We thank M.W. laboratory members for scientific discussion. This work is supported by AHA [13SDG16920099] to M.W., and by National Heart, Lung, and Blood Institute grants [R01HL121700] to M.W. Images were captured in the Imaging Core Facility at the Albany Medical College.

Alle Tierversuche wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) at Albany Medical College und ausgeführt zugelassen nach dem NIH Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren. 1. Lösung Vorbereitungen HINWEIS: Die Rosa26Cre ERT2 15, R26R-Confetti 16, &amp; alpha; MHC-Cre 17 und Rosa26-mTmG (mTmG) 20 Mauslinien wurden im Handel erworben cTnT-Cre 18 ein Geschenk von Dr. Jiao an der Universität von Alabama war NFATc1-Cre.. war 19 am Albert Einstein College of Medicine ein Geschenk von Dr. Bin Zhou. Mäuse wurden für mindestens 60 Sekunden durch Kohlendioxidinhalation in einer geschlossenen Kammer euthanasiert gefolgt durch physikalische Mittel Todes Überprüfung durch bilaterale Thorakotomie, Enthauptung oder zervikale Dislokation. <ol><li> Bereiten Sie Tamoxifen. Man löst 10 mg Tamoxifen in 10 ml Sonnenblumenkerne oil. Sobald es vollständig gelöst ist, aliquotieren und bei -20 ° C. </li><li> Bereiten phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Auflösen Na 2 HPO 4 (1,41960 g), KH 2 PO 4 (0,24496 g), NaCl (8,0669 g) und KCl (0,20129 g) in 1 l destilliertem Wasser und Einstellen des pH - Werts auf 7,4. </li><li> Bereiten PBST: 0,1% Tween-20-Lösung in PBS durch Auflösen von 100 &amp; mgr; l Tween-20 in 100 ml PBS. </li><li> Bereiten Sie Puffer blockiert. Machen 3% Rinderserumalbumin (BSA) Blockierungslösung durch Lösen von 3 g BSA in 100 ml PBST, enthaltend 0,2% Tween-20. </li><li> Bereiten Sie CUBIC-1 (Reagenz 1). Mischungs 25 wt% Harnstoff, 25 Gew% N, N, N &#39;, N&#39;-Tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylendiamin und 15 Gew% Triton X-100 in dH 2 O. </li><li> Bereiten Sie CUBIC-2 (Reagenz 2). Mischungs 50 Gew% Saccharose, 25 Gew% Harnstoff, 10 Gew% 2, 2 &#39;, 2&#39; &#39;- Nitrilotriethanol und 0,1% (v / v) Triton X-100 in dH 2 O. </li><li> Bereiten Sca le A2: 4 M Harnstoff, 10% w / v Glycerin und 0,1% w / v Triton X-100 in dH 2 O. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,7. </li><li> Bereiten Sca le B4: 8 M Harnstoff und 0,1% w / v Triton X-100 in dH 2 O. Stellen Sie den pH-Wert auf 8,7. </li><li> Bereiten Sca le 70: 4 M Harnstoff, 70% w / v Glycerin und 0,1% w / v Triton X-100 in dH 2 O. </li></ol> 2. Tamoxifen Induktion, Embryo Isolierung und Fixierung <ol><li> Tamoxifen Induktion und Embryo Isolation <ol><li> Mit Hilfe eines gekrümmten Ernährungsschlauch genehmigten Protokoll (ACUP 13-12007), Schlundsonde die weiblichen R26Cre ERT2 Confetti Mäuse (gesteckt von R26Cre ERT2 männliche Mäuse) mit 10 ug / g Tamoxifen an embryonalen Entwicklungs Tag E7.75 33. Bei embryonalen Tag 9,5 (E9.5) oder E10,5, einschläfern die weibliche Mäuse mit CO 2 und Genickbruch. </li><li> Nach Überprüfung der Maus Tod, öffnen Sie die Maus Bauchhöhle mit einer Schere (Abschnitt 1 Hinweis sehen) und das Uterushorn sezieren aus, die Eileiter Schichten mit Hilfe von Schere und Pinzette entfernen und wiederleasen die Embryonen aus dem Eileiter 23,24. <ol><li> Transfer der Embryonen auf eine Petrischale mit PBS (pH 7,4). Unter dem Binokular, entfernen Sie die nicht-embryonale Schichten (Chorion, Dottersack und Amnion) mit Hilfe einer Pinzette entfernen. </li></ol></li><li> Mit einer Pinzette und Schere, sammeln die weibliche Maus und Embryo Schwanz Proben für die Genotypisierung wie zuvor 22 berichtet. Mit Hilfe einer Plastikpipette, übertragen jeden Embryo in eine Vertiefung einer 48-Well-Platte mit 1 ml 1x PBS. </li><li> Unter einem Fluoreszenzmikroskop, identifizieren die GFP / RFP / GFP positive Embryonen über ein inverses Mikroskop mit einer Kamera. Schälen Sie die Herzbeutel mit einer Pinzette entfernt und drehen Sie das Herz / Embryo mit Hilfe von gebogenen Pinzette, um die Anzahl von fluoreszierenden Klone auf beiden Seiten des Herzens mit den GFP / RFP / CFP Filter zu bestimmen. Keine Schnitte erforderlich sind. </li></ol></li><li> GFP / RFP / GFP positive Embryonen Nach der Identifizierung, schnell die Embryonen waschen zweimal (je 2 min) mit 1x PBS in the 48 Well-Platte auf einem Plattenschüttler bei Raumtemperatur (RT). Dies wird überschüssiges Blut zu entfernen. </li><li> Befestigen Sie den Embryo / embryonale Herz mit 4% Paraformaldehyd (PFA) bei RT. Die Fixierungszeit ist abhängig von der embryonalen Alter und Gewebegröße. Für E9.5 fixieren den Embryo für 2 h bei RT. Die späten embryonalen Stadium Embryonen erfordern längere Fixierungszeit, die sogar bis 24 Stunden für die postnatale Herz verlängert werden kann. ACHTUNG: Paraformaldehyd ist giftig, sollte der Kontakt mit Haut, Augen und Schleimhäute. </li><li> Nach der Fixierung, waschen Sie den Embryo / Herz in der 48-Well-Platte zweimal (jeweils 10 Minuten) mit 1x PBS auf einem Plattenschüttler bei RT. Dies entfernt die überschüssige PFA aus dem Embryo / Herz. Die Embryonen werden dann weiter verarbeitet für ganze Berg Färbung und Gewebe Lichtung. </li></ol> 3. Ganze Berge Färbung HINWEIS: Nach dem PFA Fixierung der Embryo / Herz ganze Berg-Färbung wird wie folgt. <ol><li> Permeabilisierung den Embryo / Herz in einer 48-Well-Platte mit 1 ml von 0,1% PBST für 2 Stunden auf Plattenschüttler bei RT. </li><li> Nach Permeabilisierung, tauchen Sie den Embryo / Herz in 1 ml Blockierungspuffer, für 2 Stunden oder über Nacht auf einem Plattenschüttler bei 4 ºC. </li><li> Tauchen Sie den Embryo / Herz in die Endothelzellen-spezifischen Antikörper PECAM (CD31), verdünnt (1: 100) in 0,3 ml Puffer für 48 Stunden auf einem Plattenschüttler bei 4 ° C blockiert. </li><li> Waschen Sie den Embryo / Herz mit PBST 5-mal, jeweils 30 min bei RT auf einem Plattenschüttler. Dies entfernt den Überschuß unspezifische gebundenen primären Antikörpers aus dem Gewebe. </li><li> Tauchen Sie den Embryo / Herz in Alexa Fluor 647 Ziege anti-Ratte-Sekundär-Antikörper, verdünnt (1: 1000) in 1 ml Puffer für 48 Stunden auf einem Plattenschüttler bei 4 ° C blockiert. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 3.4 den sekundären Antikörper zu waschen. </li><li> Post-fix den Embryo / Herz mit 4% PFA für 1 h bei RT auf einem Plattenschüttler und waschen zweimal mit PBS jeweils 5 Minuten. </li><li> Stain den Embryo / Herz mit der Kernfärbung 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (verdünnt in PBST bei einer concentVerhältnis von 0,01 mg / ml) für 10 min auf Plattenschüttler bei RT. Folgen Sie mit zwei PBS Waschungen von jeweils 5 Minuten. </li></ol> 4. Embryo / Herz Clearing mit Sca l e oder CUBIC - Methode HINWEIS: Nach der ganze Berg Färbung der Embryo / Herz entweder auf die Sca le oder CUBIC Gewebe Clearing - Verfahren unterzogen wird. Die Wahl des Verfahrens hängt von der Gewebegröße und embryonalen Alter. Für E11,5 oder früheren Alter Embryonen, l e Gewebe Clearing- Verfahren Verwendung Sca, während für ältere Embryonen oder postnatale Herzen der CUBIC Gewebe Clearing- Verfahren wird bevorzugt. <ol><li> Scale-Tissue Clearing-Methode <ol><li> Inkubieren Sie den Embryo / Herz mit 1 ml Sca l e A2 - Lösung in einem Szintillationsphiole (eingewickelt in Alufolie) mit gelegentlichen sanften (von Hand) für 48 Stunden bei 4 ° C schütteln. </li><li> L e A2 Inkubation Nach Sca, Inkubation des Embryos / Herz mit 1 ml Sca l e B4 Lösung bei 4 ° C in der gleichen Fläschchen mit gelegentlichen sanften für anot Schüttelnsie 48 Stunden. </li><li> Inkubieren Sie den Embryo / Herz für weitere 48 Stunden mit 1 ml Sca l e 70 bei 4 ° C mit gelegentlichen leichtem Schütteln. Berg Embryo 90% Glycerin (siehe Abschnitt 5.1). </li></ol></li><li> CUBIC Tissue Clearing-Methode <ol><li> Für ganze Embryo / Herz CUBIC Lichtung, tauchen jeden Embryo / Herz in 1 ml CUBIC-1 mit gelegentlichen leichtem Schütteln für 48 Stunden bei 37 ºC 7. Nach 48 Stunden, um die Lösung mit dem gleichen Volumen an frischem CUBIC Reagenz 1, zu ersetzen und die Probe für weitere 48 Stunden bei 37 ° C mit gelegentlichem Schütteln mit der Hand inkubiert. </li><li> Waschen Sie die CUBIC-1 behandelt Herz / Embryo mit 1x PBS mehrmals bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln mit der Hand. Dies entfernt die überschüssige CUBIC-1-Lösung. </li><li> Nach CUBIC-1 mit PBS ausgewaschen, tauchen die Embryonen / Herzen in CUBIC-2-Lösung (1 g pro Embryo / Herz) für 48 Stunden bei 37 ° C mit gelegentlichen sanft mit der Hand schütteln. Dies folgt Embryo / Herz Montage Glycerin (siehe Abschnitt 50,2). </li></ol></li></ol> 5. Proben Montage und Imaging HINWEIS: Die geräumten Embryonen oder Organe in Sca l e 70 oder CUBIC-2 - Lösung kann mit Skala 70 und CUBIC-2 - Lösung als Abbildungsmedium direkt abgebildet werden, beziehungsweise. Betrachtet man jedoch die Anfälligkeit der embryonalen Proben Clearing Reagenzien, wenn die Proben nicht unmittelbar abgebildet werden, sondern langfristige, speichern Sie die Proben in 90% Glycerin nach dem Protokoll unten gespeichert. <ol><li> Direkt die Sca le in 1 ml 90% Glycerin und lagern bei 4 ° C bis zur Bildgebung gelöscht Probe tauchen. </li><li> Waschen Sie die CUBIC behandelte Probe mit 1x PBS zweimal, jeweils 5 min und Inkubation sequentiell die Probe mit 1 ml 30%, 50%, 70% und 90% Glycerin-Lösung jeweils für 30 min. </li><li> Zur Bebilderung, Transfer der Probe auf Glasboden Petrischale mit einer minimalen Menge von 90% Glycerin und Bild Klone mit einem konfokalen Mikroskop mit zwei Photonen-Fähigkeiten ausgestattet. </li><li> Bild das Herz oder Embryo im Glycerin mit einer 10X / 0.3 NA, ein 25X / 0,8 NA Tauch-, oder ein 40X / 1.2 NA Wasser Korrekturobjektivlinse. Bild DAPI unter Verwendung von 2-Photonen-Anregung von einer kohärenten Titan: Saphir-Laser-Chamäleon. Die Wahl des Mikroskops und die Objektivlinse von dem Zweck der Experimente abhängen wird, beispielsweise für Superauflösung, ein Lichtbogen Fluoreszenzmikroskop verwendet werden könnten. </li></ol>

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The authors declare no competing financial interests.

Der Embryo Isolation ist ein sehr wichtiger Schritt. E9.5 Embryonen sind sehr zerbrechlich und klein, so besonders darauf geachtet werden, sollten nicht die Embryo / Herzstrukturen während der Isolierung nicht zu beschädigen. Die nicht-embryonale zusätzliche Schichten des Embryos / Herz umhüllt sollte sorgfältig besonders entfernt werden, wenn die gesamte Embryo-Bildgebung. Auf diese Weise können Antikörper und Clearing-Mischung Eindringen tief in den embryonalen Geweben und hilft auch das Hintergrundsignal bei d...

Cardiac Morphogenese ist eine sequenzielle Ereignis, das die räumlich - zeitliche Organisation von vier verschiedenen Arten von Herzvorläuferzellen in verschiedene Sektoren des Herzens erforderlich ist , und erfordert auch mehrere Genregulationsnetzwerken diesen Prozess zu dirigieren die funktionelle Herz 1,2 zu bilden. Cardiac Spezifikation, Differenzierung, Strukturierung und Kammer Reifung werden von kardiogenem Transkriptionsfaktoren 3 geregelt. Genetische Mutation oder posttranskriptionalen Aberration dieser Faktoren in Herzvorläuferzellen in entweder embryonale Letalität oder angeborene Herzfehler (CHD) 4 führen könnte. Die Studie von Herzmorphogenese erfordert ein Verständnis der inhärenten strukturellen Details in drei Dimensionen (3D) und einzelne Linie Herzvorläufer markierte Zelle während der Herzentwicklung verfolgt wird das Verständnis der Herzmorphogenese fördern. Eine Reihe von hochauflösenden Abschnitt basierte Tomographieverfahren wurden in th entwickelte vergangenen Jahrzehnten zu Bild Organstruktur 5,6; Allerdings erfordern diese Verfahren teuer, spezialisierte Instrumente, umfangreiche Arbeit, und es fehlt ihnen detaillierte strukturelle Organisation auf Einzelzellauflösung in das endgültige Volumen rekonstruiert Bild 7,8. 3D volumetrischen Bildgebung auf Einzelzellebene stellt ein Mittel Vorläuferzelldifferenzierung und Zellverhalten in vivo 7 zu untersuchen. Allerdings bleibt Gewebe Lichtstreuung das primäre Hindernis Zellen und Strukturen in 3D tief im Inneren des intakten Herzens Bildgebung. Lipide sind eine Hauptquelle der Lichtstreuung, und die Entfernung von Lipiden und / oder Einstellung des Brechungsindexunterschied zwischen Lipiden und deren Umgebung sind mögliche Ansätze zur Erhöhung der Gewebetransparenz 8. In den letzten Jahren wurde eine Reihe von Gewebeclearingverfahren entwickelt, das Gewebe Opazität und Lichtstreuung zu reduzieren, wie BABB (Benzylalkohol und Benzyl benzoate-Gemisch) und DBE (Tetrahydrofuran und Dibenzylether); aber bei diesen Verfahren, Fluoreszenzlöschung bleibt ein Problem 8-10. Die Lösungsmittelbasis hydrophile Methoden, wie SeeDB (Fructose / Thioglycerin) und 3DISCO (Dichlormethan / Dibenzylether), erhalten Fluoreszenzsignale, aber machen nicht das ganze Organ transparent 7,8,11. Im Vergleich dazu macht die CLARITY Gewebe-Clearing - Verfahren der Organ transparent, aber es erfordert eine spezialisierte Elektrophoreseautomat Lipide zu entfernen 8,12, ebenso wie PACT (passive Klarheit Technik), die auch Hydrogel 7,13 Einbettung erfordert. Detaillierte Informationen zu allen verfügbaren Gewebe-Clearing - Verfahren, siehe Tabelle 1 in Richardson und Lichtman et al. 7. Im Jahr 2011 Hama et al. Serendipitously eine hydrophile Mischung &#39;Sca le&#39; (Harnstoff, Glycerin und Triton X-100 - Gemisch) entdeckt , das macht das Gehirn der Maus und Embryo durchsichent während vollständig fluoreszierende Signale von markierten Klone 14 zu erhalten. Dies ermöglicht die Abbildung des intakten Gehirn in einer Tiefe von mehreren Millimetern und großen Rekonstruktion von neuronalen Populationen und Vorsprünge an einer subzellulären Auflösung. Susaki et al. weiter verbessert Sca le von Aminoalkoholen und entwickelte die &quot;CUBIC&quot; ( eine klare, uneingeschränkte Bildgebung des Gehirns Cocktails und Computeranalyse) Gewebe Clearing - Verfahren, das Phospholipid Solubilisierung reduziert Klärzeit erhöht und erlaubt für den Mehrfarbenfluoreszenzabbildung 8 hinzugefügt wird . In der vorliegenden Studie, die Vorteile der le Sca nehmen und CUBIC Gewebe Clearing Techniken und hochauflösende 3D - optischen Schneidens, einzelne Klone innerhalb des Herzens während der Herzentwicklung wurden unter Verwendung von Rosa26Cre ERT2 verfolgt 15, R26R-Confetti 16, &amp; alpha; MHC-Cre 17, cTnT-Cre 18, </strong&gt; NFATc1-Cre 19 und Rosa26-mTmG (mTmG) 20 Mauslinien. Die Kombination der whole mount - Färbung (WMS) Verfahren weiterhin für die Färbung von anderen Proteinen in markierten Klone und für die Untersuchung ihres Verhaltens in einem 3D - Volumen Kontext erlaubt zuvor 21,22 mit Gewebe Verrechnungsverfahren entwickelt. Die Kombination von Gewebe Clearing- und WMS ermöglicht ein besseres Verständnis der Rolle der verschiedenen Gene und Proteine ​​während der Herzentwicklung und der Ätiologie von angeborenen Herzfehlern. Dieses Protokoll kann angewandt werden, um andere Vorläuferzelldifferenzierung, Zellverhalten zu untersuchen und organ Morphogenese Ereignisse während der Entwicklung.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="950">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">2,2&#8242;,2&#8242;&#8217;-nitrilotriethanol&#160;</td>
			<td style="width:192px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">90279</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4% Paraformaldehyde in PBS</td>
			<td style="width:192px;">Affymetrix</td>
			<td>19943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td style="width:192px;">Fischer Scientific&#160;</td>
			<td style="width:211px;">BP16000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetrakis(2-hydroxypropyl) ethylenediamine&#160;</td>
			<td style="width:192px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">122262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffer Saline</td>
			<td style="width:192px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">P5368-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton&#160;X-100</td>
			<td style="width:192px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Urea</td>
			<td style="width:192px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">U-1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Sucrose</td>
			<td style="width:192px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">84097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Glycerol</td>
			<td style="width:192px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">G8773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Tamoxifen</td>
			<td style="width:192px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">T5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Sunflower seed oil</td>
			<td style="width:192px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">S5007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween 20</td>
			<td style="width:192px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">PECAM (CD31)</td>
			<td>BD Pharmingen&#160;</td>
			<td style="width:211px;">550274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 647&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">DAPI nuclear stain</td>
			<td style="width:192px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">D9542</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">37oC Incubator</td>
			<td style="width:192px;">Thermoscientific Fischer</td>
			<td style="width:211px;">Heratherm, Compact Microbiological Incubators</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">48 well plates</td>
			<td style="width:192px;">Cell Treat</td>
			<td style="width:211px;">229148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Analytical Balance</td>
			<td style="width:192px;">Metler Toledo</td>
			<td>PB153-S/FACT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Zeiss 510 confocal microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Disecting Microscope</td>
			<td style="width:192px;">Unitron</td>
			<td style="width:211px;">Z850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescent microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Observer. Z1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Germinator 500 Glass Bead Sterilizer</td>
			<td style="width:192px;">CellPoint Scientific</td>
			<td style="width:211px;">GER-5287-120V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Light Source</td>
			<td style="width:192px;">SCHOTT</td>
			<td style="width:211px;">ACE I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pair of Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri dish 60x15mm&#160;</td>
			<td align="left">TPP Techno Plastic Products AG</td>
			<td>93060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Rocker II&#160; Platform Rocker</td>
			<td>Boekel Scientific</td>
			<td style="width:211px;">260350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scintillating tubes</td>
			<td style="width:192px;">Fischer Scientific&#160;</td>
			<td>03-337-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transfer pipette</td>
			<td style="width:192px;">Samco Scientific</td>
			<td style="width:211px;">202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tweezers</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging cleared embryonic and postnatal hearts at single-cell resolution

Einzel klonalen Verfolgung und Analyse auf Vollherzhöhe kann Herzvorläuferzellverhalten und Differenzierung während der Herzentwicklung, bestimmen und für die Untersuchung der zellulären und molekularen Grundlagen von normalen und abnormalen Herzmorphogenese ermöglichen. Neue aufkommende Technologien der retrospektiven Einzel klonalen Analysen machen die Untersuchung von Herz-Morphogenese auf Einzelzellauflösung möglich. Allerdings Gewebe Opazität und Lichtstreuung des Herzens als Abbildungstiefe von ganzem Herzen Bildgebung auf Einzelzellauflösung hinder erhöht. Um diese Hindernisse zu überwinden, eine ganze Embryo Clearing-System, das das Herz hoch transparent für beide Beleuchtung und Detektion machen können, müssen entwickelt werden. Zum Glück, in den letzten Jahren, viele Methoden für die ganze Organismus Clearingsystemen wie CLARITY, Sca le, SeeDB, ClearT, 3DISCO, kubisch, DBE, BABB und PACT berichtet. Dieses Labor ist daran interessiert, die zellulären und molekularen Mechanismen der KarteIAC Morphogenese. Vor kurzem haben wir einzelne Zelllinie über die ERT2 ROSA26-Cre Tracing; ROSA26-Confetti System zu dünn Label - Zellen während der Herzentwicklung. Wir passten mehrere ganze Embryo-Clearing - Methoden einschließlich Sca le und CUBIC (klar, ungehinderte Bildgebung des Gehirns Cocktails und Computeranalyse) mit whole mount Färbung Bild einzelne Klone im Inneren des Herzens , den Embryo in Kombination zu löschen. Das Herz wurde erfolgreich auf Einzelzell Auflösung abgebildet. Wir fanden , dass Sca le die embryonale Herz beseitigen können, aber die postnatale Herz nicht effektiv beseitigen können, während CUBIC die postnatale Herz beseitigen können, sondern schädigt die embryonale Herz durch das Gewebe auflöst. Die hier beschriebenen Methoden wird die Untersuchung der Genfunktion in einem einzigen Klon Auflösung während kardialen Morphogenese ermöglichen, was seinerseits die zellulären und molekularen Basis angeborener Herzfehler aufdecken kann.

Abbilden der gelöscht embryonale Herz Wirbelherzbildung ist ein räumlich - zeitlich geregelt morphogenic Prozess und hängt von der Organisation und Differenzierung von Vorläuferzellen aus vier verschiedenen Quellen 1. Zellen aus dem ersten Herzfeld des Herz Mondsichel wird in Richtung der ventralen Mittellinie falten, um eine lineare Herzrohr zu bilden. Die Zellen aus dem zweiten Herzfeld zunächst dorsomedial z...

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Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

We describe a protocol to volumetrically image fluorescent protein labeled cells deep inside intact embryonic and postnatal hearts. Utilizing tissue-clearing methods in combination with whole mount staining, single fluorescent protein-labeled cells inside an embryonic or postnatal heart can be imaged clearly and accurately.

Imaging Gelöscht Embryonale und postnatale Hearts bei Einzelzell-Auflösung

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

imaging-cleared-embryonic-postnatal-hearts-at-single-cell

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.1K Aufrufe.  Albany Medical College. We describe a protocol to volumetrically image fluorescent protein labeled cells deep inside intact embryonic and postnatal hearts. Utilizing tissue-clearing methods in combination with whole mount staining, single fluorescent protein-labeled cells inside an embryonic or postnatal heart can be imaged clearly and accurately. 

Serie: Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. One aspect of egg activation, conserved across all organisms examined, is a change in the intracellular concentration of calcium (Ca2+) often termed a 'Ca2+ wave'. While the speed and number of oscillations of the Ca2+ wave varies between species, the change in intracellular Ca2+ is key in bringing about essential events for embryonic development. These changes include resumption of the cell cycle, mRNA regulation, cortical granule exocytosis, and rearrangement of the cytoskeleton.
In the mature Drosophila egg, activation occurs in the female oviduct prior to fertilization, initiating a series of Ca2+-dependent events. Here we present a protocol for imaging the Ca2+ wave in Drosophila. This approach provides a manipulable model system to interrogate the mechanism of the Ca2+ wave and the downstream changes associated with it.

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

This article describes an adaptable ex vivo protocol for visualizing Ca2+ during egg activation in Drosophila.

Imaging Calcium in<em&gt; Drosophila</em&gt; Bei Eiaktivierung

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We first designed a reporter screen using MEFs from human CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) double transgenic mice. CD34+ cells from these mice label H2B histones with GFP, and cease labeling upon addition of doxycycline (DOX). MEFS were transduced with candidate TFs and then observed for the emergence of GFP+ cells that would indicate the acquisition of a hematopoietic or endothelial cell fate. Starting with 18 candidate TFs, and through a process of combinatorial elimination, we obtained a minimal set of factors that would induce the highest percentage of GFP+ cells. We found that Gata2, Gfi1b, and cFos were necessary and the addition of Etv6 provided the optimal induction. A series of gene expression analyses done at different time points during the reprogramming process revealed that these cells appeared to go through a precursor cell that underwent an endothelial to hematopoietic transition (EHT). As such, this reprogramming process mimics developmental hematopoiesis "in a dish," allowing study of hematopoiesis in vitro and a platform to identify the mechanisms that underlie this specification. This methodology also provides a framework for translation of this work to the human system in the hopes of generating an alternative source of patient-specific hematopoietic stem cells (HSCs) for a number of applications in the treatment and study of hematologic diseases.

The protocol described here details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts via overexpression of a minimal set of transcription factors. This technology may be translated to the human system to provide platforms for future study of hematopoiesis, hematologic disease, and hematopoietic stem cell transplant.

Maus Umprogrammieren Embryonale Fibroblasten mit Transkriptionsfaktoren ein Hemogenic Programm zu induzieren

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard microscopy techniques, due to the scattering of imaging light by the thick heart tissue, as these vessels are localized deep within the walls of the developing heart. As optical clearing of tissues using organic solvents such as BABB (1 part benzyl alcohol to 2 parts benzyl benzoate) has been shown to greatly improve the optical penetration depth that can be achieved, we combined clearance of whole, PECAM1-immunostained hearts, with laser-scanning confocal microscopy, in order to obtain high-resolution images of vessels throughout the entire heart. BABB clearance of embryonic hearts takes place rapidly and also acts to preserve the fluorescent signal for several weeks; in addition, samples can be imaged multiple times without loss of signal. This straightforward method is also applicable to imaging other types of blood vessels in whole embryos.

We present a protocol for the analysis of coronary vessels in whole embryonic murine hearts up to E15.5, using standard immunological staining methods followed by optical clearance and confocal microscopy. This technique enables visualization of blood vessels throughout the entire heart without the need for time-consuming analysis of serial sections.

Die Analyse der Herzkranzgefäße in Gelöscht Embryonale Herz

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

Kinase activity is crucial for a plethora of cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration, and apoptosis. During early embryonic development, kinase activity is highly dynamic and widespread across the embryo. Pharmacological and genetic approaches are commonly used to probe kinase activities. Unfortunately, it is challenging to achieve superior spatial and temporal resolution using these strategies. Furthermore, it is not feasible to control the kinase activity in a reversible fashion in live cells and multicellular organisms. Such a limitation remains a bottleneck for achieving a quantitative understanding of kinase activity during development and differentiation. This work presents an optogenetic strategy that takes advantage of a bicistronic system containing photoactivatable proteins Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) and the N-terminal domain of cryptochrome-interacting basic-helix-loop-helix (CIBN). Reversible activation of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway is achieved through light-mediated protein translocation in live cells. This approach can be applied to mammalian cell cultures and live vertebrate embryos. This bicistronic system can be generalized to control the activity of other kinases with similar activation mechanisms and can be applied to other model systems.

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

This protocol describes an optogenetic strategy to modulate mitogen-activated protein kinase (MAPK) activity during cell differentiation and Xenopus embryonic development. This method allows for the reversible activation of the MAPK signaling pathway in mammalian cell culture and in multicellular live organisms, like Xenopus embryos, with high spatial and temporal resolution.

Lichtvermittelte reversible Modulation des mitogenaktivierten Proteinkinase-Pathways während der Zelldifferenzierung und<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonale Entwicklung

Kinase activity is crucial for a plethora of cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration, and apoptosis. During early ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous system can be observed, with single cell resolution, in vivo. Here, we present an integrated protocol for the examination of neurodevelopment in C. elegans embryos. Our protocol combines imaging, lineaging and neuroanatomical tracing of single cells in developing embryos. We achieve long-term, four-dimensional (4D) imaging of living C. elegans&#160;embryos with nearly isotropic spatial resolution through the use of Dual-view Inverted Selective Plane Illumination Microscopy (diSPIM). Nuclei and neuronal structures in the nematode embryos are imaged and isotropically fused to yield images with resolution of ~330 nm in all three dimensions. These minute-by-minute high-resolution 4D data sets are then analyzed to correlate definitive cell-lineage identities with gene expression and morphological dynamics at single-cell and subcellular levels of detail. Our protocol is structured to enable modular implementation of each of the described steps and enhance studies on embryogenesis, gene expression, or neurodevelopment.

Here, we present a combinatorial approach using high-resolution microscopy, computational tools, and single-cell labeling in living C. elegans embryos to understand single cell dynamics during neurodevelopment.

Isotrope Licht-Sheet-Mikroskopie und automatisierte Zelllineage-Analysen zu Katalog-Caenorhabditis elegans Embryogenese mit subzellulärer Auflösung

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Capturing the Cardiac Injury Response of Targeted Cell Populations via Cleared Heart Three-Dimensional Imaging

Cardiovascular disease outranks all other causes of death and is responsible for a staggering 31% of mortalities worldwide. This disease manifests in cardiac injury, primarily in the form of an acute myocardial infarction. With little resilience following injury, the once healthy cardiac tissue will be replaced by fibrous, non-contractile scar tissue and often be a prelude to heart failure. To identify novel treatment options in regenerative medicine, research has focused on vertebrates with innate regenerative capabilities. One such model organism is the neonatal mouse, which responds to cardiac injury with robust myocardial regeneration. In order to induce an injury in the neonatal mouse that is clinically relevant, we have developed a surgery to occlude the left anterior descending artery (LAD), mirroring a myocardial infarction triggered by atherosclerosis in the human heart. When matched with the technology to track changes both within cardiomyocytes and non-myocyte populations, this model provides us with a platform to identify the mechanisms that guide heart regeneration. Gaining insight into changes in cardiac cell populations following injury once relied heavily on methods such as tissue sectioning and histological examination, which are limited to two-dimensional analysis and often damage the tissue in the process. Moreover, these methods lack the ability to trace changes in cell lineages, instead providing merely a snapshot of the injury response. Here, we describe how technologically advanced methods in lineage tracing models, whole organ clearing, and three-dimensional (3D) whole-mount microscopy can be used to elucidate mechanisms of cardiac repair. With our protocol for neonatal mouse myocardial infarction surgery, tissue clearing, and 3D whole organ imaging, the complex pathways that induce cardiomyocyte proliferation can be unraveled, revealing novel therapeutic targets for cardiac regeneration.

Cardiomyocyte proliferation following injury is a dynamic process that requires a symphony of extracellular cues from non-myocyte cell populations. Utilizing lineage tracing, passive CLARITY, and three-dimensional whole-mount confocal microscopy techniques, we can analyze the influence of a variety of cell types on cardiac repair and regeneration.

Erfassung der Herzverletzungsreaktion von gezielten Zellpopulationen über cleared Heart Three-Dimensional Imaging

Cardiovascular disease outranks all other causes of death and is responsible for a staggering 31% of mortalities worldwide. This disease manifests in ...

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and molecular complexity of skeletal elements increases with development. Tissue heterogeneity, such as at the interface of cartilaginous and osseous elements with each other or with surrounding tissues, is one obstacle to the study of developing cartilage and bone. Our protocol provides a rapid method of tissue processing and isolation of cartilage and bone that yields high quality RNA for gene expression analysis. Fresh frozen tissues of mouse embryos are sectioned and brief cresyl violet staining is used to visualize cartilage and bone with colors distinct from surrounding tissues. Slides are then rapidly dehydrated, and cartilage and bone are isolated subsequently by LCM. The minimization of exposure to aqueous solutions during this process maintains RNA integrity. Mouse Meckel&rsquo;s cartilage and mandibular bone at E16.5 were successfully collected and gene expression analysis showed differential expression of marker genes for osteoblasts, osteocytes, osteoclasts, and chondrocytes. High quality RNA was also isolated from a range of tissues and embryonic ages. This protocol details sample preparation for LCM including cryoembedding, sectioning, staining and dehydrating fresh frozen tissues, and precise isolation of cartilage and bone by LCM resulting in high quality RNA for transcriptomic analysis.

This protocol describes laser capture microdissection for the isolation of cartilage and bone from fresh frozen sections of the mouse embryo. Cartilage and bone can be rapidly visualized by cresyl violet staining and collected precisely to yield high quality RNA for transcriptomic analysis.

Laser Capture Mikrodissektion von Maus embryonalen Knorpel und Knochen für Die Genexpressionsanalyse

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular levels and provided cells for use in regenerative applications. Standard approaches for hESC culture using colony type culture to maintain undifferentiated hESCs and embryoid body (EB) and rosette formation for differentiation into different germ layers are inefficient and time-consuming. Presented here is a single-cell culture method using hESCs instead of a colony-type culture. This method allows maintenance of the characteristic features of undifferentiated hESCs, including expression of hESC markers at levels comparable to colony type hESCs. In addition, the protocol presents an efficient method for neural progenitor cell (NPC) generation from single-cell type hESCs that produces NPCs within 1 week. These cells highly express several NPC marker genes and can differentiate into various neural cell types, including dopaminergic neurons and astrocytes. This single-cell culture system for hESCs will be useful in investigating the molecular mechanisms of these processes, studies of certain diseases, and drug discovery screens.

Presented here is a protocol for the generation of a single-cell culture of human embryonic stem cells and their subsequent differentiation into neural progenitor cells. The protocol is simple, robust, scalable, and suitable for drug screening and regenerative medicine applications.

Effiziente neuronale Differenzierung mit einzelzellischer Kultur menschlicher embryonaler Stammzellen

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental biology. It has been successfully used to identify rare cell populations, discover novel marker genes, and decode spatial and temporal developmental information. The single cell method has also evolved from the microfluidic based Fluidigm C1 technology to the droplet-based solutions in the last two to three years. Here we used the heart as an example to demonstrate how to profile the mouse embryonic tissue cells using the droplet based scRNA-Seq method. In addition, we have integrated two strategies into the workflow to profile multiple samples in a single experiment. Using one of the integrated methods, we have simultaneously profiled more than 9,000 cells from eight heart samples. These methods will be valuable to the developmental biology field by providing a cost-effective way to simultaneously profile single cells from different genetic backgrounds, developmental stages, or anatomical locations.

Here we presented a multiplexed single cell mRNA sequencing method to profile gene expression in mouse embryonic tissues. The droplet-based single cell mRNA sequencing (scRNA-Seq) method in combination with multiplexing strategies can profile single cells from multiple samples simultaneously, which significantly reduces reagent costs and minimizes experimental batch effects.

Multiplexed Single Cell mRNA Sequenzierungsanalyse von Mausembryonalzellen

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental ...

Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and behave by observing the surface of a tissue. This method provides a means to visualize the complex 3-dimensional vascular architecture of the lung.
To accomplish this, a catheter is inserted into the pulmonary artery and the vasculature is simultaneously flushed of blood and chemically dilated to limit resistance. Lungs are then inflated through the trachea at a standard pressure and the polymer compound is infused into the vascular bed at a standard flow rate. Once the entire arterial network is filled and allowed to cure, the lung vasculature may be visualized directly or imaged on a micro-CT (&#181;CT) scanner.
When performed successfully, one can appreciate the pulmonary arterial network in mice ranging from early postnatal ages to adults. Additionally, while demonstrated in the pulmonary arterial bed, this method can be applied to any vascular bed with optimized catheter placement and endpoints.

The aim of this technique is ex vivo visualization of pulmonary arterial networks of early postnatal and adult mice through lung inflation and injection of a radio-opaque polymer-based compound via the pulmonary artery. Potential applications for casted tissues are also discussed.

Vaskuläres Gießen von Erwachsenen und frühpostnatalen Mauslungen für Micro-CT Imaging

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and ...