1. anticuerpo de captura sobre perlas de proteína de alta capacidad magnética A o proteína G Magnética <ol><li> Uniformemente vuelva a suspender las perlas magnéticas de agitación suave. Mantener la suspensión uniforme cuando alícuotas de perlas. </li><li> Añadir 50 l de suspensión de perlas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Colocar en el soporte magnético durante 10 s. Con cuidado eliminar el tampón de almacenamiento. </li><li> Añadir 250 l de tampón de unión del anticuerpo. </li><li> Mezclar y colocar en el soporte magnético durante 10 s. Con cuidado, retire el tampón de unión. </li><li> Añadir 1,0 ml de la muestra que contiene 50 a 100 mg de anticuerpo a las perlas. Las muestras se pueden purificar anticuerpos o anticuerpos en los medios de comunicación celular. </li><li> Mezclar la muestra durante 60 min a RT usando un mezclador de vórtice o mezclador de extremo sobre extremo. </li><li> Colocar el tubo en el soporte magnético durante 10 segundos y retirar el sobrenadante. </li><li> Añadir 250 l de tampón de unión / lavado de anticuerpo y mezclar. Colocar en el soporte magnético durante 10 segundos y retirar tampón de unión / lavado. Repita este sTEP para un total de dos lavados. </li><li> Proceda a la Sección 2 de anticuerpos marcadores utilizando la química de amina o la Sección 3 para anticuerpos marcadores utilizando la química de tiol. </li></ol> 2. El anticuerpo etiquetado Uso de Química Amina <ol><li> Anticuerpo conjugado <ol><li> Añadir 100 ml de tampón de conjugación de amina a las perlas. </li><li> Disolver los colorantes fluorescentes de amina reactiva (AlexaFluor 532-SE) en 10 mg / ml mediante la adición de 100 l de sulfóxido de dimetilo (DMSO) a 1,0 mg de tinte. Mezclar mediante agitación. Hacer esta solución justo antes de su uso. </li><li> Añadir 2,5 l de colorante reactivo con aminas de 100 mg de anticuerpo. Nota: Por lo general se recomienda un exceso molar de 5-20 colorante reactivo. Sin embargo, la cantidad de colorante reactivo añadido a necesita ser optimizado empíricamente dependiendo de tinte deseado a la proporción de anticuerpo y las propiedades de anticuerpos intrínsecos la reacción. </li><li> Mezclar la muestra durante 60 min a RT usando un mezclador de vórtice o mezclador de extremo sobre extremo. Asegúrese de que las cuentas se mantienen en suspensionorte. </li><li> Colocar el tubo en el soporte magnético durante 10 segundos y retirar el sobrenadante. </li><li> Añadir 250 l de tampón de unión / lavado de anticuerpo y mezclar. Colocar en el soporte magnético durante 10 s. Retire y deseche tampón de unión / lavado. Repita este paso para un total de dos lavados. </li></ol></li><li> recuperación de anticuerpos <ol><li> Añadir 50 l de tampón de elución a las perlas. </li><li> Mezclar durante 5 minutos a temperatura ambiente usando un mezclador de vórtice o mezclador de extremo sobre extremo. Asegúrese de que las cuentas se mantienen en suspensión. </li><li> Colocar el tubo en el soporte magnético durante 10 s. Retirar la muestra y la transferencia se eluyó a un nuevo tubo de microcentrífuga que contiene 5 l de tampón de neutralización. </li><li> Repetir el proceso una vez más y aunar las muestras eluidas. </li><li> Cuantificar la concentración de anticuerpos y teñir-a-anticuerpo relación como se describe en la Sección 4. </li></ol></li></ol> 3. El anticuerpo etiquetado Usando tiol Química <ol><li> Reducción de anticuerpos <ol><li> Añadir 250 lde tampón de conjugación de tiol y mezcla. Se coloca el tubo en el soporte magnético durante 10 s. Retirar y desechar el tampón. Repita este paso dos veces. </li><li> Añadir 100 ml de tampón de conjugación de tiol. </li><li> Añadir ditiotreitol (DTT) a una concentración final de 2,5 mM. </li><li> Mezclar la muestra durante 60 min a RT usando un mezclador de vórtice o mezclador de extremo sobre extremo. Asegúrese de que las cuentas se mantienen en suspensión. </li><li> Se coloca el tubo en el soporte magnético durante 10 segundos y desechar el tampón. </li><li> Añadir 250 l de tampón de conjugación de tiol y mezclar. Se coloca el tubo en el soporte magnético durante 10 s. Retirar y desechar el tampón. Repita este paso para un total de dos lavados. </li><li> Añadir 100 ml de tampón de conjugación de tiol. </li></ol></li><li> Anticuerpo conjugado <ol><li> Se disuelve el colorante reactivo con tiol en 10 mg / ml mediante la adición de 100 l de DMSO a 1,0 mg de tinte. Mezclar mediante agitación. Hacer esta solución justo antes de su uso. </li><li> Añadir 2,5 l de colorante reactivo con tiol de 100 mg de anticuerpos anticuerpo. Nota: Por lo general se recomienda un exceso molar de 5-20 colorante reactivo. Sin embargo, la cantidad de colorante reactivo añadido a necesita ser optimizado empíricamente dependiendo de tinte deseado a la proporción de anticuerpo y las propiedades de anticuerpos intrínsecos la reacción. </li><li> Mezclar la muestra durante 60 min a RT usando un mezclador de vórtice o mezclador de extremo sobre extremo. Asegúrese de que las cuentas se mantienen en suspensión. </li><li> Se coloca el tubo en el soporte magnético durante 10 segundos y retirar el sobrenadante. </li><li> Añadir 250 l de tampón de conjugación de tiol y mezclar. Colocar en el soporte magnético durante 10 segundos y retirar el tampón. Repita este paso para un total de dos lavados. </li></ol></li><li> Eluir Anticuerpo <ol><li> Añadir 50 l de tampón de elución a las perlas. </li><li> Mezclar durante 5 minutos a temperatura ambiente usando un mezclador de vórtice o mezclador de extremo sobre extremo. Asegúrese de que las cuentas se mantienen en suspensión. </li><li> Colocar el tubo en el soporte magnético durante 10 s. Retirar la muestra y la transferencia se eluyó a un nuevo tubo de microcentrífuga que contiene 5 l de neutralization tampón. </li><li> Repetir el proceso una vez más y aunar las muestras eluidas. </li><li> Cuantificar la concentración de anticuerpos y teñir-a-anticuerpo relación como se describe en la Sección 4. </li></ol></li></ol> Relación 4. Calcular la Teñir-a-Anticuerpo <ol><li> Medir la absorbancia del conjugado anticuerpo-colorante a 280 nm (A280) y en la λmax para el tinte (Amax). </li><li> Calcular la concentración de anticuerpo: Anticuerpo Concentración (mg / ml) = A280 - (A max × CF) / 1,4 donde CF = factor de corrección del colorante (proporcionado por el fabricante). </li><li> Se calcula la relación de colorantes-anticuerpo a: Teñir-a-Antibody Ratio (DAR) = (A max × 150.000) / Ab Concentración (mg / ml) x ε colorante donde, tinte ε = el coeficiente de extinción del colorante en su absorbancia máxima y el peso molecular del anticuerpo = 150000 Da. </li></ol>

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Authors are employees of Promega Corporation.

El objetivo de este estudio fue desarrollar un método para marcar anticuerpos, presentes en el medio celular a bajas concentraciones, con una variedad de moléculas pequeñas. Tal método permitirá a un gran número de anticuerpos, durante las primeras etapas de descubrimiento de anticuerpos, para ser etiquetados con moléculas pequeñas y se tamiza usando un ensayo biológicamente relevante. Uno de tales ensayos es el ensayo de internalización de anticuerpos mediada por el receptor, donde la internalización puede v...

Anticuerpos marcados con moléculas pequeñas son, quizás, los reactivos usados ​​más comúnmente en biología 1,2. Los anticuerpos marcados con colorantes fluorescentes y biotina se utilizan ampliamente en formación de imágenes, inmunoensayos, citometría de flujo, transferencias de Western, inmunoprecipitación y entre otras aplicaciones 3-6. Los anticuerpos radiomarcados 3,7 encuentran un amplio uso en formación de imágenes y terapia, anticuerpos marcados con fármacos citotóxicos (ADCs) están ofreciendo nuevas opciones para el tratamiento de cánceres, y dos ADC ya han sido aprobados para su uso terapéutico 8. A pesar de su amplio uso, los métodos para marcar anticuerpos se han mantenido sorprendentemente sin cambios y por lo general involucran a múltiples reacciones y desalado pasos 9-12. métodos de solución funcionan muy bien en los casos en que sólo unos pocos anticuerpos deben ser etiquetados y están disponibles en forma altamente purificada en una concentración elevada y en volúmenes suficientes. Sin embargo, para nuevas aplicaciones como ADCs, hay unatenga que marcar anticuerpos en la fase temprana de hibridoma para que puedan ser evaluados para propiedades biológicamente relevantes, por ejemplo, la internalización de anticuerpos mediada por receptores 13-16. En la etapa de hibridoma, los volúmenes de muestra son limitados, los anticuerpos se expresan en concentraciones bajas y un número de muestras son grandes, por lo tanto, métodos de etiquetado a base de soluciones no son adecuados. Para simplificar y mejorar el rendimiento de los métodos tradicionales de etiquetado de anticuerpos, algunos enfoques alternativos se han propuesto 17,18. Un enfoque consiste en utilizar las proteínas no magnético A perlas de afinidad envasados ​​en pequeñas columnas para capturar anticuerpos seguido de la reacción de marcaje y la elución de la proteína marcada y purificada. Este método se puede utilizar para marcar anticuerpos directamente desde el soporte de células, sin embargo, el uso de columnas puede ser laborioso. Un método basado perla magnética Recientemente se ha informado 19 que elimina el uso de columnas y mejora el rendimiento pero debidoa la capacidad de las perlas de la unión del anticuerpo limitado, solamente nanogramo a cantidades de microgramos bajos de los anticuerpos podría ser etiquetado. Recientemente hemos desarrollado y utilizado de alta capacidad magnética Proteína A y Proteína G cuentas (&gt; 20 mg de IgG humana / ml de perlas sedentarios) para etiquetar los anticuerpos presentes en los medios de comunicación celular con moléculas pequeñas 20. La alta capacidad de las perlas permite decenas a cientos de microgramos de anticuerpo a ser etiquetados convenientemente y la respuesta magnética rápida de las perlas simplifica el manejo y procesamiento de un gran número de muestras en paralelo. El uso de colorantes fluorescentes como sustitutos de moléculas pequeñas, se muestra que el método es compatible con amina y tiol química etiquetado y ofrece altas recuperaciones de anticuerpos marcados y muy puros. Este protocolo y el video que lo acompaña describen etiquetado en cordón de anticuerpos de ratón presentes en los medios de células utilizando cuentas de Proteína G magnética A y proteína. El protocolo esdividida en cuatro secciones: Sección 1 describe la captura de anticuerpos en la perla a partir de muestras biológicas. Después de la captura, el etiquetado de los anticuerpos con colorante fluorescente usando química de amina o tiol usando química se describe en las secciones 2 y la sección 3, respectivamente. Finalmente, la sección 4 se describe el método para el cálculo de la concentración de anticuerpos y el colorante a la proporción de anticuerpos.

<table><tbody><tr><td>Magne Protein A Beads</td><td>Promega Corporation</td><td>&amp;nbsp;G8781</td><td></td></tr><tr><td>Magne Protein G Beads</td><td>Promega Corporation&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;G7471</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 532-SE (Succinimidyl Ester)</td><td>Life Technologies</td><td>A20001</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 532-ME (Malemide)</td><td>Life Technologies</td><td>A10255</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647-ME (Maleimide)</td><td>Life Technologies</td><td>A20347</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein-ME (Maleimide)</td><td>Life Technologies</td><td>F-150</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Stand</td><td>Promega</td><td>Z5332</td><td></td></tr></tbody></table>

antibody labeling with fluorescent dyes using magnetic protein a and protein g beads

Anticuerpos marcados con pequeñas moléculas como colorantes fluorescentes, fármacos citotóxicos, y trazadores radiactivos son herramientas esenciales en la investigación biomédica, inmunodiagnóstico y más recientemente como agentes terapéuticos. Los métodos tradicionales para marcar anticuerpos con moléculas pequeñas requieren anticuerpos purificados a una concentración relativamente alta, implican múltiples etapas de diálisis y han limitado el rendimiento. Sin embargo, varias aplicaciones, incluyendo el campo de Drogas de anticuerpos conjugados (ADC), se beneficiarán de nuevos métodos que permitan el etiquetado de anticuerpos directamente desde el soporte de células. Tales métodos pueden permitir que los anticuerpos que se proyectarán en ensayos biológicamente relevantes, por ejemplo, el ensayo de internalización de anticuerpos mediada por el receptor en el caso de ADCs. A continuación, describimos un (método on-perla) método que permite el etiquetado de pequeñas cantidades de anticuerpos directamente desde el soporte celular. Este enfoque utiliza la alta capacidad de la proteína magnética A y la proteína G perlas de afinidad para capturar anticuerposde los medios de células seguido de marcaje con moléculas pequeñas usando ya sea química de amina o tiol y la posterior elución de los anticuerpos marcados. Tomando tintes fluorescentes como sustitutos de moléculas pequeñas, se demuestra el etiquetado en el cordón de tres diferentes anticuerpos de ratón directamente desde el soporte de células utilizando tanto la química amina y tiol etiquetado. La alta afinidad de unión de anticuerpos a la proteína A y la proteína G asegura recuperaciones altas así como una alta pureza de los anticuerpos marcados. Además, el uso de perlas magnéticas permite múltiples muestras para ser manejados manualmente, con lo que mejora significativamente el rendimiento de etiquetado.

Un esquema para el marcaje de anticuerpos con moléculas pequeñas usando G bolas de alta capacidad de la proteína magnética A y proteína se muestra en la Figura 1. Los anticuerpos capturados en la proteína magnético G cuentas se pueden marcar con moléculas pequeñas, por ejemplo, colorantes fluorescentes, utilizando la química de amina que las etiquetas aminas primarias de los ácidos amino de la lisina o usando química de tiol que las etiquetas en los tioles re...

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Antibody Labeling with Fluorescent Dyes Using Magnetic Protein A and Protein G Beads

El método en el talón para el marcaje de anticuerpos con moléculas pequeñas permite el etiquetado de una pequeña cantidad de anticuerpos directamente desde el soporte celular. Este método es compatible con la amina y la química de tiol, y puede manejar múltiples muestras en paralelo, de forma manual o utilizando plataformas automatizadas.

Antibody Labeling con tintes fluorescentes utilizando proteína magnética A y Proteína G cuentas

Antibodies labeled with small molecules like fluorescent dyes, cytotoxic drugs, and radioactive tracers are essential tools in biomedical research, ...

antibody-labeling-with-fluorescent-dyes-using-magnetic-protein

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.8K vistas.  Promega Corporation.  El método en el talón para el marcaje de anticuerpos con moléculas pequeñas permite el etiquetado de una pequeña cantidad de anticuerpos directamente desde el soporte celular. Este método es compatible con la amina y la química de tiol, y puede manejar múltiples muestras en paralelo, de forma manual o utilizando plataformas automatizadas. 

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Efficient and Site-specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition

There are currently many chemical tools available to introduce chemical probes into proteins to study their structure and function. A useful method is protein conjugation by genetically introducing an unnatural amino acid containing a bioorthogonal functional group. This report describes a detailed protocol for site-specific antibody conjugation. The protocol includes experimental details for the genetic incorporation of an azide-containing amino acid, and the conjugation reaction by strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC). This strain-promoted reaction proceeds by simple mixing of the reacting molecules at physiological pH and temperature, and does not require additional reagents such as copper(I) ions and copper-chelating ligands. Therefore, this method would be useful for general protein conjugation and development of antibody drug conjugates (ADCs).

Here, we present a protocol to site-specifically introduce chemical probes into an antibody fragment by genetically incorporating an azide-containing amino acid, and subsequently coupling the azide with a chemical probe by strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC).

Eficiente y específica del sitio del anticuerpo etiquetado por cicloadición de azida-alquino Strain-promovido

There are currently many chemical tools available to introduce chemical probes into proteins to study their structure and function. A useful method is ...

Investigación

Bioquímica

Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip

Global warming and eutrophication make some aquatic ecosystems behave as true bioreactors that trigger rapid and massive cyanobacterial growth; this has relevant health and economic consequences. Many cyanobacterial strains are toxin producers, and only a few cells are necessary to induce irreparable damage to the environment. Therefore, water-body authorities and administrations require rapid and efficient early-warning systems providing reliable data to support their preventive or curative decisions. This manuscript reports an experimental protocol for the in-field detection of toxin-producing cyanobacterial strains by using an antibody microarray chip with 17 antibodies (Abs) with taxonomic resolution (CYANOCHIP). Here, a multiplex fluorescent sandwich microarray immunoassay (FSMI) for the simultaneous monitoring of 17 cyanobacterial strains frequently found blooming in freshwater ecosystems, some of them toxin producers, is described. A microarray with multiple identical replicates (up to 24) of the CYANOCHIP was printed onto a single microscope slide to simultaneously test a similar number of samples. Liquid samples can be tested either by direct incubation with the antibodies (Abs) or after cell concentration by filtration through a 1- to 3-&#956;m filter. Solid samples, such as sediments and ground rocks, are first homogenized and dispersed by a hand-held ultrasonicator in an incubation buffer. They are then filtered (5 - 20 &#956;m) to remove the coarse material, and the filtrate is incubated with Abs. Immunoreactions are revealed by a final incubation with a mixture of the 17 fluorescence-labeled Abs and are read by a portable fluorescence detector. The whole process takes around 3 h, most of it corresponding to two 1-h periods of incubation. The output is an image, where bright spots correspond to the positive detection of cyanobacterial markers.

Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip

The presence of cyanobacterial toxins in fresh water reservoirs for human consumption is a major concern for water management authorities. To evaluate the risk of water contamination, this article describes an protocol for the in-field detection of cyanobacterial strains in liquid and solid samples by using an antibody microarray chip.

Protocolo Experimental para la detección de<em&gt; Las cianobacterias</em&gt; En muestras líquidas y sólidas con un chip de microarray de anticuerpos

Global warming and eutrophication make some aquatic ecosystems behave as true bioreactors that trigger rapid and massive cyanobacterial growth; this has ...

Medio ambiente

Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of live neurons with a specific primary antibody raised against an extracellular portion of the protein. Given that receptors are trafficked to and from the surface, if cells are permeabilized after fixation then both cell-surface and internal protein will be detected by the same labeled secondary antibody. Here, we adapted a method used to study protein trafficking (&#8220;antibody feeding&#8221;) to differentially label protein that had been internalized by endocytosis during the antibody incubation step and protein that either remained on the cell surface or was trafficked to the surface during this period. The ability to distinguish these two pools of protein was made possible through the incorporation of an overnight blocking step with highly-concentrated unlabeled secondary antibody after an initial incubation of unpermeabilized neurons with a fluorescently-labeled secondary antibody. After the blocking step, permeabilization of the neurons allowed detection of the internalized pool with a fluorescent secondary antibody labeled with a different fluorophore. Using this technique we were able to obtain important information about the subcellular location of this putative receptor, revealing that it was, indeed, trafficked to the cell-surface in neurons. This technique is broadly applicable to a range of cell types and cell-surface proteins, providing a suitable antibody to an extracellular epitope is available.

We describe a method to label protein on the surface of living neurons using a specific polyclonal antibody to extracellular epitopes. Protein bound by the antibody on the cell surface and subsequently internalized via endocytosis can be distinguished from protein remaining on, or trafficked to, the surface during the incubation.

Etiquetado diferencial de la superficie celular e internalizado Proteínas después Antibody alimentación de vivo cultivadas neuronas

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...

Neurociencias

Magnetic Tweezers in a Microplate Format

Mechanobiology describes how the physical forces and mechanical properties of biological material contribute to physiology and disease. Typically, these approaches are limited single-molecule methods, which restricts their availability. To address this need, a microplate assay was developed that enables mechanical manipulation while performing standard biochemical assays. This is achieved using magnets incorporated into a microplate lid to create multiple magnetic tweezers. In this format, force is exerted across biomolecules connected to paramagnetic beads, equivalent to a typical magnetic tweezer. The study demonstrates the application of this tool with FRET-based assays to monitor protein conformations. However, this approach is widely applicable to different biological systems ranging from measuring enzymatic activity through to the activation of signaling pathways in live cells.

<meta charset="utf8"></head><body>Pinzas magnéticas en formato de microplaca

Here, we describe the use of a novel microplate assay to enable mechanical manipulation of biomolecules while performing ensemble biochemical assays. This is achieved using a microplate lid modified with magnets to create multiple static magnetic tweezers across the microplate.

Pinzas magnéticas en formato de microplaca

Mechanobiology describes how the physical forces and mechanical properties of biological material contribute to physiology and disease. Typically, these ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

El aislamiento de lábil Multi-complejos de proteínas por In vivo Control Celular entrecruzamiento y Inmuno-cromatografía de afinidad magnética

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Biología

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in cell biology. Many phenomena cannot be explained by in vitro analysis in simplified systems and need additional structural information in situ, particularly in the range between 1 nm and 0.1 &#181;m, in order to be fully understood. Here, electron spectroscopic imaging, a transmission electron microscopy technique that allows simultaneous mapping of the distribution of proteins and nucleic acids, and an expression tag, miniSOG, are combined to study the structure and organization of DNA double-strand break repair foci.

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging ESI

Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.

Visualización de miniSOG Tagged proteínas de reparación de ADN en combinación con Electron espectroscópico Imaging (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in ...

Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A deeper understanding of the changes in gene expression that occur during repopulation could help identify therapeutic targets to promote the restoration of liver function in the setting of injuries. Nonetheless, methods to isolate specifically the repopulating hepatocytes are inhibited by a lack of cell markers, limited cell numbers, and the fragility of these cells. The development of translating ribosome affinity purification (TRAP) technology in conjunction with the Fah-/- mouse model to recapitulate repopulation in the setting of liver injury allows gene expression profiling of the repopulating hepatocytes. With TRAP, cell type-specific translating mRNA is rapidly and efficiently isolated. We developed a method that utilizes TRAP with affinity-based isolation of translating mRNA from hepatocytes that selectively express the green fluorescent protein (GFP)-tagged ribosomal protein (RP), GFP:RPL10A. TRAP circumvents the long time period required for fluorescence-activated cell sorting that could change the gene expression profile. Furthermore, since only the repopulating hepatocytes express the GFP:RPL10A fusion protein, the isolated mRNA is devoid of contamination from the surrounding injured hepatocytes and other cell types in the liver. The affinity-purified mRNA is of high quality and allows downstream PCR- or high-throughput sequencing-based analysis of gene expression.

Translating ribosome affinity purification (TRAP) enables rapid and efficient isolation of cell type-specific translating mRNA. Here, we demonstrate a method that combines hydrodynamic tail-vein injection in a mouse model of liver repopulation and TRAP to examine the expression profile of repopulating hepatocytes.

Perfilado de expresión génica específico del tipo de celda en el hígado del ratón

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A ...

Detection of Protein Aggregation using Fluorescence Correlation Spectroscopy

Protein aggregation is a hallmark of neurodegenerative disorders such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Alzheimer's disease (AD), Parkinson's disease (PD), Huntington's disease (HD), and so on. To detect and analyze soluble or diffuse protein oligomers or aggregates, fluorescence correlation spectroscopy (FCS), which can detect the diffusion speed and brightness of a single particle with a single molecule sensitivity, has been used. However, the proper procedure and know-how for protein aggregation detection have not been widely shared. Here, we show a standard procedure of FCS measurement for diffusion properties of aggregation-prone proteins in cell lysate and live cells: ALS-associated 25 kDa carboxyl-terminal fragment of TAR DNA/RNA-binding protein 43 kDa (TDP25) and superoxide dismutase 1 (SOD1). The representative results show that a part of aggregates of green fluorescent protein (GFP)-tagged TDP25 was slightly included in the soluble fraction of murine neuroblastoma Neuro2a cell lysate. Moreover, GFP-tagged SOD1 carrying ALS-associated mutation shows a slower diffusion in live cells. Accordingly, we here introduce the procedure to detect the protein aggregation via its diffusion property using FCS.

We here introduce a procedure to measure protein oligomers and aggregation in cell lysate and live cells using fluorescence correlation spectroscopy.

Detección de agregación de proteínas mediante espectroscopia de correlación de fluorescencia

Protein aggregation is a hallmark of neurodegenerative disorders such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Alzheimer's disease (AD), Parkinson's ...

An Immunolabeling Technique to Visualize the Subcellular Localization of Proteins

Source: Aishwarya, R., et al. <a href="https://app.jove.com/v/64085">Visualizing Subcellular Localization of a Protein in the Heart Using Quantum Dots-Mediated Immuno-Labeling Followed by Transmission Electron Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (2022).
This video demonstrates a technique for the immunolabeling of sigma-1 receptors in a murine heart tissue section using quantum dots. The heart tissue is fixed, osmicated, stained, dehydrated, embedded in resin, and then sectioned. The sections are then treated with antibodies and labeled with quantum dots to demarcate the subcellular localization of Sigma-1 receptors using electron microscopy.

Una técnica de inmunomarcaje para visualizar la localización subcelular de proteínas

1. Animal preparation

	Anesthetize the mice using 3% isoflurane. Open the chest by making a horizontal incision in the region above the middle abdomen ...

Antibody Labeling con tintes fluorescentes utilizando proteína magnética A y Proteína G cuentas

Resumen

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Capítulos en este video

Eficiente y específica del sitio del anticuerpo etiquetado por cicloadición de azida-alquino Strain-promovido

Protocolo Experimental para la detección de

Etiquetado diferencial de la superficie celular e internalizado Proteínas después Antibody alimentación de vivo cultivadas neuronas

Pinzas magnéticas en formato de microplaca

Pinzas magnéticas en formato de microplaca

El aislamiento de lábil Multi-complejos de proteínas por In vivo Control Celular entrecruzamiento y Inmuno-cromatografía de afinidad magnética

Visualización de miniSOG Tagged proteínas de reparación de ADN en combinación con Electron espectroscópico Imaging (ESI)

Perfilado de expresión génica específico del tipo de celda en el hígado del ratón

Detección de agregación de proteínas mediante espectroscopia de correlación de fluorescencia

Una técnica de inmunomarcaje para visualizar la localización subcelular de proteínas