Adult spinal cord mixed cultures were first developed using rats with grant support from an NIH/NIDA R01 award (PI De Leo) and an NIH T32 training grant (PI Green). These methods were further adapted for mouse spinal cords with support from the following grants: NIH/NIDA 5K01DA023503 (PI Cao), NIH/NINDS 5R21NS066130 (PI Cao), and NIH/NIGMS P20GM103643 (PI Meng). The authors would also like to thank Dr. Alejandro M. S. Mayer, Department of Pharmacology, Chicago College of Osteopathic Medicine, for his technical help in obtaining microglia-rich mixed glial cells.

הפרוטוקול הבא אושר על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדית השתמש (IACUC) באונ&#39; ניו אינגלנד. פרוטוקול להלן להכנת תרבויות גליה מ -4 מיתרי השדרה עכבר בוגר. 1. הכנת פתרונות במנדף תרבות בתנאי aseptic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן תקשורת תרבות: השינוי של Dulbecco המלא של התקשורת של הנשר (cDMEM) המכיל DMEM (עם 4.5 g / גלוקוז L), 10% בסרום שור עובר (FBS), 2 מ&quot;מ L- גלוטמין, 100 פניצילין IU / mL, 100 מ&quot;ג / mL סטרפטומיצין ng, 250 / מ&quot;ל ​​Amphotericin B, ו -50 מיקרומטר 2-mercaptoethanol (2-ME, ראה 1.1.1). מערבבים ולסנן לעקר כל הרכיבים האחרים ולאחר מכן להוסיף FBS. אחסן את התקשורת והתרבות ב 4 מעלות צלסיוס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 50 מ&quot;מ 2-ME / שנאגרו מלוחים פוספט (PBS) פתרון המניות: להוסיף 100 μL של מרוכז 2-ME (14.3 M) לתוך 28.6 מ&quot;ל של PBS 1x, ולסנן לעקר (הפתרון יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלסיוס עבור מספר חודשים). Use 1 מ&quot;ל של 2-ME פתרון המניות לכל 1,000 מ&quot;ל של התקשורת והתרבות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת תקשורת שיפוע הצפיפות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן פתרון תקשורת שיפוע צפיפות איזוטוני מניות (למשל, 100% Percoll) מ 1 חלק 10x PBS סטרילי רגיל ו -9 חלקים בתקשורת שיפוע צפיפות מניית סטרילי (למשל, Percoll). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את תקשורת שיפוע צפיפות 100% (תוצרת 1.2.1) עם PBS סטרילית 1x הרגיל לעשות תקשורת שיפוע צפיפות 20% (למשל, 10 מיליליטר של תקשורת שיפוע צפיפות 100% עם 40 מיליליטר של PBS 1x) ולאחסן אותו ב 4 o C. תביאו את התקשורת שיפוע צפיפות 20% לטמפרטורת החדר (RT) לפני הכנת תרבית תאים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת פתרונות ממערכת דיסוציאציה פפאין הערה: מערכת ניתוק פפאין יכולה להיות מזוהית טבלת החומרים. ערכות דיסוציאציה דומות אחרות (כולל אלה התאספו ללא צורך במיקור חוץ) יכולות לשמש גם. כל components חייב להיות סטרילי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 32 מ&quot;ל של תמיסת מלח מאוזן של ארל (EBSS) לתערובת מעכב ovomucoid (אבקה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל של EBSS אל הבקבוקון פפאין אחד (אבקה). מניחים את הצנצנת פפאין באמבט מים C 37 o במשך 10 דקות או עד פפאין נמס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 500 μL של EBSS כדי בקבוקון DNase אחד (אבקה). מערבבים בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 250 μL של פתרון DNase (לעיל) כדי בקבוקון פפאין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את הסכום הכולל של התערובת פפאין / DNase מעל הצורך (כ 800 μL של תערובת פפאין / DNase לכל כבל העכבר השדרה) ולהעביר את התערובת הדרושה לתוך צינור 50 מ&quot;ל לעיכול רקמת (שלב 3.2). אחסן את שאריות הבקבוקון המקורי ב 4 מעלות צלזיוס למשך שבועיים לפחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את כל רכיבי הערכות על קרח עד צורך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צינורות אוסף חוט השדרה: סטרילי אחד 15 מ&quot;ל צינור עם 5 מ&quot;ל של תמיסת מלח מאוזן של האנק (HBSS; ממערכת דיסוציאציה פפאין,0; לאיסוף מיתרי השדרה) וסטרילי אחד 15 צינור מ&quot;ל עם 1x PBS (למילוי את מזרק 5 מ&quot;ל, ראה שלב 2.4). בנוסף, להכין צלחת פטרי סטרילית אחד (35 מ&quot;מ או 60 מ&quot;מ) עם 5 מ&quot;ל של HBSS ולשמור אותו למכסה המנוע בתרבית. </li></ol> 2. אוסף חוט שדרה הערה: כל הציוד חייב להיות סטרילי. בצע את האוסף באזור מיועד שאושר על ידי IACUC. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג את הכלים הבאים עבור מיתרי השדרה עכבר קציר: ישר חדה / מספריים כירורגיות 18 ס&quot;מ בוטה, אזמל תקן 12 ס&quot;מ (# 3 מוצק), להבים אזמל סטרילי פלדה פחמן 10 #, decapitator חיה קטנה, 12 ס&quot;מ סטנדרטי מעוקל מלקחיים, ומחט 20G סטרילי מצורף מזרק 5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדימו עם CO 2 ולחטא את הראש העכבר באזור הגב עם 70% אתנול (EtOH). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערוף חיה עם decapitator. ביצוע חתך אורכי באמצע על הגב התחתון כדי לחשוף את שכבת השריר. עשהחיתוך רוחב נקי דרך עמודת החוליות ברמת הירך (גם חיתוך דרך שכבת השריר המכסה את העמודה החולייתנים) עם מספרי כירורגיות הישרים סטרילי (18 סנטימטרים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את החיה על גיליון טרי לנגב הפנויה. בזהירות להכניס 20 המחט G (מצורף מזרק 5 מ&quot;ל מלא PBS 1x סטרילי (שלב 1.4)) לתוך עמוד השדרה כלפי הצד מקורי. להחזיק את החיה למטה בחוזקה ודחף את המזרק במהירות. חוט השדרה כולו צריך לצאת מסוף צוואר הרחם. אסוף את חוט השדרה לתוך 15 הצינור מ&quot;ל המכיל HBSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 2.4 עבור שאר העכברים. בין כל חיה, לחטא את כל המכשירים המשמשים עם 70% EtOH. הערה: בדרך כלל, צלחת 12 גם אחת ניתן לקבוע עבור כל 4 עכבר מיתרי השדרה (ראה 4.3). </li></ol> 3. הכנה של תרחיף התא הבודד הערה: בצע את השלבים 3 ו -4 במנדף התרבות לשמור על הכל סטרילי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את כל מיתרי השדרה לתוך צלחת פטרי HBSS המכילים (שלב 1.4). חותכים כל של מיתרי השדרה לתוך חתיכות רבות בסדר, קטן עם מספריים מלקחיים סטרילית. מעבירים את רקמת חוט השדרה אל צינור חרוטי 50 מ&quot;ל המכיל את פפאין מוכן / תערובת אנזים DNase (שלב 1.3.5) באמצעות מלקחיים סטרילית או פיפטה 10 מ&quot;ל (להימנע מהוספת HBSS לתערובת אנזים, כמו זה יהיה עוד יותר לדלל את מוכן פתרון אנזים ועלול לגרום לביצועים ירד של האנזים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס הצינור בעדינות לתערובת. דגירת הצינור ב 37 o צלזיוס במשך שעה 1 ב שייקר אינקובטור / עם רעד מסלולית ב 150 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס הצינור שוב נמרצות triturate הפתרון האנזים עם רקמות בעזרת פיפטה 5 מ&quot;ל לקדם דיסוציאציה נוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ההשעיה התא לתוך צינור צנטריפוגות 15 מ&quot;ל ב 300 XG במשך 5 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך צנטריפוגה, לערבב 2.7 מ&quot;ל EBSS עם 300 μL של Inh אלבומין-ovomucoid מחדשפתרון ibitor (1.3.1) בצינור סטרילי. הוספת 150 μL של פתרון DNase (שלב 1.3.3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות צנטריפוגה, להסיר את supernatant ו resuspend התא גלולה עם פתרון מוכן לעיל (שלב 3.5). וורטקס היטב כדי לשבור את התא גלול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 מ&quot;ל של תמיסת מעכב אלבומין-ovomucoid מחדש (שלב 1.4.1) על השעיית התא. תאים צנטריפוגה ב 70 XG במשך 6 דקות ב RT. הסר את supernatant (המכיל שברי קרום). </li></ol> הסרת .4 בהמשך של המיאלין מן תרחיף התא הבודד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 8 מיליליטר של תקשורת שיפוע צפיפות 20% (מוכנה בשלב 1.2.2) לתוך השפופרת המכילה את התא גלול, מערבולת בעדינות כדי לשבש את הגלולה, צנטריפוגות התאים ב 800 XG במשך 30 דקות ב RT ללא בלימה. מוציאים בזהירות את השכבה העליונה של פסולת (בעיקר המיאלין) ואת supernatant, אבל לשמור על גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר שאריות של שיפוע צפיפות, לשטוף את התאים על ידי resuspending התא גלולה עם 8 מ&quot;ל של cDMEM מדולל (1 חלק cDMEM ו -2 חלקים HBSS). צנטריפוגה התאים ב 400 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלסיוס הסר את supernatant לשטוף את התאים שוב עם מדולל cDMEM (לעיל), באותו אופן. שמור את התאים על קרח עד זריעה אותם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ו resuspend התא גלולה בתקשורת תרבות (cDMEM מסופק עם 2-ME (מוכן בשלב 1.1)). עבור צלחת אחת 12-היטב, השתמש 3 מ&quot;ל x 4 (מספר העכברים בשימוש) + 2 מ&quot;ל = 14 מ&quot;ל התקשורת. פעולה זו תבטיח כי יש השעית תא מספיק עבור הצלחת כולה (12 בארות) ותספק עבור בארות נוספות שיכול לשמש כדי לקבוע את המספר סלולארי הממוצע לכל טוב ותוכן microglial של התרבות. אם סוגים אחרים של כלי התרבות ישמשו, לחשב את הנפח הכולל של תקשורת ותרבות הדרושה באופן יחסי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של ההשעיה תא לבאר כל צלחת 12-היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים ב C 35.9 o עם 5% CO 2. </li><li&gt; שנה את התקשורת (להסיר המדיה הישנה באמצעות שאיפה) על D 1 ולאחר מכן כל 3 - 4 ד ואילך (בדרך כלל לשנות את התקשורת על D: 1, 4, 8, ו -11, ולאחר מכן להשתמש בתאים ביום 12). הערה: ביום 1, התרבות עלולה להכיל כמויות משמעותיות של פסולת בשל המיאלין שאריות רקמת חוט השדרה; וכך, שינוי התקשורת ביום 1 מומלץ (עיין הדיון למידע נוסף). תרבויות מוכנות לטיפול בין D 12 - 14. תאים בדרך כלל הם 80% ומחוברות ב D 12 ויכולים להיות קרוב ל- 100% ומחוברים על ידי D 14. בדרך כלל, על D 12, יש כ 100,000 תאים לכל היטב צלחת 12 גם . </li></ol><img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54801/54801fig4.jpg" /> איור 2:. נציג תמונות של תאי גליה מעורבים בזמנים שונים לאחר הקמת התרבות גליה המעורבת גליה מעורבת חוט השדרה ראשית הוכנה ממבוגר C57Bl / 6 עכברים. נציג תמונותלהציג את ההתקדמות של תרבות גליה לאחר הציפוי. באותו יום 1, תאים מסוימים מצורפים צלחת התרבות, אבל הם עדיין בעיקר סביב. יש גם הרבה תאים צפים ופסולת משמעותית. באותו יום 4, רוב התאים מצורפים צלחת התרבות. תאים להופיע ענפים עם תהליכים גלויים. תאים מופצים באופן ספוראדי ותרבויות הן כ 20-30% ומחוברים בשלב זה. באותו יום 8, תרבויות הן בין 50-60% ומחוברות. באזורים מסוימים של התרבויות כתמים גדולה של תאים. יש תחומים אחרים של תרבויות צמיחה דלילה של תאים. כמה תאים בתוך הטלאים לקחת על מראה &quot;מרובע דמוי&quot;. באותו היום 12, תרבויות הן בבית או מעל 80% ומחוברות (כ -90% ומחוברים בתמונה המוצגת כאן). תא נמצא בשלב היומן של צמיחה בשלב זה ובין ימים 12-14 זה הזמן האופטימלי עבור שימוש בתאי גליה לניסויים. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54801/54801fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג</a>גרסה גדולה יותר של דמות זו. <ol start="7" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את תוכן microglial באמצעות תאי מבארות הנוספות (שלב 4.3) באמצעות מיון תא קרינה המופעלת סטנדרטי (FACS) פרוטוקול מכתים 11 באמצעות השילוב של נוגדנים חד שבטיים אנטי עכבר CD45 ואנטי עכבר CD11b. CD45 + CD11b + תאים מזוהים microglia. </li></ol>

<ol>
	<li>Gaskin, D. J., Richard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+economic+costs+of+pain+in+the+United+States.">The economic costs of pain in the United States.</a> J Pain. 13 (8), 715-724 (2012).</li><li>Ji, R. R., Berta, T., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glia+and+pain:+Is+chronic+pain+a+gliopathy?.">Glia and pain: Is chronic pain a gliopathy?.</a> Pain. 154 (01), S10-S28 (2013).</li><li>Ni, M., Aschner, M., Maines, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+rat+primary+icroglia:+isolation,+culturing+and+selected+applications.">Neonatal rat primary icroglia: isolation, culturing and selected applications.</a> Curr Protoc Toxicol. , (2010).</li><li>Cao, L., Fei, L., Chang, T. T., DeLeo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+interleukin-1beta+by+interleukin-4+in+lipopolysaccharide-treated+mixed+glial+cultures:+microglial-dependent+effects.">Induction of interleukin-1beta by interleukin-4 in lipopolysaccharide-treated mixed glial cultures: microglial-dependent effects.</a> J Neurochem. 102 (2), 408-419 (2007).</li><li>Malon, J. T., Maddula, S., Bell, H., Cao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+calcitonin+gene-related+peptide+and+CCL2+production+in+CD40-mediated+behavioral+hypersensitivity+in+a+model+of+neuropathic+pain.">Involvement of calcitonin gene-related peptide and CCL2 production in CD40-mediated behavioral hypersensitivity in a model of neuropathic pain.</a> Neuron Glia Biol. 7 (2-4), 117-128 (2011).</li><li>Blasi, E., Barluzzi, R., Bocchini, V., Mazzolla, R., Bistoni, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+of+murine+microglial+cells+by+a+v-raf+/+v-myc+carrying+retrovirus.">Immortalization of murine microglial cells by a v-raf / v-myc carrying retrovirus.</a> J Neuroimmunol. 27 (2), 229-237 (1990).</li><li>Bocchini, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immortalized+cell+line+expresses+properties+of+activated+microglial+cells.">An immortalized cell line expresses properties of activated microglial cells.</a> J Neurosci Res. 31 (4), 616-621 (1992).</li><li>Alliot, F. O., Marty, M. C., Cambier, D., Pessac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spontaneously+immortalized+mouse+microglial+cell+line+expressing+CD4.">A spontaneously immortalized mouse microglial cell line expressing CD4.</a> Dev Brain Res. 95 (1), 140-143 (1996).</li><li>Alliot, F. O., Pessac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+cell+clones+derived+from+established+cultures+of+8-day+postnatal+mouse+cerebella.">Astrocytic cell clones derived from established cultures of 8-day postnatal mouse cerebella.</a> Brain Res. 306 (1-2), 283-291 (1984).</li><li>Malon, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+content-dependent+inhibitory+effects+of+calcitonin+gene-related+peptide+(CGRP)+on+murine+retroviral+infection+of+glial+cells.">Microglial content-dependent inhibitory effects of calcitonin gene-related peptide (CGRP) on murine retroviral infection of glial cells.</a> J Neuroimmunol. 279, 64-70 (2015).</li><li>Cao, L., DeLeo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNS+Infiltrating+CD4(+)+T+lymphocytes+Contribute+to+Murine+Spinal+Nerve+Transection-Induced+Neuropathic+Pain.">CNS Infiltrating CD4(+) T lymphocytes Contribute to Murine Spinal Nerve Transection-Induced Neuropathic Pain.</a> Eur J Immunol. 38 (2), 448-458 (2008).</li><li>Mayer, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+a+short-term+in+vitro+exposure+to+the+marine+toxin+domoic+acid+on+viability,+tumor+necrosis+factor-alpha,+matrix+metalloproteinase-9+and+superoxide+anion+release+by+rat+neonatal+microglia.">Effect of a short-term in vitro exposure to the marine toxin domoic acid on viability, tumor necrosis factor-alpha, matrix metalloproteinase-9 and superoxide anion release by rat neonatal microglia.</a> BMC Pharmacol. 1, 7 (2001).</li><li>Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+the+distribution+and+morphology+of+microglia+in+the+normal+adult+mouse+brain.">Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain.</a> Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).</li><li>Rock, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Microglia+in+Central+Nervous+System+Infections.">Role of Microglia in Central Nervous System Infections.</a> Clin Microbiol Rev. 17 (4), 942-964 (2004).</li><li>Yang, I., Han, S. J., Kaur, G., Crane, C., Parsa, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Microglia+in+Central+Nervous+System+Immunity+and+Glioma+Immunology.">The Role of Microglia in Central Nervous System Immunity and Glioma Immunology.</a> J Clin Neurosci. 17 (1), 6-10 (2010).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

זה קריטי כדי לבצע את כל השלבים, כולל בתקשורת שינוי לוח זמנים-באופן עקבי על מנת לקבל תוצאות לשחזור בין ניסויים. השלבים הבאים הם קריטיים במיוחד בהשגת גליה מעורבת מבוגרים באיכות מעולה. עיכול אנזימטי הוא היבט חשוב של פרוטוקול זה. זה ח?...

כאב כרוני הוא בעיה בריאותית חמורה המשפיעה על כ -100 מיליון מבוגרים בארצות הברית, עם עלות שנתית משוערת של עד 635 מיליארדים $ 1. ראיות מצטבר ציינו תרומה משמעותית של תאי גלייה בחוט שדרה בפיתוח בכאב עצבי, אחד המיני ההרסני ביותר של כאב כרוני 2. מערכת תרבות ראויה במבחנה תעזור משמעותית נוספים חוקרים את התפקידים של ותאי גלייה ברמות התאיות ומולקולריות. נכון לעכשיו, מערכות התרבות גליה במבחנה מנוצלות על ידי חוקרים כוללות בעיקר תאי גלייה נגזרו רקמות קליפת מוח של מוח עכבר או עכברוש בילוד והנציחו שורות תאי גליה הנגזרות עכבר בילוד או להלשין ותאי גלייה עיקריים. תאים עובריים מכילים כמויות משמעותיות של תאים שלא עברו התמיינות אשר ניתן להבדיל נוספת לתאי גליה (בעיקר האסטרוציטים ו microglia), ובכך לספקתאי bundant לשימוש 3 ניסיוני. עם זאת, המחקר קודם שלנו הראה כי תאי גלייה בילוד המוח הגיבו באופן שונה משמעותי מתא גליה בחוט שדרה מבוגרת על lipopolysaccharide (LPS) גירוי. לדוגמה, interleukin (IL) -4 מוצג משופרת השפעות מעכבות על תחמוצת החנקן הנגרמת LPS (NO) ב גליה בחוט השדרה עכברוש מבוגר לעומת גליה 4 המוח בילוד. יתר על כן, את הפרופילים של ייצור chemokine על גירוי על ידי neuropeptide, calcitonin פפטיד הקשורים גן (CGRP), הם unarguably שונים בין גליה המוח עכבר בילוד (השיטות המתוארות Ref. 5) ועכבר מבוגר גליה חוט השדרה (איור 1). שורות תאים הוקמו קלות לשימוש ולתחזוקה והוא יכול לספק מספר רב של תאים בתוך פרק זמן קצר. באופן כללי, הנציח שורות תאים נוצרות גם באמצעות מערכת הנצחה וירוס בתיווך (כגון שורת תאים microglial בשימוש נרחב BV2) 6, 7 או ה הבאהדואר זיהוי של טרנספורמציה ספונטנית (כגון שורת תאי astrocyte C8-D1A וקו תא microglial-B4 C8) 8, 9 שורות תאים מצוינות ללמוד את המאפיינים המולקולריים של האסטרוציטים ו microglia בנפרד.; עם זאת, התוצאות שהתקבלו מן שורות תאים תמיד דורשות אימות נוספת תאים ראשוניים או בתנאי in vivo. כמו כן יש לציין כי לא חל דו&quot;ח של קו תא גלייה כי נגזר גליה בחוט שדרה מכרסמת. כדי לסייע בחקירת התפקיד של תאי גלייה בחוט השדרה בפיתוח בכאב עצבי, מערכת התרבות הנגזרת חוט השדרה עכבר בוגר פותחה על ידי התאמת שיטת בעבר דיווח השתמשו כדי ליצור תרבויות גליה מעורבת חולדה בוגרת 4, 5 . תרבות גליה שדרת כבל העכבר הייתה מעודנת יותר לאחרונה 10 והוא מתואר בפירוט רב יותר במאמר זה. ג תרבויות שדרה למבוגר גליה מעורבת כבלשתוקם עם העכבר זנים נבחרים שמתאימים לצרכים של מחקר מסוים, ותאי יכול להישמר בתרבות עד 21 לפוסט חניכה של התרבות. שיטה זו יכולה לשמש במחקרים כאב נוירופתי, כמו גם בחקירות של מחלות נוירולוגיות שונות שכוללות שינויים פתולוגיים בתוך חוט השדרה, כגון טרשת לרוחב amyotrophic (ALS), וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV) -associated נוירופתיה סנסורית, מרובים טרשת (MS).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="2053">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:489px;">Dulbecco&#8217;s modification of Eagle&#8217;s media (DMEM) with 4.5g/L glucose</td>
			<td style="width:277px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">12-709F</td>
			<td style="width:1168px;">The cDMEM media is a standard, widely used culture media. Individual researcher can decide where to purchase the DMEM and all other component used to make cDMEM media.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">L-Glutamine (100x)</td>
			<td style="width:277px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">17-605E</td>
			<td>The L-glutamine is a standard, widely used component for various culture media. Individual researcher can decide where to purchase L-glutamine.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:489px;">Antibiotic-Antimycotic Solution (100x)</td>
			<td style="width:277px;">Corning-Mediatech</td>
			<td style="width:119px;">30-004-CI</td>
			<td>This is a combination of penicillin, streptomycin and Amphotericin formulated to contain 10,000 units/ml penicillin G, 10 mg/ml streptomycin sulfate and 25 &#181;g/ml amphotericin B. Individual researcher can decide where to purchase individual component.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">2-mercaptoethanol (2-ME)</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M3148</td>
			<td>A BioReagent, suitable for cell culture, molecular biology and electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Papain dissociation system</td>
			<td style="width:277px;">Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LK003150</td>
			<td>Individual components of this kit can be purchased separately.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:489px;">Percoll</td>
			<td>GE Health Care</td>
			<td style="width:119px;">17-0891-01</td>
			<td>Percoll is sold as sterile solution. Undiluted Percoll can be re-autoclaved if needed.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:489px;">Lab-line incubator/shaker&#160;</td>
			<td style="width:277px;">Barstead/Lab-line</td>
			<td style="width:119px;">MaxQ4000&#160;</td>
			<td>This is the incubator/shaker we have currently. Other types of shakers can be used instead.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:489px;">Lipopolysaccharides, Salmonella Minnesota Re595&#160;</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L-9764</td>
			<td>Other strains of LPS can also induce glial responses. The magnitude of the responses may vary.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">Mouse IL-6 DuoSet ELISA&#160;</td>
			<td style="width:277px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">DY406</td>
			<td>Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">Mouse TNF-alpha DuoSet ELISA</td>
			<td style="width:277px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">DY410</td>
			<td>Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">Mouse IP-10 (CXCL10) DuoSet ELISA</td>
			<td style="width:277px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">DY466</td>
			<td>Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">Mouse MCP-1 (CCL2) ELISA Opteia set</td>
			<td style="width:277px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">555260</td>
			<td>Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">Mouse chemokine Q-Plex</td>
			<td style="width:277px;">Quansys Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">120251MS</td>
			<td>This product was available for in-house assay at the time. Instead, we sent out samples to the manufacturer for analysis.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">APC-anti-mouse-CD45 (clone 30-F11)</td>
			<td style="width:277px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">17-0451</td>
			<td>Antibody of the same clone but from other vendors can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">FITC-anti-mouse-CD11b (clone M1/70)</td>
			<td style="width:277px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">11-0112</td>
			<td>Antibody of the same clone but from other vendors can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">Accuri C6 flow cytometer</td>
			<td style="width:277px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">BD Accuri C6&#160;</td>
			<td>Each individual Researcher can use any flow cytometer he or she prefers.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">FlowJo software</td>
			<td style="width:277px;">Tree Star, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">FlowJo7.6.5</td>
			<td>Each individual Researcher can use any analysis software he or she prefers.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of primary mixed glial cultures from adult mouse spinal cord tissue

זה כבר טוב כי קיבל תגובות גליה בחוט השדרה לתרום רבות להתפתחות כאב נוירופתי. מידע עצום בנוגע לפעילות גליה ברמות התאיות ומולקולריות הושג באמצעות מערכות תרבות תאים במבחנה. המערכות חוץ הגופייה המנוצלת, כוללות בעיקר גליה עיקרית נגזרה רקמת קליפת מוח מוח בילוד והנציחו שורות תאים. עם זאת, מערכות אלה לא יכולים לשקף את המאפיינים של תאי גלייה בחוט השדרה in vivo. כדי להמשיך לחקור את התפקידים של תאים גליה בחוט השדרה בפיתוח בכאב עצבי-induced פגיעה עצבית היקפית באמצעות מערכת תרבות משקפת טוב יותר את מצב in vivo, במעבדה שלנו פיתחה שיטה להקים תרבויות גליה מעורבת חוט השדרה העיקרי מן עכברים בוגרים. בקצרה, נאספים מיתרי השדרה של עכברים בוגרים ומעובד באמצעות עיכול פפאין ואחריו הסרת המיאלין עם מאורותity-שיפוע בינוני. המתלים תא בודדים בתרבית תקשורת הנשר השונה של שלמה Dulbecco (cDMEM) בתוספת 2-mercaptoethanol (2-ME) ב 35.9 מעלות צלסיוס תנאי תרבות אלה מותאמים במיוחד עבור הצמיחה של תאי גליה מעורבים. בתנאים אלה, תאים מוכנים לשמש לניסויים בין 12 - 14 ד (תאים הם בדרך כלל בשלב יומן במהלך הזמן הזה) לאחר הקמת התרבות (D 0) ו יכולים להישמר בתנאי תרבות עד D 21. מערכת תרבות זו יכולה לשמש כדי לחקור את התגובות של תאי גלייה בחוט שדרה על גירוי עם חומרי סוכנים שונים. מלבד כאב נוירופתי, מערכת זו יכולה לשמש כדי לחקור תגובות גליה במחלות אחרות שכוללות שינויים פתולוגיים של תאי גלייה בחוט שדרה.

שיטה זו יכולה לשמש כדי להכין ותאי גלייה מעורבים משני עכברים וחולדות. מספר התאים הכולל ממוצע לכל היטב צלחת 12 גם ב -12 D-ייזום פוסט של התרבות צריך להיות יציב יחסית, עם כ 100,000 תאים לכל טוב כאשר תאים נגזרים מייתרי שדרת עכבר. תאי גלייה המתקבלים בשיטה זו ניתן ל...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue at JoVE.com

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

התפתחות כאב נוירופתי כרוך שינויים פתולוגיים של תאי גלייה בחוט השדרה. מערכת תרבות גליה אמינה נגזרה רקמת חוט שדרה מבוגרת ועוצבה ללימוד תאים אלה במבחנה חסרה. לכן, אנו מציגים כאן כיצד להקים תרבויות גליה מעורבות עיקריות מרקמות כבל מבוגר עכבר שדרה.

הכנת תרבויות גליה מעורבת ראשיים מרקמות קורד למבוגרים עכבר השדרה

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

preparation-primary-mixed-glial-cultures-from-adult-mouse-spinal-cord

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.5K Views.  University of New England.  התפתחות כאב נוירופתי כרוך שינויים פתולוגיים של תאי גלייה בחוט השדרה. מערכת תרבות גליה אמינה נגזרה רקמת חוט שדרה מבוגרת ועוצבה ללימוד תאים אלה במבחנה חסרה. לכן, אנו מציגים כאן כיצד להקים תרבויות גליה מעורבות עיקריות מרקמות כבל מבוגר עכ...

Video: Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissection והתרבות של נוירונים Commissural מחוט השדרה עובריים

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to network properties. We show how to prepare viable oblique slices of the spinal cord of young mice (P2 - P11). In this preparation, the motoneurons retain&#160;their axons coming out from the ventral roots of the&#160;spinal cord. Stimulation of these axons elicits back-propagating action potentials invading the motoneuron&#160;somas and exciting the motoneuron&#160;collaterals within the spinal cord. Recording of antidromic action potentials is an immediate, definitive and elegant way to characterize motoneuron identity, which surpasses&#160;other identification methods. Furthermore, stimulating the motoneuron collaterals is a simple and reliable way to excite the collateral targets of the motoneurons within the spinal cord, such as other motoneurons or Renshaw cells. In this protocol, we present antidromic recordings from the motoneuron somas as well as Renshaw cell excitation, resulting from ventral root stimulation.

We show how to prepare oblique slices of the spinal cord in young mice. This preparation allows for the stimulation of the ventral roots.

הכנת פרוסות קורד אלכסון שדרה עבור גחון רוט גירוי

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

זברה<em&gt; באתרו</em&gt; הכנת בחוט השדרה עבור הקלטות אלקטרו מתוך השדרה חושית הנוירונים המוטוריים

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

נוירונים חוט השדרה בידוד ותרבות מ עכברים ניאונטליים

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

הדמיה פעילות עצבית בתוך קליפת המגע הראשי באמצעות Thy1-העכברים הטרנסגניים GCaMP6s

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated digital vaporizer is utilized to achieve a stable plane of anesthesia at a low-flow rate of isoflurane. A single vertebral spine is removed, and a commercially available cover-glass is overlaid on a thin agarose bed. A 3D-printed plastic backplate is then affixed to the adjacent vertebral spines using tissue adhesive and dental cement. A stabilization platform is used to reduce motion artifact from respiration and heartbeat. This rapid and clamp-free method is well-suited for acute multi-photon fluorescence microscopy. Representative data are included for an application of this technique to two-photon microscopy of the spinal cord vasculature in transgenic mice expressing eGFP:Claudin-5 &#8212; a tight junction protein.

This protocol describes implantation of a glass window onto the spinal cord of a mouse to facilitate visualization by intravital microscopy.

כריתת למינציה ואת חוט השדרה חלון השרשה בעכבר

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a powerful tool for studying transcriptional profiles of cells, particularly in heterogeneous tissues such as the central nervous system. However, dissociation methods required for single cell sequencing can lead to experimental changes in the gene expression and cell death. Furthermore, these methods are generally restricted to fresh tissue, thus limiting studies on archival and bio-bank material. Single nucleus RNA sequencing (snRNA-Seq) is an appealing alternative for transcriptional studies, given that it accurately identifies cell types, permits the study of tissue that is frozen or difficult to dissociate, and reduces dissociation-induced transcription. Here, we present a high-throughput protocol for rapid isolation of nuclei for downstream snRNA-Seq. This method enables isolation of nuclei from fresh or frozen spinal cord samples and can be combined with two massively parallel droplet encapsulation platforms.

Here, we present a protocol to rapidly isolate high-quality nuclei from the fresh or frozen tissue for downstream massively parallel RNA sequencing. We include detergent-mechanical and hypotonic-mechanical tissue disruption and cell lysis options, both of which can be used for isolation of nuclei.

בידוד של חוט השדרה למבוגרים גרעינים עבור רצפי RNA חד-גרעין בנפט מקבילים

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

משלוח פנים-עורקי של תאי גזע עצביים למוח עכברוש ועכבר: יישום איסכמיה מוחין

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. Microglia can adopt a large spectrum of activation phenotypes. Moreover, microglia that endorse pro-inflammatory phenotype is associated with both neurodevelopmental and neurodegenerative disorders. In vitro studies are widely used in research to evaluate potential therapeutic strategies in specific cell types. In this context studying microglial activation and neuroinflammation in vitro using primary microglial cultures is more relevant than microglial cell lines or stem-cell-derived microglia. However, the use of some primary cultures might suffer from a lack of reproducibility. This protocol proposes a reproducible and relevant method of magnetically isolating microglia from neonate pups. Microglial activation using several stimuli after 4 h and 24 h by mRNA expression quantification and a Cy3-bead phagocytic assay is demonstrated here. The current work is expected to provide an easily reproducible technique for isolating physiologically relevant microglia from juvenile developmental stages.

Primary microglia cultures are commonly used to evaluate new anti-inflammatory molecules. The present protocol describes a reproducible and relevant method to magnetically isolate microglia from neonate pups.

בידוד מגנטי של תאים מיקרוגליאליים מעכבר ניאונאט עבור תרביות תאים ראשוניים

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. ...

Electromagnetic Controlled Closed-Head Model of Mild Traumatic Brain Injury in Mice

Highly reproducible animal models of traumatic brain injury (TBI), with well-defined pathologies, are needed for testing therapeutic interventions and understanding the mechanisms of how a TBI alters brain function. The availability of multiple animal models of TBI is necessary to model the different aspects and severities of TBI seen in people. This manuscript describes the use of a midline closed head injury (CHI) to develop a mouse model of mild TBI. The model is considered mild because it does not produce structural brain lesions based on neuroimaging or gross neuronal loss. However, a single impact creates enough pathology that cognitive impairment is measurable at least 1 month after injury. A step-by-step protocol to induce a CHI in mice using a stereotaxically guided electromagnetic impactor is defined in the paper. The benefits of the mild midline CHI model include the reproducibility of the injury-induced changes with low mortality. The model has been temporally characterized up to 1 year after the injury for neuroimaging, neurochemical, neuropathological, and behavioral changes. The model is complementary to open skull models of controlled cortical impact using the same impactor device. Thus, labs can model both mild diffuse TBI and focal moderate-to-severe TBI with the same impactor.

The protocol describes mild traumatic brain injury in a mouse model. In particular, a step-by-step protocol to induce a mild midline closed head injury and the characterization of the animal model is fully explained.

מודל ראש סגור מבוקר אלקטרומגנטי של פגיעה מוחית טראומטית קלה בעכברים

Highly reproducible animal models of traumatic brain injury (TBI), with well-defined pathologies, are needed for testing therapeutic interventions and ...