Adult spinal cord mixed cultures were first developed using rats with grant support from an NIH/NIDA R01 award (PI De Leo) and an NIH T32 training grant (PI Green). These methods were further adapted for mouse spinal cords with support from the following grants: NIH/NIDA 5K01DA023503 (PI Cao), NIH/NINDS 5R21NS066130 (PI Cao), and NIH/NIGMS P20GM103643 (PI Meng). The authors would also like to thank Dr. Alejandro M. S. Mayer, Department of Pharmacology, Chicago College of Osteopathic Medicine, for his technical help in obtaining microglia-rich mixed glial cells.

O seguinte protocolo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da Universidade de Nova Inglaterra. O protocolo seguinte é para a preparação de culturas gliais de rato adulto 4 medulas espinhais. 1. Preparação de Soluções em uma capa de cultura sob condições assépticas <ol><li> Preparar meios de cultura: modificação de meio de Eagle (cDMEM) contendo DMEM completo de Dulbecco (com 4,5 g / L de glucose), 10% de Soro Fetal Bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina, 100 UI / mL de penicilina, 100 mg / mL de estreptomicina , 250 ng / mL de anfotericina B, e 50 uM de 2-mercaptoetanol (2-ME; ver 1.1.1). Homogeneizar e filtrar esterilizar todos os outros componentes e depois adicionar FBS. Armazenar o meio de cultura a 4 o C. <ol><li> Preparar 2-Me / solução salina tamponada com fosfato de solução de estoque 50 mM (PBS): adiciona-se 100 mL de concentrado de 2-ME (14,3 M) em 28,6 mL de 1x PBS, e esterilizar filtro (a solução pode ser armazenada a 4 ° C durante vários meses). vocêSE 1 mL de 2-ME solução estoque para cada 1000 mL de meio de cultura. </li></ol></li><li> Preparação dos meios de gradiente de densidade <ol><li> Prepare uma solução de mídia gradiente de densidade isotônica estoque (por exemplo, 100% Percoll) a partir de 1 parte 10x normal estéril PBS e 9 partes de meios gradientes estéril densidade estoque (por exemplo, Percoll). </li><li> Dilui-se a meios de gradiente de densidade de 100% (feito em 1.2.1) com 1x PBS estéril normal para fazer uma de 20% de meio de gradiente de densidade (por exemplo, 10 mL de 100% de meio de gradiente de densidade com 40 mL de PBS 1x) e armazená-lo a quatro o C. Traga os 20% media gradiente de densidade à temperatura ambiente (RT) antes de preparar a cultura de células. </li></ol></li><li> Preparação de soluções a partir do sistema de dissociação de papaína NOTA: O sistema de dissociação de papaína pode ser identificado na Tabela Materiais. Outros kits de dissociação semelhantes (incluindo aqueles montado em casa) também pode ser usado. Todos os componeNTS deve ser estéril. <ol><li> Adicionar 32 ml de Solução Salina Equilibrada de Earle (EBSS) à mistura de inibidor de ovomucóide (pó). </li><li> Adicionar 5 mL de EBSS para um frasco papaína (pó). Colocar o frasco papaína em um banho de água a 37 ° C durante 10 minutos ou até que a papaína é dissolvido. </li><li> Adicionar 500 mL de EBSS para um frasco de ADNase (pó). Misture delicadamente. </li><li> Adicionar 250 ul da solução de ADNase (acima) para o frasco de papaína. </li><li> Calcula-se a quantidade total da mistura papaína / ADNase acima necessário (aproximadamente 800 ul de papaina mistura / ADNase por ratinho medula espinal) e transferir a mistura necessária para um tubo de 50 mL para a digestão de tecido (passo 3.2). Armazenar o restante no recipiente original, a 4 ° C durante pelo menos duas semanas. </li><li> Manter todos os componentes dos kits em gelo até ser necessária. </li></ol></li><li> Preparar tubos de colheita de medula espinal: um tubo estéril de 15 mL com 5 mL de Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS; a partir do sistema de dissociação de papaína,0; para a recolha de medula espinhal) e um tubo de 15 mL estéril com 1x PBS (para encher a seringa de 5 mL, consulte o passo 2.4). Além disso, preparar uma placa de Petri estéril (35 mm ou 60 mm) com 5 mL de HBSS e mantê-lo na capa de cultura. </li></ol> 2. Spinal Cord Colecção NOTA: Todos os equipamentos devem ser estéreis. Realizar a coleta em uma área designada aprovado pelo IACUC. <ol><li> Obter as seguintes ferramentas para a colheita do rato medulas espinhais: sem corte tesoura reta afiadas / 18 cm cirúrgicos, um bisturi de 12 cm padrão (# 3 sólida), em aço carbono estéreis bisturi lâmina nº 10, uma pequena decapitator animal, de 12 cm padrão curvo uma pinça, e uma agulha de 20G estéril ligada a uma seringa de 5 mL. </li><li> Eutanásia do animal com CO2 e desinfectar a cabeça de rato e a região de volta com 70% de etanol (EtOH). </li><li> Decapitar animal com o decapitator. Adicione uma incisão longitudinal no meio da parte inferior das costas para expor a camada muscular. Façouma transecção limpa através da coluna de vertebrados do nível do quadril (também corte através da camada de músculo que cobre a coluna de vertebrados) com as tesouras cirúrgicas retas estéreis (18 cm). </li><li> Colocar o animal em uma folha de fresco pano descartável. Cuidadosamente inserir a agulha de 20 G (ligada a uma seringa de 5 ml cheio com PBS estéril 1x (passo 1.4)) dentro da coluna vertebral em direcção ao lado rostral. Mantenha o animal para baixo firmemente e empurre a seringa rapidamente. Toda a medula espinhal deve sair a partir do final do colo do útero. Recolha da medula espinal no interior do tubo 15 mL contendo HBSS. </li><li> Repetir o passo 2.4 para o resto dos ratinhos. Entre cada animal, desinfectar todos os instrumentos utilizados com etanol 70%. NOTA: Normalmente, uma única placa de 12 poços pode ser estabelecido para cada 4 rato medula espinhal (ver 4.3). </li></ol> 3. Preparação da suspensão de células individuais Nota: Execute os passos 3 e 4 em uma capa de cultura para manter tudo esterilizado. <ol><li> Transfira todas as medulas espinhais na HBSS contendo placa de petri (passo 1.4). Corte cada uma das medulas espinhais em muitos finos, pequenos pedaços com uma tesoura e uma pinça estéril. Transferir o tecido da medula espinhal ao tubo cônico de 50 ml, contendo papaína preparado / mistura de enzima DNase (passo 1.3.5) usando uma pinça estéril ou uma pipeta de 10 (evitar a adição de HBSS à mistura enzimática, tal como esta continuará a diluir o preparado solução de enzima e pode resultar na diminuição do desempenho da enzima). </li><li> Vortex o tubo suavemente para misturar. Incubar o tubo a 37 o C durante 1 h num incubador / agitador com agitação orbital a 150 rpm. </li><li> Vortex e o tubo de novo vigorosamente tritura-se a solução de enzima com o tecido utilizando uma pipeta de 5 mL para promover ainda mais a dissociação. </li><li> Transferir a suspensão de células para um tubo de 15 ml e centrifugar a 300 xg durante 5 min à TA. </li><li> Durante a centrifugação, misturar 2,7 mL de EBSS, com 300 ul de albumina de INH-ovomucóide reconstituídosolução ibitor (1.3.1) em um tubo estéril. Adicionar 150 ul da solução de ADNase (passo 1.3.3). </li><li> Após a centrifugação, remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células com a solução preparada acima (passo 3.5). Vortex bem para quebrar o sedimento celular. </li><li> Adicionar 3 ml de solução reconstituída albumina-ovomucóide inibidor (passo 1.4.1) para a suspensão de células. células Centrifugar a 70 xg durante 6 minutos à temperatura ambiente. Remover o sobrenadante (que contém os fragmentos de membrana). </li></ol> 4. Além disso remoção da mielina da suspensão de células individuais <ol><li> Adiciona-se 8 mL de 20% de meio de gradiente de densidade (preparado no passo 1.2.2) para o tubo contendo o sedimento de células, vortex suavemente para perturbar o sedimento, e centrifugar as células a 800 xg durante 30 min à temperatura ambiente sem travagem. Remova cuidadosamente a camada superior de detritos (principalmente mielina) e o sobrenadante, mas manter o sedimento. </li><li> Para remover vestígios do gradiente de densidade, lavar as células por resuspending o sedimento celular com 8 mL de uma cDMEM diluída (1 parte cDMEM e 2 partes HBSS). Centrifugar as células a 400 xg durante 10 minutos a 4 o C. Remover o sobrenadante e lava-se as células novamente com o cDMEM diluída (de cima) da mesma maneira. Manter as células em gelo até semeando-os. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em meio de cultura (cDMEM fornecido com 2-ME (preparado no passo 1.1)). Para uma placa de 12 poços, utilize 3 mL x 4 (número de ratinhos usados ​​2 ml) + = 14 ml de meio. Isto irá assegurar que existe suspensão de células suficientes para toda a placa (12 poços) e vai proporcionar para poços adicionais que podem ser usados ​​para determinar o número médio de células por poço e o conteúdo da microglia da cultura. Se vai ser utilizados outros tipos de recipientes de cultura, calcular o volume total de meios de cultura necessária proporcionalmente. </li><li> Adicionar 1 ml de suspensão celular em cada poço de uma placa de 12 poços. </li><li> Incubar as células a 35,9 ° C com 5% de CO 2. </li><li&gt; Alterar a mídia (remover a velha mídia através de aspiração) em D 1 e depois a cada 3 - 4 d depois (normalmente alterar a mídia on D: 1, 4, 8 e 11, e, em seguida, usar as células no dia 12). NOTA: No dia 1, a cultura pode conter quantidades significativas de detritos devidos à mielina resíduo a partir do tecido da medula espinal; Assim, mudando a mídia no dia 1 é recomendada (consulte o Discussão para mais informações). As culturas estão prontas para tratamento entre D 12 - 14. As células são normalmente 80% confluentes em D 12, e pode ser próxima de 100% confluentes por D 14. Tipicamente, em D 12, existem cerca de 100000 células por poço numa placa de 12 poços . </li></ol><img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54801/54801fig4.jpg" /> Figura 2:. Imagens representativas de células gliais misturadas em diferentes momentos após o estabelecimento da cultura glia mista medula espinhal glia mistos primários foram preparados a partir de adultos camundongos C57BL / 6. imagens representativasmostram o progresso da cultura glial após o plaqueamento. No dia 1, algumas células são ligados à placa de cultura, mas que ainda são principalmente redondo. Há também muitas células flutuantes e detritos significativo. No dia 4, a maioria das células estão ligados à placa de cultura. Células parecem ramificada com processos visíveis. As células são distribuídas de forma esporádica e culturas são cerca de 20-30% confluentes no momento. No dia 8, as culturas são entre 50-60% confluentes. Algumas áreas das culturas têm grandes manchas de células. Outras áreas das culturas ter um crescimento escasso de células. Algumas células no interior das manchas assumir uma aparência &quot;quadrado-like&quot;. No dia 12, as culturas são iguais ou superiores a 80% confluentes (cerca de 90% confluentes na imagem mostrada aqui). Células estão na fase log do crescimento neste momento e entre os dias 12-14 é o momento ideal para o uso das células da glia para experimentos. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54801/54801fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma</a>versão maior desta figura. <ol start="7"><li> Examinar o conteúdo da microglia usando células dos poços adicionais (passo 4.3), através de células activadas por fluorescência padrão (FACS) usando o protocolo de coloração 11, a combinação de anticorpo anti-ratinho-CD45 e os anticorpos monoclonais anti-CD11b de rato. As células CD45 + CD11b + são identificados como microglia. </li></ol>

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H., Dri, P., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+the+distribution+and+morphology+of+microglia+in+the+normal+adult+mouse+brain.">Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain.</a> Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).</li><li>Rock, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Microglia+in+Central+Nervous+System+Infections.">Role of Microglia in Central Nervous System Infections.</a> Clin Microbiol Rev. 17 (4), 942-964 (2004).</li><li>Yang, I., Han, S. J., Kaur, G., Crane, C., Parsa, A. 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The authors have nothing to disclose.

É crítico para executar todas as etapas-incluindo os meios de comunicação Alterar o horário-de maneira consistente, a fim de obter resultados reprodutíveis entre experimentos. Os passos seguintes são particularmente crítico na obtenção de excelente qualidade adulto glia mista. A digestão enzimática é um aspecto importante deste protocolo. É crucial que os pedaços de tecido são bem digerido, a fim de se obter uma suspensão de célula única. No entanto, o excesso de digestão...

A dor crônica é um problema de saúde grave que afeta cerca de 100 milhões de adultos nos Estados Unidos, com um custo anual estimado de até 635.000.000.000 $ 1. Evidências crescentes indicou uma contribuição significativa de células gliais medula espinhal no desenvolvimento da dor neuropática, um dos tipos mais devastadores da dor crônica 2. Um sistema in vitro cultura própria ajudaria significativamente em investigar mais os papéis de células gliais nos níveis celulares e moleculares. Atualmente, os sistemas in vitro de cultura gliais utilizados pelos investigadores incluem principalmente células gliais derivadas de tecidos corticais de rato ou rato cérebros neonatal e linhas celulares imortalizadas gliais derivadas de rato neonatal ou rato células gliais primários. Neonatal células contêm um número significativo de células indiferenciadas que podem ainda ser diferenciadas em células gliais (astrócitos e principalmente da microglia), proporcionando assim umcélulas bundant para o uso experimental 3. No entanto, o nosso estudo anterior demonstrou que as células da glia cerebral neonatal responderam significativamente diferente a partir de células gliais medula espinal adultos mediante a estimulação de lipopolissacárido (LPS). Por exemplo, a interleucina (IL) -4 exibido aumenta os efeitos inibidores sobre o óxido nítrico induzida por LPS (NO) em células da glia de ratos adultos da medula espinal em comparação com as células da glia cerebral neonatal 4. Além disso, os perfis de produção de quimioquina após estimulação por um neuropeptídeo, calcitonina péptido relacionado com o gene da calcitonina (CGRP), são indiscutivelmente diferente entre as células da glia cerebral do rato neonatal (métodos descritos no Exemplo de Ref. 5) e de ratinho adulto espinal medula glia (Figura 1). As linhas celulares estabelecidas são fáceis de utilizar e de manter e pode fornecer um grande número de células num período de tempo curto. Em geral, as linhas celulares imortalizadas são gerados utilizando um sistema de imortalizao mediada por vírus (tais como a linha de células da microglia amplamente utilizado BV2) 6, 7 ou seguinte the identificação de transformação espontânea (tal como a linha de células de astrócitos C8-D1A e linha de células da microglia C8-B4) 8, 9, as linhas de células são excelentes no estudo das características moleculares dos astrócitos e microglia individualmente.; No entanto, os resultados obtidos a partir de linhas celulares exigem sempre uma validação adicional das células primárias ou em condições in vivo. Deve também notar-se que não houve um relato de uma linha de células da glia, que é derivada de uma medula espinal glia roedor. Para ajudar a investigar o papel das células do cordão gliais da coluna vertebral no desenvolvimento de dor neuropática, num sistema de cultura que é derivado a partir da medula espinal do rato adulto foi desenvolvido por adaptação de um método previamente relatado usado para gerar ratos adultos culturas gliais mistas 4, 5 . A cultura de células gliais da medula espinal do rato foi ainda mais refinado recentemente 10 e é descrito em mais detalhe neste artigo. Adultas da medula espinal misturado culturas gliais cum ser estabelecida com um rato a partir de estirpes seleccionadas que se encaixam as necessidades do estudo particular, e as células podem ser mantidas em cultura durante até 21 dias após o inicio da cultura. Este método pode ser utilizado em estudos de dor neuropática, bem como em investigações de várias doenças neurológicas que envolvem alterações patológicas no interior da medula espinal, tais como esclerose amiotrófica lateral (ALS), o vírus da imunodeficiência humana (HIV) -associated neuropatia sensorial, e múltiplos A esclerose múltipla (MS).

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modification of Eagle&amp;rsquo;s media (DMEM) with 4.5 g/L glucose</td><td>Lonza</td><td>12-709F</td><td>The cDMEM media is a standard, widely used culture media. Individual researchers can decide where to purchase the DMEM and all other components used to make cDMEM media.</td></tr><tr><td>L-Glutamine (100x)</td><td>Lonza</td><td>17-605E</td><td>The L-glutamine is a standard, widely used component for various culture media. Individual researchers can decide where to purchase L-glutamine.</td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic Solution (100x)</td><td>Corning-Mediatech</td><td>30-004-CI</td><td>This is a combination of penicillin, streptomycin and Amphotericin formulated to contain 10,000 units/mL penicillin G, 10 mg/mL streptomycin sulfate and 25 &amp;micro;g/mL amphotericin B. Individual researchers can decide where to purchase individual components.</td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol (2-ME)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td>A BioReagent, suitable for cell culture, molecular biology and electrophoresis.</td></tr><tr><td>Papain dissociation system</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LK003150</td><td>Individual components of this kit can be purchased separately.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Health Care</td><td>17-0891-01</td><td>Percoll is sold as sterile solution. Undiluted Percoll can be re-autoclaved if needed.</td></tr><tr><td>Lab-line incubator/shaker&amp;nbsp;</td><td>Barstead/Lab-line</td><td>MaxQ4000&amp;nbsp;</td><td>This is the incubator/shaker we have currently. Other types of shakers can be used instead.</td></tr><tr><td>Lipopolysaccharides, &lt;em&gt;Salmonella Minnesota&lt;/em&gt; Re595</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-9764</td><td>Other strains of LPS can also induce glial responses. The magnitude of the responses though, may vary.</td></tr><tr><td>Mouse IL-6 DuoSet ELISA&amp;nbsp;</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>DY406</td><td>Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.</td></tr><tr><td>Mouse TNF-alpha DuoSet ELISA</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>DY410</td><td>Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.</td></tr><tr><td>Mouse IP-10 (CXCL10) DuoSet ELISA</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>DY466</td><td>Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.</td></tr><tr><td>Mouse MCP-1 (CCL2) ELISA Opteia set</td><td>BD Biosciences</td><td>555260</td><td>Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.</td></tr><tr><td>Mouse chemokine Q-Plex</td><td>Quansys Biosciences</td><td>120251MS</td><td>This product was not available for in-house assay at the time. Instead, we sent out samples to the manufacturer for analysis.</td></tr><tr><td>APC-anti-mouse-CD45 (clone 30-F11)</td><td>eBioscience</td><td>17-0451</td><td>Antibody of the same clone but from other vendors can be used.</td></tr><tr><td>FITC-anti-mouse-CD11b (clone M1/70)</td><td>eBioscience</td><td>11-0112</td><td>Antibody of the same clone but from other vendors can be used.</td></tr><tr><td>Accuri C6 flow cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>BD Accuri C6&amp;nbsp;</td><td>Each individual Researcher can use any flow cytometer he or she prefers.</td></tr><tr><td>FlowJo software</td><td>Tree Star, Inc.</td><td>FlowJo7.6.5</td><td>Each individual Researcher can use any analysis software he or she prefers.</td></tr></tbody></table>

preparation of primary mixed glial cultures from adult mouse spinal cord tissue

foi bem aceite que a medula espinhal respostas gliais contribuir significativamente para o desenvolvimento de dor neuropática. Informações tremenda sobre as atividades da glia nos níveis celulares e moleculares foi obtida através dos sistemas de cultura de células in vitro. Os sistemas in vitro utilizados incluem, principalmente as células da glia primária derivada de tecido cortical cerebral neonatal e linhas de células imortalizadas. No entanto, estes sistemas podem não coincidir com as características das células da glia medula espinal in vivo. A fim de investigar o papel das células cabo gliais da coluna vertebral em desenvolvimento de nervo periférico dor neuropática induzida por lesão utilizando um sistema de cultura que reflete melhor a condição in vivo, nosso laboratório tem desenvolvido um método para estabelecer medula espinal primária culturas gliais mistas a partir de camundongos adultos. Em resumo, a espinal medula são coletadas de ratos adultos e processado através de digestão com papaína seguido pela remoção da mielina com tocasdade de gradiente médio. As suspensões de células isoladas são cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco completa (cDMEM) suplementado com 2-mercaptoetanol (2-ME) a 35,9 o C. Estas condições de cultura foram optimizado especificamente para o crescimento de células gliais mistas. Sob estas condições, as células estão prontas para serem utilizados para a experimentação entre 12 - 14 d (células são geralmente em fase log durante este tempo) após o estabelecimento da cultura (D 0) e pode ser mantido em condições de cultura até a D 21. este sistema de cultura pode ser utilizada para investigar as respostas de células gliais medula espinal após estimulação com várias substâncias e agentes. Além da dor neuropática, este sistema pode ser usado para estudar as respostas gliais em outras doenças que envolvem alterações patológicas das células gliais medula espinhal.

Este método pode ser utilizado para preparar células gliais mistas de ambos os ratinhos e ratos. O número total de células médio por poço numa placa de 12 poços em D 12 pós-iniciação da cultura deve ser relativamente estável, com cerca de 100000 células por poço, quando as células são derivadas de medulas espinais de rato. As células da glia obtidos com este método pode ser utilizado em experiências que se destinam a examinar adultos respostas cabo gliais espinal após ...

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Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

O desenvolvimento de dor neuropática envolve alterações patológicas das células gliais medula espinhal. Um sistema de cultura de células gliais de confiança derivados de tecidos de medula espinal adulta e concebido para estudar estas células in vitro é inexistente. Portanto, vamos mostrar aqui como estabelecer culturas gliais mistas primárias de tecido da medula espinhal do rato adulto.

Preparação de culturas mista glial primários de rato adulto Spinal Cord Tissue

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.6K visualizações.  University of New England.  O desenvolvimento de dor neuropática envolve alterações patológicas das células gliais medula espinhal. Um sistema de cultura de células gliais de confiança derivados de tecidos de medula espinal adulta e concebido para estudar estas células in vitro é inexistente. Portanto, vamos mostrar aqui como estabelecer culturas gliais mistas primárias de tecido da medula espinhal do rato adulto. 

Vídeo: Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue

Microglia account for approximately 12% of the total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered the major cell types of the nervous system, microglia play a significant role in normal brain physiology by monitoring tissue for debris and pathogens and maintaining homeostasis in the parenchyma via phagocytic activity 1,2. Microglia are activated during a number of injury and disease conditions, including neurodegenerative disease, traumatic brain injury, and nervous system infection 3. Under these activating conditions, microglia increase their phagocytic activity, undergo morpohological and proliferative change, and actively secrete reactive oxygen and nitrogen species, pro-inflammatory chemokines and cytokines, often activating a paracrine or autocrine loop 4-6. As these microglial responses contribute to disease pathogenesis in neurological conditions, research focused on microglia is warranted.
	Due to the cellular heterogeneity of the brain, it is technically difficult to obtain sufficient microglial sample material with high purity during in vivo experiments. Current research on the neuroprotective and neurotoxic functions of microglia require a routine technical method to consistently generate pure and healthy microglia with sufficient yield for study. We present, in text and video, a protocol to isolate pure primary microglia from mixed glia cultures for a variety of downstream applications. Briefly, this technique utilizes dissociated brain tissue from neonatal rat pups to produce mixed glial cell cultures. After the mixed glial cultures reach confluency, primary microglia are mechanically isolated from the culture by a brief duration of shaking. The microglia are then plated at high purity for experimental study.
	The principle and protocol of this methodology have been described in the literature 7,8. Additionally, alternate methodologies to isolate primary microglia are well described 9-12. Homogenized brain tissue may be separated by density gradient centrifugation to yield primary microglia 12. However, the centrifugation is of moderate length (45 min) and may cause cellular damage and activation, as well as, cause enriched microglia and other cellular populations. Another protocol has been utilized to isolate primary microglia in a variety of organisms by prolonged (16 hr) shaking while in culture 9-11. After shaking, the media supernatant is centrifuged to isolate microglia. This longer two-step isolation method may also perturb microglial function and activation. We chiefly utilize the following microglia isolation protocol in our laboratory for a number of reasons: (1) primary microglia simulate in vivo biology more faithfully than immortalized rodent microglia cell lines, (2) nominal mechanical disruption minimizes potential cellular dysfunction or activation, and (3) sufficient yield can be obtained without passage of the mixed glial cell cultures.
	It is important to note that this protocol uses brain tissue from neonatal rat pups to isolate microglia and that using older rats to isolate microglia can significantly impact the yield, activation status, and functional properties of isolated microglia. There is evidence that aging is linked with microglia dysfunction, increased neuroinflammation and neurodegenerative pathologies, so previous studies have used ex vivo adult microglia to better understand the role of microglia in neurodegenerative diseases where aging is important parameter. However, ex vivo microglia cannot be kept in culture for prolonged periods of time. Therefore, while this protocol extends the life of primary microglia in culture, it should be noted that the microglia behave differently from adult microglia and in vitro studies should be carefully considered when translated to an in vivo setting.

Isolating primary microglia from the cellular heterogeneity of the brain is essential to investigate their role in both physiological and pathological conditions. This protocol describes a mechanical isolation and mixed cell culture technique that provides high yield and high purity, viable primary microglial cells for in vitro study and downstream applications.

Isolamento Microglia primária a partir de cultura mista de células gliais de tecido de cérebro de rato neonatal

Microglia account for approximately 12% of the  total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered  the major ...

Imunologia e Infecção

Derivation of Glial Restricted Precursors from E13 mice

This is a protocol for derivation of glial restricted precursor (GRP) cells from the spinal cord of E13 mouse fetuses. These cells are early precursors within the oligodendrocytic cell lineage. Recently, these cells have been studied as potential source for restorative therapies in white matter diseases. Periventricular leukomalacia (PVL) is the leading cause of non-genetic white matter disease in childhood and affects up to 50% of extremely premature infants. The data suggest a heightened susceptibility of the developing brain to hypoxia-ischemia, oxidative stress and excitotoxicity that selectively targets nascent white matter. Glial restricted precursors (GRP), oligodendrocyte progenitor cells (OPC) and immature oligodendrocytes (preOL) seem to be key players in the development of PVL and are the subject of continuing studies. Furthermore, previous studies have identified a subset of CNS tissue that has increased susceptibility to glutamate excitotoxicity as well as a developmental pattern to this susceptibility. Our laboratory is currently investigating the role of oligodendrocyte progenitors in PVL and use cells at the GRP stage of development. We utilize these derived GRP cells in several experimental paradigms to test their response to select stresses consistent with PVL. GRP cells can be manipulated in vitro into OPCs and preOL for transplantation experiments with mouse PVL models and in vitro models of PVL-like insults including hypoxia-ischemia. By using cultured cells and in vitro studies there would be reduced variability between experiments which facilitates interpretation of the data. Cultured cells also allows for enrichment of the GRP population while minimizing the impact of contaminating cells of non-GRP phenotype.

This protocol outlines the derivation of Glial Restricted Precursors from fetal spinal cords and maintained in vitro either for transplantation or for the study of oligodendrocytic lineage.

Derivação da glia Precursores restritos de camundongos E13

This is a protocol for derivation of glial restricted precursor (GRP) cells from the spinal cord of E13 mouse fetuses. These cells are early precursors ...

Neurociência

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

Microglia cultura do Sistema Nervoso Central Neonatal e Adulto

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine neonates for the isolation of glial subpopulations. The purpose of the procedure is to dissociate microglia, oligodendrocyte progenitor cells (OPCs), and astrocytes from cortical, cerebellar, brainstem, and spinal cord tissue to facilitate further in vitro analysis. The CNS region isolation procedures allow for the determination of regional heterogeneity among glia in multiple cell culture systems. Rapid CNS region isolation is performed, followed by the mechanical removal of meninges to prevent meningeal cell contamination of glia. This protocol combines gentle tissue dissociation and plating on a specified matrix designed to preserve cell integrity and adherence. Isolating mixed glia from multiple CNS regions provides a comprehensive analysis of potentially heterogenous glia while maximizing the use of individual experimental animals. Additionally, following dissociation of regional tissue, mixed glia are further divided into multiple cell types including microglia, OPCs, and astrocytes for use in either single cell type, cell culture plate inserts, or co-culture systems. Overall, the demonstrated techniques provide a comprehensive protocol of broad applicability for careful dissection of four individual CNS regions from murine neonates and includes methods for the isolation of three individual glia cell types to examine regional heterogeneity in any number of in vitro cell culture systems or assays.

Here we present a protocol for in vitro isolation of multiple glial cell populations from a mouse CNS. This method allows for the segregation of regional microglia, oligodendrocyte precursor cells, and astrocytes to study the phenotypes of each in a variety of culture systems.

Dissecção e isolamento da glia murina de múltiplas regiões do sistema nervoso central

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine ...

Primary Microglia Isolation from Postnatal Mouse Brains

Microglia are the mononuclear phagocytes in the central nervous system (CNS), which play key roles in maintaining homeostasis and regulating the inflammatory process in the CNS. To study the microglial biology in vitro, primary microglia show great advantages compared to immortalized microglial cell lines. However, microglia isolation from the postnatal mouse brain is relatively less efficient and time-consuming. In this protocol, we provide a quick and easy-to-follow method to isolate primary microglia from the neonatal mouse brain. The overall steps of this protocol include brain dissection, primary brain cell culture, and microglia isolation. Using this approach, researchers can obtain primary microglia with high purity. In addition, the harvested primary microglia were able to respond to the lipopolysaccharides challenge, indicating they retained their immune function. Collectively, we developed a simplified approach to efficiently isolate primary microglia with high purity, which facilitates a wide range of microglial biology investigations&#160;in vitro.

<meta charset="utf8"></head><body>Isolamento primário da microglia de cérebros de camundongos pós-natais

Primary cell culture is one of the primarily used approaches for studying microglial biology in vitro. Here, we developed a method for simple and rapid microglia isolation from the mouse postnatal day 1 (P1) to P4.

Isolamento primário da microglia de cérebros de camundongos pós-natais

Microglia are the mononuclear phagocytes in the central nervous system (CNS), which play key roles in maintaining homeostasis and regulating the ...

Cocultura de AdMSCs e glia para reduzir a inflamação induzida por príons

Adipose-Derived Mesenchymal Stromal Cells Co-Cultured with Primary Mixed Glia to Reduce Prion-Induced Inflammation

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are potent regulators of inflammation through the production of anti-inflammatory cytokines, chemokines, and growth factors. These cells show an ability to regulate neuroinflammation in the context of neurodegenerative diseases such as prion disease and other protein misfolding disorders. Prion diseases can be sporadic, acquired, or genetic; they can result from the misfolding and aggregation of the prion protein in the brain. These diseases are invariably fatal, with no available treatments.
One of the earliest signs of disease is the activation of astrocytes and microglia and associated inflammation, which occurs prior to detectable prion aggregation and neuronal loss; thus, the anti-inflammatory and regulatory properties of MSCs can be harvested to treat astrogliosis in prion disease. Recently, we showed that adipose-derived MSCs (AdMSCs) co-cultured with BV2 cells or primary mixed glia reduce prion-induced inflammation through paracrine signaling. This paper describes a reliable treatment using stimulated AdMSCs to decrease prion-induced inflammation.
A heterozygous population of AdMSCs can easily be isolated from murine adipose tissue and expanded in culture. Stimulating these cells with inflammatory cytokines enhances their ability to both migrate toward prion-infected brain homogenate and produce anti-inflammatory modulators in response. Together, these techniques can be used to investigate the therapeutic potential of MSCs on prion infection and can be adapted for other protein misfolding and neuroinflammatory diseases.

Autor em destaque: Insight sobre os avanços na pesquisa de doenças priônicas

Adipose-derived mesenchymal stromal cells (AdMSCs) have potent immunomodulatory properties useful for treating diseases associated with inflammation. We demonstrate how to isolate and culture murine AdMSCs and primary mixed glia, stimulate AdMSCs to upregulate anti-inflammatory genes and growth factors, assess migration of AdMSCs, and co-culture AdMSCs with primary mixed prion-infected glia.

Células estromais mesenquimais derivadas de tecido adiposo co-cultivadas com glia mista primária para reduzir a inflamação induzida por príons

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are potent regulators of inflammation through the production of anti-inflammatory cytokines, chemokines, and growth ...

Extração eficiente de astrócitos e micróglias da medula espinhal de camundongos adultos

Isolation of Pure Astrocytes and Microglia from the Adult Mouse Spinal Cord For In Vitro Assays and Transcriptomic Studies

Astrocytes and microglia play pivotal roles in central nervous system development, injury responses, and neurodegenerative diseases. These highly dynamic cells exhibit rapid responses to environmental changes and display significant heterogeneity in terms of morphology, transcriptional profiles, and functions. While our understanding of the functions of glial cells in health and disease has advanced substantially, there remains a need for in vitro, cell-specific analyses conducted in the context of insults or injuries to comprehensively characterize distinct cell populations. Isolating cells from the adult mouse offers several advantages over cell lines or neonatal animals, as it allows for the analysis of cells under pathological conditions and at specific time points. Furthermore, focusing on spinal cord-specific isolation, excluding brain involvement, enables research into spinal cord pathologies, including experimental autoimmune encephalomyelitis, spinal cord injury, and amyotrophic lateral sclerosis. This protocol presents an efficient method for isolating astrocytes and microglia from the adult mouse spinal cord, facilitating immediate or future analysis with potential applications in functional, molecular, or proteomic downstream studies.

Autor em destaque: Isolamento de células gliais da medula espinhal de camundongos adultos 

This protocol outlines the isolation of purified astrocytes and microglia from the adult mouse spinal cord, facilitating subsequent applications such as RNA analysis and cell culture. It includes detailed cell dissociation methods and procedures designed to enhance both the quality and yield of isolated cells.

Isolamento de Astrócitos Puros e Microglia da Medula Espinhal de Camundongos Adultos para Ensaios In Vitro e Estudos Transcriptômicos

Astrocytes and microglia play pivotal roles in central nervous system development, injury responses, and neurodegenerative diseases. These highly dynamic ...

Preparação de culturas mista glial primários de rato adulto Spinal Cord Tissue

Resumo

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Capítulos neste vídeo

Isolamento Microglia primária a partir de cultura mista de células gliais de tecido de cérebro de rato neonatal

Derivação da glia Precursores restritos de camundongos E13

Microglia cultura do Sistema Nervoso Central Neonatal e Adulto

Dissecção e isolamento da glia murina de múltiplas regiões do sistema nervoso central

Isolamento primário da microglia de cérebros de camundongos pós-natais

Isolamento primário da microglia de cérebros de camundongos pós-natais

Células estromais mesenquimais derivadas de tecido adiposo co-cultivadas com glia mista primária para reduzir a inflamação induzida por príons

Células estromais mesenquimais derivadas de tecido adiposo co-cultivadas com glia mista primária para reduzir a inflamação induzida por príons

Células estromais mesenquimais derivadas de tecido adiposo co-cultivadas com glia mista primária para reduzir a inflamação induzida por príons

Isolamento de Astrócitos Puros e Microglia da Medula Espinhal de Camundongos Adultos para Ensaios In Vitro e Estudos Transcriptômicos