פרוטוקול זה מאפשר הדמיה של עוברי עכברים תוך כדי התפתחותם. זה מאפשר ללמוד קרדיוגנזה מוקדמת בפירוט. בדומה לצילום תמונות סטילס של עוברים מזויפים, הדמיה חיה מעניקה גישה מלאה לחקר תהליכים דינמיים בהתפתחות עוברים.
קשה להבין את הכישורים הנדרשים להדמיית חיים מפרסום טקסט בלבד. לראות אדם אחר עושה את זה הוא חיוני ללמוד. כדי להתחיל, לחתוך חתיכות חוט טונגסטן באורך סנטימטר אחד ולחדד אותם לקוטר 0.02 עד 0.05 מ"מ על ידי השקעת קצה החוט בתמיסת נתרן חנקתי רווי.
כדי להכין נימי זכוכית במרפקים, הניחו את נקודת האמצע של נימי זכוכית סטנדרטיים של מילימטר אחד מעל מצית בונזן למשך שלוש עד שש שניות, ומשכו באיטיות משני הקצוות עד שהנימים הופכים דקים וגמישים. לאחר מכן, שברו את הנימים לשניים וחממו אותו לזמן קצר כדי לייצר כיפוף של 90 מעלות שני סנטימטרים מהקצה. ראה חתיכת פולימתיל מתקרילט באורך של כשבעה מילימטרים, רוחב של ארבעה מילימטרים ועובי של שני מילימטרים.
החזיקו את חתיכת המתאקרילט באמצעות ספסל ספסל, ואז קדחו חורים מותאמים אישית לרוחב דרך כל היצירה. סובב את המקדחה באיטיות תוך הפעלת לחץ נמוך אך קבוע. השתמשו בקובץ עדין כדי להחליק את קצה המחזיק ולהתאים את גודלו.
בנוסף, צרו שיפוע מתון בשולי המחזיק כדי להקל על מיקום העובר. מניחים את המחזיק המוגמר בכלי עם מים מזוקקים כדי לשטוף אותו. תחת מיקרוסקופ סטריאו, בדוק את המחזיק כדי לראות אם החורים מכילים אבק קידוח.
אם קיים אבק, השתמש במחטי טונגסטן כדי להסיר אותו. כדי לעקר את המחזיק, הניחו אותו בצינור חרוטי מלא במים מזוקקים וסוניקו למשך 20 דקות עם תפוקת חשמל מינימלית של 20 וואט. לחלץ את הרחם מתוך יום עוברי המתת חסד 6.75 עד 7.5 עכבר בהריון ולהניח אותו על מגבון נייר יבש ונקי.
לאחר מכן, חותכים את הרחם, מכניסים את קצה המספריים העדינים מהצד המזום, ומחליקים את הלהב לאורך כדי לחשוף את הדיסקציה, ומעבירים אותם למדיום הדיסקציה. לנתח את העוברים, שמירה על חרוט ectoplacental שלם. לאחר מכן, מקלפים את קרום רייכטר, ומשאירים חלק ממנו על האזור העוברי הנוסף.
כדי לשמור על חום בינוני, החליפו אותו כל 10 דקות. יתר על כן, לנתח decidui בקבוצות של שלושה עד ארבעה תוך שמירה על השאר במדיום דיסקציה ממוקם באמבטיה 37 מעלות צלזיוס. הניחו מיד את העוברים המנותחים במדיום תרבית.
בחר את העוברים עם התכונות הפלואורסצנטיות הרצויות באמצעות מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי והנח אותם בצינור המכיל את מדיום התרבית באינקובטור תרבית התא כדי להתאושש במשך שעתיים לפני ההדמיה. לאחר הפעלת כל רכיבי המיקרוסקופ, כולל מחשב, תוכנה ולייזרים, הפעילו את בקר הפחמן הדו-חמצני והגדירו אותו ל-7%, הניחו טיפת שומן סיליקון בוואקום גבוה על צלחת 35 מ"מ עם תחתית כיסוי זכוכית. הניחו את המחזיק על גבי הטיפה ולחצו בעדינות כדי לשתק אותו.
להרכבת עוברים יש להעביר שניים עד שלושה עוברים מהאינקובטור לצלחת עם מחזיק. בעזרת זוג מלקחיים ומחט טונגסטן מחודדת, הניחו את העוברים בחורים. השתמש במחט כדי לחבר את העובר על ידי חרוט ectoplacental ולהכניס אותו לתוך חור תואם גודל.
בזהירות להעביר את הכלים המכילים את העוברים ואת המחזיק אל צלחת המיקרוסקופ. מנמיכים את המטרה עד להיווצרות מניסקוס נוזלי בממשק האובייקטיבי הבינוני. לאחר הנחת העובר בפוקוס, הרכיבו את תא הדגירה ואטמו אותו סביב המטרה באמצעות סרט הדבקה.
באמצעות לכידה חיה בתוכנת בקרת המיקרוסקופ, התאם את תפוקת הלייזר ואת רמות הרווח. לאחר מכן, מכסים את המדיום בשמן פרפין על ידי טפטוף איטי על המטרה. הגדר הקלטת קיטועי זמן.
הגדר מרווח של חמש עד 10 דקות עם מרווח Z של שלושה עד חמישה מיקרון בין הערימות. השאירו חלל ריק מעל Z-Stack כדי לצפות את גדילת העוברים. מינימום 50 מיקרון, הוספת 30 מיקרון לכל שעה שהרכישה לא תהיה מפוקחת.
הפעל את אפשרות השמירה האוטומטית כדי לאפשר פיקוח על הרכישה ממחשב כדי לאפשר התאמה של גודל Z-Stack במידת הצורך, כך שיתאים לתחום העניין שבפוקוס. התפתחות לב עובר חי בכל הגוף על ידי הדמיית מולטיפוטון מוצגת. ביום העוברי 7.5, פלואורסצנטיות ורידית קיימת בכל האקטודרם העצבי, עם כמה גרעינים חיוביים במזודרם הספלנצ'ני והעוברי הנוסף.
לאחר ארבע שעות, אבות אנדותל מפעילים ורידי ומתכנסים ליצירת צינור אנדוקר ואבי העורקים התחתון, אשר הופכים למבנים סגורים לאחר שבע שעות. היזהרו בעת הסרת קרום הרייכטר. זה יכול להיות ממש דבוק לעובר, במיוחד בשלבים prevacillation.
במהלך ההסרה, נסה לצבוט את הקרום על ידי האזור העוברי הנוסף.
