העיקרון הטוב ביותר של ספקטרוסקופיית מתאם הפלואורסצנטיות, FCS, הומצא לראשונה בשנות השבעים. בשנות התשעים, שיפורים חשובים ורבים עבור FCS הוקמה על ידי שילוב עם מיקרוסקופיה של מנגנון confocal. מאז, FCS שימש עבור יישומים רבים ריפוי כימיים ווירוסים, כגון אינטראקציות מולקולריות וניתוח צבירת חלבון.
צבירת חלבונים היא סימן ההיכר של הפרעות ניווניות. בהירות פלואורסצנטיות הם חלקיקים בודדים בפעולה בגדלים מולקולריים המוסברים על ידי תכונות דיפוזיה. זה מאוד חשוב במדידת צבירות חלבון כי זה יכול לקבוע מחזורי חיים מוקרנים של מולקולות, אלא גם להבחין בין הומו או פולמריזציה הטרו.
כאן, אנו מציגים הליך למדידת דיפוזיה של טרשת לרוחב amyotrophic הקשורים חלבון טופס מצטבר באמצעות FCS ב lysates התא ותאים חיים. הכן צלחת פלסטיק 100 מילימטר גדל Neuro2a תא יושב בנוחות במדיום הצמיחה הרגילה. אשר את מפגש התאים.
הסר את המדיום. מוסיפים 3.5 מיליליטר של תמיסת טריפסין-אדטה לצלחת המחסנית השלישית ומדגירים אותם ב-37 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת. מוסיפים 9.5 מיליליטר בינוני צמיחה נורמלי לתוך המנה להשעות אותם.
השעיית התא מעורבבת עם כחול טריפאן כדי להכתים את התאים המתים. הוסף השעיה לשקופית ספירת התאים. ספור את מספר התאים המשתמשים במונה התאים, או באופן ידני.
בדוק את מספר התא החי ואת הכדאיות שלהם. לדלל את התא במדיום שנספר ב 1.0 פעמים 10 לעוצמה של 5 למיליליטר. הוסף שני מיליליטרים של השעיית תאים לתוך צלחת פלסטיק 35 מילימטר עבור תמוגה תא או צלחת שטח צמיחה למדידת תא חי.
דגירה את המנה ב 37 מעלות צלזיוס ליום אחד. למחרת, להכין את התערובת של DNA פלסמיד ואת reagents transfection. מוסיפים את תערובת ההעתקה למדיום הנספר בתאים ומדגירה את התאים במשך 24 שעות.
יום אחד לאחר מכן. בדוק את ביטוי GFP באמצעות מיקרוסקופ שגרתי. אתה יכול לראות את גופי המרכיב TDP25 בהיר מאוד בתאים.
תמוגה של תאים צריכה להתבצע בספסל הביוכימי. מוציאים את המדיום בצלחת. מוסיפים שני מיליליטר של PBS ב 25 מעלות צלזיוס לשטוף כמדיום.
הסר את PBS. מניחים את המנה על צלחת אלומיניום על החלק העליון של הקרח כתוש. מיד, מוסיפים את חיץ תמוגה 200 microliter לתוך המנה.
מגרדים את המנה באמצעות מגרד תאים. לשחזר את lysate עם פסולת תא לא פתורה בצינור חדש 1.5 מילימטר. צנטריפוגה lysate בארבע מעלות צלזיוס.
למדידות תאים חיים, החליפו את המדיום במדידה טרייה לפני המדידה. בדוק את הקובץ המצורף לתא באמצעות מיקרוסקופ עם ניגודיות פאזה. כמו כן, בדוק את הביטוי GFP באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
השתמש במערכת FCS משולבת מיקרוסקופ קונפוקלית. הפעל את לייזר 488 ננומטר. לייצב את המערכת, לפחות, במשך 30 דקות.
הגדר את הנתיב האופטי. השתמש לייזר 488 ננומטר עבור האור המיידי. השתמש מפצל קרן מתאים מטרים dichroic.
וגם, נתיכים פלואורסצנטיים. בדרך כלל, נשתמש בתאי כיסוי לכיול ומדידות פתרון. בזהירות, קח את תא הכיסוי.
מניחים את משטח הזכוכית על נייר ההקרנה של העדשה. יוצקים את כיול FCS. הוסף את פתרון רודמין 6G גם כן.
מוסיפים את המים האולטרה-דקים על המטרה. אין להשתמש בשמן. שים את התא על במת המיקרוסקופ.
הזז את הבמה למיקום המתאים. צרו את התאמת חור הסיכה ופתחו את אשף התאמת חור הסיכה. נטר את קצב ספירת הפוטונין כתנועה גסה של חור הסיכה עבור כיוון ה- x.
התנוחה הבהירה ביותר נקבעה בצדק. לאחר מכן, נטר את קצב ספירת הפוטונין כתנועה עדינה. המיקום הבהיר ביותר נקבע בהצלחה זהו מיקום חור הסיכה עבור x-כיוון.
באותו אופן, לחפש את המיקום הבהיר ביותר של חור סיכה עבור y-כיוון. המיקום הבהיר ביותר עבור y-כיוון נקבע גם בהצלחה. מורכבות x ו y המיקום של חור סיכה.
עדיף להתאים את מיקום חור הסיכה לפני המדידה של כל יום. כאשר הנתיב החי משתנה, יש להתאים שוב את מיקום חור הסיכה. צור קצב ספירה ונטר את קצב ספירת הטלפונים.
עבור למצב הניטור של עלות לאלף חשיפות. ספור את טבעת התיקון של האובייקט שהרצת כך שערך עלות לאלף חשיפות הוא הגבוה ביותר. סגור את חלון שער הספירה.
התחל עם מדידת פתרון רודמין 6G. לאחר השלמת המדידה, לחץ על ההתאמה כדי לבצע ניתוח התאמת עקומה. בחר מודל להתאמת פונקציית המתאם הישנה.
עבור רודמין 6G, בחר את המודל עבור 1-רכיב, פיזור תלת מימדי עם מצב שלישייה. הגדר את שעת ההתחלה המתאימה על-ידי הזזת הקו האדום. לחץ על התאם הכל, כדי להתחיל בחישוב ההתאמה.
בדוק את סטיית ההתאמה. ודא כי הצדדים מתפרסמים ושליליים, סביב אפס. בדוק את הערכים המותאמים.
ודא שזמן הדיפוזיה הוא בערך בטווח של 20-30 מיקרו-שניות. יתר על כן, הפרמטר המבני הוא מארבע עד שמונה. פתחו את החלונית fit ובחרו דגם למדידה.
הזינו את אותו ערך פרמטר מבני בדגם לדגימה בחלונית 'התאמה'. ודא שיש להגדיר את הסוג כקבוע. מדידת GFP-TDP25 ב-lysate התא.
מניחים את הליסט בתא הכיסוי. מניחים את המכסה כדי למנוע ייבוש של lysate. מניחים את מכסה הבמה להצללה קלה.
בלוח הרכישה, הגדר את עוצמת הלייזר, את זמן המדידה ואת החזרות שלו. התחל את הרכישה. יתד נצפתה.
ספייק נצפה שוב. היתד מצביע על מולקולות בהירות שעברו בגוף הגילוי. קוצים מצביעים על אוליגומרים או אגרגטים מסיסים.
צור התאמה לביצוע ניתוח התאמת עקומה. בחר את המודל עבור דיפוזיה תלת-ממדית דו-רכיבית עם מצב שלישייה. הגדר את שעת ההתחלה המתאימה.
לחץ על התאם הכל. בדוק את הערכים המותאמים. SOD1-G85R מתויג במדידת GFP בתא חי.
שלא כמו מדידת פתרון, אני ממליץ להשתמש באינקובטור שלב החום. הניחו את צלחת פולחן התאים על במת המיקרוסקופ. אשר את המוקד ואת המיקום באמצעות העין.
בחר תא מדידה. הגדלה והתאמת מיקום התא באמצעות מצב סריקה מהיר. השג את תמונת התמונה של התאים באמצעות מצב מהירות הסריקה האיטית.
בחרו מיקום למדידת FCS בעזרת הכלי מיקום. הכוונת מציינת את מיקום המדידה. התחל את המדידה.
הירידה הקלה של רשומת קצב ספירת הפוטונין מרמזת על פוטובלצ'ינג של GFP. בצע את התאמת העקומה. מוצגות תוצאות מייצגות של GFP-TDP25 ב- lysate של התא.
הגרף העליון רישום של שיעור ספירת פוטון. איפה שיש חצים הוא ספייק, מציע אוליגומרים מסיסים ואגרגטים. הגרף האמצעי מייצג את פונקציית המתאם הישנה.
הקו האפור מציג את פונקציית המתאם הנמוכה והוותיקת. קו המגנטה מציג את הפונקציה המותאמת. הקווים המנוקדים מציינים את שעות ההתחלה והסיום להתאמה.
הטבלה התחתונה מציגה את הערך המותאם. לאחר מכן, מוצגות תוצאות מייצגות של SOD1-G85R-GFP בתא חי. הגרף העליון מייצג תיעוד של שיעור ספירת הפוטונין שלנו.
הירידה ההדרגתית של שיעור ספירת הפוטונין המתועד נצפתה, מה שמרמז על פוטובלאצ'ינג של צמיחת GFP למדידות שונות. הסיבה לכך היא מהירות הדיפוזיה האיטית בתאים חיים. הגרף האמצעי מייצג את פונקציית המתאם הישנה של SOD1.
הקו האפור מציג את פונקציית המתאם הנמוכה והוותיקת. קו המגנטה מציג את הפונקציה המותאמת. הקווים המנוקדים מציינים את שעות ההתחלה והסיום בהתאמה.
הטבלה התחתונה מציגה ערכים מותאמים. כאן אנו מראים לך הליך זה כדי למדוד דיפוזיה מכל תא המשויך TDP-25 ב lysate התא וכל מוטציה של SOD1 בתאים חיים באמצעות FCS. אוליגומרים מסיסים וצבירה ב lysate התא ניתן לראות לעתים קרובות כמו קוצים או התפרצויות.
מצד שני, בתאים חיים, קוצים כאלה נצפו לעתים רחוקות, למעט מבנים חיים ברורים. מינים מתפזרים לאט של מוטציה SOD1 של להוסיף בהירות ממוצעת עבור חלקיקים בודדים כגון הומופולימריזציה SOD1 בפנים עבורנו. ההליך המוצג כאן הוא פשוט וכדאי.
FCS אינו מכיל קרינה;מצב רדום ישירות. זו רק האמפתיה הדמיון שלך ושלנו.
