This work is supported by a Research Grant from Dialysis Clinics Inc. and from the University of Missouri Research Board Grant.

כל הצעדים פרוטוקול ביצע היו נבדקה ואושרה על ידי אוניברסיטת טיפול בבעלי חיים מיזורי ועדת שימוש (ACUC). עבור פרוטוקול זה, זכר C57Bl / 6 עכברים בני 15 שבועות נוצלו אמנם תיאורטית כל מכרסם בכל גיל יכול לשמש בניסויים. מאז, זה הוא ניתוח שאינו הישרדות, המתת חסד מושגת על ידי exsanguination ו pneumothorax בין שתי המדינות. זלוף 1. של הכליות הערה: זלוף של איברים כמו לב, כבד וכליות מסיר את הדם אשר עלולים להפריע הפרשנות של נתונים. לפיכך, אם אפשר אנחנו תמיד perfuse האיברים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר בתוך isoflurane (3 מ&quot;ל / דקה) תא אינדוקציה עד שזה נייח. בשלב הבא, להסיר את העכבר מתוך החדר, ולהניח אותה dorsally על שולחן הניתוח והמקום חרוט isoflurane על האף העכבר ולדחוף isoflurane בשיעור של 1.5 מ&quot;ל / דקה דרך הרגולטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את respons קמצוץ הבוהןדואר עם פינצטה כדי להעריך אם החיה השיגה מטוס של הרדמה כירורגית. נקו את הבטן הגחון עם מליחים לחתוך את הבטן עם מספריים לדחוף את אברי הבטן (מתוך בתחום כירורגית) אל הצד השמאלי של העכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף דם מן הווריד הנבוב נחות עם מד 25-קבוע מחט מזרק 1 סמ&quot;ק ולהוסיף אותו צינור 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge המכיל 10 μl של 0.5M EDTA. הערה: אוסף של דם הוא אופציונלי. פלזמה ניתן להשתמש למדידות ביוכימיים. לויקוציטים ניתן להשתמש עבור מבחני cytometry הזרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים, לעשות חתך קטן הפרוזדורים זכות לאפשר את התערובת של דם PBS מהשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח מזרק 50 סמ&quot;ק ולמלא עם PBS קר כקרח (20-30 סמ&quot;ק). לאחר מכן, לצרף מחט G 21-25 על המזרק, לנקב את החדר השמאלי בשיא גודלה היחסי (תוך כדי לחיצה על הלב בעדינות בין מלקחיים) ולאט לאט perfuse החדר השמאלי עם pH בופר פוספט 7.4 (PBS) במשךשל 1-2 דקות. הערה: הלב מייד מחוויר על המ&quot;ל של זלוף הראשון. שים הכבד לצורך לבן, כמו זו מצביעה על כך זלוף ניקוז דם מתוך הכבד באמצעות החזר ורידי דרך הווריד הנבוב. בנוסף, לוודא כי הריאות הם אינם מרחיבים במהלך העירוי כמו זה מציין לנקב של החדר הימני. אם הריאות היו להתרחב, לשלוף את המחט מעט לאחור לתוך החדר השמאלי ולהמשיך זלוף. הזמן שלוקח מן החתך הראשון עד המתת חסד מושגת הוא פחות מ -2 דקות </li></ol> Dissection 2. של הכליות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר זלוף תושלם, השתמש מספריים מלקחיים לנתח בכליה הימנית מן ונספחיו (כלי דם, שומן ובלוטות יותרת הכליה) ובלו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוצא בעדינות את הקפסולה כיסוי הכליה ידי גזירה לנתח עם מלקחיים. לשקול את הכליה. הערה: שקילת הכליה היא אופציונלית. עם זאת, כמה ניסוייםעלול לגרום לשינוי גודל כליה / משקל אשר עשוי לשמש כדי לנרמל תשואת תא לגרם של רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שקילת כליות, למקם אותו 1 מ&quot;ל של RPMI-1640 המכיל FBS 0.5% או cytometry זרימה פתרון חיץ מכתים (צינור מתברג חרוטי 50 מ&quot;ל) והמקום צינור על הקרח עד לשימוש נוסף. הערה: על מנת להקל על התיאור, נתאר את שאר בידוד של תאים חיסוניים זרימת cytometry פתרון חיץ מכתים. בנוסף, נתאר בידוד של תאים חיסוניים כליה אחת, אם כי שתי הכליות או 1 + 1/3 rd של הכליות ניתן להשתמש בהתאם הניסויים במורד הזרם (לא חובה). 1/3 rd של הכליה יכול להיות קפוא לניסויים חלבון / RNA ו- 1/3 rd ניתן להציב מאגרים עבור במיקרוסקופ אלקטרונים אימונוהיסטוכימיה או שידור. </li></ol> המגון 3. כליות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבל שקית המגון קיבולת 5-80 מ&quot;ל עם פרטי זיהוי מדגם,להסיר את המסננת בפנים (STR) וזורק אותו. מלא את השקית עם 5 מיליליטר של קרח קר cytometry זרימת פתרון מכתים הצפה ולהעביר כליות למאגר. חזור על תהליך זה למדגם שני או יותר דגימות כי צריך עיבוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקפלים את השקית המגון לשניים, כאלה שחצי אחד יש את הכליה שקוע בפתרון מכתים הצפת cytometry זרימה ואת החצי השני הוא מקופל פשוט על זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את homogenizer רקמות ולהגדיר אותו מהר סל&quot;ד (הגדרה). מניח את שקית המגון המקופלת עם הכליות מול ההנעה, קרובה לקצה התחתון אבל לוודא את החלק התחתון של השקיות אין לרדת אל מתחת לגבול התחתון של המשוטים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבד המדגם השני בו זמנית שכן ישנם 2 משוטים. בחר זמן כמו 120 שניות. שימו לב משוטים לנוע קדימה ואחורה כדי homogenize הכליות. הערה: בינתיים, השבתה זו ניתן להשתמש כדי להכין 2 כליות יותר (או רקמות אחרות) דגימות בעוד השניים הראשונים מעבדים. </li></ol&gt; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שסיים עם סט של הומוגניזציה ראשון, להעביר את השקיות לקרח וטען מחדש את homogenizer הרקמות עם הסדרה הבאה של דגימות וכן הלאה. ראייה להבטיח כי הכליות הן הומוגני כראוי ולא נתחים גדולים גלויים. הערה: באופן כללי, 2 דקות בתוך homogenizer רקמות בסל&quot;ד מהר היא נאותה עבור הכליה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים מסננת תא 100 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי 50 מ&quot;ל על הקרח. הבא, פיפטה homogenate לחלוטין על מסננת התא. גדר בצנטריפוגה רצפה 50 XG דקות 1 ב 4 ° C ו לטעון את הדגימות לתוך צנטריפוגות. הערה: צנטריפוגה יבטיח שכל homogenate (התאים המכילים) עברו דרך מסננת התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצינורות מתוך צנטריפוגה ומניח אותם בחזרה על קרח. מחק את מסננות תא ולשמור את homogenate. להוסיף נפח שווה (~ 6 מ&quot;ל) של חיץ תמוגה 1x RBC אל התא גלולה / supernatant ו פיפטה מעלה ומטה מספר פעמים כדי לעשות השעיה תא אחיד. Visually, להתבונן חלק הצבע האדום בירידת ההשעיה מיידית. השאירו את הצינורות על קרח למשך 5 דקות כדי להשיג תמוגה RBC מקסימלית. הערה: צעד תמוגה RBC ניתן לדלג אם החוקר הוא בטוח של זלוף כליות מניפולצית תא פחות היא רצויה. ראינו עלייה משמעותית בתשואה תא כליות בכך שלא להעמיד את ההשעיה תא תמוגה RBC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין צינורות בצנטריפוגה כי הוגדרה 500 XG, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי ליצור תא גלולה. הערה: במהלך שלבים 3.6 ו -3.7, להתכונן סיליקה colloidal (Percoll) צנטריפוגה שיפוע צפיפות מבוססת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 10 מיליליטר עגול צינורות פוליפרופילן תחתונים ומדביק תוויות עם מספרי מדגם מקבילים ומניח אותם מתלים צינור. הערה: להלן תיאור איך לעשות ריאגנטים שיפוע צפיפות מספיק ל -4 דגימות כליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 7 מ&quot;ל של cytometry זרימה פתרון מכתים הצפת פיפטה אותו לתוך צינור חרוטי 15 מ&quot;ל. הוסף 1 מ&quot;ל של 2 M סוכרוזלהכין 0.25 M סוכרוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, לקחת 7.2 מ&quot;ל של ריאגנט מפל צפיפויות פיפטה אותו לתוך 15 מ&quot;ל צינור אחר חרוטי. להוסיף 1.55 מ&quot;ל של cytometry זרימה פתרון מכתים הצפת 1.25 מ&quot;ל של 2 M סוכרוז להכין 72% מגיב צפיפות שיפוע 0.25 M סוכרוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 1 מ&quot;ל של ריאגנט שיפוע צפיפות 72% לתוך צינור פוליפרופילן אחד עגול התחתונה עבור כל דגימה. </li></ol></li></ol> 4. צנטריפוגה שיפוע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שלב 3.7, לקחת את הצינורות החוצה בעדינות למזוג supernatant בתנועה אחת חלקה גם למזוג הטיפה הבאה של נוזל המהווה תוך הצינור מוחזק במהופך. הערה: שלב זה חשוב מאז והותיר אחריו נוזל עודף יכול לשנות את שיפוע הצפיפות מספיק כדי ליצור וריאציה בתשואות. כאשר הצינור מוגדר בחזרה זקוף, ~ 200-300 μl של נוזל נשאר עם תא גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 1 מ&quot;ל של 0.25 M סוכרוז על תא גלולה בעדינות אך בתקיפות פיפטה מעלה ומטה כדי בריןg לתאי השעיה אחידה. לאחר מכן, להוסיף את ההשעיה תא 1 מ&quot;ל ריאגנט שיפוע צפיפות 72% (3.7.4) ושוב פיפטה במרץ לערבב את התאים כדי ליצור מגיב שיפוע צפיפות 36%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 1 מ&quot;ל של מגיב שיפוע צפיפות 72% לתוך פיפטה פוליפרופילן פסטר (העברה). עם לחץ גם על הנורה (שומר על העמודה הנוזלת בקצה ומונע היווצרות בועה), הכנס את פיפטה פסטר לתחתית השעית התא (מגיב שיפוע צפיפות 36%) בעדינות ולפרוק מגיבים שיפוע צפיפות 72% כדי ליצור שכבת כבד ברורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק דוגמיות בעדינות ומניחים לתוך צנטריפוגות, שהוא בטמפרטורת החדר למשך שלב זה. ספין במשך 20-30 דקות ב g 500 x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים מכין עוד שני סטים של פוליפרופילן עגול צינורות צנטריפוגה בתחתית עם מזהי מדגם המקבילים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שלב 4.4 יושלם, להסיר את המדגם המכיל צינורות פוליפרופילן בעדינות, עם רעד מינימאלי ולהגדיר אותו למטהעל מתלה צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרים את צינור הדגימה הראשון שפופרת הריקה המתאימה לו. עם טפטפת פוליפרופילן פסטר, בעדינות אך ביסודיות עם שאיבה נמדדת, להסיר את &quot;שכבת זבל&quot; העליונה או &quot;חומר דביק&quot; והכניס אותו לתוך הצינור צנטריפוגות תחתי העגול הריק. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך הסרת החלק העליון של שיפוע עד &quot;מעיל באפי&quot; הוא הגיע (עשוי להופיע מחוץ לבן עם גוון אדמדם [תאי הדם האדומים]). עצור שאיבת אם לגובה של ~ 3 מ&quot;מ הוא הגיע מן &quot;מעיל באפי&quot;. הערה: ודא כי החומר הזה נעלם לחלוטין מהחלק העליון של השיפוע לפני שתמשיך יניקה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח פיפטה פסטר טרי צינור צנטריפוגות תחתית עגול טרי בעדינות להסיר את המעייל באפים. המשך כדי לשאוב 3 - 5 מ&quot;מ מתחת מעיל באפי, על מנת להבטיח כי רוב התאים נאספים והוסיף אל הצינור התחתון ה -2 nd חדש עם מזהה מדגם המתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1-2 מ&quot;ל of cytometry זרימה מכתים הצפת הפתרון הצינור 2 nd ומערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה התאים ב XG 500 עבור 5 דקות ב 4 ° C. צעד לשטוף 2 nd עם פתרון חיץ מכתים cytometry זרימה הוא אופציונלי. Resuspend ב 500 μl של פתרון cytometry זרימה מכתים הצפת והמשך לספור תאים באמצעות hemocytometer. </li></ol> 5. אופציונלי (תיוג תא) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliqout כל דגימה עבור אותו מספר של תאים. מוסיפים את הנוגדן חסימת בדילול של 0.5 מיקרוגרם לכל 10 6 תאים (CD16 אנטי / CD32 FCR) דגירה על קרח למשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את קוקטייל הרצוי של נוגדנים ראשוניים (מצומדות כדי fluorophores המתאים) אשר נקבעים לעבוד היטב אחד עם השני על ידי החוקר, לפני הניסויים בפועל. דגירה על קרח למשך 30 דקות. שוטפים את התאים עם PBS. הערה: ההפגנה של תיוג תא חיסון כלית כתב היד הזה, השתמשנו T-lymphocyte ולוח תא מקרופאג / הדנדריטים. הפאנל T-לימפוציטים כללה FVS510 הכתם הכדאיות ניתן לתקן, אנטי CD45 (שיבוט: 30-F11) BV421, אנטי-Foxp3 (Clone: ​​FJK-16s) APC, אנטי-CD127 (Clone: ​​A7R34) PE / Cy7, אנטי CD44 (Clone: ​​IM7) PerCP / Cy5.5, אנטי CD4 (Clone: ​​RM4-5) APC-Cy7, אנטי CD8 (Clone: ​​53-6.7) BV785. פנל מקרופאג כלל FVS510 כתם הכדאיות ניתן לתקן, אנטי CD45 (שיבוט: 30-F11) BV421, אנטי-Ly6G (Clone: ​​1A8) FITC, אנטי-CD11b (Clone: ​​M1 / ​​70) PerCP-Cy5.5, Anti- F4 / 80 (Clone: ​​BM8) APC, אנטי CD11c (Clone: ​​N418) BV785. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף את כתם הכדאיות ניתן לתקן ולהשאיר על-גבי ספסל למשך 5 דקות. שוטפים את התאים עם פתרון מכתים הצפת cytometry זרימה כדי להסיר עודפי של Stain הכדאיות ניתן לתקן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מגיב קיבוע / Permeabilization דגירה לילה ב 4 מעלות צלזיוס. לשטוף בתמיסת permeabilization. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כתם תאי, לחסום שוב עם אנטי CD16 / 32 FCR עבור 10min. מוסיפים את כתמי תאיים דגירה במשך 20-30 דקות. 2x לשטוף PEפתרון rmeabilization. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend ב cytometry זרימה מכתים מאגר דגימות פתרון וברח דרך FACS מכונת 3,9. </li></ol>

<ol>
	<li>Ascon, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+functional+characterization+of+kidney-infiltrating+lymphocytes+in+renal+ischemia+reperfusion+injury.">Phenotypic and functional characterization of kidney-infiltrating lymphocytes in renal ischemia reperfusion injury.</a> J. Immunol. 177 (5), 3380-3387 (2006).</li><li>Ascon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+ischemia-reperfusion+leads+to+long+term+infiltration+of+activated+and+effector-memory+T+lymphocytes.">Renal ischemia-reperfusion leads to long term infiltration of activated and effector-memory T lymphocytes.</a> Kidney Int. 75 (5), 526-535 (2009).</li><li>Belliere, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+macrophage+subtypes+influence+the+progression+of+rhabdomyolysis-induced+kidney+injury.">Specific macrophage subtypes influence the progression of rhabdomyolysis-induced kidney injury.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 26 (6), 1363-1377 (2015).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagenase+digestion+down-regulates+the+density+of+CD27+on+lymphocytes.">Collagenase digestion down-regulates the density of CD27 on lymphocytes.</a> J. Immunol. Methods. 413, 57-61 (2014).</li><li>Dong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resident+dendritic+cells+are+the+predominant+TNF-secreting+cell+in+early+renal+ischemia-reperfusion+injury.">Resident dendritic cells are the predominant TNF-secreting cell in early renal ischemia-reperfusion injury.</a> Kidney Int. 71 (7), 619-628 (2007).</li><li>Hickey, F. B., Martin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetic+kidney+disease+and+immune+modulation.">Diabetic kidney disease and immune modulation.</a> Curr. Opin. Pharmacol. , (2013).</li><li>Kawakami, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resident+renal+mononuclear+phagocytes+comprise+five+discrete+populations+with+distinct+phenotypes+and+functions.">Resident renal mononuclear phagocytes comprise five discrete populations with distinct phenotypes and functions.</a> J. Immunol. 191 (6), 3358-3372 (2013).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+glomeruli+from+mice:+A+practical+approach+for+beginners.">Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners.</a> Exp. Ther. Med. 5 (5), 1322-1326 (2013).</li><li>Picot, J., Guerin, C. L., Le Van, K. C., Boulanger, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+retrospective,+fundamentals+and+recent+instrumentation.">Flow cytometry: retrospective, fundamentals and recent instrumentation.</a> Cytotechnology. 64 (2), 109-130 (2012).</li><li>Ricardo, S. D., van, G. H., Eddy, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+diversity+in+renal+injury+and+repair.">Macrophage diversity in renal injury and repair.</a> J. Clin. Invest. 118 (11), 3522-3530 (2008).</li><li>Rodriguez-Iturbe, B., Pons, H., Herrera-Acosta, J., Johnson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+immunocompetent+cells+in+nonimmune+renal+diseases.">Role of immunocompetent cells in nonimmune renal diseases.</a> Kidney Int. 59 (5), 1626-1640 (2001).</li><li>Vielhauer, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+renal+recruitment+of+macrophages+and+T+cells+in+mice+lacking+the+duffy+antigen/receptor+for+chemokines.">Efficient renal recruitment of macrophages and T cells in mice lacking the duffy antigen/receptor for chemokines.</a> Am. J. Pathol. 175 (1), 119-131 (2009).</li><li>Weisheit, C. K., Engel, D. R., Kurts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+Cells+and+Macrophages:+Sentinels+in+the+Kidney.">Dendritic Cells and Macrophages: Sentinels in the Kidney.</a> Clin. J. Am. Soc. Nephrol. , (2015).</li><li>Williams, S. K., McKenney, S., Jarrell, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagenase+lot+selection+and+purification+for+adipose+tissue+digestion.">Collagenase lot selection and purification for adipose tissue digestion.</a> Cell Transplant. 4 (3), 281-289 (1995).</li><li>Yamamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deterioration+and+variability+of+highly+purified+collagenase+blends+used+in+clinical+islet+isolation.">Deterioration and variability of highly purified collagenase blends used in clinical islet isolation.</a> Transplantation. 84 (8), 997-1002 (2007).</li><li>Zhou, J., Nagarkatti, P., Zhong, Y., Nagarkatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+modulation+by+chondroitin+sulfate+and+its+degraded+disaccharide+product+in+the+development+of+an+experimental+model+of+multiple+sclerosis.">Immune modulation by chondroitin sulfate and its degraded disaccharide product in the development of an experimental model of multiple sclerosis.</a> J. Neuroimmunol. 223 (1-2), 55-64 (2010).</li></ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

הצגנו כאן מתודולוגיה להשיג תאים חיסוניים מהכליה באופן אמין ויעיל. השינוי המרכזי לשלב עיכול collagenase בשימוש הנרחב (הפרעה מכאנית של רקמה) חוסך כ -30 דקות והבידוד של מספר רב של תאי קיימא חיסוניים לוקח פחות משעות עבור 4 דגימות כליות. יתר על כן, בהתאם שאלת המחקר שלנו, אנחנו עכשי...

הפעלת מערכת חיסונית מתרחשת מחלות כליה מרובות ותהליכי pathophysiological 6,10,11,13. אזורים מסוכנים של מחקר פעיל להקיף את טריגרים שונים עבור הפעלת המערכת החיסונית, סוגי תאים שונים מעורבים, דפוס ציטוקינים / chemokine באווירה מחלה מסוימת, אפנון של כל התהליכים הנ&quot;ל על ידי תרופה מסוימת וכו &#39;כדי להדגים, ב-רה-פרפוזיה איסכמיה פציעה (מודל אי-ספיקת כליות חריפה), יש עלייה בתאי המערכת החיסונית או מח עצם שמקורם בתאי hematopoietic או CD45 + תאים בתוך כמה שעות, הנסמך דרך תקופת תיקון או סיסטיק (לימים 6 שבועות) 5, 12. תאים חיסוניים אלו מפרישים הן פרו-דלקתיים ואנטי-דלקתי ציטוקינים chemokines לתזמר את תהליך תיקון 5,12. נכון לעכשיו, את היכולת להשתמש fluorophores המרובה בו זמנית לתייג אוכלוסיות תאי השעית תא בודדת גדלה עם המודעהפורקן של זרימה המודרנית cytometry מכונה מארבעה עד חמישה לייזרים. זו הוסיפה משמעותית את היכולת להפלות אוכלוסיות תאים בהתבסס על המצב התפקודי שלהם 3,7. לדוגמה, כדי לתייג מקרופאג בצורה מדויקת ככל F4 / 80 נמוך CD11b גבוהה Ly6b גבוהה CD206 נמוך, לפחות עוד 3 fluorophores יהיה צורך במדגם נפח זהה לשער עבור תאים חיים, CD45 + (לויקוציטים) ו Ly6G- (נויטרופילים) ו זה מאוד אפשרי עם cytometers התזרים החדש 3. עם זאת, המבחנים במורד הזרם עבור הפרשת ציטוקינים, התפשטות תאים, cytotoxicity, הפעלת מקרופאג כימות של מספרים של תת השונה של לימפוציטים ומונוציטים לא רק צריכים באיכות טובה (תאי חיים, singlets) אבל מספר הולם של תאים. המערכת החיסונית בכליות מורכבת משני רכיבים אדפטיבית מולד סוגי תאים מרובים 1,7,13. לדוגמא, בעכברים שני הילדneys יחד מדווח להכיל 2-17% (28,000-266,000) CD45 + תאים של תאי חיסון הכוללות כליות המבודדות (1.4 x 10 6 תאים) וכ 5-15% (1,400-4,200) אלה הם CD4 + תאי 1 , 5,12. אחוז קטן (5-15%, 70-630) של CD4 + אלה התאים FoxP3 + תאים (איור 1) 1. בשל הפחתות החכמות צעד אלה באחוזים של תאים, לפעמים אוכלוסיית עניין התא (במקרה זה CD45 + CD4 + FoxP3 + תאים) מיוצג על ידי גרידא ~ 100 תאים. המספר הקטן של CD45 + CD4 + FoxP3 + תאים עושה את זה הכרחי כי מספר גדול של תאים הכוללים מבודדים התאים הם באיכות טובה ללימודים במורד כגון מבחני הפרשת ציטוקינים. יתר על כן, ייתכן שיהיה צורך לשלב כליות מעכברים 2-3 מאז subpopulations אינם מיוצגים במספרים גבוהים מספיק כדי לבצע מבחנים לכימות. לפיכך, בידוד אמין ויעיל של אוכלוסיות תאים mononuclear כליות רצוי כדי הרבעהy הספקטרום אימונולוגיים הקשורים למחלות כליה. באופן מסורתי, לבידוד תרמי של תאים mononuclear בכליות, החוקרים השתמשו במגוון של digestions האנזימטית כגון collagenase 1A או II כולל DNase 1 1,5,12. עובדה ידועה היא כי יש collagenases הפעילות האנזימטית משתנה עם הרבה מספרים ועל ידי חברה של ייצור, דבר המחייב טיטרציה עבור הריכוז האופטימלי ומשך הדגירה 4,14,15. בנוסף, מערכת העיכול עם collagenase מוסיף זמן וקוצצים את הכליה לחתיכות קטנות, מחייבת הדגירה של חתיכות כליות באמבט מחוממת (37 מעלות צלזיוס) ואת זמן נוסף הדגירה EDTA להפסקת התגובה. בנוסף, פחות סטריליות עשויים להיות מושגת על כמה נהלים במורד צורך תרבית תאים. יתרה מכך, בהתאם החוקר וכל המשתנים המעורבים, זה מוביל השתנות נתונים ופרשנות על פני מעבדות. לאחרונה, עםפיתוח משבשי רקמה המכאני / homogenizers 16, צעד עיכול collagenase הוא נמנע לחלוטין ובמקומו הפרעה מכאנית פשוטה של הכליות 2. בזאת, אנחנו מדגימים שיטה פשוטה אך יעילה עבור הבידוד של תאים חיסוניים כלית עקירות תא חיסון היומיום. חשוב לציין, טכניקה זו ניתן להתאים רקמות רכות והלא-סיביות אחרות כגון כבד ומוח 16.

<table><tbody><tr><td>Stomacher 80 Biomaster lab system</td><td>Seward</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stomacher 80 Classic bags</td><td>Seward</td><td>BA6040/STR</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend XFR Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Or equivalent equipment&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63514-11</td><td></td></tr><tr><td>Analytical flow cytometer</td><td>BD LSR-X20 Fortessa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Percoll&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P1644</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s phosphate buffered saline 1x (DPBS)</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylene tubes, no cap</td><td>Becton Dickinson</td><td>352002</td><td></td></tr><tr><td>Fixable Viability Stain</td><td>BD Biosciences&amp;nbsp;</td><td>FVS510,&amp;nbsp; 564406</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD16/32 (Clone: 93)</td><td>EBioscience</td><td>14-0161</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD45 (clone: 30-F11)&amp;nbsp; BV421&amp;nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>103133/4</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Foxp3 (Clone: FJK-16s) APC</td><td>EBioscience</td><td>17-5773</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD127 (Clone: A7R34) PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>135013/4</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD44 (Clone: IM7) PerCP/Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>103031/2</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD4 (Clone: RM4-5) APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>100413/4</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD8 (Clone: 53-6.7) BV785</td><td>Biolegend</td><td>100749/50</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ly6G (Clone: 1A8) FITC</td><td>Biolegend</td><td>127605/6</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD11b (Clone: M1/70) PerCP-Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>101227/8</td><td></td></tr><tr><td>Anti-F4/80 (Clone: BM8) APC</td><td>Biolegend</td><td>123115/6</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD11c (Clone: N418) BV785</td><td>Biolegend</td><td>117335/6</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD301 (Clone: LOM-14) PE-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>145705/6</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD26 (Clone: H194-112) PE</td><td>Biolegend</td><td>137803/4</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;mu;m filter&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Tubes 50 ml</td><td>Fisher</td><td></td><td>Or equivalent equipment&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fisherbrand Tubes 15 ml</td><td>Fisher</td><td></td><td>Or equivalent equipment&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher chemical</td><td>S5-3</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipette fine tip</td><td>Samco Scientific</td><td>232</td><td>Or equivalent equipment&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Flow Cytometery Staining Buffer Solution</td><td>EBioscience</td><td>00-4222-26</td><td>Or equivalent equipment&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1x RBC Lysis Buffer</td><td>EBioscience</td><td>00-4333-57</td><td>Or equivalent equipment&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

reliable and high efficiency extraction of kidney immune cells

Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes. The immune system consists of both adaptive and innate components and multiple cell types. Sometimes, the cell type of interest is present in very low numbers among the large numbers of total cells isolated from the kidney. Hence, reliable and efficient isolation of kidney mononuclear cell populations is important in order to study the immunological problems associated with kidney diseases. Traditionally, tissue isolation of kidney mononuclear cells have been performed via enzymatic digestions using different varieties and strengths of collagenases/DNAses yielding varying numbers of viable immune cells. Recently, with the development of the mechanical tissue disruptors for single cell isolation, the collagenase digestion step is avoided and replaced by a simple mechanical disruption of the kidneys after extraction from the mouse. Herein, we demonstrate a simple yet efficient method for the isolation of kidney mononuclear cells for every day immune cell extractions. We further demonstrate an example of subset analysis of immune cells in the kidney. Importantly, this technique can be adapted to other soft and non-fibrous tissues such as the liver and brain.

מספר פאנלים שניתן להפעיל תלוי במספר של תאי מערכת החיסון שניתן להפיק באופן אמין מן הכליות. בזאת, אנחנו מדגימים את היכולת להפעיל 2 לוחות, אחד עבור לימפוציטים מסוג T ואחד מקרופאגים / תאים דנדריטים. בלוח T-לימפוציטים, אנחנו נסתכל קודם כל על פיזור קדימה (FSC) ?...

Watch this Scientific Journal Video about Reliable and High Efficiency Extraction of Kidney Immune Cells at JoVE.com

Reliable and High Efficiency Extraction of Kidney Immune Cells

Techniques that are reliable and efficient for the isolation of kidney immune cells are needed for downstream applications. This requires surface antibody labeling of a small number of kidney immune cells. Herein, we describe a concise method for isolation of kidney immune cells that seemingly achieves this goal.

הפקת יעילות אמינה גבוהה של תאים מכליות חיסון

Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes.  The immune system consists of both adaptive and innate ...

reliable-and-high-efficiency-extraction-of-kidney-immune-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.3K Views.  Department of Medicine, University of Missouri-Columbia and Harry S Truman Memorial Veteran's Hospital. Techniques that are reliable and efficient for the isolation of kidney immune cells are needed for downstream applications. This requires surface antibody labeling of a small number of kidney immune cells. Herein, we describe a concise method for isolation of kidney immune cells that seemingly achieves this goal.

Video: Reliable and High Efficiency Extraction of Kidney Immune Cells

Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in various immune responses. DN T cells are a unique immune cell type that has been implicated in regulating immune and autoimmune responses and tolerance to allotransplants1-6. DN T cells are, however, rare in peripheral blood and secondary lymphoid organs (spleen and lymph nodes), but are major residents of the normal kidney. Very little is known about their pathophysiologic function7 due to their paucity in the periphery. We recently described a comprehensive phenotypic and functional analysis of this population in the kidney8 in steady state and during ischemia reperfusion injury. Analysis of DN T cell function will be greatly enhanced by developing a protocol for their isolation from the kidney.
Here, we describe a novel protocol that allows isolation of highly pure ab CD4+ CD8+ T cells and DN T cells from the murine kidney. Briefly, we digest kidney tissue using collagenase and isolate kidney mononuclear cells (KMNC) by density gradient. This is followed by two steps to enrich hematopoietic T cells from 3% to 70% from KMNC. The first step consists of a positive selection of hematopoietic cells using a CD45+ isolation kit. In the second step, DN T cells are negatively isolated by removal of non-desired cells using CD4, CD8, and MHC class II monoclonal antibodies and CD1d &#945;-galcer tetramer. This strategy leads to a population of more than 90% pure DN T cells. Surface staining with the above mentioned antibodies followed by FACs analysis is used to confirm purity.

DNabT cells are rare among peripheral T cells; however, they are abundant in certain non-lymphoid tissues. Difficulty of isolating DN T cells from non-lymphoid tissue hinders their functional analysis despite increasing recognized pathophysiologic significance. We describe a novel protocol for isolation of highly purified DN T cells from murine kidney.

בידוד של תאי T αβ כפול שליליים מהכליות

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in ...

Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model substrates for organ-scale tissue development. Sprague Dawley rat kidneys are cannulated by inserting a catheter into the renal artery and perfused with a series of low-concentration detergents (Triton X-100 and sodium dodecyl sulfate (SDS)) over 26 hr to derive intact, whole-kidney scaffolds with intact perfusable vasculature, glomeruli, and renal tubules. Following decellularization, the renal scaffold is placed inside a custom-designed perfusion bioreactor vessel, and the catheterized renal artery is connected to a perfusion circuit consisting of: a peristaltic pump; tubing; and optional probes for pH, dissolved oxygen, and pressure. After sterilizing the scaffold with peracetic acid and ethanol, and balancing the pH (7.4), the kidney scaffold is prepared for seeding via perfusion of culture medium within a large-capacity incubator maintained at 37 &#176;C and 5% CO2. Forty million renal cortical tubular epithelial (RCTE) cells are injected through the renal artery, and rapidly perfused through the scaffold under high flow (25 ml/min) and pressure (~230 mmHg) for 15 min before reducing the flow to a physiological rate (4 ml/min). RCTE cells primarily populate the tubular ECM niche within the renal cortex, proliferate, and form tubular epithelial structures over seven days of perfusion culture. A 44 &#181;M resazurin solution in culture medium is perfused through the kidney for 1 hr during medium exchanges to provide a fluorometric, redox-based metabolic assessment of cell viability and proliferation during tubulogenesis. The kidney perfusion bioreactor permits non-invasive sampling of medium for biochemical assessment, and multiple inlet ports allow alternative retrograde seeding through the renal vein or ureter. These protocols can be used to recellularize kidney scaffolds with a variety of cell types, including vascular endothelial, tubular epithelial, and stromal fibroblasts, for rapid evaluation within this system.

This protocol describes decellularization of Sprague Dawley rat kidneys by antegrade perfusion of detergents through the vasculature, producing acellular renal extracellular matrices that serve as templates for repopulation with human renal epithelial cells. Recellularization and use of the resazurin perfusion assay to monitor growth is performed within specially-designed perfusion bioreactors.

Repopulation תאי אפיתל והכנה של מכרסמים תאיים מטריקס פיגומים לפיתוח רקמות כליה

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model ...

Bioengineering

Kupffer Cell Isolation for Nanoparticle Toxicity Testing

The large majority of in vitro nanotoxicological studies have used immortalized cell lines for their practicality. However, results from nanoparticle toxicity testing in immortalized cell lines or primary cells have shown discrepancies, highlighting the need to extend the use of primary cells for in vitro assays. This protocol describes the isolation of mouse liver macrophages, named Kupffer cells, and their use to study nanoparticle toxicity. Kupffer cells are the most abundant macrophage population in the body and constitute part of the reticulo-endothelial system (RES), responsible for the capture of circulating nanoparticles. The Kupffer cell isolation method reported here is based on a 2-step perfusion method followed by purification on density gradient. The method, based on collagenase digestion and density centrifugation, is adapted from the original protocol developed by Smedsr&#248;d et al. designed for rat liver cell isolation and provides high yield (up to 14 x 106 cells per mouse) and high purity (&#62;95%) of Kupffer cells. This isolation method does not require sophisticated or expensive equipment and therefore represents an ideal compromise between complexity and cell yield. The use of heavier mice (35-45 g) improves the yield of the isolation method but also facilitates remarkably the procedure of portal vein cannulation. The toxicity of functionalized carbon nanotubes f-CNTs was measured in this model by the modified LDH assay. This method assesses cell viability by measuring the lack of structural integrity of Kupffer cell membrane after incubation with f-CNTs. Toxicity induced by f-CNTs can be measured consistently using this assay, highlighting that isolated Kupffer cells are useful for nanoparticle toxicity testing. The overall understanding of nanotoxicology could benefit from such models, making the nanoparticle selection for clinical translation more efficient.

Liver macrophages, named Kupffer cells, are responsible for the capture of circulating nanoparticles. We describe here a method, of high cell purity and yield, for Kupffer cell isolation. The modified LDH assay is used here to measure the toxicity induced by carbon nanotubes in Kupffer cells.

בידוד תא Kupffer לNanoparticle בדיקת רעילות

The large majority of in vitro nanotoxicological studies have used immortalized cell lines for their practicality. However, results from nanoparticle ...

A Novel Clinical Grade Isolation Method for Human Kidney Perivascular Stromal Cells

Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) are tissue homeostatic and immune modulatory cells that have shown beneficial effects in kidney diseases and transplantation. Perivascular Stromal Cells (PSCs) share characteristics with bone marrow MSCs (bmMSCs). However, they also possess, most likely due to local imprinting, tissue-specific properties and play a role in local tissue homeostasis. This tissue specificity may result in tissue specific repair, also within the human kidney. We previously showed that human kidney PSCs (kPSCs) have enhanced kidney epithelial wound healing whereas bmMSCs did not have this potential. Moreover, kPSCs can ameliorate kidney injury in vivo. Therefore, kPSCs constitute an interesting source for cell therapy, particularly for kidney diseases and renal transplantation. Here we show the detailed isolation and culture method for kPSCs from transplant-grade human kidneys based on whole-organ perfusion of digestive enzymes via the renal artery and enrichment for the perivascular marker NG2. In this way, large cell quantities can be obtained that are suitable for cellular therapy.

Here we present a novel clinical grade isolation and culture method for kidney Perivascular Stromal Cells (kPSCs) based on whole organ perfusion with digestive enzymes and NG2-cell enrichment. With this method, it is possible to acquire sufficient cell numbers for cellular therapy.

הרומן כיתה קלינית שיטת בידוד תאי סטרומה Perivascular כליה אנושית

Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) are tissue homeostatic and immune modulatory cells that have shown beneficial effects in kidney diseases and ...

Medicine

Detection of MicroRNA Expression in the Kidneys of Immunoglobulin A Nephropathic Mice

Immunoglobulin A (IgA) nephropathy is a type of primary glomerulonephritis characterized by the abnormal deposition of IgA, leading to the end-stage renal failure. In recent years, the involvement of microRNAs (miRNAs) has been reported in the pathogenesis of IgA nephropathy. However, there is no established method for profiling miRNAs in IgA nephropathy using small animal models. Therefore, we developed a reliable method for analyzing miRNA in the kidney of an IgA mouse model (HIGA mouse). The goal of this protocol is to detect the altered expression levels of miRNAs in the kidneys of HIGA mice when compared with the levels in kidneys of control mice. In brief, this method consists of four steps: 1) obtaining kidney samples from HIGA mice; 2) purifying total RNA from kidney samples; 3) synthesizing complementary DNA from total RNA; and 4) quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) of miRNAs. Using this method, we successfully detected the expression levels of several miRNAs (miR-155-5p, miR-146a-5p, and miR-21-5p) in the kidneys of HIGA mice. This new method can be applied to other studies profiling miRNAs in IgA nephropathy.

microRNAs are involved in the pathogenesis of IgA nephropathy. We have developed a reliable method for detecting microRNA expression levels in the kidneys of an IgA nephropathy mouse model (HIGA mice). This new method will facilitate to check for miRNAs involvement in IgA nephropathy.

זיהוי ביטוי מיקרו-רנ"א בכליות של אימונוגלובולין עכברים נפרופתיים

Immunoglobulin A (IgA) nephropathy is a type of primary glomerulonephritis characterized by the abnormal deposition of IgA, leading to the end-stage renal ...

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the key steps to investigate TRMs. There are slight variations in lymphocyte isolation protocols for different organs. Kidney is an essential non-lymphoid organ with numerous immune cell infiltration especially after pathogen exposure or autoimmune activation. In recent years, multiple labs including our own have started characterizing kidney resident CD8+ T cells in various physiological and pathological settings in both mouse and human. Due to the abundance of T lymphocytes, kidney represents an attractive model organ to study TRMs in non-mucosal or non-barrier tissues. Here, we will describe a protocol commonly used in TRM-focused labs to isolate CD8+ T cells from mouse kidneys following systemic viral infection. Briefly, using an acute lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) infection model in C57BL/6 mice, we demonstrate intravascular CD8+ T cell labeling, enzymatic digestion, and density gradient centrifugation to isolate and enrich lymphocytes from mouse kidneys to make samples ready for the subsequent flow cytometry analysis.

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Following viral infection, kidney harbors a relatively large number of CD8+ T cells and offers an opportunity to study non-mucosal TRM cells. Here, we describe a protocol to isolate mouse kidney lymphocytes for flow cytometry analysis.

בידוד של עכבר כליות תושב CD8+ תאי T לניתוח ציטומטריה זרימה

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...

An Efficient Sieving Method to Isolate Intact Glomeruli from Adult Rat Kidney

Preservation of glomerular structure and function is pivotal in the prevention of glomerulonephritis, a category of kidney disease characterized by proteinuria which can eventually lead to chronic and end-stage renal disease. The glomerulus is a complex apparatus responsible for the filtration of plasma from the body. In disease, structural integrity is lost and allows for the abnormal leakage of plasma contents into the urine. A method to isolate and examine glomeruli in culture is critical for the study of these diseases. In this protocol, an efficient method of retrieving intact glomeruli from adult rat kidneys while conserving structural and morphological characteristics is described. This process is capable of generating high yields of glomeruli per kidney with minimal contamination from other nephron segments. With these glomeruli, injury conditions can be mimicked by incubating them with a variety of chemical toxins, including protamine sulfate, which causes foot process effacement and proteinuria in animal models. Degree of injury can be assessed using transmission electron microscopy, immunofluorescence staining, and western blotting. Nephrin and Wilms Tumor 1 (WT1) levels can also be assessed from these cultures. Due to the ease and flexibility of this protocol, the isolated glomeruli can be utilized as described or in a way that best suits the needs of the researcher to help better study glomerular health and structure in diseased states.

The main focus of this protocol is to efficiently isolate viable primary glomeruli cultures with minimal contaminants for use in a variety of downstream applications. The isolated glomeruli retain structural relationships between component cell types and can be cultured ex vivo for a short time.

דרך יעילה Sieving כדי לבודד Glomeruli ללא פגע מן החולדה למבוגרים כליות

Preservation of glomerular structure and function is pivotal in the prevention of glomerulonephritis, a category of kidney disease characterized by ...

Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) imaging. They have received great attention in all research areas for the potential to analyze microscopic multicellular structures that extend over macroscopic distances. Given that kidney tubules, vasculature, nerves, and glomeruli extend in many directions, which have been only partially captured by traditional two-dimensional techniques so far, tissue clearing also opened up many new areas of kidney research. The list of optical clearing methods is rapidly growing, but it remains difficult for beginners in this field to choose the best method for a given research question. Provided here is a simple method that combines antibody labeling of thick mouse kidney slices; optical clearing with cheap, non-toxic and ready-to-use chemical ethyl cinnamate; and confocal imaging. This protocol describes how to perfuse kidneys and use an antigen-retrieval step to increase antibody- binding without requiring specialized equipment. Its application is presented in imaging different multicellular structures within the kidney, and how to troubleshoot poor antibody penetration into tissue is addressed. We also discuss the potential difficulties of imaging endogenous fluorophores and acquiring very large samples and how to overcome them. This simple protocol provides an easy-to-setup and comprehensive tool to study tissue in three dimensions.

The combination of antibody labeling, optical clearing, and advanced light microscopy allows three-dimensional analysis of complete structures or organs. Described here is a simple method to combine immunolabeling of thick kidney slices, optical clearing with ethyl cinnamate, and confocal imaging that enables visualization and quantification of three-dimensional kidney structures.

ניקוי אופטי ודימות רקמות כליות של אימונוולילד

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are executed by multiple cell types arranged in a complex architecture across the corticomedullary axis of the organ. Recent advances in single-cell transcriptomics have accelerated the understanding of cell type-specific gene expression in renal physiology and disease. However, enzyme-based tissue dissociation protocols, which are frequently utilized for single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq), require mostly fresh (non-archived) tissue, introduce transcriptional stress responses, and favor the selection of abundant cell types of the kidney cortex resulting in an underrepresentation of cells of the medulla.
Here, we present a protocol that avoids these problems. The protocol is based on nuclei isolation at 4 &#176;C from frozen kidney tissue. Nuclei are isolated from a central piece of the mouse kidney comprised of the cortex, outer medulla, and inner medulla. This reduces the overrepresentation of cortical cells typical for whole-kidney samples for the benefit of medullary cells such that data will represent the entire corticomedullary axis at sufficient abundance. The protocol is simple, rapid, and adaptable and provides a step towards the standardization of single-nuclei transcriptomics in kidney research.

Here, we present a protocol to isolate high-quality nuclei from frozen mouse kidneys that improve the representation of medullary kidney cell types and avoids the gene expression artifacts from enzymatic tissue dissociation.

בידוד גרעינים מכליה של עכבר בוגר לריצוף RNA של גרעין יחיד

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

Biology

Optimizing Isolation and Purification of Murine Glomerular Mesangial Cells

Mesangial cells (MCs) are stromal cells located in the middle space of the glomerulus, with pivotal functions in glomerular homeostasis. Methods for isolating, purifying, and culturing glomerular MCs have been developed and optimized since the 1980s for use in biomedical research, particularly in the field of nephrology. Mice are the most frequently used experimental animal models in research on renal diseases. In this study, we developed an optimized protocol for murine MCs isolation and ex vivo cell culture. These cells can be passaged multiple times, frozen, revived, and cultured without compromising cell growth or protein expression. This optimized approach significantly reduces the study duration for researchers and enables long-term cell preservation. The necessary equipment for the procedures is easily accessible in a basic biomedical laboratory, and the procedural steps are straightforward. The acquisition of target cells requires only 2-3 weeks, a reduction of at least 1 week compared to existing methods.

This study developed an optimized protocol for the isolation of murine mesangial cells (MCs) and their ex vivo cell culture. These cells can be passaged multiple times, frozen, revived, and cultured without compromising cell growth or protein expression.

אופטימיזציה של בידוד וטיהור של תאים מזנגיים גלומרולרים של עכברים

Mesangial cells (MCs) are stromal cells located in the middle space of the glomerulus, with pivotal functions in glomerular homeostasis. Methods for ...