This work is supported by a Research Grant from Dialysis Clinics Inc. and from the University of Missouri Research Board Grant.

gerçekleştirilen tüm protokol adımları gözden ve Missouri Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Üniversitesi (ACUC) tarafından onaylanmıştır. herhangi bir yaşta herhangi bir teorik kemirgen deneyleri için de kullanılabilir, ancak bu protokol için, 15 haftalık, erkek C57BL / 6 fareleri kullanılmıştır. Bu bir hayatta olmayan cerrahi olduğu için, ötenazi kan kaybından ve bilateral pnömotoraks ile sağlanır. Böbrekler 1. perfüzyon Not: kalp, karaciğer ve böbrek gibi organların Perfüzyon verilerin yorumlanması ile engel olabilir kanı temizler. Mümkünse Bu nedenle, biz her zaman organlar serpmek. <ol><li> o hareketsiz kadar (3 ml / dak) indüksiyon odası, bir izofluran fare yerleştirin. Sonra, odanın dışında fare kaldırmak diseksiyon masaya dorsal yattı ve fare burun üzerinde izofluran koni yerleştirin ve regülatör ile 1.5 ml / dk hızında izofluran itin. </li><li> ayak tutam tepk kontrolhayvan anestezi cerrahi uçağı elde etti ise cımbız ile e değerlendirmek. tuzlu su ile ventral karın temizleyin ve makas ile karın kesip açmak ve farenin sol tarafına (cerrahi alanı dışında kalan) karın organları itin. </li><li> ile inferior vena kava kan toplayın 25 gauge 1 cc şırınga iğne sabit ve 0.5M EDTA 10 ul içeren bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüp ekleyin. Not: Kan Toplama isteğe bağlıdır. Plazma biyokimyasal ölçümler için de kullanılabilir. Lökositler akış sitometri deneyleri için kullanılabilmektedir. </li><li> makas kullanarak, sağ atriyum küçük bir kesim sonraki adımda kan ve PBS karışımı izin yapmak. </li><li> 50 cc şırınga alın ve buz soğukluğunda PBS (20-30 cc) ile doldurun. Sonra, bir şırınga için 21-25 G iğne takılır (forseps ile yavaşça kalp tutarken) tepe noktası, sol ventrikül delinerek yavaş boyunca fosfat tamponlu tuz, pH 7.4 (PBS) ile sol ventrikül serpmek1-2 dk. Not: Kalp hemen perfüzyon ilk birkaç mililitre üzerine blanches. Bu perfüzyon vena kava yoluyla venöz dönüş yoluyla karaciğer kanı drene olduğunu gösterir gibi, haşlama için karaciğer gözlemleyin. Buna ek olarak, bu sağ ventrikül patlağı gösterir gibi akciğer infüzyon sırasında genişleyen değil emin olun. akciğerler genişletmek için olsaydı, biraz geri sol ventrikül içine iğne çekilme ve perfüzyon devam edin. elde edilir ötanazi kadar ilk kesi alınan zaman az 2 dk </li></ol> Böbrekler 2. Diseksiyon <ol><li> perfüzyon tamamlandıktan sonra, ekleri (kan damarları, yağ ve adrenal bezler) ve tüketim sağ böbrek incelemek için makas ve forseps kullanabilir. </li><li> Yavaşça kesme ve forseps ile diseksiyon ile böbrek kaplayan kapsülü kaldırın. böbrek tartılır. Not: böbrek Tartı isteğe bağlıdır. Bununla birlikte, bazı deneylerBöbrek boyutu / doku gramı başına hücre verimi normalize etmek için kullanılabilmektedir ağırlık değişikliği ile sonuçlanabilir. </li><li> böbrek Tartıldıktan sonra,% 0.5 FBS ihtiva eden RPMI-1640 içinde 1 ml koyun veya lekelenme tampon çözeltisi sitometrisi (50 ml konik vidalı kapaklı tüp) akar ve daha sonra kullanılmak kadar buz üzerinde tüp yerleştirin. Not: açıklaması kolaylığı, biz boyama tampon çözelti flow sitometri bağışıklık hücrelerinin izolasyonu kalan anlatacağız için. Her iki böbrek veya böbrek 1 + 1/3 Rd (isteğe bağlı) alt deneylere bağlı olarak kullanılabilmesine rağmen ek olarak, tek bir böbrekten bağışıklık hücrelerinin izolasyonu anlatacağız. Böbrek 1/3 üçüncü protein / RNA deneyler için dondurulmuş olabilir ve 1/3 rd immünohistokimya veya transmisyon elektron mikroskobu için tamponlar içinde yerleştirilebilir. </li></ol> Böbrekler 3. Homojenizasyon <ol><li> örnek tanımlama bilgileri içeren bir 5-80 ml kapasiteli homojenizasyon çanta Etiket,iç süzgeci (STR) kaldırmak ve atın. buz Sitometrisi lekeleme tampon maddesi çözeltisi, 5 ml torbayı doldurmak tampona böbrek aktarın. İkinci numune veya işleme ihtiyaç daha fazla örnek için bu işlemi tekrarlayın. </li><li> bir yarım Akış Sitometri lekeleme tampon maddesi çözeltisi içine daldırılmış böbrek, diğer yarısı ise sadece üzerine katlanır, böylece, devre homojenleştirme torba katlayın. </li><li> Doku homojenleştirici açın ve hızlı (ayar) rpm olarak ayarlayın. alt kenarına yakın raket karşı karşıya böbrek katlanmış homojenizasyon çantası yerleştirin ama çanta alt uç kürekler alt sınırının altında kayan olmadığından emin olun. <ol><li> 2 kürek olduğu gibi aynı zamanda ikinci örnek işleyin. 120 sn olarak süreyi seçin. kürekler böbrekler homojenize için ileri ve geri hareket gözlemleyin. Not: Bu arada, bu kesinti ilk iki işlem sırasında örnekleri 2 fazla böbrek (veya başka doku) hazırlamak için kullanılabilir. </li></ol&gt; </li><li> homojenizasyon birinci seti ile tamamladıktan sonra, buz torbaları aktarmak ve böylece bir sonraki numune seti ve doku homojenleştirici yükleyin. Görme böbrekler yeterince homojenize ve hiçbir büyük parçalar görünür olduğundan emin olun. Not: Genellikle, hızlı rpm&#39;de doku homojenleştiricisi içinde 2 dakika böbrek için yeterlidir. </li><li> buz üzerinde 50 ml konik tüp içine 100 mikron hücre süzgeç yerleştirin. Sonra, hücre süzgecinden tamamen üzerinde Homojenat pipetle. 4 ° C de 1 dakika 50 xg bir taban santrifüj ayarlamak ve santrifüj örnekleri yükleyin. Not: Santrifüj Tüm homojenat (ihtiva eden hücreler) bir hücre süzgecinden geçirildi olduğunu garanti eder. </li><li> santrifüj tüpleri çıkarın ve buz üzerinde geri koyun. Hücre süzgeçler atın ve Homojenat tutun. eşit miktarda ekleyin (~ 6 mi) üniform bir hücre süspansiyonu yapmak için hücre peleti / yüzer tabakanın ve pipet ve aşağı yukarı birkaç kez 1 x RBC parçalama tamponu. visuaLly hemen süspansiyon azalma kırmızı rengin bazı gözlemleyin. Maksimum RBC parçalama elde etmek için 5 dakika boyunca buz üzerinde tüpler bırakın. Not: Araştırmacı böbrek perfüzyon ve daha az hücre manipülasyonu istenen emindir ise RBC parçalama adım atlanabilir. Biz RBC lizis hücre süspansiyonu tabi değil tarafından böbrek hücre veriminde önemli bir artış gözlemledik. </li><li> 5 dakika bir hücre tanesinin oluşturulması için 500 x g&#39;de, 4 ° C olarak ayarlandı santrifüj tüpleri dönerler. Adımlar 3.6 ve 3.7 sırasında koloidal silika (Percoll) tabanlı yoğunluk gradyan santrifüj hazırlamak Not:. <ol><li> alt polipropilen tüpler yuvarlak 10 ml alın ve ilgili örnek numaraları ile onları etiketlemek ve bir tüp rafa koyun. Not: Aşağıdaki 4 böbrek örnekleri için yeterli yoğunluk gradyan reaktifler yapmak açıklamaktadır. </li><li> Sitometrisi Boyama Tampon çözeltisi 7 ml alın ve bir 15 ml konik tüp içine pipetle. 2 M sükroz, 1 ml ilave edilir0.25 M sukroz hazırlar. </li><li> Sonra, başka bir 15 ml konik tüp içine yoğunluk gradyan reaktif ve pipet bunu 7.2 ml alır. % 72 yoğunluk gradyan reaktif ve doğrudan 0.25 M sükroz hazırlamak Sitometrisi lekeleme tampon maddesi çözeltisi 1.55 mi, 2 M sukroz, 1.25 ml ilave edilir. </li><li> Pipet her bir örnek için bir yuvarlak dipli polipropilen tüpe% 72 yoğunluk gradyan ayıracı 1 ml. </li></ol></li></ol> 4. dereceli santrifüj <ol><li> Adım 3.7 sonra tüpleri almak ve yavaşça tek bir hareketle yavaşça süpernatant süzün ve ayrıca tüp baş aşağı tutulurken oluşturan sıvının bir sonraki damla süzün. Not: Bu adım verimleri varyasyon oluşturmak için yeterli yoğunluk gradiyenti değiştirebilirsiniz aşırı sıvı geride bırakarak beri önemlidir. Tüp dik geri ayarlandığında, ~ sıvı 200-300 ul hücre pelet ile kalır. </li><li> Pipet ve yavaşça ama kuvvetlice hücre pelet üzerine 0.25 M sükroz 1 ml yukarı pipet ve Brin aşağıg muntazam süspansiyonuna hücreleri. Sonra,% 36 yoğunluk gradyan maddesi oluşturmak için hücreleri karıştırmak için şiddetle pipetle bir kez daha 1 ml% 72 yoğunluk gradyan reaktifi (3.7.4) hücre süspansiyonu ekleyin ve. </li><li> polipropilen Pasteur (transfer) pipet içine% 72 yoğunluk gradyan reaktif 1 ml alın. ampul bile basınç, yavaşça hücre süspansiyonu altına Pasteur pipeti (% 36 yoğunluk gradyan reaktif) eklemek ve bir oluşturmak için% 72 yoğunluk gradyan reaktifi boşaltın (ucunda sıvı sütunu tutar ve kabarcık oluşumunu engeller) farklı ağır tabaka. </li><li> yavaşça numune tüpleri almak ve bu aşama için, oda sıcaklığında bir santrifüj içine yerleştirin. 500 x g&#39;de 20-30 dakika süreyle Spin. </li><li> Bu arada, gelen örnek tanıtıcı ile alt santrifüj tüpleri yuvarlak polipropilen başka iki takım hazırlamak. </li><li> Adım 4.4 tamamlandıktan sonra, en az çalkalanarak yavaşça polipropilen tüpler içeren örneği kaldırmak ve aşağı ayarlayınTüp raf. </li><li> İlk örnek tüp ve ilgili boş tüp Pick up. Bir polipropilen Pasteur pipeti ile nazikçe ama iyice ölçülen emme ile üst &quot;önemsiz katmanı&quot; veya &quot;yapışkan malzeme&quot; kaldırmak ve boş yuvarlak dipli santrifüj tüpüne koyun. <ol><li> (Kırmızımtırak bir renk [kırmızı kan hücreleri] off-beyaz görünebilir) ulaşıldığında &quot;buffy coat&quot; kadar degrade üst kısmını kaldırarak devam edin. ~ 3 mm yükseklik &quot;buffy coat&quot; ulaşılır ise emiş durdurun. Not: Bu malzeme tamamen emme devam etmeden önce degrade üst kısmından gitti olduğundan emin olun. </li></ol></li><li> taze Pasteur pipet ve taze bir yuvarlak dipli santrifüj tüpü alın ve yavaşça buffy coat çıkarın. Hücrelerin en toplanmış ve uygun numune tanımlayıcı ile 2. yeni yuvarlak dipli tüpe eklenir sağlamak için, buffy coat altında 5 mm - 3 emme devam ediyor. </li><li> 1-2 ml o Eklef Sitometrisi Boyama Tampon 2. tüp çözüm ve yukarı ve aşağı pipetleme ile iyice karıştırın. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 500 xg&#39;de hücreleri dönerler. Sitometrisi Boyama Tampon çözeltisi ile 2. yıkama adım isteğe bağlıdır. Sitometrisi Boyama Tampon çözeltisinin 500 ul ve yeniden süspanse hemasitometre kullanarak hücreleri saymak geçin. </li></ol> 5. İsteğe bağlı (Hücre Etiketleme) <ol><li> hücrelerin aynı sayıda, her numune Aliqout. 10 6 hücre başına 0.5 ug (anti-CD16 / CD32 FcR) bir seyreltme bloke antikor ilave edin ve 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. </li><li> önce gerçek deneyler, araştırmacı tarafından birbirleri ile iyi çalışması için belirlenir (uygun fluorophores konjuge) primer antikorlar istenen kokteyl ekleyin. 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Hücrelerin PBS ile yıkayın. Not: Bu yazının böbrek bağışıklık hücre etiketleme gösteri için, T-ly kullanılanmphocyte ve makrofaj / dendritik hücre paneli. BV421, Anti-Foxp3 (Clone: ​​FJK-16&#39;lar) APC, Anti-CD127 (Klon: A7R34): T-lenfosit paneli tamir edilebilir Canlılık Leke FVS510, anti-CD45 (30-F11 klonu) oluşuyordu PE / Cy7, anti CD44 (Klon: IM7) PerCP / Cy5.5, anti-CD4 (klon: RM4-5) APC-Cy7, anti-CD8 (Klon: 53-6,7) BV785. BV421, Anti-Ly6G (Klon: 1A8) FITC, anti-CD11 b (Klon: M1 / ​​70) PerCP-Cy5.5, Anti: makrofaj paneli tamir edilebilir Canlılık Leke FVS510, anti-CD45 (30-F11 klonu) oluşuyordu F4 / 80 (Klon: BM8) APC, anti-CD11c (Klon: N418) BV785. </li><li> Fixable Canlılık Leke ekleyin ve 5 dakika boyunca tezgah üstünde bırakın. Fixable Canlılık Stain fazlalığını ortadan kaldırmak için Sitometrisi Boyama Tampon çözeltisi ile hücreleri yıkayın. </li><li> Sabitleme / Permeabilization reaktif ekleyin ve 4 ºC de gece inkübe edin. permeabilizasyon çözeltisi içinde yıkanır. </li><li> hücre içi leke, 10 dakika süreyle, anti-CD16 / 32 FCR ile tekrar engeller. hücre içi lekeleri ekleyin ve 20-30 dakika inkübe edilir. pe yıkayın 2xrmeabilization çözeltisi. </li><li> FACS makine 3,9 ile Sitometrisi Boyama Tampon çözümü ve çalışma örneklerinde süspanse. </li></ol>

<ol>
	<li>Ascon, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+functional+characterization+of+kidney-infiltrating+lymphocytes+in+renal+ischemia+reperfusion+injury.">Phenotypic and functional characterization of kidney-infiltrating lymphocytes in renal ischemia reperfusion injury.</a> J. Immunol. 177 (5), 3380-3387 (2006).</li><li>Ascon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+ischemia-reperfusion+leads+to+long+term+infiltration+of+activated+and+effector-memory+T+lymphocytes.">Renal ischemia-reperfusion leads to long term infiltration of activated and effector-memory T lymphocytes.</a> Kidney Int. 75 (5), 526-535 (2009).</li><li>Belliere, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+macrophage+subtypes+influence+the+progression+of+rhabdomyolysis-induced+kidney+injury.">Specific macrophage subtypes influence the progression of rhabdomyolysis-induced kidney injury.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 26 (6), 1363-1377 (2015).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagenase+digestion+down-regulates+the+density+of+CD27+on+lymphocytes.">Collagenase digestion down-regulates the density of CD27 on lymphocytes.</a> J. Immunol. Methods. 413, 57-61 (2014).</li><li>Dong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resident+dendritic+cells+are+the+predominant+TNF-secreting+cell+in+early+renal+ischemia-reperfusion+injury.">Resident dendritic cells are the predominant TNF-secreting cell in early renal ischemia-reperfusion injury.</a> Kidney Int. 71 (7), 619-628 (2007).</li><li>Hickey, F. B., Martin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetic+kidney+disease+and+immune+modulation.">Diabetic kidney disease and immune modulation.</a> Curr. Opin. Pharmacol. , (2013).</li><li>Kawakami, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resident+renal+mononuclear+phagocytes+comprise+five+discrete+populations+with+distinct+phenotypes+and+functions.">Resident renal mononuclear phagocytes comprise five discrete populations with distinct phenotypes and functions.</a> J. Immunol. 191 (6), 3358-3372 (2013).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+glomeruli+from+mice:+A+practical+approach+for+beginners.">Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners.</a> Exp. Ther. Med. 5 (5), 1322-1326 (2013).</li><li>Picot, J., Guerin, C. L., Le Van, K. C., Boulanger, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+retrospective,+fundamentals+and+recent+instrumentation.">Flow cytometry: retrospective, fundamentals and recent instrumentation.</a> Cytotechnology. 64 (2), 109-130 (2012).</li><li>Ricardo, S. D., van, G. H., Eddy, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+diversity+in+renal+injury+and+repair.">Macrophage diversity in renal injury and repair.</a> J. Clin. Invest. 118 (11), 3522-3530 (2008).</li><li>Rodriguez-Iturbe, B., Pons, H., Herrera-Acosta, J., Johnson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+immunocompetent+cells+in+nonimmune+renal+diseases.">Role of immunocompetent cells in nonimmune renal diseases.</a> Kidney Int. 59 (5), 1626-1640 (2001).</li><li>Vielhauer, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+renal+recruitment+of+macrophages+and+T+cells+in+mice+lacking+the+duffy+antigen/receptor+for+chemokines.">Efficient renal recruitment of macrophages and T cells in mice lacking the duffy antigen/receptor for chemokines.</a> Am. J. Pathol. 175 (1), 119-131 (2009).</li><li>Weisheit, C. K., Engel, D. R., Kurts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+Cells+and+Macrophages:+Sentinels+in+the+Kidney.">Dendritic Cells and Macrophages: Sentinels in the Kidney.</a> Clin. J. Am. Soc. Nephrol. , (2015).</li><li>Williams, S. K., McKenney, S., Jarrell, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagenase+lot+selection+and+purification+for+adipose+tissue+digestion.">Collagenase lot selection and purification for adipose tissue digestion.</a> Cell Transplant. 4 (3), 281-289 (1995).</li><li>Yamamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deterioration+and+variability+of+highly+purified+collagenase+blends+used+in+clinical+islet+isolation.">Deterioration and variability of highly purified collagenase blends used in clinical islet isolation.</a> Transplantation. 84 (8), 997-1002 (2007).</li><li>Zhou, J., Nagarkatti, P., Zhong, Y., Nagarkatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+modulation+by+chondroitin+sulfate+and+its+degraded+disaccharide+product+in+the+development+of+an+experimental+model+of+multiple+sclerosis.">Immune modulation by chondroitin sulfate and its degraded disaccharide product in the development of an experimental model of multiple sclerosis.</a> J. Neuroimmunol. 223 (1-2), 55-64 (2010).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Biz burada güvenilir ve verimli bir şekilde böbrek bağışıklık hücreleri elde etmek için bir metodoloji sunduk. Yaygın olarak kullanılan kolajenaz sindirimi aşama (doku mekanik tahrip) başlıca modifikasyonu yaklaşık 30 dk tasarruf sağlar ve uygun bir bağışıklık hücreleri, çok sayıda yalıtım 4 Böbrek örnekleri için iki saatten az sürer. Ayrıca, bizim araştırma sorusu bağlı olarak, şimdi tek bir böbrek kullanmak bağışıklık hücre izolasyonu için (diğer böbrek Western lekeleri,...

Bağışıklık sistemi aktivasyonu çoklu böbrek hastalıkları ve patofizyolojik süreçlerde 6,10,11,13 oluşur. aktif bir araştırma için potansiyel alanlar, bağışıklık sistemi aktivasyonu için çeşitli tetikleyiciler kapsayan, çeşitli hücre türleri dahil, belirli bir hastalık ortamda sitokin / kemokin desen gibi, belirli bir ilaç tarafından bahsedilen işlemlerin tümünü modülasyonu iskemi-reperfüzyon olarak, Örnek vermek gerekirse, yaralanma (akut böbrek hasarı için bir model), (6 hafta sonra) 5 tamir veya fibrozis dönem boyunca sürekli bir kaç saat içinde hematopoietik hücreleri ya da CD45 + hücrelerinden oluşan bağışıklık hücreleri veya kemik iliği içinde bir artış vardır, 12. Bu bağışıklık hücreleri, tamir 5,12 işlemini düzenlemek için pro-enflamatuar ve anti-inflamatuar sitokinler ve kemokinler, hem salgılar. Şu anda, tek bir hücre süspansiyonu hücre popülasyonlarının etiket aynı anda birden fazla fluorophores kullanma yeteneği reklamla arttıdört beş lazerler ile makinelerin sitometri, modern akış havalandırma. Bu büyük ölçüde onların fonksiyonel durumu 3,7 dayalı hücre popülasyonlarının ayrımcılık yeteneği ekledi. F4 / 80, düşük CD11b yüksek Ly6b yüksek CD206, düşük, en az 3 fazla flüoroforlar canlı hücreler, CD45 + (lökositler) ve Ly6G- (nötrofiller) ve bulunmaktadır kapısı aynı numune hacmi içindeki gerekli olacaktır Örneğin, doğru bir makrofaj etiket Bu çok mümkün yeni akış sitometrelerinde 3 beraberdir. Ancak, sitokin salgılanması, hücre proliferasyonu, sitotoksisite, makrofaj aktivasyonu ve lenfositlerin ve monositlerin çeşitli alt kümeleri sayısı ölçümü için alt deneyler sadece kaliteli (canlı hücreleri, tekli), fakat hücrelerinin yeterli sayılarda gerekmektedir. Böbrek bağışıklık sistemi adaptif ve bileşenleri ve birden fazla hücre tipleri 1,7,13 hem oluşur. Örneğin farelerde, iki çocuk(1.4 x 10 6 hücre) ve bunların yaklaşık% 5-15 (1,400-4,200) izole edilmiş toplam böbrek bağışıklık hücrelerinin Neys birlikte 2-17% içerdiği rapor edilmiştir (28,000-266,000) CD45 + hücreleri, CD4 + hücreleri 1 olan , 5,12. Bu CD4 + hücrelerinin küçük bir yüzdesi (% 5-15, 70-630) FoxP3 + hücreleri (Şekil 1) 1 vardır. Nedeniyle (bu durumda CD45 + CD4 + FoxP3 + hücrelerinde) hücrelerin yüzdelerinde, bu adım adım azalmalar, ilgi konusu zaman hücre popülasyonuna 100 ° sadece hücreler tarafından temsil edilmektedir. CD45 + CD4 + FoxP3 + hücrelerinin az sayıda zorunludur toplam hücrelerin çok sayıda izole edilir ve hücreler, sitokin salgılama tahlillerinde alt-çalışmalar için iyi kalitede olmasını sağlar. Ayrıca, subpopülasyonunun ölçülebilir deneyleri gerçekleştirmek için yeterince yüksek sayıda temsil edilmemektedir çünkü 2-3 farelerin böbrek birleştirmek gerekebilir. Bu nedenle, böbrek mononükleer hücre popülasyonlarının güvenilir ve etkin izolasyon damızlık için arzu ediliry böbrek hastalıkları ile ilişkili immünolojik spektrum. Geleneksel olarak, böbrek mononükleer hücrelerin izolasyonu için, araştırmacılar, bu DNase 1 1,5,12 içeren kolajenaz 1A veya II gibi enzimatik sindirim çeşitli kullandık. İyi kollajenazlar uygun konsantrasyon ve inkübasyon 4,14,15 süresince titrasyonu zorunludur, lot numaraları ve imalat şirketi tarafından değişir enzimatik etkinliğe sahip olduğu bilinmektedir. Buna ek olarak, kollajenaz ile sindirim küçük parçalar halinde böbrek kıyma zaman ekler, reaksiyonun durdurulması için EDTA inkübasyon için ısıtılmış (37 ° C) banyo ve ek süre böbrek parçalarının inkübasyon gerektirmektedir. Buna ek olarak, daha az steril hücre kültürü ihtiyaç duyan bir alt işlemler için elde edilebilir. Daha da önemlisi, ilgili araştırmacı ve tüm değişkenlere bağlı olarak, bu laboratuarlar arasında veri ve yorumlanması değişkenlik yol açar. Son zamanlarda, ilemekanik doku bozucular / homojenizatör 16 geliştirilmesi, kolajenaz sindirimi aşama tamamen kaçınılması ve böbrekler 2 basit bir mekanik bozulma ile değiştirilir. Bu yazıda, gündelik bağışıklık hücre ekstraksiyon için böbrek bağışıklık hücrelerinin izolasyonu için basit ama etkili bir yöntem ortaya koymaktadır. Önemli olarak, bu teknik, örneğin karaciğer ve beyin 16 gibi diğer yumuşak ve lifsiz dokular adapte edilebilir.

<table><tbody><tr><td>Stomacher 80 Biomaster lab system</td><td>Seward</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stomacher 80 Classic bags</td><td>Seward</td><td>BA6040/STR</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend XFR Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Or equivalent equipment&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63514-11</td><td></td></tr><tr><td>Analytical flow cytometer</td><td>BD LSR-X20 Fortessa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Percoll&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P1644</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s phosphate buffered saline 1x (DPBS)</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylene tubes, no cap</td><td>Becton Dickinson</td><td>352002</td><td></td></tr><tr><td>Fixable Viability Stain</td><td>BD Biosciences&amp;nbsp;</td><td>FVS510,&amp;nbsp; 564406</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD16/32 (Clone: 93)</td><td>EBioscience</td><td>14-0161</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD45 (clone: 30-F11)&amp;nbsp; BV421&amp;nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>103133/4</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Foxp3 (Clone: FJK-16s) APC</td><td>EBioscience</td><td>17-5773</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD127 (Clone: A7R34) PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>135013/4</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD44 (Clone: IM7) PerCP/Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>103031/2</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD4 (Clone: RM4-5) APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>100413/4</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD8 (Clone: 53-6.7) BV785</td><td>Biolegend</td><td>100749/50</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ly6G (Clone: 1A8) FITC</td><td>Biolegend</td><td>127605/6</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD11b (Clone: M1/70) PerCP-Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>101227/8</td><td></td></tr><tr><td>Anti-F4/80 (Clone: BM8) APC</td><td>Biolegend</td><td>123115/6</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD11c (Clone: N418) BV785</td><td>Biolegend</td><td>117335/6</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD301 (Clone: LOM-14) PE-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>145705/6</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD26 (Clone: H194-112) PE</td><td>Biolegend</td><td>137803/4</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;mu;m filter&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Tubes 50 ml</td><td>Fisher</td><td></td><td>Or equivalent equipment&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fisherbrand Tubes 15 ml</td><td>Fisher</td><td></td><td>Or equivalent equipment&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher chemical</td><td>S5-3</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipette fine tip</td><td>Samco Scientific</td><td>232</td><td>Or equivalent equipment&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Flow Cytometery Staining Buffer Solution</td><td>EBioscience</td><td>00-4222-26</td><td>Or equivalent equipment&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1x RBC Lysis Buffer</td><td>EBioscience</td><td>00-4333-57</td><td>Or equivalent equipment&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

reliable and high efficiency extraction of kidney immune cells

Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes. The immune system consists of both adaptive and innate components and multiple cell types. Sometimes, the cell type of interest is present in very low numbers among the large numbers of total cells isolated from the kidney. Hence, reliable and efficient isolation of kidney mononuclear cell populations is important in order to study the immunological problems associated with kidney diseases. Traditionally, tissue isolation of kidney mononuclear cells have been performed via enzymatic digestions using different varieties and strengths of collagenases/DNAses yielding varying numbers of viable immune cells. Recently, with the development of the mechanical tissue disruptors for single cell isolation, the collagenase digestion step is avoided and replaced by a simple mechanical disruption of the kidneys after extraction from the mouse. Herein, we demonstrate a simple yet efficient method for the isolation of kidney mononuclear cells for every day immune cell extractions. We further demonstrate an example of subset analysis of immune cells in the kidney. Importantly, this technique can be adapted to other soft and non-fibrous tissues such as the liver and brain.

çalıştırılabilir panel sayısı güvenilir böbrekler üzerinden elde edilebilir bağışıklık hücrelerinin sayısına bağlıdır. Bu yazıda, 2 panel, T-lenfositlerinin için ve makrofajlar / dendritik hücreler için bir çalıştırma yeteneğini göstermek. T-lenfosit panelinde, ilk forward scatter (FSC) ve yan dağılım (SSC) şekline bakmak ve Şekil 1 (sol üst nokta arsa) &#39;de gösterildiği gibi ilgi nüfusu tasvir. Daha sonra, bir canlılık markö...

Watch this Scientific Journal Video about Reliable and High Efficiency Extraction of Kidney Immune Cells at JoVE.com

Reliable and High Efficiency Extraction of Kidney Immune Cells

Techniques that are reliable and efficient for the isolation of kidney immune cells are needed for downstream applications. This requires surface antibody labeling of a small number of kidney immune cells. Herein, we describe a concise method for isolation of kidney immune cells that seemingly achieves this goal.

Böbrek Bağışıklık Hücreleri Güvenilir ve Yüksek Verimlilik Ekstraksiyon

Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes.  The immune system consists of both adaptive and innate ...

reliable-and-high-efficiency-extraction-of-kidney-immune-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.3K Görüntüleme.  Department of Medicine, University of Missouri-Columbia and Harry S Truman Memorial Veteran's Hospital. Techniques that are reliable and efficient for the isolation of kidney immune cells are needed for downstream applications. This requires surface antibody labeling of a small number of kidney immune cells. Herein, we describe a concise method for isolation of kidney immune cells that seemingly achieves this goal.

Video: Reliable and High Efficiency Extraction of Kidney Immune Cells

Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in various immune responses. DN T cells are a unique immune cell type that has been implicated in regulating immune and autoimmune responses and tolerance to allotransplants1-6. DN T cells are, however, rare in peripheral blood and secondary lymphoid organs (spleen and lymph nodes), but are major residents of the normal kidney. Very little is known about their pathophysiologic function7 due to their paucity in the periphery. We recently described a comprehensive phenotypic and functional analysis of this population in the kidney8 in steady state and during ischemia reperfusion injury. Analysis of DN T cell function will be greatly enhanced by developing a protocol for their isolation from the kidney.
Here, we describe a novel protocol that allows isolation of highly pure ab CD4+ CD8+ T cells and DN T cells from the murine kidney. Briefly, we digest kidney tissue using collagenase and isolate kidney mononuclear cells (KMNC) by density gradient. This is followed by two steps to enrich hematopoietic T cells from 3% to 70% from KMNC. The first step consists of a positive selection of hematopoietic cells using a CD45+ isolation kit. In the second step, DN T cells are negatively isolated by removal of non-desired cells using CD4, CD8, and MHC class II monoclonal antibodies and CD1d &#945;-galcer tetramer. This strategy leads to a population of more than 90% pure DN T cells. Surface staining with the above mentioned antibodies followed by FACs analysis is used to confirm purity.

DNabT cells are rare among peripheral T cells; however, they are abundant in certain non-lymphoid tissues. Difficulty of isolating DN T cells from non-lymphoid tissue hinders their functional analysis despite increasing recognized pathophysiologic significance. We describe a novel protocol for isolation of highly purified DN T cells from murine kidney.

Böbrek gelen Çift Negatif αβ T Hücreleri İzolasyon

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model substrates for organ-scale tissue development. Sprague Dawley rat kidneys are cannulated by inserting a catheter into the renal artery and perfused with a series of low-concentration detergents (Triton X-100 and sodium dodecyl sulfate (SDS)) over 26 hr to derive intact, whole-kidney scaffolds with intact perfusable vasculature, glomeruli, and renal tubules. Following decellularization, the renal scaffold is placed inside a custom-designed perfusion bioreactor vessel, and the catheterized renal artery is connected to a perfusion circuit consisting of: a peristaltic pump; tubing; and optional probes for pH, dissolved oxygen, and pressure. After sterilizing the scaffold with peracetic acid and ethanol, and balancing the pH (7.4), the kidney scaffold is prepared for seeding via perfusion of culture medium within a large-capacity incubator maintained at 37 &#176;C and 5% CO2. Forty million renal cortical tubular epithelial (RCTE) cells are injected through the renal artery, and rapidly perfused through the scaffold under high flow (25 ml/min) and pressure (~230 mmHg) for 15 min before reducing the flow to a physiological rate (4 ml/min). RCTE cells primarily populate the tubular ECM niche within the renal cortex, proliferate, and form tubular epithelial structures over seven days of perfusion culture. A 44 &#181;M resazurin solution in culture medium is perfused through the kidney for 1 hr during medium exchanges to provide a fluorometric, redox-based metabolic assessment of cell viability and proliferation during tubulogenesis. The kidney perfusion bioreactor permits non-invasive sampling of medium for biochemical assessment, and multiple inlet ports allow alternative retrograde seeding through the renal vein or ureter. These protocols can be used to recellularize kidney scaffolds with a variety of cell types, including vascular endothelial, tubular epithelial, and stromal fibroblasts, for rapid evaluation within this system.

This protocol describes decellularization of Sprague Dawley rat kidneys by antegrade perfusion of detergents through the vasculature, producing acellular renal extracellular matrices that serve as templates for repopulation with human renal epithelial cells. Recellularization and use of the resazurin perfusion assay to monitor growth is performed within specially-designed perfusion bioreactors.

Epitel Hücre Repopulation ve Böbrek Doku Kalkınma Kemirgen Ekstrasellüler Matriks iskelelerinin hazırlanması

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model ...

Biyomühendislik

Rapid Depletion of Renal Macrophages using Human CD59/Intermedilysin Cell Ablation Tool

Renal macrophages (RMs) are essential for kidney health, orchestrating immune surveillance, tissue homeostasis, and responses to injury. Previously, we reported the use of a human CD59 (hCD59)/intermedilysin (ILY) cell ablation tool to study the distinct fate, dynamics, and niches of RMs of bone marrow or embryonic origin. RMs originate from yolk sac-derived macrophages, fetal liver monocytes, and bone marrow-derived monocytes and are maintained in adulthood through local proliferation and recruitment of circulating monocytes. Here, we report a detailed protocol for the selective ablation of RMs to study their regeneration, including 1) generation and characterization of the Cre-inducible expression of hCD59 in mouse RMs, 2) purification of ILY and characterization of ILY activity, 3) induction of hCD59 expression on RMs in compound mice, and 4) characterization of regeneration after ILY-mediated RM ablation. ILY specifically and rapidly depletes RMs in compound mice, with efficient macrophage ablation within 1 day of ILY administration. Renal macrophage regeneration began by day 3 post-ablation, with ~88% recovery by day 7. This model offers a powerful tool for studying macrophage biology and can be used for selectively ablating other cell populations in the kidney, liver, and fatty tissues to investigate their function and regeneration.

A protocol is reported here for the selective ablation of renal macrophages to study their regeneration using the human CD59/intermedilysin cell ablation tool. This method is also applicable for studying the function and regeneration of the other cell populations in the kidney, liver, and fatty tissue.

İnsan CD59 / Intermedilysin Hücre Ablasyon Aracı Kullanılarak Renal Makrofajların Hızlı Tükenmesi

Renal macrophages (RMs) are essential for kidney health, orchestrating immune surveillance, tissue homeostasis, and responses to injury. Previously, we ...

Gelişim Biyolojisi

A Novel Clinical Grade Isolation Method for Human Kidney Perivascular Stromal Cells

Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) are tissue homeostatic and immune modulatory cells that have shown beneficial effects in kidney diseases and transplantation. Perivascular Stromal Cells (PSCs) share characteristics with bone marrow MSCs (bmMSCs). However, they also possess, most likely due to local imprinting, tissue-specific properties and play a role in local tissue homeostasis. This tissue specificity may result in tissue specific repair, also within the human kidney. We previously showed that human kidney PSCs (kPSCs) have enhanced kidney epithelial wound healing whereas bmMSCs did not have this potential. Moreover, kPSCs can ameliorate kidney injury in vivo. Therefore, kPSCs constitute an interesting source for cell therapy, particularly for kidney diseases and renal transplantation. Here we show the detailed isolation and culture method for kPSCs from transplant-grade human kidneys based on whole-organ perfusion of digestive enzymes via the renal artery and enrichment for the perivascular marker NG2. In this way, large cell quantities can be obtained that are suitable for cellular therapy.

Here we present a novel clinical grade isolation and culture method for kidney Perivascular Stromal Cells (kPSCs) based on whole organ perfusion with digestive enzymes and NG2-cell enrichment. With this method, it is possible to acquire sufficient cell numbers for cellular therapy.

İnsan böbrek Perivasküler Stromal hücreler için bir roman klinik sınıf izolasyon yöntemi

Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) are tissue homeostatic and immune modulatory cells that have shown beneficial effects in kidney diseases and ...

Tıp

Detection of MicroRNA Expression in the Kidneys of Immunoglobulin A Nephropathic Mice

Immunoglobulin A (IgA) nephropathy is a type of primary glomerulonephritis characterized by the abnormal deposition of IgA, leading to the end-stage renal failure. In recent years, the involvement of microRNAs (miRNAs) has been reported in the pathogenesis of IgA nephropathy. However, there is no established method for profiling miRNAs in IgA nephropathy using small animal models. Therefore, we developed a reliable method for analyzing miRNA in the kidney of an IgA mouse model (HIGA mouse). The goal of this protocol is to detect the altered expression levels of miRNAs in the kidneys of HIGA mice when compared with the levels in kidneys of control mice. In brief, this method consists of four steps: 1) obtaining kidney samples from HIGA mice; 2) purifying total RNA from kidney samples; 3) synthesizing complementary DNA from total RNA; and 4) quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) of miRNAs. Using this method, we successfully detected the expression levels of several miRNAs (miR-155-5p, miR-146a-5p, and miR-21-5p) in the kidneys of HIGA mice. This new method can be applied to other studies profiling miRNAs in IgA nephropathy.

microRNAs are involved in the pathogenesis of IgA nephropathy. We have developed a reliable method for detecting microRNA expression levels in the kidneys of an IgA nephropathy mouse model (HIGA mice). This new method will facilitate to check for miRNAs involvement in IgA nephropathy.

İmmünoglobulin A Nefropatik Farelerin Böbreklerinde MikroRNA Ekspresyonunun Tespiti

Immunoglobulin A (IgA) nephropathy is a type of primary glomerulonephritis characterized by the abnormal deposition of IgA, leading to the end-stage renal ...

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the key steps to investigate TRMs. There are slight variations in lymphocyte isolation protocols for different organs. Kidney is an essential non-lymphoid organ with numerous immune cell infiltration especially after pathogen exposure or autoimmune activation. In recent years, multiple labs including our own have started characterizing kidney resident CD8+ T cells in various physiological and pathological settings in both mouse and human. Due to the abundance of T lymphocytes, kidney represents an attractive model organ to study TRMs in non-mucosal or non-barrier tissues. Here, we will describe a protocol commonly used in TRM-focused labs to isolate CD8+ T cells from mouse kidneys following systemic viral infection. Briefly, using an acute lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) infection model in C57BL/6 mice, we demonstrate intravascular CD8+ T cell labeling, enzymatic digestion, and density gradient centrifugation to isolate and enrich lymphocytes from mouse kidneys to make samples ready for the subsequent flow cytometry analysis.

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Following viral infection, kidney harbors a relatively large number of CD8+ T cells and offers an opportunity to study non-mucosal TRM cells. Here, we describe a protocol to isolate mouse kidney lymphocytes for flow cytometry analysis.

Akış Sitometri Analizi için Fare Böbrek-Resident CD8+ T hücrelerinin izolasyonu

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...

An Efficient Sieving Method to Isolate Intact Glomeruli from Adult Rat Kidney

Preservation of glomerular structure and function is pivotal in the prevention of glomerulonephritis, a category of kidney disease characterized by proteinuria which can eventually lead to chronic and end-stage renal disease. The glomerulus is a complex apparatus responsible for the filtration of plasma from the body. In disease, structural integrity is lost and allows for the abnormal leakage of plasma contents into the urine. A method to isolate and examine glomeruli in culture is critical for the study of these diseases. In this protocol, an efficient method of retrieving intact glomeruli from adult rat kidneys while conserving structural and morphological characteristics is described. This process is capable of generating high yields of glomeruli per kidney with minimal contamination from other nephron segments. With these glomeruli, injury conditions can be mimicked by incubating them with a variety of chemical toxins, including protamine sulfate, which causes foot process effacement and proteinuria in animal models. Degree of injury can be assessed using transmission electron microscopy, immunofluorescence staining, and western blotting. Nephrin and Wilms Tumor 1 (WT1) levels can also be assessed from these cultures. Due to the ease and flexibility of this protocol, the isolated glomeruli can be utilized as described or in a way that best suits the needs of the researcher to help better study glomerular health and structure in diseased states.

The main focus of this protocol is to efficiently isolate viable primary glomeruli cultures with minimal contaminants for use in a variety of downstream applications. The isolated glomeruli retain structural relationships between component cell types and can be cultured ex vivo for a short time.

Yetişkin sıçan böbrek üzerinden olduğu gibi Glomeruli yalıtmak için verimli bir eleme yöntemi

Preservation of glomerular structure and function is pivotal in the prevention of glomerulonephritis, a category of kidney disease characterized by ...

Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) imaging. They have received great attention in all research areas for the potential to analyze microscopic multicellular structures that extend over macroscopic distances. Given that kidney tubules, vasculature, nerves, and glomeruli extend in many directions, which have been only partially captured by traditional two-dimensional techniques so far, tissue clearing also opened up many new areas of kidney research. The list of optical clearing methods is rapidly growing, but it remains difficult for beginners in this field to choose the best method for a given research question. Provided here is a simple method that combines antibody labeling of thick mouse kidney slices; optical clearing with cheap, non-toxic and ready-to-use chemical ethyl cinnamate; and confocal imaging. This protocol describes how to perfuse kidneys and use an antigen-retrieval step to increase antibody- binding without requiring specialized equipment. Its application is presented in imaging different multicellular structures within the kidney, and how to troubleshoot poor antibody penetration into tissue is addressed. We also discuss the potential difficulties of imaging endogenous fluorophores and acquiring very large samples and how to overcome them. This simple protocol provides an easy-to-setup and comprehensive tool to study tissue in three dimensions.

The combination of antibody labeling, optical clearing, and advanced light microscopy allows three-dimensional analysis of complete structures or organs. Described here is a simple method to combine immunolabeling of thick kidney slices, optical clearing with ethyl cinnamate, and confocal imaging that enables visualization and quantification of three-dimensional kidney structures.

Optik temizleme ve Immünolabeled böbrek dokusu görüntüleme

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are executed by multiple cell types arranged in a complex architecture across the corticomedullary axis of the organ. Recent advances in single-cell transcriptomics have accelerated the understanding of cell type-specific gene expression in renal physiology and disease. However, enzyme-based tissue dissociation protocols, which are frequently utilized for single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq), require mostly fresh (non-archived) tissue, introduce transcriptional stress responses, and favor the selection of abundant cell types of the kidney cortex resulting in an underrepresentation of cells of the medulla.
Here, we present a protocol that avoids these problems. The protocol is based on nuclei isolation at 4 &#176;C from frozen kidney tissue. Nuclei are isolated from a central piece of the mouse kidney comprised of the cortex, outer medulla, and inner medulla. This reduces the overrepresentation of cortical cells typical for whole-kidney samples for the benefit of medullary cells such that data will represent the entire corticomedullary axis at sufficient abundance. The protocol is simple, rapid, and adaptable and provides a step towards the standardization of single-nuclei transcriptomics in kidney research.

Here, we present a protocol to isolate high-quality nuclei from frozen mouse kidneys that improve the representation of medullary kidney cell types and avoids the gene expression artifacts from enzymatic tissue dissociation.

Tek Çekirdekli RNA Dizilimi için Yetişkin Fare Böbreğinden Çekirdek İzolasyonu

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

Biyoloji

Optimizing Isolation and Purification of Murine Glomerular Mesangial Cells

Mesangial cells (MCs) are stromal cells located in the middle space of the glomerulus, with pivotal functions in glomerular homeostasis. Methods for isolating, purifying, and culturing glomerular MCs have been developed and optimized since the 1980s for use in biomedical research, particularly in the field of nephrology. Mice are the most frequently used experimental animal models in research on renal diseases. In this study, we developed an optimized protocol for murine MCs isolation and ex vivo cell culture. These cells can be passaged multiple times, frozen, revived, and cultured without compromising cell growth or protein expression. This optimized approach significantly reduces the study duration for researchers and enables long-term cell preservation. The necessary equipment for the procedures is easily accessible in a basic biomedical laboratory, and the procedural steps are straightforward. The acquisition of target cells requires only 2-3 weeks, a reduction of at least 1 week compared to existing methods.

This study developed an optimized protocol for the isolation of murine mesangial cells (MCs) and their ex vivo cell culture. These cells can be passaged multiple times, frozen, revived, and cultured without compromising cell growth or protein expression.

Murin Glomerüler Mezanjiyal Hücrelerin İzolasyonunu ve Saflaştırılmasını Optimize Etmek

Mesangial cells (MCs) are stromal cells located in the middle space of the glomerulus, with pivotal functions in glomerular homeostasis. Methods for ...