Name: antibody labeling with fluorescent dyes using magnetic protein a and protein g beads
Uploaded: 2016-09-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Antibody Labeling with Fluorescent Dyes Using Magnetic Protein A and Protein G Beads at JoVE.com

1. לכידת נוגדן על בקיבולת גבוהה חלבון מגנטי או חלבון מגנטי חרוזים G <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן אחיד מחדש להשעות חרוזים מגנטיים ידי רעד עדין. שמור את מדי השעיה כאשר aliquoting חרוזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של slurry חרוז צינור 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge. מקום לעמוד המגנטי במשך 10 שניות. מוציאים בזהירות את למאגר אחסון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 250 μl של חיץ נוגדן מחייב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים ומניחים לעמוד המגנטי במשך 10 שניות. מוציאים בזהירות את חיץ מחייב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1.0 מ&quot;ל של מדגם המכיל 50-100 מיקרוגרם של נוגדנים חרוזים. דוגמאות ניתן מטוהרים נוגדנים או נוגדנים בתקשורת תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים מדגם למשך 60 דקות ב RT בעזרת מערבל מערבולת או מערבל הקצה על הקצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח צינורית לעמוד המגנטי במשך 10 שניות ולהסיר supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 250 μl של חיץ מחייב / כביסה נוגדן ומערבבים. המקום לעמוד המגנטי במשך 10 שניות ולהסיר חיץ מחייב / כביסה. חזור על פעולה זו sTEP עבור סכום כולל של שני שוטף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך לסעיף 2 לנוגדני תווית באמצעות כימיה אמינה או סעיף 3 לנוגדני תווית באמצעות כימית תיאול. </li></ol> 2. תיוג נוגדן שימוש אמין לכימיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המצומד נוגדן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μl של חיץ נטיה אמין אל חרוזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את צבעי ניאון-reactive אמין (AlexaFluor 532-SE) ב 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​על ידי הוספת 100 μl של sulfoxide דימתיל (DMSO) ל -1.0 מ&quot;ג של צבע. מערבבים על ידי vortexing. בצע פתרון זה רק לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 2.5 μl של צבע אמין-פעיל 100 מיקרוגרם של הנוגדן. הערה: בדרך כלל עודפת 5-20 טוחן של צבע תגובתי מומלצת. עם זאת, כמות של צבע תגובתי להוסיף התגובה צריכה להיות מותאמת באופן אמפירי בהתאם לצבוע רצוי יחס נוגדן ומאפייני נוגדן מהותיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים מדגם למשך 60 דקות ב RT בעזרת מערבל מערבולת או מערבל הקצה על הקצה. ודא כי החרוזים להישאר suspension. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח צינורית לעמוד המגנטי במשך 10 שניות ולהסיר supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 250 μl של חיץ מחייב / כביסה נוגדן ומערבבים. מקום לעמוד המגנטי במשך 10 שניות. סר וזורק חיץ מחייב / כביסה. חזור על שלב זה עבור סכום כולל של שני שוטף. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחזור נוגדן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של חיץ elution על חרוזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים במשך 5 דקות ב RT בעזרת מערבל מערבולת או מערבל הקצה על הקצה. ודא כי חרוזים לרחף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח צינורית לעמוד המגנטי במשך 10 שניות. הסר מדגם eluted ולהעביר צינור מיקרו צנטריפוגות חדש המכיל 5 μl של חיץ הניטרול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על התהליך עוד פעם אחת לרכז את דגימות eluted. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את ריכוז הנוגדנים לצבוע-אל-נוגדן יחס כמפורט בסעיף 4. </li></ol></li></ol> 3. תיוג נוגדן שימוש תיאול לכימיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפחתת נוגדן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 250 μlשל חיץ ותמהיל נטיה תיאול. מניחים את הצינורית לעמוד המגנטי במשך 10 שניות. סר וזורק למאגר. חזור על פעולה זו פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μl של חיץ נטיה תיאול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף Dithiothreitol (DTT) לריכוז סופי של 2.5 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים מדגם למשך 60 דקות ב RT בעזרת מערבל מערבולת או מערבל הקצה על הקצה. ודא כי חרוזים לרחף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינורית לעמוד המגנטי במשך 10 שניות וזורקים חיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 250 μl של חיץ נטיה תיאול ומערבבים. מניחים את הצינורית לעמוד המגנטי במשך 10 שניות. סר וזורק למאגר. חזור על שלב זה עבור סכום כולל של שני שוטף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μl של חיץ נטיה תיאול. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המצומד נוגדן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את צבען תיאול-reactive ב 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​על ידי הוספת 100 μl של DMSO ל -1.0 מ&quot;ג של צבע. מערבבים על ידי vortexing. בצע פתרון זה רק לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 2.5 μl של צבע תיאול-פעיל 100 מיקרוגרם של אנטיגוּף. הערה: בדרך כלל עודפת 5-20 טוחן של צבע תגובתי מומלצת. עם זאת, כמות של צבע תגובתי להוסיף התגובה צריכה להיות מותאמת באופן אמפירי בהתאם לצבוע רצוי יחס נוגדן ומאפייני נוגדן מהותיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים מדגם למשך 60 דקות ב RT בעזרת מערבל מערבולת או מערבל הקצה על הקצה. ודא כי חרוזים לרחף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינורית לעמוד המגנטי במשך 10 שניות ולהסיר supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 250 μl של חיץ נטיה תיאול ומערבבים. מקום לעמוד מגנטי במשך 10 שניות ולהסיר למאגר. חזור על שלב זה עבור סכום כולל של שני שוטף. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute נוגדן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של חיץ elution על חרוזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים במשך 5 דקות ב RT בעזרת מערבל מערבולת או מערבל הקצה על הקצה. ודא כי חרוזים לרחף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח צינורית לעמוד המגנטי במשך 10 שניות. הסר מדגם eluted ולהעביר צינור מיקרו צנטריפוגות חדש המכיל 5 μl של neutחיץ ralization. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על התהליך עוד פעם אחת לרכז את דגימות eluted. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את ריכוז הנוגדנים לצבוע-אל-נוגדן יחס כמפורט בסעיף 4. </li></ol></li></ol> 4. חישוב יחס צבען אל-נוגדן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את הספיגה של המצומד הנוגדן-צבען ב 280 ננומטר (A280) ובבית λmax עבור הצבע (אמקס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשבתי את ריכוז הנוגדן: ריכוז נוגדן (מ&quot;ג / מ&quot;ל) = A280 - (מקסימום × CF) / 1.4 איפה CF = תיקון גורם של הצבע (המסופק על ידי היצרן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את יחס צבען אל-נוגדן: צבען אל-נוגדן יחס (DAR) = (A max × 150,000) / ריכוז Ab (מ&quot;ג / מ&quot;ל) × ε לצבוע שם, לצבוע ε = מקדם הכחדה של צבע במקסימום ספיגת שלה ועל משקל מולקולרי של נוגדן = 150,000 דא. </li></ol>

<ol>
	<li>Colwill, K., Graslund, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+roadmap+to+generate+renewable+protein+binders+to+the+human+proteome.">A roadmap to generate renewable protein binders to the human proteome.</a> Nat Methods. 8 (7), 551-558 (2011).</li><li>Silverstein, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeled+antigens+and+antibodies:+the+evolution+of+magic+markers+and+magic+bullets.">Labeled antigens and antibodies: the evolution of magic markers and magic bullets.</a> Nat Immunol. 5 (12), 1211-1217 (2004).</li><li>Day, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+modified+antibodies+as+diagnostic+imaging+agents.">Chemically modified antibodies as diagnostic imaging agents.</a> Curr Opin Chem Biol. 14 (6), 803-809 (2010).</li><li>Cunningham, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+flow+cytometry+and+fluorescent+probes+for+flow+cytometry.">Overview of flow cytometry and fluorescent probes for flow cytometry.</a> Methods Mol Biol. 588, 319-326 (2010).</li><li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+modern+quantitative+fluorescent+western+blotting+with+troubleshooting+strategies.">A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies.</a> J Vis Exp. (93), e52099 (2014).</li><li>Dundas, C. M., Demonte, D., Park, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptavidin-biotin+technology:+improvements+and+innovations+in+chemical+and+biological+applications.">Streptavidin-biotin technology: improvements and innovations in chemical and biological applications.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 97 (21), 9343-9353 (2013).</li><li>Kraeber-Bodere, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radioimmunoconjugates+for+the+treatment+of+cancer.">Radioimmunoconjugates for the treatment of cancer.</a> Semin Oncol. 41 (5), 613-622 (2014).</li><li>Leal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-drug+conjugates:+an+emerging+modality+for+the+treatment+of+cancer.">Antibody-drug conjugates: an emerging modality for the treatment of cancer.</a> Ann N Y Acad Sci. 1321, 41-54 (2014).</li><li>Drachman, J. G., Senter, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-drug+conjugates:+the+chemistry+behind+empowering+antibodies+to+fight+cancer.">Antibody-drug conjugates: the chemistry behind empowering antibodies to fight cancer.</a> Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2013, 306-310 (2013).</li><li>Hermanson, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioconjugate Techniques. , 380-382 (1996).</li><li>Shrestha, D., Bagosi, A., Szollosi, J., Jenei, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+the+three+different+fluorophore+antibody+conjugation+strategies.">Comparative study of the three different fluorophore antibody conjugation strategies.</a> Anal Bioanal Chem. 404 (5), 1449-1463 (2012).</li><li>Vira, S., Mekhedov, E., Humphrey, G., Blank, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent-labeled+antibodies:+Balancing+functionality+and+degree+of+labeling.">Fluorescent-labeled antibodies: Balancing functionality and degree of labeling.</a> Anal Biochem. 402 (2), 146-150 (2010).</li><li>Isa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+system+to+identify+small+molecules+that+induce+internalization+and+degradation+of+HER2.">High-throughput screening system to identify small molecules that induce internalization and degradation of HER2.</a> ACS Chem Biol. 9 (10), 2237-2241 (2014).</li><li>Liao-Chan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+antibody+internalization+with+novel+monoclonal+antibodies+against+Alexa+fluorophores.">Quantitative assessment of antibody internalization with novel monoclonal antibodies against Alexa fluorophores.</a> PLoS One. 10 (4), e0124708 (2015).</li><li>Riedl, T., van Boxtel, E., Bosch, M., Parren, P. W., Gerritsen, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Screening+for+Internalizing+Antibodies+by+Homogeneous+Fluorescence+Imaging+of+a+pH-Activated+Probe.">High-Throughput Screening for Internalizing Antibodies by Homogeneous Fluorescence Imaging of a pH-Activated Probe.</a> J Biomol Screen. 21 (1), 12-23 (2016).</li><li>Nath, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogeneous+plate+based+antibody+internalization+assay+using+pH+sensor+fluorescent+dye.">Homogeneous plate based antibody internalization assay using pH sensor fluorescent dye.</a> J Immunol Methods. 431, 11-21 (2016).</li><li>Lundberg, E., Sundberg, M., Graslund, T., Uhlen, M., Svahn, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+reproducible+fluorescent+labeling+of+small+amounts+of+antibodies+on+solid+phase.">A novel method for reproducible fluorescent labeling of small amounts of antibodies on solid phase.</a> J Immunol Methods. 322 (1-2), 40-49 (2007).</li><li>Strachan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-phase+biotinylation+of+antibodies.">Solid-phase biotinylation of antibodies.</a> J Mol Recognit. 17 (3), 268-276 (2004).</li><li>Dezfouli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+bead+assisted+labeling+of+antibodies+at+nanogram+scale.">Magnetic bead assisted labeling of antibodies at nanogram scale.</a> Proteomics. 14 (1), 14-18 (2014).</li><li>Nath, N., Godat, B., Benink, H., Urh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-bead+antibody-small+molecule+conjugation+using+high-capacity+magnetic+beads.">On-bead antibody-small molecule conjugation using high-capacity magnetic beads.</a> J Immunol Methods. 426, 95-103 (2015).</li><li>Lund, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+variation+in+binding+of+Protein+A+and+Protein+G+to+immunoglobulin+type+G+by+isothermal+titration+calorimetry.">Exploring variation in binding of Protein A and Protein G to immunoglobulin type G by isothermal titration calorimetry.</a> J Mol Recognit. 24 (6), 945-952 (2011).</li><li>Safarik, I., Safarikova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+techniques+for+the+isolation+and+purification+of+proteins+and+peptides.">Magnetic techniques for the isolation and purification of proteins and peptides.</a> Biomagn Res Technol. 2 (1), 7 (2004).</li><li>Flygare, J. A., Pillow, T. H., Aristoff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-drug+conjugates+for+the+treatment+of+cancer.">Antibody-drug conjugates for the treatment of cancer.</a> Chem Biol Drug Des. 81 (1), 113-121 (2013).</li><li>Shen, B. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugation+site+modulates+the+in+vivo+stability+and+therapeutic+activity+of+antibody-drug+conjugates.">Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates.</a> Nat Biotechnol. 30 (2), 184-189 (2012).</li><li>Acchione, M., Kwon, H., Jochheim, C. M., Atkins, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+linker+and+conjugation+chemistry+on+antigen+binding,+Fc+receptor+binding+and+thermal+stability+of+model+antibody-drug+conjugates.">Impact of linker and conjugation chemistry on antigen binding, Fc receptor binding and thermal stability of model antibody-drug conjugates.</a> MAbs. 4 (3), 362-372 (2012).</li></ol>

Authors are employees of Promega Corporation.

מטרת המחקר הנוכחי הייתה לפתח שיטה לתייג נוגדנים, נוכח בתקשורת התא בריכוזים נמוכים, עם מגוון רחב של מולקולות קטנות. שיטה כזו תאפשר מספר רב של נוגדנים, בשלבים הראשונים של גילוי נוגדנים, כדי להיות מתויגת עם מולקולות קטנות, ובדרך הוקרנה באמצעות assay רלוונטית מבחינה ביולוג?...

נוגדנים שכותרתו עם מולקולות קטנות הם אולי ריאגנטים הנפוצים ביותר 1,2 ביולוגיה. נוגדנים שכותרתו עם צבעי ניאון ו ביוטין נמצאים בשימוש נרחב בתחום ההדמיה, immunoassays, cytometry זרימה, כתמים מערביים, ו immunoprecipitation בין יישומים אחרים 3-6. נוגדני radiolabeled 3,7 למצוא שימוש נרחב בתחום הדמית טיפול, נוגדנים שכותרתו עם תרופות ציטוטוקסיות (ADC) מציעים אפשרויות חדשות לטיפול הסרטן, ושני ממירים ADC שכבר אושרו לשימוש טיפולי 8. למרות השימוש הנרחב שלהם, שיטות נוגדני תיוג נותרו ללא שינוי מפתיע ובדרך כלל כרוכות תגובות מרובות desalting שלבי 9-12. שיטות פתרון היטב לשימוש במקרים בם רק כמה נוגדנים צריכים להיות מתויגים והם זמינים בצורה נקיה במיוחד בריכוז גבוה בהיקפי מספיק. עם זאת, עבור יישומים חדשים יותר כמו ממירי ADC, קייםצריך לתייג נוגדנים בשלב hybridoma מוקדם כדי שיוכלו להיות מוקרן על תכונות רלוונטיות מבחינה ביולוגית, למשל, 13-16 הפנמת נוגדן קולטן בתיווך. בשלב hybridoma, כרכי מדגם מוגבלים, הנוגדנים באים לידי ביטוי בריכוזים נמוכים ומספר דגימות גדולות, ומכאן שיטות תיוג מבוסס פתרון אינן מתאימות. כדי לפשט ולשפר את התפוקה של שיטות תיוג נוגדן המסורתיות, כמה גישות חלופיות הוצעו 17,18. גישה אחת היא להשתמש חלבון שאינו מגנטי חרוזים זיקה ארוזים עמודים קטנים ללכוד נוגדנים ואחריו התגובה תיוג ו elution של חלבון הנקרא וטיהר. שיטה זו יכולה לשמש כדי לתייג נוגדנים ישירות תקשורת תא, לעומת זאת, השימוש בעמודים יכול להיות מייגע. שיטה מגנטית חרוז מבוססת לאחרונה דווחה 19 זה מבטל את השימוש בעמודים משפר את התפוקה אך בשלכדי הנוגדן המוגבל יכולת קשירה של החרוזים, רק ננוגרם לכמויות מיקרוגרם נמוכים של הנוגדנים יכול להיות מתויג. פתחנו לאחרונה והשתמשנו קיבולת גבוהה חלבון מגנטי חלבון G חרוזים (&gt; 20 מ&quot;ג של IgG אדם / מיליליטר של חרוזים מיושבים) לתייג נוגדנים נוכחיים בתקשורת תא עם מולקולות קטנות 20. הקיבולת הגבוהה של החרוזים מאפשרת עשרות עד מאה מיקרוגרם של נוגדנים להיות מתויגות בנוחות התגובה המגנטית המהירה של חרוזי מפשט טיפול ועיבוד של מספר רב של דגימות במקבילות. באמצעות צבעי ניאון כמו התחליפים עבור מולקולות קטנות, אנו מראים כי השיטה תואמת כימיה תיוג אמין ו תיאול ומציע החלמה גבוה של נוגדנים שכותרתו מאוד טהור. פרוטוקול זה ואת הסרטון מלווה לתאר תיוג על-חרוז של נוגדני העכבר נוכחיים בתקשורת התא באמצעות חלבון מגנט חלבון G חרוזים. הפרוטוקול הואלארבעה חלקים מחולקים: סעיף 1 מתאר את לכידתו של נוגדנים על החרוז מ דגימות ביולוגיות. בעקבות לכיד, התיוג של נוגדנים עם צבע פלואורסצנטי באמצעות כימיה אמינה או באמצעות כימית תיאול מתואר בסעיפים 2 וסעיף 3, בהתאמה. לבסוף, סעיף 4 מתאר את השיטה לצורך החישוב של ריכוז נוגדנים ואת צבע יחס נוגדן.

<table><tbody><tr><td>Magne Protein A Beads</td><td>Promega Corporation</td><td>&amp;nbsp;G8781</td><td></td></tr><tr><td>Magne Protein G Beads</td><td>Promega Corporation&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;G7471</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 532-SE (Succinimidyl Ester)</td><td>Life Technologies</td><td>A20001</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 532-ME (Malemide)</td><td>Life Technologies</td><td>A10255</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647-ME (Maleimide)</td><td>Life Technologies</td><td>A20347</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein-ME (Maleimide)</td><td>Life Technologies</td><td>F-150</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Stand</td><td>Promega</td><td>Z5332</td><td></td></tr></tbody></table>

antibody labeling with fluorescent dyes using magnetic protein a and protein g beads

נוגדנים שכותרתו עם מולקולות קטנות כמו צבעי ניאון, תרופות ציטוטוקסיות קליעים נותבים רדיואקטיביים הם כלים חיוניים במחקר ביו, immunodiagnostics ולאחרונה כסוכנים טיפוליים. שיטות מסורתיות נוגדני תיוג עם מולקולות קטנות דורשות מטוהרי נוגדנים בריכוז גבוה יחסית, כרוכות צעדי דיאליזה מרובות מוגבלות תפוקה. עם זאת, מספר יישומים, כוללים בתחום הנוגדן ותרופות conjugates (ADC), ייהנו שיטות חדשות שתאפשרנה תיוג של נוגדנים ישירות תקשורת תא. שיטות אלה עשויות לאפשר נוגדנים שיוקרו מבחנים רלוונטיים מבחינה ביולוגית, למשל, assay הפנמת נוגדן קולטן בתיווך במקרה של ממירי ADC. כאן, אנו מתארים שיטה (על-חרוז) שיטה המאפשרת תיוג של כמויות קטנות של נוגדנים ישירות תקשורת תא. גישה זו משתמשת חלבון מגנטי קיבולת גבוהה חלבון זיקת G חרוז ללכוד נוגדניםמתקשורת התא ואחריו תיוג עם מולקולות קטנות או באמצעות אמין או כימית תיאול ו elution הבאה של הנוגדנים שכותרתו. אם ניקח צבעי ניאון כמו תחליפים עבור מולקולות קטנות, אנחנו מדגימים את התוויות על-חרוז של שלושה נוגדנים שונים עכבר ישירות מהמדיה תא באמצעות שני אמין וכימית תיוג תיאול. הזיקה מחייבת נוגדנים הגבוהה לחלבון וחלבון G מבטיחה החלמה גבוהה, כמו גם טוהר גבוה של הנוגדנים שכותרתו. בנוסף, שימוש חרוז מגנטיים מאפשר דגימות מרובות כדי להיות מטופלים באופן ידני, ובכך לשפר את תפוקת תיוג משמעותי.

סכימטי תיוג נוגדנים עם מולקולות קטנות באמצעות חלבון מגנטי גבוהה קיבולת חלבון G חרוזים מוצג באיור 1. נוגדנים שנתפסו על חרוזים המגנטי החלבון G יכולים להיות מתויגים עם מולקולות קטנות, עבור צבעי ניאון למשל, באף אחת כימיה אמינה אשר תוויות אמינים ...

Watch this Scientific Journal Video about Antibody Labeling with Fluorescent Dyes Using Magnetic Protein A and Protein G Beads at JoVE.com

Antibody Labeling with Fluorescent Dyes Using Magnetic Protein A and Protein G Beads

השיטה על-חרוז תיוג נוגדנים עם מולקולות קטנות מאפשרת סימון של כמות קטנה של נוגדנים ישירות תקשורת תא. שיטה זו תואמת אמין וכימית תיאול, ואת יכולה להתמודד עם דגימות מרובות במקביל, באופן ידני או באמצעות פלטפורמות אוטומטיות.

תיוג נוגדן עם צבעי ניאון באמצעות חלבון מגנטי חלבון G חרוזים

Antibodies labeled with small molecules like fluorescent dyes, cytotoxic drugs, and radioactive tracers are essential tools in biomedical research, ...

antibody-labeling-with-fluorescent-dyes-using-magnetic-protein

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.8K Views.  Promega Corporation.  השיטה על-חרוז תיוג נוגדנים עם מולקולות קטנות מאפשרת סימון של כמות קטנה של נוגדנים ישירות תקשורת תא. שיטה זו תואמת אמין וכימית תיאול, ואת יכולה להתמודד עם דגימות מרובות במקביל, באופן ידני או באמצעות פלטפורמות אוטומטיות. 

Video: Antibody Labeling with Fluorescent Dyes Using Magnetic Protein A and Protein G Beads

Efficient and Site-specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition

There are currently many chemical tools available to introduce chemical probes into proteins to study their structure and function. A useful method is protein conjugation by genetically introducing an unnatural amino acid containing a bioorthogonal functional group. This report describes a detailed protocol for site-specific antibody conjugation. The protocol includes experimental details for the genetic incorporation of an azide-containing amino acid, and the conjugation reaction by strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC). This strain-promoted reaction proceeds by simple mixing of the reacting molecules at physiological pH and temperature, and does not require additional reagents such as copper(I) ions and copper-chelating ligands. Therefore, this method would be useful for general protein conjugation and development of antibody drug conjugates (ADCs).

Here, we present a protocol to site-specifically introduce chemical probes into an antibody fragment by genetically incorporating an azide-containing amino acid, and subsequently coupling the azide with a chemical probe by strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC).

יעיל אתר ספציפי תיוג נוגדן ידי cycloaddition יזיד-אלקין קדם-Strain

There are currently many chemical tools available to introduce chemical probes into proteins to study their structure and function. A useful method is ...

Biochemistry

Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip

Global warming and eutrophication make some aquatic ecosystems behave as true bioreactors that trigger rapid and massive cyanobacterial growth; this has relevant health and economic consequences. Many cyanobacterial strains are toxin producers, and only a few cells are necessary to induce irreparable damage to the environment. Therefore, water-body authorities and administrations require rapid and efficient early-warning systems providing reliable data to support their preventive or curative decisions. This manuscript reports an experimental protocol for the in-field detection of toxin-producing cyanobacterial strains by using an antibody microarray chip with 17 antibodies (Abs) with taxonomic resolution (CYANOCHIP). Here, a multiplex fluorescent sandwich microarray immunoassay (FSMI) for the simultaneous monitoring of 17 cyanobacterial strains frequently found blooming in freshwater ecosystems, some of them toxin producers, is described. A microarray with multiple identical replicates (up to 24) of the CYANOCHIP was printed onto a single microscope slide to simultaneously test a similar number of samples. Liquid samples can be tested either by direct incubation with the antibodies (Abs) or after cell concentration by filtration through a 1- to 3-&#956;m filter. Solid samples, such as sediments and ground rocks, are first homogenized and dispersed by a hand-held ultrasonicator in an incubation buffer. They are then filtered (5 - 20 &#956;m) to remove the coarse material, and the filtrate is incubated with Abs. Immunoreactions are revealed by a final incubation with a mixture of the 17 fluorescence-labeled Abs and are read by a portable fluorescence detector. The whole process takes around 3 h, most of it corresponding to two 1-h periods of incubation. The output is an image, where bright spots correspond to the positive detection of cyanobacterial markers.

Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip

The presence of cyanobacterial toxins in fresh water reservoirs for human consumption is a major concern for water management authorities. To evaluate the risk of water contamination, this article describes an protocol for the in-field detection of cyanobacterial strains in liquid and solid samples by using an antibody microarray chip.

פרוטוקול הניסוי לזיהוי<em&gt; כחוליות</em&gt; בדגימות נוזלים ומוצקים עם צ&#39;יפ Microarray נוגדן

Global warming and eutrophication make some aquatic ecosystems behave as true bioreactors that trigger rapid and massive cyanobacterial growth; this has ...

Environment

Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of live neurons with a specific primary antibody raised against an extracellular portion of the protein. Given that receptors are trafficked to and from the surface, if cells are permeabilized after fixation then both cell-surface and internal protein will be detected by the same labeled secondary antibody. Here, we adapted a method used to study protein trafficking (&#8220;antibody feeding&#8221;) to differentially label protein that had been internalized by endocytosis during the antibody incubation step and protein that either remained on the cell surface or was trafficked to the surface during this period. The ability to distinguish these two pools of protein was made possible through the incorporation of an overnight blocking step with highly-concentrated unlabeled secondary antibody after an initial incubation of unpermeabilized neurons with a fluorescently-labeled secondary antibody. After the blocking step, permeabilization of the neurons allowed detection of the internalized pool with a fluorescent secondary antibody labeled with a different fluorophore. Using this technique we were able to obtain important information about the subcellular location of this putative receptor, revealing that it was, indeed, trafficked to the cell-surface in neurons. This technique is broadly applicable to a range of cell types and cell-surface proteins, providing a suitable antibody to an extracellular epitope is available.

We describe a method to label protein on the surface of living neurons using a specific polyclonal antibody to extracellular epitopes. Protein bound by the antibody on the cell surface and subsequently internalized via endocytosis can be distinguished from protein remaining on, or trafficked to, the surface during the incubation.

תיוג ההפרש של על פני קרום תא וחלבונים הפנימו לאחר האכלת נוגדן שידורים חיים בתרבית נוירונים

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...

Neuroscience

Magnetic Tweezers in a Microplate Format

Mechanobiology describes how the physical forces and mechanical properties of biological material contribute to physiology and disease. Typically, these approaches are limited single-molecule methods, which restricts their availability. To address this need, a microplate assay was developed that enables mechanical manipulation while performing standard biochemical assays. This is achieved using magnets incorporated into a microplate lid to create multiple magnetic tweezers. In this format, force is exerted across biomolecules connected to paramagnetic beads, equivalent to a typical magnetic tweezer. The study demonstrates the application of this tool with FRET-based assays to monitor protein conformations. However, this approach is widely applicable to different biological systems ranging from measuring enzymatic activity through to the activation of signaling pathways in live cells.

Here, we describe the use of a novel microplate assay to enable mechanical manipulation of biomolecules while performing ensemble biochemical assays. This is achieved using a microplate lid modified with magnets to create multiple static magnetic tweezers across the microplate.

Mechanobiology describes how the physical forces and mechanical properties of biological material contribute to physiology and disease. Typically, these ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

בידוד יציב Multi-חלבון על ידי תסביכים In vivo מבוקר נייד חוצה קישור חיסונית מגנטי כרומטוגרפיה זיקה

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Biology

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ribonucleoprotein complexes (miRNPs) that are often expressed in a cell-type dependently. To understand how the interplay of these RNA-binding factors affects the regulation of individual transcripts, high resolution maps of in vivo protein-RNA interactions are necessary1.
A combination of genetic, biochemical and computational approaches are typically applied to identify RNA-RBP or RNA-RNP interactions. Microarray profiling of RNAs associated with immunopurified RBPs (RIP-Chip)2 defines targets at a transcriptome level, but its application is limited to the characterization of kinetically stable interactions and only in rare cases3,4 allows to identify the RBP recognition element (RRE) within the long target RNA. More direct RBP target site information is obtained by combining in vivo UV crosslinking5,6 with immunoprecipitation7-9 followed by the isolation of crosslinked RNA segments and cDNA sequencing (CLIP)10. CLIP was used to identify targets of a number of RBPs11-17. However, CLIP is limited by the low efficiency of UV 254 nm RNA-protein crosslinking, and the location of the crosslink is not readily identifiable within the sequenced crosslinked fragments, making it difficult to separate UV-crosslinked target RNA segments from background non-crosslinked RNA fragments also present in the sample.
We developed a powerful cell-based crosslinking approach to determine at high resolution and transcriptome-wide the binding sites of cellular RBPs and miRNPs that we term PAR-CliP (Photoactivatable-Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation) (see Fig. 1A for an outline of the method). The method relies on the incorporation of photoreactive ribonucleoside analogs, such as 4-thiouridine (4-SU) and 6-thioguanosine (6-SG) into nascent RNA transcripts by living cells. Irradiation of the cells by UV light of 365 nm induces efficient crosslinking of photoreactive nucleoside-labeled cellular RNAs to interacting RBPs. Immunoprecipitation of the RBP of interest is followed by isolation of the crosslinked and coimmunoprecipitated RNA. The isolated RNA is converted into a cDNA library and deep sequenced using Solexa technology. One characteristic feature of cDNA libraries prepared by PAR-CliP is that the precise position of crosslinking can be identified by mutations residing in the sequenced cDNA. When using 4-SU, crosslinked sequences thymidine to cytidine transition, whereas using 6-SG results in guanosine to adenosine mutations. The presence of the mutations in crosslinked sequences makes it possible to separate them from the background of sequences derived from abundant cellular RNAs.
Application of the method to a number of diverse RNA binding proteins was reported in Hafner et al.18

RNA transcripts are subject to extensive posttranscriptional regulation that is mediated by a multitude of trans-acting RNA-binding proteins (RBPs). Here we present a generalizable method to identify precisely and on a transcriptome-wide scale the RNA binding sites of RBPs.

PAR-Clip - שיטה לזהות Transcriptome רחב אתרי קישור של חלבונים RNA הכבילה

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in cell biology. Many phenomena cannot be explained by in vitro analysis in simplified systems and need additional structural information in situ, particularly in the range between 1 nm and 0.1 &#181;m, in order to be fully understood. Here, electron spectroscopic imaging, a transmission electron microscopy technique that allows simultaneous mapping of the distribution of proteins and nucleic acids, and an expression tag, miniSOG, are combined to study the structure and organization of DNA double-strand break repair foci.

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging ESI

Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.

הדמיה של חלבונים תיקון ה- DNA miniSOG תייג בשילוב עם אלקטרונים Spectroscopic הדמיה (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in ...

Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A deeper understanding of the changes in gene expression that occur during repopulation could help identify therapeutic targets to promote the restoration of liver function in the setting of injuries. Nonetheless, methods to isolate specifically the repopulating hepatocytes are inhibited by a lack of cell markers, limited cell numbers, and the fragility of these cells. The development of translating ribosome affinity purification (TRAP) technology in conjunction with the Fah-/- mouse model to recapitulate repopulation in the setting of liver injury allows gene expression profiling of the repopulating hepatocytes. With TRAP, cell type-specific translating mRNA is rapidly and efficiently isolated. We developed a method that utilizes TRAP with affinity-based isolation of translating mRNA from hepatocytes that selectively express the green fluorescent protein (GFP)-tagged ribosomal protein (RP), GFP:RPL10A. TRAP circumvents the long time period required for fluorescence-activated cell sorting that could change the gene expression profile. Furthermore, since only the repopulating hepatocytes express the GFP:RPL10A fusion protein, the isolated mRNA is devoid of contamination from the surrounding injured hepatocytes and other cell types in the liver. The affinity-purified mRNA is of high quality and allows downstream PCR- or high-throughput sequencing-based analysis of gene expression.

Translating ribosome affinity purification (TRAP) enables rapid and efficient isolation of cell type-specific translating mRNA. Here, we demonstrate a method that combines hydrodynamic tail-vein injection in a mouse model of liver repopulation and TRAP to examine the expression profile of repopulating hepatocytes.

סוג תא-ביטוי גנים ספציפי ליצירת פרופיל בכבד העכבר

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A ...

Detection of Protein Aggregation using Fluorescence Correlation Spectroscopy

Protein aggregation is a hallmark of neurodegenerative disorders such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Alzheimer's disease (AD), Parkinson's disease (PD), Huntington's disease (HD), and so on. To detect and analyze soluble or diffuse protein oligomers or aggregates, fluorescence correlation spectroscopy (FCS), which can detect the diffusion speed and brightness of a single particle with a single molecule sensitivity, has been used. However, the proper procedure and know-how for protein aggregation detection have not been widely shared. Here, we show a standard procedure of FCS measurement for diffusion properties of aggregation-prone proteins in cell lysate and live cells: ALS-associated 25 kDa carboxyl-terminal fragment of TAR DNA/RNA-binding protein 43 kDa (TDP25) and superoxide dismutase 1 (SOD1). The representative results show that a part of aggregates of green fluorescent protein (GFP)-tagged TDP25 was slightly included in the soluble fraction of murine neuroblastoma Neuro2a cell lysate. Moreover, GFP-tagged SOD1 carrying ALS-associated mutation shows a slower diffusion in live cells. Accordingly, we here introduce the procedure to detect the protein aggregation via its diffusion property using FCS.

We here introduce a procedure to measure protein oligomers and aggregation in cell lysate and live cells using fluorescence correlation spectroscopy.

איתור צבירת חלבונים באמצעות ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטי

Protein aggregation is a hallmark of neurodegenerative disorders such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Alzheimer's disease (AD), Parkinson's ...

A Technique to Detect Cyanobacterial Strains Using an Antibody Microarray Chip

Source: Blanco, Y. et al., <a href="https://app.jove.com/v/54994">Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2017)
This video demonstrates a method to detect the Cyanobacterial strains in an environmental sample using an antibody microarray chip. Samples carrying various bacteria interact with printed antibodies, and immunostaining with fluorophore-labeled anti-cyanobacterial-strain antibodies reveals the presence of specific cyanobacterial strains through fluorescence in distinct spots.

תיוג נוגדן עם צבעי ניאון באמצעות חלבון מגנטי חלבון G חרוזים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video