This work is supported by a Research Grant from Dialysis Clinics Inc. and from the University of Missouri Research Board Grant.

수행 모든 프로토콜 단계 검토와 미주리 동물 관리 및 사용위원회의 대학 (ACUC)에 의해 승인되었다. 모든 연령에서 이론적으로 모든 설치류 실험에 사용할 수 있지만,이 프로토콜의 경우, 15주 세 남성 C57BL / 6 마​​우스를 사용 하였다. 이 비 생존 수술 때문에 안락사 방혈 및 양자 기흉에 의해 달성된다. 신장의 1 관류 참고 : 심장, 간, 신장 등 장기의 관류 데이​​터의 해석을 방해 할 수 혈액을 제거합니다. 가능하면 따라서, 우리는 항상 장기를 관류. <ol><li> 그것은 움직이지 될 때까지 (3 ml / 분) 유도 챔버 이소 플루 란에 마우스를 놓습니다. 다음으로, 챔버에서 마우스를 제거 해부 테이블에 등쪽를 놓고 마우스 코의 이소 플루 란 콘을 배치하고 조절을 통해 1.5 ml / 분의 속도로 이소 플루 란을 누릅니다. </li><li> 발가락 핀치 응 답을 확인동물 마취의 수술 비행기를 달성 한 경우 핀셋 전자는 평가합니다. 식염수 복부 복부를 청소하고 가위로 복부를 열고 잘라 마우스의 왼쪽에 (수술 분야 중) 복부 장기를 밀어 넣습니다. </li><li> 과 하대 정맥에서 혈액을 수집 25 게이지 1 cc의 주사기에 바늘 고정 0.5M EDTA의 10 μl를 포함하는 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 추가합니다. 참고 : 혈액의 컬렉션은 선택 사항입니다. 플라즈마 생화학 적 측정을 위해 사용될 수있다. 백혈구는 유세포 분석을 위해 사용될 수있다. </li><li> 가위를 사용하여, 오른쪽 심방에 작은 상처가 다음 단계에서 혈액과 PBS의 혼합물을 수 있도록 할 수 있습니다. </li><li> 50 CC 주사기를 타고 얼음처럼 차가운 PBS (20 ~ 30 CC)를 입력합니다. 다음, 주사기에 21 ~ 25 G 바늘을 부착 (집게 사이에 부드럽게 마음을 잡고)의 정점에서 좌심실에 구멍을 천천히 과정을 통해 인산염 완충 식염수 산도 7.4 (PBS)과 좌심실을 관류1 ~ 2 분. 참고 : 마음이 바로 관류의 처음 몇 밀리리터에 blanches. 이 재관류이 대정맥을 통해 정맥 반환을 통해 간에서 혈액을 배출되어 있음을 나타냅니다 같이 희게의 간을 준수하십시오. 또한,이 우심실의 구멍을 나타냅니다으로 폐 주입시 확대되지 않도록해야합니다. 폐 확장한다면, 약간 뒤로 좌심실에 바늘을 철회하고 재관류를 계속합니다. 달성 안락사까지 제 절개 찍은 시간 미만이 최소 인 </li></ol> 신장 2. 해부 <ol><li> 관류가 완료되면, 첨부 파일 (혈관, 지방과 부신) 및 소비세의 권리 신장을 해부 가위와 집게를 사용합니다. </li><li> 부드럽게 절단 및 포셉으로 해부하여 신장을 덮고있는 캡슐을 제거합니다. 신장의 무게를. 참고 : 신장 무게 것은 선택 사항입니다. 그러나, 일부 실험신장 사이즈 / 조직의 그램 당 셀 수율을 정규화하기 위해 사용될 수있다 중량의 변화가 발생할 수있다. </li><li> 신장 무게 후, 0.5 % FBS를 포함하는 RPMI-1640 1 ㎖에 배치 또는 염색 완충 용액 세포 계측법 (50 ML 원뿔 스크류 캡 튜브를) 흐름 및 추가 사용까지 얼음에 튜브를 배치합니다. 참고 설명의 편의상, 우리는 염색 완충액 유세포 면역 세포의 분리의 나머지를 들어 설명한다. 모두 신장 또는 신장의 1 + 1 / 3의 RD (옵션) 하류의 실험에 따라 사용될 수 있지만, 또한, 단일 신장에서의 면역 세포의 분리를 설명한다. 신장의 1/3 RD 단백질 / RNA 실험에 고정 될 수 있고, 1/3 RD는 면역 또는 투과 전자 현미경을위한 버퍼에 배치 될 수있다. </li></ol> 신장의 3 균질화 <ol><li> 샘플의 식별 정보와 함께 5 내지 80 ml의 용량 균질화 백 레이블링내부 스트레이너 (STR)를 제거하고 폐기합니다. 차가운 얼음 유동 세포 계측법 염색 완충 용액의 5 ml의 가방을 채우고 버퍼에 신장을 전송합니다. 두 번째 샘플 또는 처리가 필요 이상의 샘플에 대해이 과정을 반복합니다. </li><li> 절반은 유동 세포 계측법 염색 완충액에 침지 신장을 가지며, 나머지 절반은 단순히 위로 절첩되도록 반으로 균질화 백 접어. </li><li> 조직 균질의 전원을 켜고 빠른 (설정) rpm으로 설정합니다. 하단 가장자리에 패 직면 신장과 접힌 균질화 가방을 배치하지만 가방의 하단이 패의 아래쪽 테두리 아래로 슬라이딩되지 않습니다 있는지 확인하십시오. <ol><li> 2 패이 있기 때문에 동시에 두 번째 샘플을 처리합니다. 120 초로 시간을 선택합니다. 패는 신장을 균질화 앞뒤로 이동 관찰한다. 주 : 한편, 중단이 처음 두가 처리되는 동안 샘플이 더 신장 (또는 다른 조직)을 제조하는데 사용될 수있다. </li></올&gt; </li><li> 균질화의 첫 번째 세트를 완료 한 후, 얼음에 가방을 전송하는 등 다음의 샘플 세트와 함께 조직 균질를 다시로드합니다. 시각적으로 신장이 충분히 균질화하고 더 큰 덩어리를 볼 수 없는지 확인합니다. 참고 : 일반적으로, 빠른 rpm에서 조직 균질의 2 분의 신장에 적합합니다. </li><li> 얼음에 50 ML 원뿔 튜브에 100 μm의 셀 스트레이너를 놓습니다. 다음으로, 셀 스트레이너로 완전하게 균질 피펫. 4 ° C에서 1 분 50 XG에서 바닥 원심 분리기를 설정하고 원심 분리기에 샘플을로드합니다. 참고 : 원심 분리는 모든 균질 (포함하는 셀)을 셀 스트레이너를 통과 한 것을 보장합니다. </li><li> 원심 분리기에서 튜브를 제거하고 얼음에 다시 배치합니다. 셀 스트레이너를 무시하고 균질을 유지합니다. 동일 부피 추가 (~ 6 mL)에 균일 한 세포 현탁액을 만들기 위해 세포 펠렛 / 상등액 피펫 위아래로 수회에 1X RBC 용해 완충액. Visua에서야 베드로, 즉시 정지 감소에 붉은 색의 일부를 관찰합니다. 최대 RBC 용해를 달성하기 위해 5 분 동안 얼음에 튜브를 남겨주세요. 참고 : 연구자는 신장 관류 적은 세포 조작이 필요한 자신감을 경우 RBC 용해 단계를 건너 뛸 수 있습니다. 우리는 RBC 용해에 세포 현탁액을 실시하지 않음으로써 신장 세포 수율의 현저한 증가를 관찰 하였다. </li><li> 5 분 세포 펠렛을 형성하도록 500 XG, 39 ° C로 설정되어있는 원심 분리기에서 튜브를 스핀. 단계 3.6 및 3.7 동안 콜로 이달 실리카 (퍼콜)를 기반으로 밀도 구배 원심 분리 준비 :합니다. <ol><li> 바닥 폴리 프로필렌 튜브 라운드 10 mL를 취하여 해당 샘플 번호로 레이블과 튜브 랙에 배치합니다. 참고 : 다음은 4 신장 샘플에 대한 충분한 밀도 구배 시약을 만드는 방법을 설명합니다. </li><li> 유동 세포 계측법 염색 완충 용액 7 mL를 취하여 15 ML 원뿔 튜브로 피펫. 2 M 자당의에 1 ML을 추가0.25 M 자당을 준비합니다. </li><li> 다음으로, 또 다른 15 ML 원뿔 관에 밀도 구배 시약과 피펫을 7.2 mL를 취하여. 72 %를 밀도 구배 시약 및 0.25 M 자당을 준비하는 유동 세포 계측법 염색 완충 용액 1.55 mL 및 2 M 자당의 1.25 ML을 추가합니다. </li><li> 피펫 각 샘플에 대해 하나의 둥근 바닥의 폴리 프로필렌 튜브에 72 % 농도 구배 시약 1 ㎖. </li></ol></li></ol> 4. 그라데이션 원심 분리 <ol><li> 단계 3.7 후, 튜브를 꺼내 부드럽게 한 부드러운 움직임에 뜨는을 가만히 따르다 또한 튜브가 거꾸로 유지되는 동안 형성 액체의 다음 드롭을 가만히 따르다. 참고 :이 단계는 수익률의 변화를 만들 수있을만큼 밀도 구배를 변경할 수를 초과하는 액체 뒤에 남겨두고 이후 중요하다. 튜브가 수직으로 다시 설정하면 ~ 액의 200 ~ 300 μL은 세포 펠렛으로 남아있다. </li><li> 피펫 조심스럽게 그러나 적극적으로 세포 펠렛 상에 0.25 M 자당 1 ml의 최대 피펫 및 브린 아래로g 균일 한 서스펜션에 세포. 다음에, 36 % 농도 구배 시약을 형성하기 위해 세포를 혼합하여 강하게 피펫 다시 1 ㎖의 72 % 밀도 구배 시약 (3.7.4)에 세포 현탁액을 추가. </li><li> 폴리 프로필렌 파스퇴르 (전송) 피펫으로 72 %의 밀도 구배 시약 1 mL를 취하여. 전구의 압력도 부드럽게 세포 현탁액의 하단에 파스퇴르 피펫 (36 % 농도 구배 시약)을 삽입하고을 형성하는 72 % 농도 구배 시약을 언로드 (선단에서 액체 열을 유지하고 기포 형성을 방지) 별개의 무거운 층. </li><li> 부드럽게 샘플 튜브를 선택하고이 단계 동안 실내 온도에서 원심 분리로 놓는다. 500 X g에서 20 ~ 30 분 스핀. </li><li> 한편, 해당 샘플 식별자 바닥 원심 분리기 튜브의 둘레에 폴리 프로필렌의 다른 두 세트를 준비합니다. </li><li> 단계 4.4이 완료된 후, 최소한의 진탕 부드럽게 폴리 프로필렌 튜브를 함유하는 샘플을 제거하고 아래로 설정할튜브 랙. </li><li> 첫 번째 샘플 튜브 및 해당 빈 튜브를 선택합니다. 폴리 프로필렌 파스퇴르 피펫으로 부드럽게하지만 철저하게 측정 흡입으로, 상단 &quot;정크 층&quot;또는 &quot;끈적 끈적한 물질&quot;을 제거하고 빈 둥근 바닥 원심 분리기 튜브에 넣어. <ol><li> (붉은 색조 [적혈구]와 오프 화이트 나타날 수 있습니다) 도달 &quot;버피 코트 &#39;까지 그라데이션의 상단 부분을 제거 진행합니다. ~ 3mm의 높이가 &quot;버피 코트&quot;로부터 도달하면 흡인 정지. 참고 :이 물건이 완전히 흡입을 계속하기 전에 그라데이션의 상부에서 사라 있는지 확인합니다. </li></ol></li><li> 신선한 파스퇴르 피펫과 신선한 둥근 바닥 원심 분리기 튜브를 타고 부드럽게 버피 코트를 제거합니다. 세포의 대부분을 수집하고 적절한 샘플 식별자와 2 차 새로운 둥근 바닥 튜브에 추가되도록, 버피 코트 아래 5mm - 3 흡인 계속합니다. </li><li> 1-2 ml의 O를 추가F 유동 세포 계측법 염색 버퍼 2 차 튜브에 용액로 pipetting 아래로 잘 섞는다. </li><li> 4 ° C에서 5 분 동안 500 XG에서 세포를 스핀 다운. 유동 세포 계측법 염색 완충 용액와 2 차 세척 단계는 선택 사항입니다. 유동 세포 계측법 염색 완충 용액 500 μL와에 재현 탁은 혈구를 사용하여 세포를 계산 진행합니다. </li></ol> 5. 옵션 (셀 라벨) <ol><li> 동일한 수의 셀에 대한 각 샘플 Aliqout. 10 6 셀 당 0.5 μg의 (안티 CD16 / CD32 FcRγ 쇄)의 희석에 차단 항체를 추가하고 15 분 동안 얼음에 품어. </li><li> 전에 실제 실험에, 연구자에 의해 서로 잘 작동하도록 결정된다 (적절한 형광 접합) 일차 항체의 원하는 칵테일을 추가합니다. 30 분 동안 빙상에서 인큐베이션. PBS로 세포를 씻으십시오. 참고 :이 원고에 대한 신장 면역 세포 라벨의 데모를 들어, 우리는 T-LY 사용mphocyte 및 대 식세포 / 수지상 세포 패널. BV421, 안티 Foxp3의 (클론 : FJK-16) APC, 안티 CD127 (클론 : A7R34) 다음 T 림프구 패널 고칠 생존 얼룩 FVS510, 항 CD45 (30-F11 클론)로 구성 PE / Cy7, 안티 CD44 (클론 : IM7)를 PerCP / Cy5.5, 안티 - CD4 (클론 : RM4-5) APC-Cy7, 안티 - CD8 (클론 : 53-6.7) BV785. BV421, 안티 Ly6G (클론 : 1A8) FITC, 안티 CD11b를 (클론 : M1 /​​ 70)를 PerCP-Cy5.5, 안티 : 대 식세포 패널 고칠 생존 얼룩 FVS510, 항 CD45 (30-F11 복제) 구성 F4 / 80 (클론 : BM8) APC, 안티의 CD11c (클론 : N418) BV785. </li><li> 고 정부 생존 얼룩을 추가하고 5 분 동안 벤치 위에 둡니다. 고 정부 생존 얼룩 초과를 제거하는 유동 세포 계측법 염색 완충 용액으로 세포를 씻으십시오. </li><li> 고정 / Permeabilization 시약을 추가하고 4 ºC에서 밤새 품어. permeabilization 용액에 세척 할 것. </li><li> 세포 내 얼룩의 경우, 10 분 동안 항 CD16 / 32 FcRγ 쇄 다시 차단합니다. 세포 내 얼룩을 추가하고 20 ~ 30 분 동안 품어. 체육의 워시 2 배rmeabilization 솔루션입니다. </li><li> FACS 시스템 3.9을 통해 유동 세포 계측법 염색 버퍼 솔루션 및 실행 샘플을 Resuspend. </li></ol>

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저자는 공개 아무것도 없어.

우리는 여기에서 안정적이고 효율적으로 신장에서의 면역 세포를 얻을 수있는 방법을 제시 하였다. 널리 사용되는 콜라겐 분해 공정 (조직의 기계적인 파괴)에 대한 주요 변경은 약 30 분 동안 저장하고, 가능한 면역 세포의 다수의 분리 4 신장 샘플 하에서 2 시간 걸린다. 또한, 연구의 질문에 따라, 우리는 이제 하나의 신장을 사용하는 우리의 면역 세포 분리를위한 (다른 신장은 웨스턴 블랏, PCR?...

면역 시스템의 활성화는 여러 신장 질환 및 병태 생리 학적 과정 6,10,11,13에서 발생합니다. 활발한 연구 발생할 수있는 영역은 면역계의 활성화를위한 다양한 트리거들을 포함, 다양한 세포 유형과 관련된 특정 질환 속에서 사이토킨 / 케 모킨 패턴 등 특정 약물에 의한 상기 프로세스의 모두의 조절은 국소 빈혈 - 재관류에 예증 상해 (급성 신부전에 대한 모델), (6 주 이상) 5 수리 또는 섬유증의 기간을 통해 유지된다 몇 시간 내에 조혈 세포 또는 CD45 + 세포 유래 면역 세포 또는 골수의 증가가,가, 12. 이들 면역 세포가 복구 5,12- 과정을 조율하는 염증성 및 항 염증성 사이토 카인 및 케모카인을 분비 모두. 현재, 단일 세포 현탁액으로 세포 집단 라벨을 동시에 다수의 형광체를 사용할 수있는 능력은 광고와 증가4 ~ 5 레이저와 기계 계측법 현대적인 흐름을 배출. 이것은 실질적으로 자신의 기능 상태 3,7에 따라 세포 집단을 구별하는 기능을 추가했습니다. F4 / 80 로우는 CD11b 고 Ly6b 높은 CD206 낮은 적어도 3 개의 형광체는 생균, CD45 + (백혈구) 및 Ly6G- (호중구) 및 위해 게이트에 동일한 샘플 볼륨에 필요한 것 예를 들어, 정확하게 식세포 레이블을 이것은 매우 가능한 새로운 흐름 세포 계측기 3입니다. 그러나, 사이토 카인의 분비, 세포 증식, 세포 독성, 대 식세포 활성화 및 림프구 및 단구의 다양한 서브 세트의 수의 정량 하류 분석법뿐만 아니라 좋은 품질 (생균, 단봉)하지만 세포의 적당한 숫자를 필요로한다. 신장에서의 면역 체계는 적응 및 선천적 부품 및 여러 세포 유형 1,7,13 모두 이루어진다. 예를 들어, 마우스에서 두 아이(1.4 × 106 세포) 및 이들의 약 5~15% (1,400-4,200) 절연 신장 총 면역 세포 neys 함께 2~17%를 포함하는보고 (28,000-266,000)는 CD45 + 세포는 CD4 + 세포이다 한 , 5,12-. 이 CD4 + 세포의 작은 비율 (5-15%, 70-630)는 Foxp3의 + 세포 (그림 1) 일 수 있습니다. 때문에 (이 경우 CD45 + CD4 + Foxp3의 + 세포) 세포의 비율에서 이러한 단계 현명한 감소 관심 때로는 세포 인구 100 ~ 단순한 세포에 의해 표현된다. CD4 + CD45 + 세포 + Foxp3의 소수는 필수적 총 다수의 셀이 분리되어 상기 세포는 시토 킨 분비 분석 등 하류 연구 양질의 것으로한다. 또한, 상기 개체군은 정량 분석​​을 수행하기 위해 충분히 높은 숫자로 표현되지 않기 때문에 2-3 마우스로부터 신장을 결합 할 필요가있다. 따라서, 신장 단핵 세포 집단의 안정적이고 효율적인 분리 스터드 위해 바람직Y 신장 질환과 관련된 면역 스펙트럼. 전통적으로, 신장 단핵 세포의 분리를 위해, 연구자들은 1 1,5,12 DNase를 포함 콜라게나 1A 또는 II와 같은 효소 digestions 다양한 사용했다. 잘 콜라게나 최적 농도 및 배양 4,14,15의 기간 동안 적정을 필요로, 로트 번호와 제조 회사에 따라 다릅니다 효소 활성을 갖는 것으로 알려져있다. 또한, 콜라게나 제와 소화가 작은 조각으로 신장을 닦지 시간을 추가하여 반응을 정지 EDTA의 배양을위한 가열 (37 ℃로) 목욕 및 추가 시간에 신장 조각의 배양을 필요로한다. 또한, 이하 불임은 세포 배양을 필요로하는 일부의 하류 절차에 대해 달성 될 수있다. 더 중요한 것은, 관련 연구자 모든 변수에 따라, 그것을 실험실에 걸쳐 데이터를 해석 가변성 리드. 최근과티슈 기계 교란 / 균질 기 (16)의 개발은 콜라게나 제 소화 공정을 완전히 피할 신장이 간단한 기계적 파괴로 대체된다. 여기서, 우리는 매일 면역 세포 추출에 대한 신장 면역 세포의 분리를위한 간단하면서도 효율적인 방법을 보여줍니다. 중요한 것은,이 방법은 뇌와 간 (16) 등의 다른 연질 및 비 섬유 성 조직으로 구성 될 수있다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stomacher 80 Biomaster lab system</td>
			<td>Seward</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stomacher 80 Classic bags</td>
			<td>Seward</td>
			<td>BA6040/STR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend XFR Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Or equivalent equipment&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>63514-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical flow cytometer</td>
			<td>BD LSR-X20 Fortessa</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline 1X (DPBS)</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>14190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene tubes, no cap</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>352002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Stain</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>FVS510,&#160; 564406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD16/32 (Clone: 93)</td>
			<td>EBioscience</td>
			<td>14-0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD45 (clone: 30-F11)&#160; BV421&#160;</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>103133/4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Foxp3 (Clone: FJK-16s) APC</td>
			<td>EBioscience</td>
			<td>17-5773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD127 (Clone: A7R34) PE/Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>135013/4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD44 (Clone: IM7) PerCP/Cy5.5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103031/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD4 (Clone: RM4-5) APC-Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100413/4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD8 (Clone: 53-6.7) BV785</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100749/50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ly6G (Clone: 1A8) FITC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>127605/6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD11b (Clone: M1/70) PerCP-Cy5.5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101227/8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-F4/80 (Clone: BM8) APC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>123115/6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD11c (Clone: N418) BV785</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>117335/6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD301 (Clone: LOM-14) PE-Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>145705/6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD26 (Clone: H194-112) PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>137803/4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;m filter&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Tubes 50 ml</td>
			<td>Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Or equivalent equipment&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Tubes 15 ml</td>
			<td>Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Or equivalent equipment&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher chemical</td>
			<td>S5-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette fine tip</td>
			<td>Samco Scientific</td>
			<td>232</td>
			<td>Or equivalent equipment&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometery Staining Buffer Solution</td>
			<td>EBioscience</td>
			<td>00-4222-26</td>
			<td>Or equivalent equipment&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X RBC Lysis Buffer</td>
			<td>EBioscience</td>
			<td>00-4333-57</td>
			<td>Or equivalent equipment&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reliable and high efficiency extraction of kidney immune cells

Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes. The immune system consists of both adaptive and innate components and multiple cell types. Sometimes, the cell type of interest is present in very low numbers among the large numbers of total cells isolated from the kidney. Hence, reliable and efficient isolation of kidney mononuclear cell populations is important in order to study the immunological problems associated with kidney diseases. Traditionally, tissue isolation of kidney mononuclear cells have been performed via enzymatic digestions using different varieties and strengths of collagenases/DNAses yielding varying numbers of viable immune cells. Recently, with the development of the mechanical tissue disruptors for single cell isolation, the collagenase digestion step is avoided and replaced by a simple mechanical disruption of the kidneys after extraction from the mouse. Herein, we demonstrate a simple yet efficient method for the isolation of kidney mononuclear cells for every day immune cell extractions. We further demonstrate an example of subset analysis of immune cells in the kidney. Importantly, this technique can be adapted to other soft and non-fibrous tissues such as the liver and brain.

실행될 수있는 패널들의 수를 확실하게 신장에서 추출 될 수 면역 세포의 수에 의존한다. 여기서, 우리는이 패널, T 림프구 용 및 대 식세포 / 수지상 세포를 실행할 수있는 능력을 입증한다. T 림프구 패널에서, 우리는 먼저 앞으로 분산 형 (FSC)와 사이드 분산 형 (SSC) 패턴을보고 그림 1 (왼쪽 상단 도트 플롯)과 같이 관심의 인구를 묘사. 다음에, 생존 마커,이 ?...

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Reliable and High Efficiency Extraction of Kidney Immune Cells

Techniques that are reliable and efficient for the isolation of kidney immune cells are needed for downstream applications. This requires surface antibody labeling of a small number of kidney immune cells. Herein, we describe a concise method for isolation of kidney immune cells that seemingly achieves this goal.

신장 면역 세포의 신뢰성 및 고효율 추출

Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes.  The immune system consists of both adaptive and innate ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.3K 조회수.  Department of Medicine, University of Missouri-Columbia and Harry S Truman Memorial Veteran's Hospital. Techniques that are reliable and efficient for the isolation of kidney immune cells are needed for downstream applications. This requires surface antibody labeling of a small number of kidney immune cells. Herein, we describe a concise method for isolation of kidney immune cells that seemingly achieves this goal.

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Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, including signaling, cytoskeletal remodeling, regulation of gene expression, apoptosis and cell cycle progression 1. Calpains have been implicated in many pathologies including muscular dystrophies, cancer, diabetes, Alzheimer's disease and multiple sclerosis 1. Calpain regulation is complex and incompletely understood. mRNA and protein levels correlate poorly with activity, limiting the use of gene or protein expression techniques to measure calpain activity. This video protocol details a flow cytometric assay developed in our laboratory for measuring calpain activity in fixed and living cells. This method uses the fluorescent substrate BOC-LM-CMAC, which is cleaved specifically by calpain, to measure calpain activity. 2 In this video, calpain activity in fixed and living murine 32Dkit leukemia cells, alone or as part of a splenocyte population is measured using an LSRII (BD Bioscience). 32Dkit cells are shown to have elevated activity compared to normal splenocytes.

This article will detail the protocol for measuring calpain activity in fixed and living cells using flow cytometry.

유동세포계측법로 고정하고 살아있는 세포에서 Calpain 활동을 측정

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

연구

면역학 및 감염병학

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between liver sinusoidal endothelial cells and hepatocytes1,2. Stellate cells are derived from bone marrow precursors and store up to 80% of the total body vitamin A1, 2. Upon activation, stellate cells differentiate into myofibroblasts to produce extracellular matrix, thus contributing to liver fibrosis3. Based on their ability to contract, myofibroblastic stellate cells can regulate the vascular tone associated with portal hypertension4. Recently, we demonstrated that hepatic stellate cells are potent antigen presenting cells and can activate NKT cells as well as conventional T lymphocytes5. 

 Here we present a method for the efficient preparation of hepatic stellate cells from mouse liver. Due to their perisinusoidal localization, the isolation of hepatic stellate cells is a multi-step process. In order to render stellate cells accessible to isolation from the space of Disse, mouse livers are perfused in situ with the digestive enzymes Pronase E and Collagenase P. Following perfusion, the liver tissue is subjected to additional enzymatic treatment with Pronase E and Collagenase P in vitro. Subsequently, the method takes advantage of the massive amount of vitamin A-storing lipid droplets in hepatic stellate cells. This feature allows the separation of stellate cells from other hepatic cell types by centrifugation on an 8% Nycodenz gradient. The protocol described here yields a highly pure and homogenous population of stellate cells. Purity of preparations can be assessed by staining for the marker molecule glial fibrillary acidic protein (GFAP), prior to analysis by fluorescence microscopy or flow cytometry. Further, light microscopy reveals the unique appearance of star-shaped hepatic stellate cells that harbor high amounts of lipid droplets. 


 Taken together, we present a detailed protocol for the efficient isolation of hepatic stellate cells, including representative images of their morphological appearance and GFAP expression that help to define the stellate cell entity.

Here we describe a method for the isolation of hepatic stellate cells from mouse liver. For stellate cell purification, mouse livers are digested in situ and in vitro by pronase-collagenase treatment prior to density gradient centrifugation. This technique yields highly pure hepatic stellate cells.

셀을 별 모양으로 일곱 단계

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam cells, immune cells, vascular endothelial and smooth muscle cells, platelets, extracellular matrix, and a lipid-rich core with extensive necrosis and fibrosis of surrounding tissues.1 The innate and adaptive arms of the immune response are involved in the initiation, development and persistence of atherosclerosis.2, 3 There is a significant body of evidence that different subsets of the immune cells, such as macrophages, dendritic cells, T and B lymphocytes, are present within the aortas of healthy and atherosclerosis-prone mice4. Additionally, immune cells are found in the surrounding aortic adventitia which suggests an important role of this tissue in atherogenesis.2
For some time, the quantitative detection of different types of immune cells, their activation status, and the cellular composition within the aortic wall was limited by RT-PCR and immunohistochemical methods for the study of atherosclerosis. Few attempts were made to perform flow cytometry using human aortas, and a number of problems, such as a high autofluorescence, have been reported5,6. Human atherosclerotic plaques were digested with collagenase 1, and free cells were collected and stained for CD14+/CD11c+ to highlight macrophage-derived foam cells. In this study, a "mock" channel was used to avoid false-positive staining.6 Necrotic materials accumulating during the digestion process give rise in a large amount of debris that generates a high autofluorescence in aortic samples. To resolve this problem, a panel of negative and positive controls has been proposed, but only double staining could be applied in these samples. We have developed a new flow cytometry-based method7 to analyze the immune cell composition and characterize the activation, proliferation, differentiation of immune cells in healthy and atherosclerosis-prone aorta. This method allows the investigation of the immune cell composition of the aortic wall and opens possibilities to use a broad spectrum of immunological methods for investigations of immune aspects of this disease.

This paper presents a flow cytometry-based method to investigate the immune composition of aortas. The paper also illustrates an additional technique that allows examining surrounding adventitia and vessel wall separately. This method opens possibilities to perform phenotypical analyses of aortic leukocytes and apply several immunological assays for atherosclerosis studies.

Murine Aortas 이내에 면역 세포의 흐름 Cytometry 분석

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5 These immune cells, which include mast cells, T-cells and macrophages; store and release a variety of biologically active mediators including cytokines and proteases such as tryptase.6-8 These mediators have been shown to be key players in extracellular matrix metabolism by activating matrix metalloproteinases or causing collagen accumulation by modulating the cardiac fibroblasts' function.9-11 However, available techniques for isolating cardiac immune cells have been problematic because they use bacterial collagenase to digest the myocardial tissue. This technique causes activation of the immune cells and thus a loss of function. For example, cardiac mast cells become significantly less responsive to compounds that cause degranulation.12 Therefore, we developed a technique that allows for the isolation of functional cardiac immune cells which would lead to a better understanding of the role of these cells in cardiac disease.13, 14
This method requires a familiarity with the anatomical location of the rat's xiphoid process, axilla and falciform ligament, and pericardium of the heart. These landmarks are important to increase success of the procedure and to ensure a higher yield of cardiac immune cells. These isolated cardiac immune cells can then be used for characterization of functionality, phenotype, maturity, and co-culture experiments with other cardiac cells to gain a better understanding of their interactions.

This method for isolating functional immune cells from the heart provides an alternative to the conventional methods of collagenase digestion, which causes unwanted immune cell activation, resulting in a decreased responsiveness of these cells. Our method of isolation yields functional cardiac immune cells by avoiding problems associated with enzymatic digestion.

심장 기능 면역 세포의 분리

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

2 - 광자 현미경을 사용하여 마우스 Thymus의 Intravital 영상

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

The discovery of increased macrophage infiltration in the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an intensification of interest in immune cell contribution to local and systemic insulin resistance. Isolation and quantification of different immune cell populations in lean and obese AT is now a commonly utilized technique in immunometabolism laboratories; yet extreme care must be taken both in stromal vascular cell isolation and in the flow cytometry analysis so that the data obtained is reliable and interpretable. In this video we demonstrate how to mince, digest, and isolate the immune cell-enriched stromal vascular fraction. Subsequently, we show how to antibody label macrophages and T lymphocytes and how to properly gate on them in flow cytometry experiments. Representative flow cytometry plots from low fat-fed lean and high fat-fed obese mice are provided. A critical element of this analysis is the use of antibodies that do not fluoresce in channels where AT macrophages are naturally autofluorescent, as well as the use of proper compensation controls.

Adipose tissue (AT) is a site of intense immune cell activation and interaction. Almost all cells of the immune system are present in AT and their ratios are altered by obesity. Proper isolation, quantification, and characterization of AT immune cell populations are critical for understanding their role in immunometabolic disease.

지방 조직 면역 세포의 분리

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in various immune responses. DN T cells are a unique immune cell type that has been implicated in regulating immune and autoimmune responses and tolerance to allotransplants1-6. DN T cells are, however, rare in peripheral blood and secondary lymphoid organs (spleen and lymph nodes), but are major residents of the normal kidney. Very little is known about their pathophysiologic function7 due to their paucity in the periphery. We recently described a comprehensive phenotypic and functional analysis of this population in the kidney8 in steady state and during ischemia reperfusion injury. Analysis of DN T cell function will be greatly enhanced by developing a protocol for their isolation from the kidney.
Here, we describe a novel protocol that allows isolation of highly pure ab CD4+ CD8+ T cells and DN T cells from the murine kidney. Briefly, we digest kidney tissue using collagenase and isolate kidney mononuclear cells (KMNC) by density gradient. This is followed by two steps to enrich hematopoietic T cells from 3% to 70% from KMNC. The first step consists of a positive selection of hematopoietic cells using a CD45+ isolation kit. In the second step, DN T cells are negatively isolated by removal of non-desired cells using CD4, CD8, and MHC class II monoclonal antibodies and CD1d &#945;-galcer tetramer. This strategy leads to a population of more than 90% pure DN T cells. Surface staining with the above mentioned antibodies followed by FACs analysis is used to confirm purity.

DNabT cells are rare among peripheral T cells; however, they are abundant in certain non-lymphoid tissues. Difficulty of isolating DN T cells from non-lymphoid tissue hinders their functional analysis despite increasing recognized pathophysiologic significance. We describe a novel protocol for isolation of highly purified DN T cells from murine kidney.

신장에서 더블 네거티브 (Double Negative) αβ의 T 세포의 분리

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining the role of the gene of interest in the development, differentiation, and function of NK cells. Recent advances related to chimeric antigen receptors (CARs) in cancer immunotherapy accentuate the need for an efficient method to deliver exogenous genes to effector lymphocytes. The efficiencies of lentiviral-mediated gene transductions into primary human or mouse NK cells remain significantly low, which is a major limiting factor. Recent advances using cationic polymers, such as polybrene, show an improved gene transduction efficiency in T cells. However, these products failed to improve the transduction efficiencies of NK cells. This work shows that dextran, a branched glucan polysaccharide, significantly improves the transduction efficiency of human and mouse primary NK cells. This highly reproducible transduction methodology provides a competent tool for transducing human primary NK cells, which can vastly improve clinical gene delivery applications and thus NK cell-based cancer immunotherapy.

The goal of this study was to formulate technologies that allow for successful gene transduction in primary natural killer (NK) cells. The dextran-mediated lentiviral transduction of human or mouse primary NK cells results in higher gene expression efficiencies. This method of gene transduction will vastly improve NK cell genetic manipulation.

Dextran Murine 및 인간의 기본 NK 세포의 Lentiviral 변환 효율 향상

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart

The immune system is an essential component of a healthy heart. The myocardium is home to a rich population of different immune cell subsets with functional compartmentalization both during steady state and during different forms of inflammation. Until recently, the study of immune cells in the heart required the use of microscopy or poorly developed digestion protocols, which provided enough sensitivity during severe inflammation but were unable to confidently identify small &#8212; but key &#8212; populations of cells during steady state. Here, we discuss a simple method combining enzymatic (collagenase, hyaluronidase and DNAse) and mechanical digestion of murine hearts preceded by intravascular administration of fluorescently-labelled antibodies to differentiate small but unavoidable intravascular cell contaminants. This method generates a suspension of isolated viable cells that can be analyzed by flow cytometry for identification, phenotyping and quantification, or further purified with fluorescence-activated cell sorting or magnetic bead separation for transcriptional analysis or in vitro studies. We include an example of a step-by-step flow cytometric analysis to differentiate the key macrophage and dendritic cell populations of the heart. For a medium sized experiment (10 hearts) the completion of the procedure requires 2&#8211;3 h.

This protocol presents a simple and efficient method to isolate, identify and quantify immune cells residing in the myocardium of mice during steady state or inflammation. The protocol combines enzymatic and mechanical digestion for the generation of a single cell suspension that can be further analyzed by flow cytometry.

절연 및 심장의 Extravascular 면역 세포의 식별

The immune system is an essential component of a healthy heart. The myocardium is home to a rich population of different immune cell subsets with ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In response to these damages, complex molecular machineries rapidly reseal the plasma membrane to restore its barrier function and maintain cell survival. Despite 60 years of research in this field, we still lack a thorough understanding of the cell resealing machinery. With the goal of identifying cellular components that control plasma membrane resealing or drugs that can improve resealing, we have developed a fluorescence-based high-throughput assay that measures the plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells cultured in microplates. As a model system for plasma membrane damage, cells are exposed to the bacterial pore-forming toxin listeriolysin O (LLO), which forms large 30-50 nm diameter proteinaceous pores in cholesterol-containing membranes. The use of a temperature-controlled multi-mode microplate reader allows for rapid and sensitive spectrofluorometric measurements in combination with brightfield and fluorescence microscopy imaging of living cells. Kinetic analysis of the fluorescence intensity emitted by a membrane impermeant nucleic acid-binding fluorochrome reflects the extent of membrane wounding and resealing at the cell population level, allowing for the calculation of the cell resealing efficiency. Fluorescence microscopy imaging allows for the enumeration of cells, which constitutively express a fluorescent chimera of the nuclear protein histone 2B, in each well of the microplate to account for potential variations in their number and allows for eventual identification of distinct cell populations. This high-throughput assay is a powerful tool expected to expand our understanding of membrane repair mechanisms via screening for host genes or exogenously added compounds that control plasma membrane resealing.

Here we describe a high-throughput fluorescence-based assay that measures the plasma membrane resealing efficiency through fluorometric and imaging analyses in living cells. This assay can be used for screening drugs or target genes that regulate plasma membrane resealing in mammalian cells.

포유류 세포에서 효율 Resealing 원형질 막의 높은 처리량 측정

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...