansätze zur Erhöhung der Gewebetransparenz 8. In den letzten Jahren wurde eine Reihe von Gewebeclearingverfahren entwickelt, das Gewebe Opazität und Lichtstreuung zu reduzieren, wie BABB (Benzylalkohol und Benzyl benzoate-Gemisch) und DBE (Tetrahydrofuran und Dibenzylether); aber bei diesen Verfahren, Fluoreszenzlöschung bleibt ein Problem 8-10. Die Lösungsmittelbasis hydrophile Methoden, wie SeeDB (Fructose / Thioglycerin) und 3DISCO (Dichlormethan / Dibenzylether), erhalten Fluoreszenzsignale, aber machen nicht das ganze Organ transparent 7,8,11. Im Vergleich dazu macht die CLARITY Gewebe-Clearing - Verfahren der Organ transparent, aber es erfordert eine spezialisierte Elektrophoreseautomat Lipide zu entfernen 8,12, ebenso wie PACT (passive Klarheit Technik), die auch Hydrogel 7,13 Einbettung erfordert. Detaillierte Informationen zu allen verfügbaren Gewebe-Clearing - Verfahren, siehe Tabelle 1 in Richardson und Lichtman et al. 7. Im Jahr 2011 Hama et al. Serendipitously eine hydrophile Mischung &#39;Sca le&#39; (Harnstoff, Glycerin und Triton X-100 - Gemisch) entdeckt , das macht das Gehirn der Maus und Embryo durchsichent während vollständig fluoreszierende Signale von markierten Klone 14 zu erhalten. Dies ermöglicht die Abbildung des intakten Gehirn in einer Tiefe von mehreren Millimetern und großen Rekonstruktion von neuronalen Populationen und Vorsprünge an einer subzellulären Auflösung. Susaki et al. weiter verbessert Sca le von Aminoalkoholen und entwickelte die &quot;CUBIC&quot; ( eine klare, uneingeschränkte Bildgebung des Gehirns Cocktails und Computeranalyse) Gewebe Clearing - Verfahren, das Phospholipid Solubilisierung reduziert Klärzeit erhöht und erlaubt für den Mehrfarbenfluoreszenzabbildung 8 hinzugefügt wird . In der vorliegenden Studie, die Vorteile der le Sca nehmen und CUBIC Gewebe Clearing Techniken und hochauflösende 3D - optischen Schneidens, einzelne Klone innerhalb des Herzens während der Herzentwicklung wurden unter Verwendung von Rosa26Cre ERT2 verfolgt 15, R26R-Confetti 16, &amp; alpha; MHC-Cre 17, cTnT-Cre 18, </strong&gt; NFATc1-Cre 19 und Rosa26-mTmG (mTmG) 20 Mauslinien. Die Kombination der whole mount - Färbung (WMS) Verfahren weiterhin für die Färbung von anderen Proteinen in markierten Klone und für die Untersuchung ihres Verhaltens in einem 3D - Volumen Kontext erlaubt zuvor 21,22 mit Gewebe Verrechnungsverfahren entwickelt. Die Kombination von Gewebe Clearing- und WMS ermöglicht ein besseres Verständnis der Rolle der verschiedenen Gene und Proteine ​​während der Herzentwicklung und der Ätiologie von angeborenen Herzfehlern. Dieses Protokoll kann angewandt werden, um andere Vorläuferzelldifferenzierung, Zellverhalten zu untersuchen und organ Morphogenese Ereignisse während der Entwicklung.

<table><tbody><tr><td>2,2&amp;prime;,2&amp;prime;&amp;rsquo;-nitrilotriethanol&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>90279</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyde in PBS</td><td>Affymetrix</td><td>19943</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fischer Scientific&amp;nbsp;</td><td>BP16000</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&amp;rsquo;,N&amp;rsquo;-tetrakis(2-hydroxypropyl) ethylenediamine&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>122262</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffer Saline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>Triton&amp;nbsp;X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U-1250</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8773</td><td></td></tr><tr><td>Tamoxifen</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T5648</td><td></td></tr><tr><td>Sunflower seed oil</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5007</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>PECAM (CD31)</td><td>BD Pharmingen&amp;nbsp;</td><td>550274</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-21247</td><td></td></tr><tr><td>DAPI nuclear stain</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>37&lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C Incubator</td><td>Thermoscientific Fischer</td><td>Heratherm, Compact Microbiological Incubators</td><td></td></tr><tr><td>48 well plates</td><td>Cell Treat</td><td>229148</td><td></td></tr><tr><td>Analytical Balance</td><td>Metler Toledo</td><td>PB153-S/FACT</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss 510 confocal microscope</td><td></td></tr><tr><td>Disecting Microscope</td><td>Unitron</td><td>Z850</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent microscope</td><td>Zeiss</td><td>Observer. Z1</td><td></td></tr><tr><td>Germinator 500 Glass Bead Sterilizer</td><td>CellPoint Scientific</td><td>GER-5287-120V</td><td></td></tr><tr><td>Light Source</td><td>SCHOTT</td><td>ACE I</td><td></td></tr><tr><td>Pair of Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 60 mm x15 mm&amp;nbsp;</td><td>TPP Techno Plastic Products AG</td><td>93060</td><td></td></tr><tr><td>Rocker II&amp;nbsp; Platform Rocker</td><td>Boekel Scientific</td><td>260350</td><td></td></tr><tr><td>Scintillating tubes</td><td>Fischer Scientific&amp;nbsp;</td><td>03-337-26</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipette</td><td>Samco Scientific</td><td>202</td><td></td></tr><tr><td>Tweezers</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging cleared embryonic and postnatal hearts at single-cell resolution

Einzel klonalen Verfolgung und Analyse auf Vollherzhöhe kann Herzvorläuferzellverhalten und Differenzierung während der Herzentwicklung, bestimmen und für die Untersuchung der zellulären und molekularen Grundlagen von normalen und abnormalen Herzmorphogenese ermöglichen. Neue aufkommende Technologien der retrospektiven Einzel klonalen Analysen machen die Untersuchung von Herz-Morphogenese auf Einzelzellauflösung möglich. Allerdings Gewebe Opazität und Lichtstreuung des Herzens als Abbildungstiefe von ganzem Herzen Bildgebung auf Einzelzellauflösung hinder erhöht. Um diese Hindernisse zu überwinden, eine ganze Embryo Clearing-System, das das Herz hoch transparent für beide Beleuchtung und Detektion machen können, müssen entwickelt werden. Zum Glück, in den letzten Jahren, viele Methoden für die ganze Organismus Clearingsystemen wie CLARITY, Sca le, SeeDB, ClearT, 3DISCO, kubisch, DBE, BABB und PACT berichtet. Dieses Labor ist daran interessiert, die zellulären und molekularen Mechanismen der KarteIAC Morphogenese. Vor kurzem haben wir einzelne Zelllinie über die ERT2 ROSA26-Cre Tracing; ROSA26-Confetti System zu dünn Label - Zellen während der Herzentwicklung. Wir passten mehrere ganze Embryo-Clearing - Methoden einschließlich Sca le und CUBIC (klar, ungehinderte Bildgebung des Gehirns Cocktails und Computeranalyse) mit whole mount Färbung Bild einzelne Klone im Inneren des Herzens , den Embryo in Kombination zu löschen. Das Herz wurde erfolgreich auf Einzelzell Auflösung abgebildet. Wir fanden , dass Sca le die embryonale Herz beseitigen können, aber die postnatale Herz nicht effektiv beseitigen können, während CUBIC die postnatale Herz beseitigen können, sondern schädigt die embryonale Herz durch das Gewebe auflöst. Die hier beschriebenen Methoden wird die Untersuchung der Genfunktion in einem einzigen Klon Auflösung während kardialen Morphogenese ermöglichen, was seinerseits die zellulären und molekularen Basis angeborener Herzfehler aufdecken kann.

Abbilden der gelöscht embryonale Herz Wirbelherzbildung ist ein räumlich - zeitlich geregelt morphogenic Prozess und hängt von der Organisation und Differenzierung von Vorläuferzellen aus vier verschiedenen Quellen 1. Zellen aus dem ersten Herzfeld des Herz Mondsichel wird in Richtung der ventralen Mittellinie falten, um eine lineare Herzrohr zu bilden. Die Zellen aus dem zweiten Herzfeld zunächst dorsomedial z...

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Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

We describe a protocol to volumetrically image fluorescent protein labeled cells deep inside intact embryonic and postnatal hearts. Utilizing tissue-clearing methods in combination with whole mount staining, single fluorescent protein-labeled cells inside an embryonic or postnatal heart can be imaged clearly and accurately.

Imaging Gelöscht Embryonale und postnatale Hearts bei Einzelzell-Auflösung

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

imaging-cleared-embryonic-postnatal-hearts-at-single-cell

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.1K Aufrufe.  Albany Medical College. We describe a protocol to volumetrically image fluorescent protein labeled cells deep inside intact embryonic and postnatal hearts. Utilizing tissue-clearing methods in combination with whole mount staining, single fluorescent protein-labeled cells inside an embryonic or postnatal heart can be imaged clearly and accurately. 

Serie: Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated discs, and costameres requires the coordinated assembly of multiple components in time and space. Disruption in assembly of these components leads to developmental heart defects. Immunofluorescent staining techniques are used commonly in cultured cardiomyocytes to probe myofibril maturation, but this ex vivo approach is limited by the extent to which myocytes will fully differentiate in culture, lack of normal in vivo mechanical inputs, and absence of endocardial cues. Application of immunofluorescence techniques to the study of developing mouse heart is desirable but more technically challenging, and methods often lack sufficient sensitivity and resolution to visualize sarcomeres in the early stages of heart development. Here, we describe a robust and reproducible method to co-immunostain multiple proteins or to co-visualize a fluorescent protein with immunofluorescent staining in the embryonic mouse heart and use this method to analyze developing myofibrils, intercalated discs, and costameres. This method can be further applied to assess cardiomyocyte structural changes caused by mutations that lead to developmental heart defects.

Mutations that lead to congenital heart defects benefit from in vivo investigation of cardiac structure during development, but high-resolution structural studies in the mouse embryonic heart are technically challenging. Here we present a robust immunofluorescence and image analysis method to assess cardiomyocyte-specific structures in the developing mouse heart.

Analyse Cardiomyocyte Entwicklung mit Immunfluoreszenz in embryonalen Maus Herz

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard microscopy techniques, due to the scattering of imaging light by the thick heart tissue, as these vessels are localized deep within the walls of the developing heart. As optical clearing of tissues using organic solvents such as BABB (1 part benzyl alcohol to 2 parts benzyl benzoate) has been shown to greatly improve the optical penetration depth that can be achieved, we combined clearance of whole, PECAM1-immunostained hearts, with laser-scanning confocal microscopy, in order to obtain high-resolution images of vessels throughout the entire heart. BABB clearance of embryonic hearts takes place rapidly and also acts to preserve the fluorescent signal for several weeks; in addition, samples can be imaged multiple times without loss of signal. This straightforward method is also applicable to imaging other types of blood vessels in whole embryos.

We present a protocol for the analysis of coronary vessels in whole embryonic murine hearts up to E15.5, using standard immunological staining methods followed by optical clearance and confocal microscopy. This technique enables visualization of blood vessels throughout the entire heart without the need for time-consuming analysis of serial sections.

Die Analyse der Herzkranzgefäße in Gelöscht Embryonale Herz

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development and organogenesis are two areas of research that have benefitted greatly from these advances, due to the high quality of data that can be obtained directly from imaging pre-implantation embryos or ex vivo organs. While pre-implantation embryos have yielded data with especially high spatial resolution, later stages have been less amenable to three-dimensional reconstruction. Obtaining high-quality 3D or volumetric data for known embryonic structures in combination with fate mapping or genetic lineage tracing will allow for a more comprehensive analysis of the morphogenetic events taking place during embryogenesis.
This protocol describes a whole-mount immunofluorescence approach that allows for the labeling, visualization, and quantification of progenitor cell populations within the developing cardiac crescent, a key structure formed during heart development. The approach is designed in such a way that both cell- and tissue-level information can be obtained. Using confocal microscopy and image processing, this protocol allows for three-dimensional spatial reconstruction of the cardiac crescent, thereby providing the ability to analyze the localization and organization of specific progenitor populations during this critical phase of heart development. Importantly, the use of reference antibodies allows for successive masking of the cardiac crescent and subsequent quantitative measurements of areas within the crescent. This protocol will not only enable a detailed examination of early heart development, but with adaptations should be applicable to most organ systems in the gastrula to early somite stage mouse embryo.

Here, we describe a protocol for whole mount immunofluorescence and image-based quantitative volumetric analysis of early stage mouse embryos. We present this technique as a powerful approach to qualitatively and quantitatively assess cardiac structures during development, and propose that it may be widely adaptable to other organ systems.

Quantitative ganze-Mount Immunfluoreszenz Analyse der kardialen Vorläuferzellen Populationen in Mausembryonen

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Capturing the Cardiac Injury Response of Targeted Cell Populations via Cleared Heart Three-Dimensional Imaging

Cardiovascular disease outranks all other causes of death and is responsible for a staggering 31% of mortalities worldwide. This disease manifests in cardiac injury, primarily in the form of an acute myocardial infarction. With little resilience following injury, the once healthy cardiac tissue will be replaced by fibrous, non-contractile scar tissue and often be a prelude to heart failure. To identify novel treatment options in regenerative medicine, research has focused on vertebrates with innate regenerative capabilities. One such model organism is the neonatal mouse, which responds to cardiac injury with robust myocardial regeneration. In order to induce an injury in the neonatal mouse that is clinically relevant, we have developed a surgery to occlude the left anterior descending artery (LAD), mirroring a myocardial infarction triggered by atherosclerosis in the human heart. When matched with the technology to track changes both within cardiomyocytes and non-myocyte populations, this model provides us with a platform to identify the mechanisms that guide heart regeneration. Gaining insight into changes in cardiac cell populations following injury once relied heavily on methods such as tissue sectioning and histological examination, which are limited to two-dimensional analysis and often damage the tissue in the process. Moreover, these methods lack the ability to trace changes in cell lineages, instead providing merely a snapshot of the injury response. Here, we describe how technologically advanced methods in lineage tracing models, whole organ clearing, and three-dimensional (3D) whole-mount microscopy can be used to elucidate mechanisms of cardiac repair. With our protocol for neonatal mouse myocardial infarction surgery, tissue clearing, and 3D whole organ imaging, the complex pathways that induce cardiomyocyte proliferation can be unraveled, revealing novel therapeutic targets for cardiac regeneration.

Cardiomyocyte proliferation following injury is a dynamic process that requires a symphony of extracellular cues from non-myocyte cell populations. Utilizing lineage tracing, passive CLARITY, and three-dimensional whole-mount confocal microscopy techniques, we can analyze the influence of a variety of cell types on cardiac repair and regeneration.

Erfassung der Herzverletzungsreaktion von gezielten Zellpopulationen über cleared Heart Three-Dimensional Imaging

Cardiovascular disease outranks all other causes of death and is responsible for a staggering 31% of mortalities worldwide. This disease manifests in ...

Live Imaging of Early Cardiac Progenitors in the Mouse Embryo

The first steps of heart development imply drastic changes in cell behavior and differentiation. While analysis of fixed embryos allows studying in detail specific developmental stages in a still snapshot, live imaging captures dynamic morphogenetic events, such as cell migration, shape changes, and differentiation, by imaging the embryo as it develops. This complements fixed analysis and expands the understanding of how organs develop during embryogenesis. Despite its advantages, live imaging is rarely used in mouse models because of its technical challenges. Early mouse embryos are sensitive when cultured ex vivo and require efficient handling. To facilitate a broader use of live imaging in mouse developmental research, this paper presents a detailed protocol for two-photon live microscopy that allows long-term acquisition in mouse embryos. In addition to the protocol, tips are provided on embryo handling and culture optimization. This will help understand key events in early mouse organogenesis, enhancing the understanding of cardiovascular progenitor biology.

We present a detailed protocol for mouse embryo culture and imaging that enables 3D + time imaging of cardiac progenitor cells. This video-toolkit addresses the key skills required for successful live imaging otherwise hard to acquire from text-only publications.

Live-Bildgebung früher kardialer Vorläuferzellen im Mausembryo

The first steps of heart development imply drastic changes in cell behavior and differentiation. While analysis of fixed embryos allows studying in detail ...

Isolierung von Zellkernen aus kardialen Vorläuferzellen der Maus mit Einzelzellauflösung

Nuclei Isolation from Mouse Cardiac Progenitor Cells for Epigenome and Gene Expression Profiling at Single-Cell Resolution

The developing heart is a complex structure containing various progenitor cells controlled by complex regulatory mechanisms. The examination of the gene expression and chromatin state of individual cells allows the identification of the cell type and state. Single-cell sequencing approaches have revealed a number of important characteristics of cardiac progenitor cell heterogeneity. However, these methods are generally restricted to fresh tissue, which limits studies with diverse experimental conditions, as the fresh tissue must be processed at once in the same run to reduce the technical variability. Therefore, easy and flexible procedures to produce data from methods such as single-nucleus RNA sequencing (snRNA-seq) and the single-nucleus assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (snATAC-seq) are needed in this area. Here, we present a protocol to rapidly isolate nuclei for subsequent single-nuclei dual-omics (combined snRNA-seq and snATAC-seq). This method allows the isolation of nuclei from frozen samples of cardiac progenitor cells and can be combined with platforms that use microfluidic chambers.

Autor im Rampenlicht: Zellkernisolierung aus kardialen Vorläuferzellen der Maus für die Erstellung von Epigenom- und Genexpressionsprofilen mit Einzelzellauflösung  

Here, we present a protocol describing cell nuclei preparation. After microdissection and enzymatic dissociation of cardiac tissue into single cells, the progenitor cells were frozen, followed by isolation of pure viable cells, which were used for single-nucleus RNA sequencing and the single-nucleus assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing analyses.

Zellkernisolierung aus kardialen Vorläuferzellen der Maus für die Erstellung von Epigenom- und Genexpressionsprofilen mit Einzelzellauflösung

The developing heart is a complex structure containing various progenitor cells controlled by complex regulatory mechanisms. The examination of the gene ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. Traditional light-sheet techniques involve the use of a single illumination beam directed orthogonally at sample tissue. Images of large samples that are produced using a single illumination beam contain stripes or artifacts and suffer from a reduced resolution due to the scattering and absorption of light by the tissue. This study uses a dual-sided illumination beam and a simplified CLARITY optical clearing technique for the murine heart. These techniques allow for deeper imaging by removing lipids from the heart and produce a large field of imaging, greater than 10 x 10 x 10 mm3. As a result, this strategy enables us to quantify the ventricular dimensions, track the cardiac lineage, and localize the spatial distribution of cardiac-specific proteins and ion-channels from the post-natal to adult mouse hearts with sufficient contrast and resolution.

This study uses a dual-sided illumination light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) technique combined with optical clearing to study the murine heart.

Licht-Blatt Fluoreszenzmikroskopie for the Study of Murine Herzen

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...

Biotechnik

Lichtblattmikroskopie und Gewebereinigung für eine umfassende kardiale Bildgebung

Light-Sheet Imaging to Reveal Cardiac Structure in Rodent Hearts

Light-sheet microscopy (LSM) plays a pivotal role in comprehending the intricate three-dimensional (3D) structure of the heart, providing crucial insights into fundamental cardiac physiology and pathologic responses. We hereby delve into the development and implementation of the LSM technique to elucidate the micro-architecture of the heart in mouse models. The methodology integrates a customized LSM system with tissue clearing techniques, mitigating light scattering within cardiac tissues for volumetric imaging. The combination of conventional LSM with image stitching and multiview deconvolution approaches allows for the capture of the entire heart. To address the inherent trade-off between axial resolution and field of view (FOV), we further introduce an axially swept light-sheet microscopy (ASLM) method to minimize out-of-focus light and uniformly illuminate the heart across the propagation direction. In the meanwhile, tissue clearing methods such as iDISCO enhance light penetration, facilitating the visualization of deep structures and ensuring a comprehensive examination of the myocardium throughout the entire heart. The combination of the proposed LSM and tissue clearing methods presents a promising platform for researchers in resolving cardiac structures in rodent hearts, holding great potential for the understanding of cardiac morphogenesis and remodeling.

Author Spotlight: Maßgeschneiderte Light-Sheet-Bildgebung zur Untersuchung von Myokardstrukturen in Nagetierherzen

The protocol utilizes advanced light-sheet microscopy along with adapted tissue clearing methods to investigate intricate cardiac structures in rodent hearts, holding great potential for the understanding of cardiac morphogenesis and remodeling.

Light-Sheet-Bildgebung zur Aufdeckung der Herzstruktur in Nagetierherzen

Light-sheet microscopy (LSM) plays a pivotal role in comprehending the intricate three-dimensional (3D) structure of the heart, providing crucial insights ...

Imaging Gelöscht Embryonale und postnatale Hearts bei Einzelzell-Auflösung

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Analyse Cardiomyocyte Entwicklung mit Immunfluoreszenz in embryonalen Maus Herz

Die Analyse der Herzkranzgefäße in Gelöscht Embryonale Herz

Quantitative ganze-Mount Immunfluoreszenz Analyse der kardialen Vorläuferzellen Populationen in Mausembryonen

Erfassung der Herzverletzungsreaktion von gezielten Zellpopulationen über cleared Heart Three-Dimensional Imaging

Live-Bildgebung früher kardialer Vorläuferzellen im Mausembryo

Zellkernisolierung aus kardialen Vorläuferzellen der Maus für die Erstellung von Epigenom- und Genexpressionsprofilen mit Einzelzellauflösung

Zellkernisolierung aus kardialen Vorläuferzellen der Maus für die Erstellung von Epigenom- und Genexpressionsprofilen mit Einzelzellauflösung

Zellkernisolierung aus kardialen Vorläuferzellen der Maus für die Erstellung von Epigenom- und Genexpressionsprofilen mit Einzelzellauflösung

Licht-Blatt Fluoreszenzmikroskopie for the Study of Murine Herzen

Light-Sheet-Bildgebung zur Aufdeckung der Herzstruktur in Nagetierherzen