고용량 자기 단백질 A 또는 자기 단백질 G 비즈 상 1. 항체 캡처 <ol><li> 균일 부드러운 흔들림에 의한 자기 구슬을 다시 일시 중지합니다. 구슬을 분취 때 서스펜션 유니폼을 유지합니다. </li><li> 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 비드 슬러리의 50 μl를 추가합니다. 10 초 동안 자기 스탠드에 배치합니다. 조심스럽게 저장 버퍼를 제거합니다. </li><li> 항체 결합 버퍼의 250 μl를 추가합니다. </li><li> 혼합하고 10 초 동안 자기 스탠드에 배치합니다. 조심스럽게 결합 버퍼를 제거합니다. </li><li> 구슬에 항체의 50 ~ 100 μg의를 포함하는 샘플의 1.0 ML을 추가합니다. 시료는 세포 배지에서 항체 또는 항체를 정제 할 수있다. </li><li> 볼텍스 믹서 엔드 오버 엔드 믹서로 실온에서 60 분 동안 샘플을 섞는다. </li><li> 10 초 동안 자기 스탠드에 튜브를 놓고 뜨는을 제거합니다. </li><li> 항체 결합 / 세척 버퍼의 250 μl를 추가하고 혼합한다. 10 초 동안 자기 스탠드에 놓고 바인딩 / 세척 버퍼를 제거합니다. 이 S 반복두 세척 총 TEP. </li><li> 아민 화학 또는 제 3 항에 티올 화학 제를 사용하여 라벨 항체에를 사용하여 라벨 항체에 제 2로 넘어갑니다. </li></ol> 아민 화학을 사용하여 2. 항체 라벨링 <ol><li> 복합체 항체 <ol><li> 구슬에 아민 결합 버퍼의 100 μl를 추가합니다. </li><li> 색소 1.0 mg의 디메틸 설폭 사이드 (DMSO) 100 μL를 첨가하여 10 ㎎ / ㎖의 아민 반응성 형광 염료 (AlexaFluor 532-SE)를 녹인다. 텍싱에 의해 섞는다. 그냥 사용하기 전에이 솔루션을합니다. </li><li> 항체의 100 μg의에 대한 아민 반응성 염료의 2.5 μl를 추가합니다. 참고 : 일반적으로 반응성 염료의 5 ~ 20 몰 과량을 권장합니다. 그러나, 반응성 염료의 양이 반응이 경험적으로 항체 비율과 고유 항체 속성에 원하는 염료에 따라 최적화 할 필요가에 추가. </li><li> 볼텍스 믹서 엔드 오버 엔드 믹서로 실온에서 60 분 동안 샘플을 섞는다. 구슬이 suspensio에 남아 있는지 확인엔. </li><li> 10 초 동안 자기 스탠드에 튜브를 놓고 뜨는을 제거합니다. </li><li> 항체 결합 / 세척 버퍼의 250 μl를 추가하고 혼합한다. 10 초 동안 자기 스탠드에 배치합니다. 제거하고 결합 / 세척 버퍼를 폐기합니다. 이 세척의 총에 대해이 단계를 반복합니다. </li></ol></li><li> 항체 복구 <ol><li> 구슬로 용출 버퍼의 50 μl를 추가합니다. </li><li> 볼텍스 믹서 엔드 오버 엔드 혼합기를 사용하여 RT에서 5 분 동안 혼합한다. 구슬이 서스펜션에 남아 있는지 확인합니다. </li><li> 10 초 동안 자기 스탠드에 튜브를 놓습니다. 중화 버퍼의 5 μl를 포함하는 새로운 마이크로 원심 분리기 튜브에 용출 샘플 및 전송을 제거합니다. </li><li> 프로세스를 한 번 더 반복 용출 샘플을 풀. </li><li> 항체 농도 정량 염료 투 항체 비율 섹션 4에 기술 된 바와 같이. </li></ol></li></ol> 티올 화학을 사용하여 3. 항체 라벨링 <ol><li> 항체 감소 <ol><li> 250 μl를 추가티올 결합 버퍼와 혼합. 10 초 동안 자기 스탠드에 튜브를 놓습니다. 제거하고 버퍼를 폐기합니다. 두 번이 단계를 반복합니다. </li><li> 티올 결합 버퍼의 100 μl를 추가합니다. </li><li> 2.5 mM의 최종 농도로 디티 오 트레이 톨 (DTT)를 추가한다. </li><li> 볼텍스 믹서 엔드 오버 엔드 믹서로 실온에서 60 분 동안 샘플을 섞는다. 구슬이 서스펜션에 남아 있는지 확인합니다. </li><li> 10 초 동안 자기 스탠드에 튜브를 삽입하고 버퍼를 폐기합니다. </li><li> 티올 결합 버퍼의 250 μl를 추가하고 혼합한다. 10 초 동안 자기 스탠드에 튜브를 놓습니다. 제거하고 버퍼를 폐기합니다. 이 세척의 총에 대해이 단계를 반복합니다. </li><li> 티올 결합 버퍼의 100 μl를 추가합니다. </li></ol></li><li> 복합체 항체 <ol><li> 색소 1.0 mg의 DMSO 100 ㎕를 첨가하여 / ㎖에서 10 mg의 티올 - 반응성 염료를 녹인다. 텍싱에 의해 섞는다. 그냥 사용하기 전에이 솔루션을합니다. </li><li> 안티의 100 μg의에 대한 티올 - 반응성 염료의 2.5 μl를 추가신체. 참고 : 일반적으로 반응성 염료의 5 ~ 20 몰 과량을 권장합니다. 그러나, 반응성 염료의 양이 반응이 경험적으로 항체 비율과 고유 항체 속성에 원하는 염료에 따라 최적화 할 필요가에 추가. </li><li> 볼텍스 믹서 엔드 오버 엔드 믹서로 실온에서 60 분 동안 샘플을 섞는다. 구슬이 서스펜션에 남아 있는지 확인합니다. </li><li> 10 초 동안 자기 스탠드에 튜브를 삽입하고 상층 액을 제거합니다. </li><li> 티올 결합 버퍼의 250 μl를 추가하고 혼합한다. 10 초 동안 자기 스탠드에 놓고 버퍼를 제거합니다. 이 세척의 총에 대해이 단계를 반복합니다. </li></ol></li><li> 용출 항체 <ol><li> 구슬로 용출 버퍼의 50 μl를 추가합니다. </li><li> 볼텍스 믹서 엔드 오버 엔드 혼합기를 사용하여 RT에서 5 분 동안 혼합한다. 구슬이 서스펜션에 남아 있는지 확인합니다. </li><li> 10 초 동안 자기 스탠드에 튜브를 놓습니다. neut의 5 μl를 포함하는 새로운 마이크로 원심 분리기 튜브에 용출 샘플 및 전송을 제거ralization 버퍼입니다. </li><li> 프로세스를 한 번 더 반복 용출 샘플을 풀. </li><li> 항체 농도 정량 염료 투 항체 비율 섹션 4에 기술 된 바와 같이. </li></ol></li></ol> 4. 계산 염료로 항체 비율 <ol><li> 파장 280nm (A280)에서 상기 염료 (AMAX)에 λmax에서 항체 - 염료 접합체의 흡광도를 측정한다. </li><li> 항체 농도를 계산한다 : 항체 농도 (㎎ / ㎖) A280 = - (CF × 최대) / 1.4 여기서 CF (제조업체에서 제공) 염료 = 보정 계수. </li><li> 염료에 대한 항체의 비율을 계산한다 : 염료 - 투 - 항체 비율 (DAR) = (15 × 최대) / Ab의 농도 (㎎ / ㎖) × ε 염료 여기서, ε = 염료의 흡광의 흡광도 최대 염료의 계수 및 항체의 분자량 = 150,000 다. </li></ol>

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Authors are employees of Promega Corporation.

이 연구의 목적은 작은 분자의 다양한 낮은 농도에서 세포 배지에서 본 발명의 항체를 라벨 할 수있는 방법을 개발 하였다. 항체 탐색의 초기 단계에서 항체의 다수를 허용 이러한 방법은 작은 분자 표지 및 생물학적 관련성 분석을 이용하여 선별한다. 그러한 분석은 국제화도 유사한 결합 친 화성을 가진 항체 사이에 다를 수 있습니다 수용체 매개 항체 내재화 분석이다. 따라서, 기존의 효소 결합 면역 분석 (ELISA)을 기반으로 검사 이외에 자신의 국제화 특성에 대해 구체적으로 항체를 선별하는 것이 중요하다. 초기 항체 개발 단계에서 항체 레이블을 할 수있는 방법에 대한 주요 요구 사항은 다음과 같습니다 직접 세포 미디어에서 항체 레이블을 할 수있는) 능력; b)는 세포 미디어 항체 농도가 50 ㎍ / ㎖의 경우 예를 들어, 낮은 농도로 존재하는 항체 레이블을 할 수있는 능력; 기음)표지 항체 및 항체 농도의 순도는 다운 스트림 응용 프로그램과 호환되어야합니다; d) 상기 방법은 아민 및 티올 계 화학 결합과 호환되어야한다 e) 상기 방법은 동시에 다수의 샘플들을 처리와 호환되어야한다. 이러한 요구를 고려하면 대용량 자기 단백질 A와 단백질 G 비드를 사용하여 비드상의 항체 표지 및 정제 방법을 개발 하였다. 도 2에 도시 된 바와 같이, 이러한 비드 낮은 비 특이 적 결합 특성을 갖는 친수성 셀룰로오스 기반으로 고순도의 항체 제조에 결과이다. 비드의 고용량 비즈 소량 효율적 미디어 항체 캔 항체를 포착 할 수 있다는 것을 의미 따라서 항체를 집중하고 작은 볼륨에서 용출 될 수있다. 표 1에서, 10 μL 비드 1.0 ml의 시료로부터 항체 (예상 농도가 50 내지 100 μg의 / ㎖)을 캡처하는 데 사용 된 정착D 표지 항체 200-500 μg의 / ㎖ 사이 농도에서 120 ㎕의 부피로 용출 하였다. 이 농도는 일반적으로 항체 농도가 1.0 ㎍ / ㎖의 10 NG / ㎖ (15, 16)의 범위 셀 기반 국제화 실험과 호환됩니다. 온 - 비드 표식 방법은 아민 및 티올 화학 및 표지 항체 (표 1)의 효율적인 복구를 함께 달성 할 수있는 염료에 대한 항체 비율의 넓은 범위 모두와 호환 가능하다. 실험을 삼중으로 수행하고, 최대 12 개의 시료는 상당히 처리 시간을 단축 직접 병렬로 처리 하였다. 라벨의 처리량은 상기 자성 비드는 19, 22을 사용하여 다른 애플리케이션에 도시 된 바와 같이 로봇 플랫폼을 사용함으로써 증가 될 수있다. 높은 항체 량 시료는 쉽게 복구 항체 및 표지 efficie을 유지하면서 포착 사용 비드의 양을 증가시켜 수용 될 수있다ncy (표 2). 다양한 염료 항체 접합체가 제조 될 수 있다는 것은 염료에 대한 항체의 비율을 최적화 할 필요가 있도록 상기 방법은 또한 다수의 염료와 호환된다. 2-4 항체 비율 염료 11,12 최적 인 것으로 측정 된 ADC를 승인하는 경우에 항체 당 약 3.5의 평균은 23보고되었다. 비드에 접합 화학, 그것은 하류 애플리케이션의 요구 사항에 따라 항체 당 소분자의 최적 수는 조정 비교적 용이하다. 또한, 표지 용 티올 아민 화학 모두는 항원 수용체 결합 것으로, 생체 내에서 안정성을 도시 된 바와 같이 ADC에서 중요한 가장 궁합 옵션을 결정하기 위해 테스트 될 수 있고, 항체의 치료 적 활성은 공액 화학 (24)에 따라 25. 좋은 항체 라벨 및 복구를 달성하기 위해 몇 가지 주요 요소가 있습니다. 소분자 A의 속성항체 비율 항체 복구 및 염료 모두에 필요한 드라이버 재. 작은 소수성 분자, 항체의 비율이 높은 염료 비특이적 비드로 표지 된 항체를 부착하고 상당히 감소 된 항체 복구를 야기한다. 때때로, 염료 및 항체 특성에 따라, 우리는 하나의 구슬이 때문에 다른 것보다 더 잘 작동 할 수 있음을 발견, 최적화 동안 모두 구슬의 테스트는 유용 할 수있다. 단백질 A와 단백질 G는 다른 종의 항체에 대한 적절한 구슬을 선택할 때 고려해야 할 다른 아형, 다른 친 화성 (21)이있다. 예를 들어, 단백질 A는 ​​따라서 단백질 G 비즈 강력하게 권장 마우스의 IgG1 낮은 친 화성을 가지고있다. 티올 화학의 경​​우, DTT 및 TCEP 환원제는 동일하게 작동합니다. DTT하지만 그에 완전히 세척에 의해 제거되어야하는 말레이 미드의 반응을 방해한다. 2.7의 낮은 pH를 용출하는 것이 좋습니다,하지만 2.2의 낮은 pH는 효율적인 녹화 필요할 수 있습니다어떤 경우에는 overy. 낮은 pH에서 변성 수 있습니다 표지 항체 효율적인 복구 및 항체의 기능 사이의 균형은 경험적으로 결정되어야 할 것이다. 또한 화학 표지, 항체 - 항원의 결합 활성 11,23 영향을 미칠 수있는 것으로 알려져있다, 그러므로, 원하는 응용 프로그램을 사용하여 하류 라벨링 후 항체의 기능을 테스트하기 위해 절대적으로 필요하다. 요약하면, 우리는 사전 정제 단계없이 셀 미디어에서 직접 형광 염료와 항체 레이블을하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 고용량 자기 단백질 A와 단백질 G 비드를 활용하고 높은 농도 (10, 11)에서 고순도의 항체를 필요로하는 용액 기반 표식 방법에 비해 상당한 개선이다. 자성 비드의 사용은 비 - 자성 비드 기반 분류 기술 (17, 18) 위에 이점이다 설명서뿐만 아니라 자동 샘플 취급을 가능하게한다. 고용량 BEA의 마지막 사용DS는 구슬의 소량을 사용하여 마이크로 그램의 수백 낮은 마이크로 그램 수준에서 항체 표지 반응의 스케일 업을 허용하고 다른 자기 비드 기반 표시 방법 (19)에서이 방법을 구별합니다. 여기에 제시된 프로토콜은 형광 염료로 표지 항체를 설명하지만,이 방법은 바이오틴, 세포 독성 약물 및 가능한 효소를 포함하는 다른 라벨로 확장 될 수있다.

작은 분자로 표지 된 항체는 아마도 생물학 1,2-에서 가장 일반적으로 사용되는 시약이다. 형광 염료 및 비오틴 표지 항체는 광범위하게 다른 응용 프로그램 3-6 사이, 세포 계측법 서쪽 오 점, 그리고 면역 흐름, 이미징, 면역에 사용됩니다. 방사성 표지 항체는 3,7 암의 치료를위한 새로운 옵션을 제공하고, 2 개의 ADC를 이미 치료 사용 (8) 승인 된 이미징 및 치료, 세포 독성 약물 (ADC)는 표지 항체에 광범위하게 사용을 찾을 수 있습니다. 자신의 광범위한 사용에도 불구하고, 라벨 항체의 방법은 놀라 울 정도로 변화가 없었다 일반적으로 여러 반응을 포함하고 탈염는 9 ~ 12 단계를했다. 해결 방법은 단 몇 항체가 표시 될 필요가 높은 농도로 고도로 정제 된 형태로 사용할 수있는 경우에 충분한 볼륨에서 매우 잘 작동합니다. 그러나 ADC를 같은 새로운 애플리케이션을 위해 존재하는그들은 예를 들어, 수용체 매개 항체 내재화 13-16에 대한 생물학적 관련 특성에 대한 검사를 할 수 있도록 초기 하이 브리 도마 단계에서 항체 레이블을해야합니다. 하이 브리 도마 단계에서 샘플 볼륨 항체는 낮은 농도로 발현되고 샘플들의 수는 이에 기반 솔루션 라벨링 방법이 적합하지 않다, 큰되어 제한된다. 단순화 전통적인 항체 라벨링 방법의 처리율을 향상시키기 위해 몇 가지 다른 방식은 17, 18을 제안되어있다. 하나의 방법은 표지 및 표지 반응 및 정제 된 단백질의 용출에 이어 항체를 캡처하는 비자 성 단백질을 작은 열 충전 한 화성 비드를 사용하는 것이다. 이 방법은 세포 배지로부터 직접 항체 라벨을 사용할 수 있지만, 컬럼의 사용은 힘든 일 수있다. 자기 비드 기반 방법은 최근 컬럼의 사용을 제거하고 처리량 그러나 때문에 개선이 19보고 된 바있다구슬의 능력을 결합 제한 항체, 항체의 낮은 마이크로 그램 수량 만 나노 그램이 표시 될 수 있습니다. 우리는 최근에 개발 된 고용량에게 자기 단백질 A와 단백질 G 비즈 (&gt; 인간 IgG / 정착 구슬 ml의 20 mg)을 작은 분자 (20)와 세포 미디어에 존재하는 항체 레이블을 사용합니다. 비드의 고용량은 항체의 마이크로 그램의 수십 내지 수백 편리한 라벨되도록 비드의 신속한 자기 응답 병렬 샘플들의 다수의 취급 및 처리를 단순화한다. 작은 분자에 대한 대용으로 형광 염료를 사용하여, 우리는 방법은 아민과 티올 라벨 화학와 호환되며 라벨이 매우 순수 항체의 높은 회수율을 제공하고 있음을 보여준다. 이 프로토콜 및 첨부 영상 자기 단백질 A와 단백질 G 비드를 이용하여 세포 배지에 존재하는 마우스 항체에 비드 레이블링을 설명한다. 이 프로토콜은네 개의 섹션으로 나누어 : 1 절은 생물학적 시료에서 비드에 항체의 캡처를 설명합니다. 캡쳐 후에, 화학 제를 사용하여, 아민 또는 티올 화학 제를 사용하여 형광 색소와 항체의 표지는 각각 2 항과 제 3 항에 기재되어있다. 마지막으로, (4) 항체 농도의 계산 및 항체 비 염색하는 방법을 설명한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="592">
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Magne Protein A Beads</td>
			<td style="width:103px;">Promega Corporation</td>
			<td style="width:119px;">&#160;G8781</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Magne Protein G Beads</td>
			<td style="width:103px;">Promega Corporation&#160;</td>
			<td style="width:119px;">&#160;G7471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">AlexaFluor 532-SE (Succinimidyl Ester)</td>
			<td style="width:103px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A20001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">AlexaFluor 532-ME (Malemide)</td>
			<td style="width:103px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A10255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">AlexaFluor 647-ME (Maleimide)</td>
			<td style="width:103px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A20347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Fluorescein-ME (Maleimide)</td>
			<td style="width:103px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">F-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Magnetic Stand</td>
			<td style="width:103px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">Z5332</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

antibody labeling with fluorescent dyes using magnetic protein a and protein g beads

형광 염료, 세포 독성 약물, 방사성 추적자 같은 작은 분자 표지 항체는 필수적인 생물 의학 연구 도구, immunodiagnostics 그리고 최근과 같은 치료제이다. 작은 분자 표지 항체에 대한 전통적인 방법은 상대적으로 높은 농도로 항체를 정제 여러 투석 단계를 포함하고 처리량을 제한 필요합니다. 그러나, 항체 약물 결합체 (ADC)는 분야를 포함한 여러 응용 프로그램은, 세포 미디어에서 직접 항체의 라벨을 허용하는 새로운 방법에서 도움이됩니다. 이러한 방법은 항체, 예를 들어, 생물학적 관련 분석법에서 선별 할 수 있으며, ADC는 경우의 수용체 - 매개 된 항체 내재화 분석. 여기서는 직접 세포 배지에서 항체의 적은 양의 표지를 가능하게하는 방법 (온 비드 법)을 설명한다. 이 방법은 항체를 캡처하는 고용량 자기 단백질 A와 단백질 G 친 화성 구슬을 이용아민 또는 티올 화학 표지 된 항체의 후속 용출을 사용하여 작은 분자로 표지 하였다 셀 매체. 작은 분자에 대한 대용으로 형광 염료를 복용, 우리는 직접 아민과 티올 라벨 화학을 모두 사용하여 셀 미디어에서 세 가지 다른 마우스 항체의 온 - 비드 라벨을 보여줍니다. 단백질 A와 단백질 G 항체의 높은 결합 친화도가 높은 회수율뿐만 아니라 표지 된 항체의 순도를 보장한다. 또한, 자성 비드를 사용하여 여러 샘플 크게 라벨링 스루풋을 향상 수동으로 취급 될 수있다.

고용량 자기 단백질 A와 단백질 G 비드를 사용하는 작은 분자로 항체를 라벨링하는 개략도는도 1에 도시되어있다. 항체 라벨 아민 화학 제를 사용하여, 예컨대, 형광 염료, G 비드 작은 분자로 표지 될 수있는 자기 단백질 캡처 리신 아미노산 또는 항체의 힌지 영역에서 환원 된 티올로 라벨 티올 화학 제를 사용하여 일차 아민. 항체 및 단백질 G 사이의 선호도 라벨 반응 중 항체의 손실을 최소화 21 결과 강하다. 간단한 정제를 비교할 때 이는 형광 염료로 표지 한 후 세 가지 마우스 항체 이소 타입 (표 1)의 효율적인 복구 (50-90%)에 반영된다. (19 이전에보고 된 것과 유사) 효율적인 복구가 쿠마 젤도 알 수있다 (그림 2) 밴드 intensi정제 된 항체의 중쇄 및 경쇄의 관계 및 표지 항체는 쿠마 겔 (도 2)에서와 같이 자기 단백질 G 비드 고순도 항체 결과 낮은 비 - 특이 적 결합 특성을 갖는다. 표 1에보고 된 결과를 반영하고 두 중쇄 및 경쇄는 찬란 (그림 2) 레이블이 표시됩니다. 온 - 비드 라벨은 자기 단백질 A 구슬에서 수행 항체 비율 (표 2) 높은 회복과 좋은 염료의 결과로 여러 형광 염료와 호환 할 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54545/54545fig1.jpg" /> 형광 분자와 항체의 온 - 비드 표지 그림 1. 도식. (A) 항체 라벨링 티올 화학 제를 사용하여. 항체는 고용량 자기 단백질 A 또는 자기 단백질 G B의 캡처EADS는 DTT 또는 트리스 (2- 카르복시 에틸) 포스 핀 (TCEP)와 같은 환원제를 이용하여 사슬 간 이황화 결합의 환원 하였다. 형광 염료를 포함하는 티올 반응 말레이 미드 라벨 ​​항체에 추가됩니다. 표지 된 항체는 낮은 pH 용출에 의해 회수하고 즉시 중화된다. (B) 항체 라벨링 아민 화학 제를 사용하여. 고용량 자기 단백질 A와 단백질 G 비즈에 촬영 된 항체는 라이신의 주 아민에 항체를 라벨 아민 반응성 형광 염료와 반응한다. 레이블이 항체는 낮은 pH 용출에 의해 용출 즉시 중화된다. 나스, N. 등. (20)에서 적응하는 것은 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54545/54545fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54545/54545fig2.jpg" /> 그림 2. 변성 S세 마우스 IgG의 DS-PAGE 겔의 이미지가 비드 방법을 사용하여 정제 AlexaFluor 532 표지 동형. (A) 아민 반응물 (B) 티올 반응. 티올 - 반응성 염료로 표지 항체의 젤 이미지. 레인 1-6은 표 1에 도시 된 샘플에 대응한다. 젤 먼저 형광 스캐너를 이용하여 이미징 만 AlexaFluor 532 표식 항체 중쇄 및 경쇄를 표시 하였다. 항체는 정제 된 샘플은 표시되지 않습니다. 젤이어​​서 표지 된 항체뿐 아니라 정제 된 항체의 중쇄 및 경쇄를 표시 쿠마시 염색으로 염색 하였다. 나스, N. 등. (20)에서 적응하는 것은 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54545/54545fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td&gt; <td></td><td colspan="2"> 아민 반응 </td><td colspan="2"> 티올 반응 </td></tr><tr><td> 잘 </td><td> 이소 </td><td></td><td> 항체 복구 (μg의) </td><td> 항체 비율로 염료 </td><td> 항체 복구 (μg의) </td><td> 항체 비율로 염료 </td></tr><tr><td> 1 </td><td rowspan="2"> 마우스의 IgG1 </td><td> 정화 </td><td> 54.8 ± 1.8 </td><td> 0 </td><td> 49.2 ± 2.0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 이 </td><td> 활용 </td><td> 27.4 ± 3.2 </td><td> 4.2 ± 0.2 </td><td> 46.​​2 ± 3.5 </td><td> 1.6 ± 0.2 </td></tr><tr><td> 삼 </td><td rowspan="2"> 마우스 IgG2a의 </td><td> 정화 </td><td> 85.9 ± 6.4 </td><td> 0 </td><td> 75.3 ± 8.0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> ConjugATION </td><td> 60.7 ± 3.2 </td><td> 4.4 ± 0.1 </td><td> 61.5 ± 7.4 </td><td> 5.5 ± 0.4 </td></tr><tr><td> (5) </td><td rowspan="2"> 마우스의 IgG2b </td><td> 정화 </td><td> 79.9 ± 6.9 </td><td> 0 </td><td> 73.3 ± 1.4 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 활용 </td><td> 66.7 ± 0.5 </td><td> 5.6 ± 0.1 </td><td> 55.7 ± 0.9 </td><td> 5.2 ± 0.5 </td></tr></tbody></table> 표 1 :. 아민 및 티올 화학 물질을 사용하여 직접 세포 미디어에서 세 마우스 IgG 이소 타입의 온 - 비드 라벨 각 샘플의 경우, 1.0 ml의 세포 배지의 분취 한 단지 아민 반응성 AlexaFluor 532 염료에 비드 표지에 사용 된 자기 단백질 G 비드 (50 μL 슬러리) 및 제 분취 액을 사용하여 항체를 정제 하였다. 두 경우 항체 회수율을 산출 하였다 (본문에 설명 된)을표지 반응 동안 항체의 손실을 결정하기 위해 비교 거라고. 항체 비율 염료는 세 항체에 대해 계산 하였다. 모든 반응은 3 중으로 수행 하였다. 나스, N. 등에서 적응. (20) <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="2"> 자기 단백질 G 비즈 </td><td colspan="2"> 자기 단백질 A 구슬 </td></tr><tr><td></td><td></td><td> 항체 복구 (μg의) </td><td> 항체 비율로 염료 </td><td> 항체 복구 (μg의) </td><td> 항체 비율로 염료 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 정화 </td><td> 263.7 ± 10.4 </td><td> 0 </td><td> 269​​.4 ± 5​​.1 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 이 </td><td> AlexaFluor532 </td><td> 182.9 ± 15.3 </td><td> 5.377; 0.04 </td><td> 189.1 ± 6.9 </td><td> 6.9 ± 0.2 </td></tr><tr><td> 삼 </td><td> AlexaFluor647 </td><td> 192.5 ± 2.9 </td><td> 3.3 ± 0.1 </td><td> 112.3 ± 11.4 </td><td> 3.6 ± 0.2 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 형광 </td><td> 179.5 ± 5.3 </td><td> 6.8 ± 0.1 </td><td> 201.5 ± 6.5 </td><td> 6.8 ± 0.1 </td></tr></tbody></table> 표 2. 세 가지 티올 - 반응성 형광 염료와 마우스의 IgG2a의 온 비드 레이블링 집중된 셀 미디어 샘플 그 방법을 보여주기 위해 본 실험에 사용 된 항체는 다른 양을 채용 할 수있다. 또한, 컨쥬 게이션 반응은 자기 단백질 G뿐만 아니라 자기 단백질 G 비드 (100 μL 슬러리)를 사용하는 항체의 정제에 사용 된 세포 배지 농축 1.0 ㎖가 자기 단백질 A. 하나의 분취 액을 사용하여 수행 하였다. 세 가지 다른 1.0 ML의 나누어지는들 표지 및 티올 반응성 AlexaFluor 532, AlexaFluor 647 및 형광으로 정제 하였다. (텍스트에 설명 된대로) 및 각종 라벨 반응에 비해 항체 복구는 계산 하였다. 항체 비율 염료는 세 형광 염료에 대해 계산 하였다. 유사 정제 및 표시 자성 단백질 A 비드를 사용하여 수행 하였다. 모든 반응은 3 중으로 수행 하였다. 나스, N. 등에서 적응. &#39;(20) <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 완충기 </td><td> 댓글 / 설명 </td></tr><tr><td> 아민 결합 완충액 (10mM의 중탄산 나트륨 완충액, pH를 8.5) </td><td> 1. 0.084 g 중탄산 나트륨 2. 증류수에 녹인다. pH를 8.5로 조정합니다. 3. 탈 이온수 100 ㎖에 최종 볼륨을 조정합니다. </td></tr><tr><td> 티올 활용 버퍼 (1 mM의 EDTA, pH가 7과 10 mM의 인산 버퍼입니다.0) </td><td> 1. 0.0378 g 인산 나트륨, 일 염기성, 수화물 2. 0.195 g ​​인산 나트륨, 이염, 수화물 3. 증류수에 녹인다. 4. 1.0 mM의 최종 농도로 EDTA를 추가한다. 5. pH 7로 조정합니다. 6. 탈 이온수 100 ㎖에 최종 볼륨을 조정합니다. </td></tr><tr><td> 항체 결합 / 세척 완충액 (10 mM의 인산 완충액, pH를 7.0) </td><td> 1. 0.0378 g 인산 나트륨, 일 염기성, 수화물 2. 0.195 g ​​인산 나트륨, 이염, 수화물 3. 증류수에 녹인다. pH 7로 조정합니다. 4. 탈 이온수 100 ㎖에 최종 볼륨을 조정합니다. </td></tr><tr><td> 용출 완충액 (50 mM의 글리신 완충액, pH를 2.7) </td><td> 1. 0.188 g 글리신 2. 증류수에 녹인다. HCl로 2.7 산도를 조정합니다. 3. 탈 물 50 ㎖에 최종 볼륨을 조정합니다. </td></tr><tr><td> 중화 버퍼 (2 M 트리스 버퍼, 산도 7.5) </td><td> 1. 0.472 g후, Trizma베이스 2. 2.54 g의 후, Trizma 염산염 3. 증류수에 녹인다. pH를 7.5로 조정합니다. 4. 탈 이온수 10 ml의에 최종 볼륨을 조정합니다. </td></tr></tbody></table> 표 3 : 버퍼 조성물에 관한 것이다.

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Antibody Labeling with Fluorescent Dyes Using Magnetic Protein A and Protein G Beads

작은 분자와 항체를 라벨에 대한 온 - 비드 방법은 직접 세포 미디어에서 항체의 소량의 라벨 수 있습니다. 이 방법은 아민 및 티올 화학과 호환 가능하며, 병렬로 다수의 시료를 수동 또는 자동 플랫폼을 사용하여 처리 할 수​​있다.

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Specific Marking of HIV-1 Positive Cells using a Rev-dependent Lentiviral Vector Expressing the Green Fluorescent Protein

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, the LTR is also responsive to cellular activation states and to the local chromatin activity where the integration has occurred. This can result in high HIV-independent activity, and has restricted the usefulness of LTR-based reporter to mark HIV positive cells 1,2,3. Here, we constructed an expression lentiviral vector that possesses, in addition to the Tat-responsive LTR, numerous HIV DNA sequences that include the Rev-response element and HIV splicing sites 4,5,6. The vector was incorporated into a lentiviral reporter virus, permitting highly specific detection of replicating HIV in living cell populations. The activity of the vector was measured by expression of the green fluorescence protein (GFP). The application of this vector as reported here offers a novel alternative approach to existing methods, such as in situ PCR or HIV antigen staining, to identify HIV-positive cells. The vector can also express therapeutic genes for basic or clinical experimentation to target HIV-positive cells.

We have developed a lentiviral vector that possesses, in addition to the Tat-responsive LTR, the Rev-response element (RRE) that can regulate reporter gene expression in an HIV-1 Tat- and Rev-dependent fashion. The vector permits the specific detection of replicating HIV in living cells via the expression of GFP.

그린 형광 단백질을 표현 레브 종속 Lentiviral 벡터를 사용하여 HIV - 1 양성 세포의 특정 마킹

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, ...

연구

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A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes. The majority of them belong to the superfamily of G protein-coupled receptors (GPCRs). We have focused on characterizing arthropod kinin receptors from the tick and mosquito. Arthropod kinins are multifunctional neuropeptides with myotropic, diuretic, and neurotransmitter function. Here, a method for systematic analyses of structure-activity relationships of insect kinins on two heterologous kinin receptor-expressing systems is described. We provide important information relevant to the development of biostable kinin analogs with the potential to disrupt the diuretic, myotropic, and/or digestive processes in ticks and mosquitoes.
The kinin receptors from the southern cattle tick, Boophilus microplus (Canestrini), and the mosquito Aedes aegypti (Linnaeus), were stably expressed in the mammalian cell line CHO-K1. Functional analyses of these receptors were completed using a calcium bioluminescence plate assay that measures intracellular bioluminescence to determine cytoplasmic calcium levels upon peptide application to these recombinant cells. This method takes advantage of the aequorin protein, a photoprotein isolated from luminescent jellyfish. We transiently transfected the aequorin plasmid (mtAEQ/pcDNA1) in cell lines that stably expressed the kinin receptors. These cells were then treated with the cofactor coelenterazine, which complexes with intracellular aequorin. This bond breaks in the presence of calcium, emitting luminescence levels indicative of the calcium concentration. As the kinin receptor signals through the release of intracellular calcium, the intensity of the signal is related to the potency of the peptide.
This protocol is a synthesis of several previously described protocols with modifications; it presents step-by-step instructions for the stable expression of GPCRs in a mammalian cell line through functional plate assays (Staubly et al., 2002 and Stables et al., 1997). Using this methodology, we were able to establish stable cell lines expressing the mosquito and the tick kinin receptors, compare the potency of three mosquito kinins, identify critical amino acid positions for the ligand-receptor interaction, and perform semi-throughput screening of a peptide library. Because insect kinins are susceptible to fast enzymatic degradation by endogenous peptidases, they are severely limited in use as tools for pest control or endocrinological studies. Therefore, we also tested kinin analogs containing amino isobutyric acid (Aib) to enhance their potency and biostability. This peptidase-resistant analog represents an important lead in the development of biostable insect kinin analogs and may aid in the development of neuropeptide-based arthropod control strategies.

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

This protocol provides instructions for clonal-cell line selection and a calcium bioluminescence assay to analyze the structure-activity relationships of synthesized arthropod neuropeptides on their cognate GPCRs. This assay can be used for receptor deorphanization and structure-activity relationship studies for synthetic analog design and peptide/drug-lead discovery.

모기의 기능 분석을 위해 칼슘 Bioluminescence 분석 ( Aedes aegypti)와 틱 ( Rhipicephalus microplus) G 단백질 결합 수용체

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes.  The ...

Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing

The current prognosis and classification of CRC relies on staging systems that integrate histopathologic and clinical findings. However, in the majority of CRC cases, cell dysfunction is the result of numerous mutations that modify protein expression and post-translational modification1.
A number of cell surface antigens, including cluster of differentiation (CD) antigens, have been identified as potential prognostic or metastatic biomarkers in CRC. These antigens make ideal biomarkers as their expression often changes with tumour progression or interactions with other cell types, such as tumour-infiltrating lymphocytes (TILs) and tumour-associated macrophages (TAMs).
The use of immunohistochemistry (IHC) for cancer sub-classification and prognostication is well established for some tumour types2,3. However, no single &#x2018;marker&#x2019; has shown prognostic significance greater than clinico-pathological staging or gained wide acceptance for use in routine pathology reporting of all CRC cases. 
A more recent approach to prognostic stratification of disease phenotypes relies on surface protein profiles using multiple 'markers'. While expression profiling of tumours using proteomic techniques such as iTRAQ is a powerful tool for the discovery of biomarkers4, it is not optimal for routine use in diagnostic laboratories and cannot distinguish different cell types in a mixed population. In addition, large amounts of tumour tissue are required for the profiling of purified plasma membrane glycoproteins by these methods. 
In this video we described a simple method for surface proteome profiling of viable cells from disaggregated CRC samples using a DotScan CRC antibody microarray. The 122-antibody microarray consists of a standard 82-antibody region recognizing a range of lineage-specific leukocyte markers, adhesion molecules, receptors and markers of inflammation and immune response5, together with a satellite region for detection of 40 potentially prognostic markers for CRC. Cells are captured only on antibodies for which they express the corresponding antigen. The cell density per dot, determined by optical scanning, reflects the proportion of cells expressing that antigen, the level of expression of the antigen and affinity of the antibody6. 
For CRC tissue or normal intestinal mucosa, optical scans reflect the immunophenotype of mixed populations of cells. Fluorescence multiplexing can then be used to profile selected sub-populations of cells of interest captured on the array. For example, Alexa 647-anti-epithelial cell adhesion molecule (EpCAM; CD326), is a pan-epithelial differentiation antigen that was used to detect CRC cells and also epithelial cells of normal intestinal mucosa, while Phycoerythrin-anti-CD3, was used to detect infiltrating T-cells7. The DotScan CRC microarray should be the prototype for a diagnostic alternative to the anatomically-based CRC staging system.

We described a procedure for the disaggregation of colorectal cancer (CRC) to produce viable single cells, which are then captured on customized antibody microarrays recognizing surface antigens (DotScan CRC microarray). Sub-populations of cells bound to the microarray can be profiled by fluorescence multiplexing using monoclonal antibodies tagged with fluorescent dyes.

항체 Microarray 및 형광 멀티플렉싱을 사용하여 대장암 세포 표면 단백질 프로파일

The current prognosis and classification of CRC relies on staging systems that integrate histopathologic and clinical findings. However, in the majority ...

Protein Misfolding Cyclic Amplification of Prions

Prions are infectious agents that cause the inevitably fatal transmissible spongiform encephalopathy (TSE) in animals and humans9,18. The prion protein has two distinct isoforms, the non-infectious host-encoded protein (PrPC) and the infectious protein (PrPSc), an abnormally-folded isoform of PrPC 8.
One of the challenges of working with prion agents is the long incubation period prior to the development of clinical signs following host inoculation13. This traditionally mandated long and expensive animal bioassay studies. Furthermore, the biochemical and biophysical properties of PrPSc are poorly characterized due to their unusual conformation and aggregation states.
PrPSc can seed the conversion of PrPC to PrPSc in vitro14. PMCA is an in vitro technique that takes advantage of this ability using sonication and incubation cycles to produce large amounts of PrPSc, at an accelerated rate, from a system containing excess amounts of PrPC and minute amounts of the PrPSc seed19. This technique has proven to effectively recapitulate the species and strain specificity of PrPSc conversion from PrPC, to emulate prion strain interference, and to amplify very low levels of PrPSc from infected tissues, fluids, and environmental samples6,7,16,23 .
This paper details the PMCA protocol, including recommendations for minimizing contamination, generating consistent results, and quantifying those results. We also discuss several PMCA applications, including generation and characterization of infectious prion strains, prion strain interference, and the detection of prions in the environment.

Protein misfolding cyclic amplification (PMCA) is an in vitro assay for the study of prion conversion and strain and species barriers. It can also be used as a prion detection assay.

Prions의 단백질 Misfolding의 순환 증폭

Prions  are infectious agents that cause the inevitably fatal transmissible spongiform  encephalopathy (TSE) in animals and humans9,18. The prion protein ...

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact cellular functions, including energetics and signal transductions. While both fluorescent and electrophysiological methods, including electrode usage and patch-clamping, have been well developed for measuring these events in eukaryotic cells, methodology for measuring similar events in microorganisms have proven more challenging to develop given their small size in combination with the more complex outer surface of bacteria shielding the membrane. During our studies of death-initiation in Streptococcus pneumoniae (pneumococcus), we wanted to elucidate the role of membrane events, including changes in polarity, integrity, and intracellular ion concentrations. Searching the literature, we found that very few studies exist. Other investigators had monitored radioisotope uptake or equilibrium to measure ion fluxes and membrane potential and a limited number of studies, mostly in Gram-negative organisms, had seen some success using carbocyanine or oxonol fluorescent dyes to measure membrane potential, or loading bacteria with cell-permeant acetoxymethyl (AM) ester versions of ion-sensitive fluorescent indicator dyes. We therefore established and optimized protocols for measuring membrane potential, rupture, and ion-transport in the Gram-positive organism S. pneumoniae. We developed protocols using the bis-oxonol dye DiBAC4(3) and the cell-impermeant dye propidium iodide to measure membrane depolarization and rupture, respectively, as well as methods to optimally load the pneumococci with the AM esters of the ratiometric dyes Fura-2, PBFI, and BCECF to detect changes in intracellular concentrations of Ca2+, K+, and H+, respectively, using a fluorescence-detection plate reader. These protocols are the first of their kind for the pneumococcus and the majority of these dyes have not been used in any other bacterial species. Though our protocols have been optimized for S. pneumoniae, we believe these approaches should form an excellent starting-point for similar studies in other bacterial species.

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Unlike that seen for eukaryotes, there is a paucity of studies that detail membrane depolarization and ion concentration changes in bacteria, primarily as their small size makes conventional methods of measurement difficult. Here, we detail protocols for monitoring such events in the significant Gram-positive pathogen Streptococcus pneumoniae utilizing fluorescence techniques.

막 극성, 멤브레인 무결성 및 세포 내 이온 농도의 모니터링 변경<em&gt; 폐렴 구균</em&gt; 형광 염료를 사용

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP&#8211;Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

인플루엔자 A 바이러스의 핵 단백질과 마우스 MX1 단백질의 공동 면역 침전

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Inoculating Anopheles gambiae Mosquitoes with Beads to Induce and Measure the Melanization Immune Response

The stimulation of immune responses is a common tool in invertebrate studies to examine the efficacy and the mechanisms of immunity. This stimulation is based on the injection of non-pathogenic particles into insects, as the particles will be detected by the immune system and will induce the production of immune effectors. We focus here on the stimulation of the melanization response in the mosquito Anopheles gambiae. The melanization response results in the encapsulation of foreign particles and parasites with a dark layer of melanin. To stimulate this response, mosquitoes are inoculated with beads in the thoracic cavity using microcapillary glass tubes. Then, after 24 hr, the mosquitoes are dissected to retrieve the beads. The degree of melanization of the bead is measured using image analysis software. Beads do not have the pathogenic effects of parasites, or their capacity to evade or suppress the immune response. These injections are a way to measure immune efficacy and the impact of immune stimulations on other life history traits, such as fecundity or longevity. It is not exactly the same as directly studying host-parasite interactions, but it is an interesting tool to study immunity and its evolutionary ecology.

Inoculating Anopheles gambiae Mosquitoes with Beads to Induce and Measure the Melanization Immune Response

Through inoculation with beads, the described technique enables the stimulation of the mosquito melanization response in the hemolymph circulating system. The amount of melanin covering the beads can be measured after dissection as a measure of the immune response.

접종<em&gt; 아노 펠 레스 gambiae</emMelanization 면역 반응을 유도하고 측정하는 비즈&gt; 모기

The stimulation of immune responses is a common tool in invertebrate studies to examine the efficacy and the mechanisms of immunity. This stimulation is ...

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP)

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research is deciphering how these dynamic protein complexes act to integrate signals from multiple sources in order to direct a specific biological response, and how this becomes deregulated in many disease settings. Despite the importance of this key biochemical mechanism, there is a lack of experimental techniques that can facilitate the specific and sensitive deconvolution of these multi-molecular signaling complexes.
Here this shortcoming is addressed through the combination of a protein complementation assay with a conformation-specific nanobody, which we have termed Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP). This novel technique facilitates the specific isolation and downstream proteomic characterization of any pair of interacting proteins, to the exclusion of un-complexed individual proteins and complexes formed with competing binding partners. 
The BiCAP technique is adaptable to a wide array of downstream experimental assays, and the high degree of specificity afforded by this technique allows more nuanced investigations into the mechanics of protein complex assembly than is currently possible using standard affinity purification techniques.

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification BiCAP

This manuscript describes the protocol for Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP). This novel method facilitates the specific isolation and downstream proteomic characterization of any two interacting proteins, while excluding un-complexed individual proteins as well as complexes formed with competing binding partners.

해 다중 단백질 신호 복합물 분자 보완성 친 화력 정화 (BiCAP)에 의해

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research ...

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in human sera and in separate preparations of polyclonal intravenous immunoglobulin (IVIg). The protocol describes the methodological steps involved in sample preparation, printing of arrays, assay procedure, and data analysis. In addition, this protocol could be further developed to incorporate diverse clinical samples including plasma and cell culture supernatants. We show how protein microarray can be used to determine a combination of isotype (IgG, IgA, IgM), subclass (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2), and strain-specific antibodies to highly purified whole C. difficile toxins A and B (toxinotype 0, strain VPI 10463, ribotype 087), toxin B from a C. difficile toxin-B-only expressing strain (CCUG 20309), a precursor form of a B fragment of binary toxin, pCDTb, ribotype-specific whole surface layer proteins (SLPs; 001, 002, 027), and control proteins (tetanus toxoid and Candida albicans). During the experiment, microarrays are probed with sera from individuals with C. difficile infection (CDI), individuals with cystic fibrosis (CF) without diarrhea, healthy controls (HC), and from individuals pre- and post-IVIg therapy for the treatment of CDI, combined immunodeficiency disorder, and chronic inflammatory demyelinating polyradiculopathy. We encounter significant differences in toxin neutralization efficacies and multi-isotype specific antibody levels between patient groups, commercial preparations of IVIg, and sera before and following IVIg administration. Also, there is a significant correlation between microarray and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for antitoxin IgG levels in serum samples. These results suggest that microarray could become a promising tool for profiling antibody responses to C.difficile antigens in vaccinated or infected humans. With further refinement of antigen panels and a reduction in production costs, we anticipate that microarray technology may help optimize and select the most clinically useful immunotherapies for C. difficile infection in a patient-specific manner.

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

This article describes a simple protein microarray method for profiling humoral immune responses to a 7-plex panel of highly purified Clostridium difficile antigens in human sera. The protocol can be extended for the determination of specific antibody responses in preparations of polyclonal intravenous immunoglobulin.

항 원 특정 항 체 응답 다음 Clostridium 남과 어울리지 않 는 감염의 혈 청 학적인 결정에 대 한 단백질 Microarray 분석 결과

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in ...

TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks

Proximity labeling (PL) techniques using engineered ascorbate peroxidase (APEX) or Escherichia coli biotin ligase BirA (known as BioID) have been successfully used for identification of protein-protein interactions (PPIs) in mammalian cells. However, requirements of toxic hydrogen peroxide (H2O2) in APEX-based PL, longer incubation time with biotin (16&#8211;24 h), and higher incubation temperature (37 &#176;C) in BioID-based PL severely limit their applications in plants. The recently described TurboID-based PL addresses many limitations of BioID and APEX. TurboID allows rapid proximity labeling of proteins in just 10&#8201;min under room temperature (RT) conditions. Although the utility of TurboID has been demonstrated in animal models, we recently showed that TurboID-based PL performs better in plants compared to BioID for labeling of proteins that are proximal to a protein of interest. Provided here is a step-by-step protocol for the identification of protein interaction partners using the N-terminal Toll/interleukin-1 receptor (TIR) domain of the nucleotide-binding leucine-rich repeat (NLR) protein family as a model. The method describes vector construction, agroinfiltration of protein expression constructs, biotin treatment, protein extraction and desalting, quantification, and enrichment of the biotinylated proteins by affinity purification. The protocol described here can be easily adapted to study other proteins of interest in Nicotiana and other plant species.

Described here is a proximity labeling method for identification of interaction partners of the TIR domain of the NLR immune receptor in Nicotiana benthamiana leaf tissue. Also provided is a detailed protocol for the identification of interactions between other proteins of interest using this technique in Nicotiana and other plant species.

형광 염료와 항체 라벨은 자기 단백질 A와 단백질 G 비즈를 사용하여

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