Name: reliable and high efficiency extraction of kidney immune cells
Uploaded: 2016-08-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
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This work is supported by a Research Grant from Dialysis Clinics Inc. and from the University of Missouri Research Board Grant.

수행 모든 프로토콜 단계 검토와 미주리 동물 관리 및 사용위원회의 대학 (ACUC)에 의해 승인되었다. 모든 연령에서 이론적으로 모든 설치류 실험에 사용할 수 있지만,이 프로토콜의 경우, 15주 세 남성 C57BL / 6 마​​우스를 사용 하였다. 이 비 생존 수술 때문에 안락사 방혈 및 양자 기흉에 의해 달성된다. 신장의 1 관류 참고 : 심장, 간, 신장 등 장기의 관류 데이​​터의 해석을 방해 할 수 혈액을 제거합니다. 가능하면 따라서, 우리는 항상 장기를 관류. <ol><li> 그것은 움직이지 될 때까지 (3 ml / 분) 유도 챔버 이소 플루 란에 마우스를 놓습니다. 다음으로, 챔버에서 마우스를 제거 해부 테이블에 등쪽를 놓고 마우스 코의 이소 플루 란 콘을 배치하고 조절을 통해 1.5 ml / 분의 속도로 이소 플루 란을 누릅니다. </li><li> 발가락 핀치 응 답을 확인동물 마취의 수술 비행기를 달성 한 경우 핀셋 전자는 평가합니다. 식염수 복부 복부를 청소하고 가위로 복부를 열고 잘라 마우스의 왼쪽에 (수술 분야 중) 복부 장기를 밀어 넣습니다. </li><li> 과 하대 정맥에서 혈액을 수집 25 게이지 1 cc의 주사기에 바늘 고정 0.5M EDTA의 10 μl를 포함하는 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 추가합니다. 참고 : 혈액의 컬렉션은 선택 사항입니다. 플라즈마 생화학 적 측정을 위해 사용될 수있다. 백혈구는 유세포 분석을 위해 사용될 수있다. </li><li> 가위를 사용하여, 오른쪽 심방에 작은 상처가 다음 단계에서 혈액과 PBS의 혼합물을 수 있도록 할 수 있습니다. </li><li> 50 CC 주사기를 타고 얼음처럼 차가운 PBS (20 ~ 30 CC)를 입력합니다. 다음, 주사기에 21 ~ 25 G 바늘을 부착 (집게 사이에 부드럽게 마음을 잡고)의 정점에서 좌심실에 구멍을 천천히 과정을 통해 인산염 완충 식염수 산도 7.4 (PBS)과 좌심실을 관류1 ~ 2 분. 참고 : 마음이 바로 관류의 처음 몇 밀리리터에 blanches. 이 재관류이 대정맥을 통해 정맥 반환을 통해 간에서 혈액을 배출되어 있음을 나타냅니다 같이 희게의 간을 준수하십시오. 또한,이 우심실의 구멍을 나타냅니다으로 폐 주입시 확대되지 않도록해야합니다. 폐 확장한다면, 약간 뒤로 좌심실에 바늘을 철회하고 재관류를 계속합니다. 달성 안락사까지 제 절개 찍은 시간 미만이 최소 인 </li></ol> 신장 2. 해부 <ol><li> 관류가 완료되면, 첨부 파일 (혈관, 지방과 부신) 및 소비세의 권리 신장을 해부 가위와 집게를 사용합니다. </li><li> 부드럽게 절단 및 포셉으로 해부하여 신장을 덮고있는 캡슐을 제거합니다. 신장의 무게를. 참고 : 신장 무게 것은 선택 사항입니다. 그러나, 일부 실험신장 사이즈 / 조직의 그램 당 셀 수율을 정규화하기 위해 사용될 수있다 중량의 변화가 발생할 수있다. </li><li> 신장 무게 후, 0.5 % FBS를 포함하는 RPMI-1640 1 ㎖에 배치 또는 염색 완충 용액 세포 계측법 (50 ML 원뿔 스크류 캡 튜브를) 흐름 및 추가 사용까지 얼음에 튜브를 배치합니다. 참고 설명의 편의상, 우리는 염색 완충액 유세포 면역 세포의 분리의 나머지를 들어 설명한다. 모두 신장 또는 신장의 1 + 1 / 3의 RD (옵션) 하류의 실험에 따라 사용될 수 있지만, 또한, 단일 신장에서의 면역 세포의 분리를 설명한다. 신장의 1/3 RD 단백질 / RNA 실험에 고정 될 수 있고, 1/3 RD는 면역 또는 투과 전자 현미경을위한 버퍼에 배치 될 수있다. </li></ol> 신장의 3 균질화 <ol><li> 샘플의 식별 정보와 함께 5 내지 80 ml의 용량 균질화 백 레이블링내부 스트레이너 (STR)를 제거하고 폐기합니다. 차가운 얼음 유동 세포 계측법 염색 완충 용액의 5 ml의 가방을 채우고 버퍼에 신장을 전송합니다. 두 번째 샘플 또는 처리가 필요 이상의 샘플에 대해이 과정을 반복합니다. </li><li> 절반은 유동 세포 계측법 염색 완충액에 침지 신장을 가지며, 나머지 절반은 단순히 위로 절첩되도록 반으로 균질화 백 접어. </li><li> 조직 균질의 전원을 켜고 빠른 (설정) rpm으로 설정합니다. 하단 가장자리에 패 직면 신장과 접힌 균질화 가방을 배치하지만 가방의 하단이 패의 아래쪽 테두리 아래로 슬라이딩되지 않습니다 있는지 확인하십시오. <ol><li> 2 패이 있기 때문에 동시에 두 번째 샘플을 처리합니다. 120 초로 시간을 선택합니다. 패는 신장을 균질화 앞뒤로 이동 관찰한다. 주 : 한편, 중단이 처음 두가 처리되는 동안 샘플이 더 신장 (또는 다른 조직)을 제조하는데 사용될 수있다. </li></올&gt; </li><li> 균질화의 첫 번째 세트를 완료 한 후, 얼음에 가방을 전송하는 등 다음의 샘플 세트와 함께 조직 균질를 다시로드합니다. 시각적으로 신장이 충분히 균질화하고 더 큰 덩어리를 볼 수 없는지 확인합니다. 참고 : 일반적으로, 빠른 rpm에서 조직 균질의 2 분의 신장에 적합합니다. </li><li> 얼음에 50 ML 원뿔 튜브에 100 μm의 셀 스트레이너를 놓습니다. 다음으로, 셀 스트레이너로 완전하게 균질 피펫. 4 ° C에서 1 분 50 XG에서 바닥 원심 분리기를 설정하고 원심 분리기에 샘플을로드합니다. 참고 : 원심 분리는 모든 균질 (포함하는 셀)을 셀 스트레이너를 통과 한 것을 보장합니다. </li><li> 원심 분리기에서 튜브를 제거하고 얼음에 다시 배치합니다. 셀 스트레이너를 무시하고 균질을 유지합니다. 동일 부피 추가 (~ 6 mL)에 균일 한 세포 현탁액을 만들기 위해 세포 펠렛 / 상등액 피펫 위아래로 수회에 1X RBC 용해 완충액. Visua에서야 베드로, 즉시 정지 감소에 붉은 색의 일부를 관찰합니다. 최대 RBC 용해를 달성하기 위해 5 분 동안 얼음에 튜브를 남겨주세요. 참고 : 연구자는 신장 관류 적은 세포 조작이 필요한 자신감을 경우 RBC 용해 단계를 건너 뛸 수 있습니다. 우리는 RBC 용해에 세포 현탁액을 실시하지 않음으로써 신장 세포 수율의 현저한 증가를 관찰 하였다. </li><li> 5 분 세포 펠렛을 형성하도록 500 XG, 39 ° C로 설정되어있는 원심 분리기에서 튜브를 스핀. 단계 3.6 및 3.7 동안 콜로 이달 실리카 (퍼콜)를 기반으로 밀도 구배 원심 분리 준비 :합니다. <ol><li> 바닥 폴리 프로필렌 튜브 라운드 10 mL를 취하여 해당 샘플 번호로 레이블과 튜브 랙에 배치합니다. 참고 : 다음은 4 신장 샘플에 대한 충분한 밀도 구배 시약을 만드는 방법을 설명합니다. </li><li> 유동 세포 계측법 염색 완충 용액 7 mL를 취하여 15 ML 원뿔 튜브로 피펫. 2 M 자당의에 1 ML을 추가0.25 M 자당을 준비합니다. </li><li> 다음으로, 또 다른 15 ML 원뿔 관에 밀도 구배 시약과 피펫을 7.2 mL를 취하여. 72 %를 밀도 구배 시약 및 0.25 M 자당을 준비하는 유동 세포 계측법 염색 완충 용액 1.55 mL 및 2 M 자당의 1.25 ML을 추가합니다. </li><li> 피펫 각 샘플에 대해 하나의 둥근 바닥의 폴리 프로필렌 튜브에 72 % 농도 구배 시약 1 ㎖. </li></ol></li></ol> 4. 그라데이션 원심 분리 <ol><li> 단계 3.7 후, 튜브를 꺼내 부드럽게 한 부드러운 움직임에 뜨는을 가만히 따르다 또한 튜브가 거꾸로 유지되는 동안 형성 액체의 다음 드롭을 가만히 따르다. 참고 :이 단계는 수익률의 변화를 만들 수있을만큼 밀도 구배를 변경할 수를 초과하는 액체 뒤에 남겨두고 이후 중요하다. 튜브가 수직으로 다시 설정하면 ~ 액의 200 ~ 300 μL은 세포 펠렛으로 남아있다. </li><li> 피펫 조심스럽게 그러나 적극적으로 세포 펠렛 상에 0.25 M 자당 1 ml의 최대 피펫 및 브린 아래로g 균일 한 서스펜션에 세포. 다음에, 36 % 농도 구배 시약을 형성하기 위해 세포를 혼합하여 강하게 피펫 다시 1 ㎖의 72 % 밀도 구배 시약 (3.7.4)에 세포 현탁액을 추가. </li><li> 폴리 프로필렌 파스퇴르 (전송) 피펫으로 72 %의 밀도 구배 시약 1 mL를 취하여. 전구의 압력도 부드럽게 세포 현탁액의 하단에 파스퇴르 피펫 (36 % 농도 구배 시약)을 삽입하고을 형성하는 72 % 농도 구배 시약을 언로드 (선단에서 액체 열을 유지하고 기포 형성을 방지) 별개의 무거운 층. </li><li> 부드럽게 샘플 튜브를 선택하고이 단계 동안 실내 온도에서 원심 분리로 놓는다. 500 X g에서 20 ~ 30 분 스핀. </li><li> 한편, 해당 샘플 식별자 바닥 원심 분리기 튜브의 둘레에 폴리 프로필렌의 다른 두 세트를 준비합니다. </li><li> 단계 4.4이 완료된 후, 최소한의 진탕 부드럽게 폴리 프로필렌 튜브를 함유하는 샘플을 제거하고 아래로 설정할튜브 랙. </li><li> 첫 번째 샘플 튜브 및 해당 빈 튜브를 선택합니다. 폴리 프로필렌 파스퇴르 피펫으로 부드럽게하지만 철저하게 측정 흡입으로, 상단 &quot;정크 층&quot;또는 &quot;끈적 끈적한 물질&quot;을 제거하고 빈 둥근 바닥 원심 분리기 튜브에 넣어. <ol><li> (붉은 색조 [적혈구]와 오프 화이트 나타날 수 있습니다) 도달 &quot;버피 코트 &#39;까지 그라데이션의 상단 부분을 제거 진행합니다. ~ 3mm의 높이가 &quot;버피 코트&quot;로부터 도달하면 흡인 정지. 참고 :이 물건이 완전히 흡입을 계속하기 전에 그라데이션의 상부에서 사라 있는지 확인합니다. </li></ol></li><li> 신선한 파스퇴르 피펫과 신선한 둥근 바닥 원심 분리기 튜브를 타고 부드럽게 버피 코트를 제거합니다. 세포의 대부분을 수집하고 적절한 샘플 식별자와 2 차 새로운 둥근 바닥 튜브에 추가되도록, 버피 코트 아래 5mm - 3 흡인 계속합니다. </li><li> 1-2 ml의 O를 추가F 유동 세포 계측법 염색 버퍼 2 차 튜브에 용액로 pipetting 아래로 잘 섞는다. </li><li> 4 ° C에서 5 분 동안 500 XG에서 세포를 스핀 다운. 유동 세포 계측법 염색 완충 용액와 2 차 세척 단계는 선택 사항입니다. 유동 세포 계측법 염색 완충 용액 500 μL와에 재현 탁은 혈구를 사용하여 세포를 계산 진행합니다. </li></ol> 5. 옵션 (셀 라벨) <ol><li> 동일한 수의 셀에 대한 각 샘플 Aliqout. 10 6 셀 당 0.5 μg의 (안티 CD16 / CD32 FcRγ 쇄)의 희석에 차단 항체를 추가하고 15 분 동안 얼음에 품어. </li><li> 전에 실제 실험에, 연구자에 의해 서로 잘 작동하도록 결정된다 (적절한 형광 접합) 일차 항체의 원하는 칵테일을 추가합니다. 30 분 동안 빙상에서 인큐베이션. PBS로 세포를 씻으십시오. 참고 :이 원고에 대한 신장 면역 세포 라벨의 데모를 들어, 우리는 T-LY 사용mphocyte 및 대 식세포 / 수지상 세포 패널. BV421, 안티 Foxp3의 (클론 : FJK-16) APC, 안티 CD127 (클론 : A7R34) 다음 T 림프구 패널 고칠 생존 얼룩 FVS510, 항 CD45 (30-F11 클론)로 구성 PE / Cy7, 안티 CD44 (클론 : IM7)를 PerCP / Cy5.5, 안티 - CD4 (클론 : RM4-5) APC-Cy7, 안티 - CD8 (클론 : 53-6.7) BV785. BV421, 안티 Ly6G (클론 : 1A8) FITC, 안티 CD11b를 (클론 : M1 /​​ 70)를 PerCP-Cy5.5, 안티 : 대 식세포 패널 고칠 생존 얼룩 FVS510, 항 CD45 (30-F11 복제) 구성 F4 / 80 (클론 : BM8) APC, 안티의 CD11c (클론 : N418) BV785. </li><li> 고 정부 생존 얼룩을 추가하고 5 분 동안 벤치 위에 둡니다. 고 정부 생존 얼룩 초과를 제거하는 유동 세포 계측법 염색 완충 용액으로 세포를 씻으십시오. </li><li> 고정 / Permeabilization 시약을 추가하고 4 ºC에서 밤새 품어. permeabilization 용액에 세척 할 것. </li><li> 세포 내 얼룩의 경우, 10 분 동안 항 CD16 / 32 FcRγ 쇄 다시 차단합니다. 세포 내 얼룩을 추가하고 20 ~ 30 분 동안 품어. 체육의 워시 2 배rmeabilization 솔루션입니다. </li><li> FACS 시스템 3.9을 통해 유동 세포 계측법 염색 버퍼 솔루션 및 실행 샘플을 Resuspend. </li></ol>

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저자는 공개 아무것도 없어.

우리는 여기에서 안정적이고 효율적으로 신장에서의 면역 세포를 얻을 수있는 방법을 제시 하였다. 널리 사용되는 콜라겐 분해 공정 (조직의 기계적인 파괴)에 대한 주요 변경은 약 30 분 동안 저장하고, 가능한 면역 세포의 다수의 분리 4 신장 샘플 하에서 2 시간 걸린다. 또한, 연구의 질문에 따라, 우리는 이제 하나의 신장을 사용하는 우리의 면역 세포 분리를위한 (다른 신장은 웨스턴 블랏, PCR?...

면역 시스템의 활성화는 여러 신장 질환 및 병태 생리 학적 과정 6,10,11,13에서 발생합니다. 활발한 연구 발생할 수있는 영역은 면역계의 활성화를위한 다양한 트리거들을 포함, 다양한 세포 유형과 관련된 특정 질환 속에서 사이토킨 / 케 모킨 패턴 등 특정 약물에 의한 상기 프로세스의 모두의 조절은 국소 빈혈 - 재관류에 예증 상해 (급성 신부전에 대한 모델), (6 주 이상) 5 수리 또는 섬유증의 기간을 통해 유지된다 몇 시간 내에 조혈 세포 또는 CD45 + 세포 유래 면역 세포 또는 골수의 증가가,가, 12. 이들 면역 세포가 복구 5,12- 과정을 조율하는 염증성 및 항 염증성 사이토 카인 및 케모카인을 분비 모두. 현재, 단일 세포 현탁액으로 세포 집단 라벨을 동시에 다수의 형광체를 사용할 수있는 능력은 광고와 증가4 ~ 5 레이저와 기계 계측법 현대적인 흐름을 배출. 이것은 실질적으로 자신의 기능 상태 3,7에 따라 세포 집단을 구별하는 기능을 추가했습니다. F4 / 80 로우는 CD11b 고 Ly6b 높은 CD206 낮은 적어도 3 개의 형광체는 생균, CD45 + (백혈구) 및 Ly6G- (호중구) 및 위해 게이트에 동일한 샘플 볼륨에 필요한 것 예를 들어, 정확하게 식세포 레이블을 이것은 매우 가능한 새로운 흐름 세포 계측기 3입니다. 그러나, 사이토 카인의 분비, 세포 증식, 세포 독성, 대 식세포 활성화 및 림프구 및 단구의 다양한 서브 세트의 수의 정량 하류 분석법뿐만 아니라 좋은 품질 (생균, 단봉)하지만 세포의 적당한 숫자를 필요로한다. 신장에서의 면역 체계는 적응 및 선천적 부품 및 여러 세포 유형 1,7,13 모두 이루어진다. 예를 들어, 마우스에서 두 아이(1.4 × 106 세포) 및 이들의 약 5~15% (1,400-4,200) 절연 신장 총 면역 세포 neys 함께 2~17%를 포함하는보고 (28,000-266,000)는 CD45 + 세포는 CD4 + 세포이다 한 , 5,12-. 이 CD4 + 세포의 작은 비율 (5-15%, 70-630)는 Foxp3의 + 세포 (그림 1) 일 수 있습니다. 때문에 (이 경우 CD45 + CD4 + Foxp3의 + 세포) 세포의 비율에서 이러한 단계 현명한 감소 관심 때로는 세포 인구 100 ~ 단순한 세포에 의해 표현된다. CD4 + CD45 + 세포 + Foxp3의 소수는 필수적 총 다수의 셀이 분리되어 상기 세포는 시토 킨 분비 분석 등 하류 연구 양질의 것으로한다. 또한, 상기 개체군은 정량 분석​​을 수행하기 위해 충분히 높은 숫자로 표현되지 않기 때문에 2-3 마우스로부터 신장을 결합 할 필요가있다. 따라서, 신장 단핵 세포 집단의 안정적이고 효율적인 분리 스터드 위해 바람직Y 신장 질환과 관련된 면역 스펙트럼. 전통적으로, 신장 단핵 세포의 분리를 위해, 연구자들은 1 1,5,12 DNase를 포함 콜라게나 1A 또는 II와 같은 효소 digestions 다양한 사용했다. 잘 콜라게나 최적 농도 및 배양 4,14,15의 기간 동안 적정을 필요로, 로트 번호와 제조 회사에 따라 다릅니다 효소 활성을 갖는 것으로 알려져있다. 또한, 콜라게나 제와 소화가 작은 조각으로 신장을 닦지 시간을 추가하여 반응을 정지 EDTA의 배양을위한 가열 (37 ℃로) 목욕 및 추가 시간에 신장 조각의 배양을 필요로한다. 또한, 이하 불임은 세포 배양을 필요로하는 일부의 하류 절차에 대해 달성 될 수있다. 더 중요한 것은, 관련 연구자 모든 변수에 따라, 그것을 실험실에 걸쳐 데이터를 해석 가변성 리드. 최근과티슈 기계 교란 / 균질 기 (16)의 개발은 콜라게나 제 소화 공정을 완전히 피할 신장이 간단한 기계적 파괴로 대체된다. 여기서, 우리는 매일 면역 세포 추출에 대한 신장 면역 세포의 분리를위한 간단하면서도 효율적인 방법을 보여줍니다. 중요한 것은,이 방법은 뇌와 간 (16) 등의 다른 연질 및 비 섬유 성 조직으로 구성 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>Stomacher 80 Biomaster lab system</td><td>Seward</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stomacher 80 Classic bags</td><td>Seward</td><td>BA6040/STR</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend XFR Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Or equivalent equipment&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63514-11</td><td></td></tr><tr><td>Analytical flow cytometer</td><td>BD LSR-X20 Fortessa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Percoll&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P1644</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s phosphate buffered saline 1x (DPBS)</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylene tubes, no cap</td><td>Becton Dickinson</td><td>352002</td><td></td></tr><tr><td>Fixable Viability Stain</td><td>BD Biosciences&amp;nbsp;</td><td>FVS510,&amp;nbsp; 564406</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD16/32 (Clone: 93)</td><td>EBioscience</td><td>14-0161</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD45 (clone: 30-F11)&amp;nbsp; BV421&amp;nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>103133/4</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Foxp3 (Clone: FJK-16s) APC</td><td>EBioscience</td><td>17-5773</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD127 (Clone: A7R34) PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>135013/4</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD44 (Clone: IM7) PerCP/Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>103031/2</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD4 (Clone: RM4-5) APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>100413/4</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD8 (Clone: 53-6.7) BV785</td><td>Biolegend</td><td>100749/50</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ly6G (Clone: 1A8) FITC</td><td>Biolegend</td><td>127605/6</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD11b (Clone: M1/70) PerCP-Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>101227/8</td><td></td></tr><tr><td>Anti-F4/80 (Clone: BM8) APC</td><td>Biolegend</td><td>123115/6</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD11c (Clone: N418) BV785</td><td>Biolegend</td><td>117335/6</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD301 (Clone: LOM-14) PE-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>145705/6</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD26 (Clone: H194-112) PE</td><td>Biolegend</td><td>137803/4</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;mu;m filter&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Tubes 50 ml</td><td>Fisher</td><td></td><td>Or equivalent equipment&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fisherbrand Tubes 15 ml</td><td>Fisher</td><td></td><td>Or equivalent equipment&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher chemical</td><td>S5-3</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipette fine tip</td><td>Samco Scientific</td><td>232</td><td>Or equivalent equipment&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Flow Cytometery Staining Buffer Solution</td><td>EBioscience</td><td>00-4222-26</td><td>Or equivalent equipment&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1x RBC Lysis Buffer</td><td>EBioscience</td><td>00-4333-57</td><td>Or equivalent equipment&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

reliable and high efficiency extraction of kidney immune cells

Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes. The immune system consists of both adaptive and innate components and multiple cell types. Sometimes, the cell type of interest is present in very low numbers among the large numbers of total cells isolated from the kidney. Hence, reliable and efficient isolation of kidney mononuclear cell populations is important in order to study the immunological problems associated with kidney diseases. Traditionally, tissue isolation of kidney mononuclear cells have been performed via enzymatic digestions using different varieties and strengths of collagenases/DNAses yielding varying numbers of viable immune cells. Recently, with the development of the mechanical tissue disruptors for single cell isolation, the collagenase digestion step is avoided and replaced by a simple mechanical disruption of the kidneys after extraction from the mouse. Herein, we demonstrate a simple yet efficient method for the isolation of kidney mononuclear cells for every day immune cell extractions. We further demonstrate an example of subset analysis of immune cells in the kidney. Importantly, this technique can be adapted to other soft and non-fibrous tissues such as the liver and brain.

실행될 수있는 패널들의 수를 확실하게 신장에서 추출 될 수 면역 세포의 수에 의존한다. 여기서, 우리는이 패널, T 림프구 용 및 대 식세포 / 수지상 세포를 실행할 수있는 능력을 입증한다. T 림프구 패널에서, 우리는 먼저 앞으로 분산 형 (FSC)와 사이드 분산 형 (SSC) 패턴을보고 그림 1 (왼쪽 상단 도트 플롯)과 같이 관심의 인구를 묘사. 다음에, 생존 마커,이 ?...

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Reliable and High Efficiency Extraction of Kidney Immune Cells

Techniques that are reliable and efficient for the isolation of kidney immune cells are needed for downstream applications. This requires surface antibody labeling of a small number of kidney immune cells. Herein, we describe a concise method for isolation of kidney immune cells that seemingly achieves this goal.

신장 면역 세포의 신뢰성 및 고효율 추출

Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes.  The immune system consists of both adaptive and innate ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.3K 조회수.  Department of Medicine, University of Missouri-Columbia and Harry S Truman Memorial Veteran's Hospital. Techniques that are reliable and efficient for the isolation of kidney immune cells are needed for downstream applications. This requires surface antibody labeling of a small number of kidney immune cells. Herein, we describe a concise method for isolation of kidney immune cells that seemingly achieves this goal.

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Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in various immune responses. DN T cells are a unique immune cell type that has been implicated in regulating immune and autoimmune responses and tolerance to allotransplants1-6. DN T cells are, however, rare in peripheral blood and secondary lymphoid organs (spleen and lymph nodes), but are major residents of the normal kidney. Very little is known about their pathophysiologic function7 due to their paucity in the periphery. We recently described a comprehensive phenotypic and functional analysis of this population in the kidney8 in steady state and during ischemia reperfusion injury. Analysis of DN T cell function will be greatly enhanced by developing a protocol for their isolation from the kidney.
Here, we describe a novel protocol that allows isolation of highly pure ab CD4+ CD8+ T cells and DN T cells from the murine kidney. Briefly, we digest kidney tissue using collagenase and isolate kidney mononuclear cells (KMNC) by density gradient. This is followed by two steps to enrich hematopoietic T cells from 3% to 70% from KMNC. The first step consists of a positive selection of hematopoietic cells using a CD45+ isolation kit. In the second step, DN T cells are negatively isolated by removal of non-desired cells using CD4, CD8, and MHC class II monoclonal antibodies and CD1d &#945;-galcer tetramer. This strategy leads to a population of more than 90% pure DN T cells. Surface staining with the above mentioned antibodies followed by FACs analysis is used to confirm purity.

DNabT cells are rare among peripheral T cells; however, they are abundant in certain non-lymphoid tissues. Difficulty of isolating DN T cells from non-lymphoid tissue hinders their functional analysis despite increasing recognized pathophysiologic significance. We describe a novel protocol for isolation of highly purified DN T cells from murine kidney.

신장에서 더블 네거티브 (Double Negative) αβ의 T 세포의 분리

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in ...

연구

면역학 및 감염병학

Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model substrates for organ-scale tissue development. Sprague Dawley rat kidneys are cannulated by inserting a catheter into the renal artery and perfused with a series of low-concentration detergents (Triton X-100 and sodium dodecyl sulfate (SDS)) over 26 hr to derive intact, whole-kidney scaffolds with intact perfusable vasculature, glomeruli, and renal tubules. Following decellularization, the renal scaffold is placed inside a custom-designed perfusion bioreactor vessel, and the catheterized renal artery is connected to a perfusion circuit consisting of: a peristaltic pump; tubing; and optional probes for pH, dissolved oxygen, and pressure. After sterilizing the scaffold with peracetic acid and ethanol, and balancing the pH (7.4), the kidney scaffold is prepared for seeding via perfusion of culture medium within a large-capacity incubator maintained at 37 &#176;C and 5% CO2. Forty million renal cortical tubular epithelial (RCTE) cells are injected through the renal artery, and rapidly perfused through the scaffold under high flow (25 ml/min) and pressure (~230 mmHg) for 15 min before reducing the flow to a physiological rate (4 ml/min). RCTE cells primarily populate the tubular ECM niche within the renal cortex, proliferate, and form tubular epithelial structures over seven days of perfusion culture. A 44 &#181;M resazurin solution in culture medium is perfused through the kidney for 1 hr during medium exchanges to provide a fluorometric, redox-based metabolic assessment of cell viability and proliferation during tubulogenesis. The kidney perfusion bioreactor permits non-invasive sampling of medium for biochemical assessment, and multiple inlet ports allow alternative retrograde seeding through the renal vein or ureter. These protocols can be used to recellularize kidney scaffolds with a variety of cell types, including vascular endothelial, tubular epithelial, and stromal fibroblasts, for rapid evaluation within this system.

This protocol describes decellularization of Sprague Dawley rat kidneys by antegrade perfusion of detergents through the vasculature, producing acellular renal extracellular matrices that serve as templates for repopulation with human renal epithelial cells. Recellularization and use of the resazurin perfusion assay to monitor growth is performed within specially-designed perfusion bioreactors.

상피 세포 다시 채우기 및 신장 조직 개발을위한 설치류 세포 외 기질 비계의 준비

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model ...

생체공학

Rapid Depletion of Renal Macrophages using Human CD59/Intermedilysin Cell Ablation Tool

Renal macrophages (RMs) are essential for kidney health, orchestrating immune surveillance, tissue homeostasis, and responses to injury. Previously, we reported the use of a human CD59 (hCD59)/intermedilysin (ILY) cell ablation tool to study the distinct fate, dynamics, and niches of RMs of bone marrow or embryonic origin. RMs originate from yolk sac-derived macrophages, fetal liver monocytes, and bone marrow-derived monocytes and are maintained in adulthood through local proliferation and recruitment of circulating monocytes. Here, we report a detailed protocol for the selective ablation of RMs to study their regeneration, including 1) generation and characterization of the Cre-inducible expression of hCD59 in mouse RMs, 2) purification of ILY and characterization of ILY activity, 3) induction of hCD59 expression on RMs in compound mice, and 4) characterization of regeneration after ILY-mediated RM ablation. ILY specifically and rapidly depletes RMs in compound mice, with efficient macrophage ablation within 1 day of ILY administration. Renal macrophage regeneration began by day 3 post-ablation, with ~88% recovery by day 7. This model offers a powerful tool for studying macrophage biology and can be used for selectively ablating other cell populations in the kidney, liver, and fatty tissues to investigate their function and regeneration.

A protocol is reported here for the selective ablation of renal macrophages to study their regeneration using the human CD59/intermedilysin cell ablation tool. This method is also applicable for studying the function and regeneration of the other cell populations in the kidney, liver, and fatty tissue.

Human CD59/Intermedilysin Cell Ablation Tool을 사용한 신장 대식세포의 급격한 고갈

Renal macrophages (RMs) are essential for kidney health, orchestrating immune surveillance, tissue homeostasis, and responses to injury. Previously, we ...

발생학

A Novel Clinical Grade Isolation Method for Human Kidney Perivascular Stromal Cells

Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) are tissue homeostatic and immune modulatory cells that have shown beneficial effects in kidney diseases and transplantation. Perivascular Stromal Cells (PSCs) share characteristics with bone marrow MSCs (bmMSCs). However, they also possess, most likely due to local imprinting, tissue-specific properties and play a role in local tissue homeostasis. This tissue specificity may result in tissue specific repair, also within the human kidney. We previously showed that human kidney PSCs (kPSCs) have enhanced kidney epithelial wound healing whereas bmMSCs did not have this potential. Moreover, kPSCs can ameliorate kidney injury in vivo. Therefore, kPSCs constitute an interesting source for cell therapy, particularly for kidney diseases and renal transplantation. Here we show the detailed isolation and culture method for kPSCs from transplant-grade human kidneys based on whole-organ perfusion of digestive enzymes via the renal artery and enrichment for the perivascular marker NG2. In this way, large cell quantities can be obtained that are suitable for cellular therapy.

Here we present a novel clinical grade isolation and culture method for kidney Perivascular Stromal Cells (kPSCs) based on whole organ perfusion with digestive enzymes and NG2-cell enrichment. With this method, it is possible to acquire sufficient cell numbers for cellular therapy.

인간의 신장 혈관 주위 Stromal 세포에 대 한 새로운 임상 등급 격리 방법

Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) are tissue homeostatic and immune modulatory cells that have shown beneficial effects in kidney diseases and ...

의학

Detection of MicroRNA Expression in the Kidneys of Immunoglobulin A Nephropathic Mice

Immunoglobulin A (IgA) nephropathy is a type of primary glomerulonephritis characterized by the abnormal deposition of IgA, leading to the end-stage renal failure. In recent years, the involvement of microRNAs (miRNAs) has been reported in the pathogenesis of IgA nephropathy. However, there is no established method for profiling miRNAs in IgA nephropathy using small animal models. Therefore, we developed a reliable method for analyzing miRNA in the kidney of an IgA mouse model (HIGA mouse). The goal of this protocol is to detect the altered expression levels of miRNAs in the kidneys of HIGA mice when compared with the levels in kidneys of control mice. In brief, this method consists of four steps: 1) obtaining kidney samples from HIGA mice; 2) purifying total RNA from kidney samples; 3) synthesizing complementary DNA from total RNA; and 4) quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) of miRNAs. Using this method, we successfully detected the expression levels of several miRNAs (miR-155-5p, miR-146a-5p, and miR-21-5p) in the kidneys of HIGA mice. This new method can be applied to other studies profiling miRNAs in IgA nephropathy.

microRNAs are involved in the pathogenesis of IgA nephropathy. We have developed a reliable method for detecting microRNA expression levels in the kidneys of an IgA nephropathy mouse model (HIGA mice). This new method will facilitate to check for miRNAs involvement in IgA nephropathy.

면역글로불린 A 신병성 마우스의 신장에서 MicroRNA 발현 검출

Immunoglobulin A (IgA) nephropathy is a type of primary glomerulonephritis characterized by the abnormal deposition of IgA, leading to the end-stage renal ...

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the key steps to investigate TRMs. There are slight variations in lymphocyte isolation protocols for different organs. Kidney is an essential non-lymphoid organ with numerous immune cell infiltration especially after pathogen exposure or autoimmune activation. In recent years, multiple labs including our own have started characterizing kidney resident CD8+ T cells in various physiological and pathological settings in both mouse and human. Due to the abundance of T lymphocytes, kidney represents an attractive model organ to study TRMs in non-mucosal or non-barrier tissues. Here, we will describe a protocol commonly used in TRM-focused labs to isolate CD8+ T cells from mouse kidneys following systemic viral infection. Briefly, using an acute lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) infection model in C57BL/6 mice, we demonstrate intravascular CD8+ T cell labeling, enzymatic digestion, and density gradient centrifugation to isolate and enrich lymphocytes from mouse kidneys to make samples ready for the subsequent flow cytometry analysis.

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Following viral infection, kidney harbors a relatively large number of CD8+ T cells and offers an opportunity to study non-mucosal TRM cells. Here, we describe a protocol to isolate mouse kidney lymphocytes for flow cytometry analysis.

유동 세포 분석용 마우스 신장 거주자 CD8+ T 세포의 격리

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...

An Efficient Sieving Method to Isolate Intact Glomeruli from Adult Rat Kidney

Preservation of glomerular structure and function is pivotal in the prevention of glomerulonephritis, a category of kidney disease characterized by proteinuria which can eventually lead to chronic and end-stage renal disease. The glomerulus is a complex apparatus responsible for the filtration of plasma from the body. In disease, structural integrity is lost and allows for the abnormal leakage of plasma contents into the urine. A method to isolate and examine glomeruli in culture is critical for the study of these diseases. In this protocol, an efficient method of retrieving intact glomeruli from adult rat kidneys while conserving structural and morphological characteristics is described. This process is capable of generating high yields of glomeruli per kidney with minimal contamination from other nephron segments. With these glomeruli, injury conditions can be mimicked by incubating them with a variety of chemical toxins, including protamine sulfate, which causes foot process effacement and proteinuria in animal models. Degree of injury can be assessed using transmission electron microscopy, immunofluorescence staining, and western blotting. Nephrin and Wilms Tumor 1 (WT1) levels can also be assessed from these cultures. Due to the ease and flexibility of this protocol, the isolated glomeruli can be utilized as described or in a way that best suits the needs of the researcher to help better study glomerular health and structure in diseased states.

The main focus of this protocol is to efficiently isolate viable primary glomeruli cultures with minimal contaminants for use in a variety of downstream applications. The isolated glomeruli retain structural relationships between component cell types and can be cultured ex vivo for a short time.

그대로 Glomeruli 성인 쥐 신장에서 분리 하는 효율적인 체질 하 방법

Preservation of glomerular structure and function is pivotal in the prevention of glomerulonephritis, a category of kidney disease characterized by ...

Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) imaging. They have received great attention in all research areas for the potential to analyze microscopic multicellular structures that extend over macroscopic distances. Given that kidney tubules, vasculature, nerves, and glomeruli extend in many directions, which have been only partially captured by traditional two-dimensional techniques so far, tissue clearing also opened up many new areas of kidney research. The list of optical clearing methods is rapidly growing, but it remains difficult for beginners in this field to choose the best method for a given research question. Provided here is a simple method that combines antibody labeling of thick mouse kidney slices; optical clearing with cheap, non-toxic and ready-to-use chemical ethyl cinnamate; and confocal imaging. This protocol describes how to perfuse kidneys and use an antigen-retrieval step to increase antibody- binding without requiring specialized equipment. Its application is presented in imaging different multicellular structures within the kidney, and how to troubleshoot poor antibody penetration into tissue is addressed. We also discuss the potential difficulties of imaging endogenous fluorophores and acquiring very large samples and how to overcome them. This simple protocol provides an easy-to-setup and comprehensive tool to study tissue in three dimensions.

The combination of antibody labeling, optical clearing, and advanced light microscopy allows three-dimensional analysis of complete structures or organs. Described here is a simple method to combine immunolabeling of thick kidney slices, optical clearing with ethyl cinnamate, and confocal imaging that enables visualization and quantification of three-dimensional kidney structures.

면역 표지된 신장 조직의 광학 클리어링 및 화상 진찰

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are executed by multiple cell types arranged in a complex architecture across the corticomedullary axis of the organ. Recent advances in single-cell transcriptomics have accelerated the understanding of cell type-specific gene expression in renal physiology and disease. However, enzyme-based tissue dissociation protocols, which are frequently utilized for single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq), require mostly fresh (non-archived) tissue, introduce transcriptional stress responses, and favor the selection of abundant cell types of the kidney cortex resulting in an underrepresentation of cells of the medulla.
Here, we present a protocol that avoids these problems. The protocol is based on nuclei isolation at 4 &#176;C from frozen kidney tissue. Nuclei are isolated from a central piece of the mouse kidney comprised of the cortex, outer medulla, and inner medulla. This reduces the overrepresentation of cortical cells typical for whole-kidney samples for the benefit of medullary cells such that data will represent the entire corticomedullary axis at sufficient abundance. The protocol is simple, rapid, and adaptable and provides a step towards the standardization of single-nuclei transcriptomics in kidney research.

Here, we present a protocol to isolate high-quality nuclei from frozen mouse kidneys that improve the representation of medullary kidney cell types and avoids the gene expression artifacts from enzymatic tissue dissociation.

Single-Nucleus RNA 시퀀싱을 위한 성인 마우스 신장에서 핵 분리

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

생물학

Optimizing Isolation and Purification of Murine Glomerular Mesangial Cells

Mesangial cells (MCs) are stromal cells located in the middle space of the glomerulus, with pivotal functions in glomerular homeostasis. Methods for isolating, purifying, and culturing glomerular MCs have been developed and optimized since the 1980s for use in biomedical research, particularly in the field of nephrology. Mice are the most frequently used experimental animal models in research on renal diseases. In this study, we developed an optimized protocol for murine MCs isolation and ex vivo cell culture. These cells can be passaged multiple times, frozen, revived, and cultured without compromising cell growth or protein expression. This optimized approach significantly reduces the study duration for researchers and enables long-term cell preservation. The necessary equipment for the procedures is easily accessible in a basic biomedical laboratory, and the procedural steps are straightforward. The acquisition of target cells requires only 2-3 weeks, a reduction of at least 1 week compared to existing methods.

This study developed an optimized protocol for the isolation of murine mesangial cells (MCs) and their ex vivo cell culture. These cells can be passaged multiple times, frozen, revived, and cultured without compromising cell growth or protein expression.

Mesangial cells (MCs) are stromal cells located in the middle space of the glomerulus, with pivotal functions in glomerular homeostasis. Methods for ...