Adult spinal cord mixed cultures were first developed using rats with grant support from an NIH/NIDA R01 award (PI De Leo) and an NIH T32 training grant (PI Green). These methods were further adapted for mouse spinal cords with support from the following grants: NIH/NIDA 5K01DA023503 (PI Cao), NIH/NINDS 5R21NS066130 (PI Cao), and NIH/NIGMS P20GM103643 (PI Meng). The authors would also like to thank Dr. Alejandro M. S. Mayer, Department of Pharmacology, Chicago College of Osteopathic Medicine, for his technical help in obtaining microglia-rich mixed glial cells.

Il seguente protocollo è stato approvato dal Comitato Istituzionale Animal Care e Usa (IACUC) presso l&#39;Università del New England. Il seguente protocollo è per la preparazione di colture gliali da 4 adulti topo midollo spinale. 1. preparazione di soluzioni in una cappa di coltura in condizioni asettiche <ol><li> Preparare terreni di coltura: modifica completa Dulbecco dei mezzi di Eagle (cDMEM) contenente DMEM (con 4,5 g / L di glucosio), il 10% siero fetale bovino (FBS), 2 mM L-glutammina, 100 UI / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina , 250 ng / mL Amfotericina B, e 50 mM 2-mercaptoetanolo (2-ME; vedi 1.1.1). Mescolare e filtrare sterilizzare tutti gli altri componenti e quindi aggiungere FBS. Conservare il terreno di coltura a 4 ° C. <ol><li> Preparare 50 mm 2-ME / PBS soluzione madre (PBS): aggiungere 100 ml di concentrato 2-ME (14.3 M) in 28,6 ml di PBS 1x, e sterilizzare il filtro (la soluzione può essere conservato a 4 ° C per diversi mesi). USE 1 ml di 2-ME soluzione di riserva per ogni 1.000 ml di terreni di coltura. </li></ol></li><li> Preparazione del supporto gradiente di densità <ol><li> Preparare uno stock isotonica soluzione multimediale gradiente di densità (ad esempio, 100% Percoll) da 1 parte di 10x normale PBS sterile e 9 parti dei media pendenza sterile magazzino densità (ad esempio, Percoll). </li><li> Diluire il supporto gradiente di densità 100% (fatto in 1.2.1) con regolare 1x PBS sterile per fare un supporto gradiente di densità del 20% (ad esempio, 10 ml di 100% dei media gradiente di densità con 40 ml di PBS 1x) e conservarlo a 4 o C. Portare il supporto gradiente di densità 20% a temperatura ambiente (RT) prima di preparare la coltura cellulare. </li></ol></li><li> Preparazione delle soluzioni dal sistema di dissociazione papaina NOTA: Il sistema di dissociazione papaina può essere identificato nella tabella materiali. Altri kit dissociazione simili (compresi quelli assemblati in-house) possono anche essere utilizzati. Tutti ComponeNTS devono essere sterili. <ol><li> Aggiungere 32 ml di soluzione salina bilanciata di Earle (EBSS) alla miscela inibitore ovomucoid (polvere). </li><li> Aggiungere 5 ml di EBSS di un flaconcino papaina (polvere). Posizionare la fiala papaina a 37 o C bagnomaria per 10 minuti o fino a quando la papaina è sciolto. </li><li> Aggiungere 500 ml di EBSS di un flaconcino DNasi (polvere). Mescolare delicatamente. </li><li> Aggiungere 250 ml di soluzione di DNasi (sopra) al flaconcino papaina. </li><li> Calcolare la quantità totale di quanto sopra miscela papaina / DNasi necessario (circa 800 ml di papaina / miscela DNasi per il mouse midollo spinale) e trasferire la miscela necessaria in un tubo da 50 ml per la digestione del tessuto (punto 3.2). Conservare il rimanente nel flacone originale a 4 ° C per almeno due settimane. </li><li> Tenere tutti i componenti dei kit in ghiaccio fino al momento dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Preparare provette per il prelievo del midollo spinale: una provetta sterile 15 ml con 5 ml di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS, dal sistema di papaina di dissociazione,0; per la raccolta di midollo spinale) e una sterile 15 ml di tubo con PBS 1x (per riempire la siringa da 5 ml, vedere il punto 2.4). Inoltre, preparare una piastra di Petri sterile (35 mm o 60 mm) con 5 ml di HBSS e tenerlo nella cappa coltura. </li></ol> 2. midollo spinale Collection NOTA: Tutte le attrezzature devono essere sterili. Eseguire la collezione in una zona designata approvato dal IACUC. <ol><li> Ottenere i seguenti strumenti per la raccolta di topo midollo spinale: diritto / smussato forbici chirurgiche affilate 18 cm, un bisturi da 12 cm standard (3 solid #), in acciaio al carbonio sterili lame di bisturi # 10, un piccolo Decapitator animali, standard di 12 cm curvo forcipe, e un ago 20G sterili attaccato ad una siringa da 5 mL. </li><li> Eutanasia l&#39;animale con CO 2 e disinfettare la testa del mouse e la regione posteriore con il 70% di etanolo (EtOH). </li><li> Decapitare animale con il Decapitator. Fare un incisione longitudinale centrale sulla parte bassa della schiena per esporre lo strato muscolare. Rendereuna transezione pulita attraverso la colonna vertebrati a livello dell&#39;anca (taglio anche attraverso lo strato muscolare che copre la colonna vertebrato) con le forbici chirurgiche rette sterili (18 cm). </li><li> Posto l&#39;animale su un foglio di fresco salvietta monouso. Inserire con attenzione il 20 ago G (attaccato ad una siringa da 5 ml riempita con sterile 1x PBS (punto 1.4)) nella colonna vertebrale verso il lato rostrale. Tenere l&#39;animale verso il basso con forza e spingere la siringa in fretta. L&#39;intero midollo spinale dovrebbe uscire dalla fine cervicale. Raccogliere il midollo spinale nel tubo da 15 ml contenente HBSS. </li><li> Ripetere il passaggio 2.4 per il resto dei topi. Tra ogni animale, disinfettare tutti gli strumenti utilizzati con il 70% EtOH. NOTA: in genere, un unico 12-pozzetti può essere stabilita per ogni 4 topo midollo spinale (vedi 4.3). </li></ol> 3. Preparazione della cella singola sospensione Nota: Eseguire i punti 3 e 4 in una cappa di coltura per tenere tutto sterile. <ol><li> Trasferire tutti i midolli spinali nella capsula di Petri HBSS contenente (passo 1,4). Tagliare ciascuno dei midollo spinale in tanti sottili, piccoli pezzi con le forbici e pinze sterili. Trasferire il tessuto del midollo spinale al tubo conico da 50 ml contenente la papaina preparato / miscela di enzimi DNasi (fase 1.3.5) utilizzando una pinza sterile o un mL pipetta 10 (evitare di aggiungere HBSS alla miscela di enzimi, in modo da diluire ulteriormente il preparato soluzione enzimatica e può causare una riduzione delle prestazioni di enzima). </li><li> Agitare la provetta delicatamente per miscelare. Incubare la provetta a 37 ° C per 1 h in un incubatore / agitatore orbitale con agitazione a 150 rpm. </li><li> Vortex la provetta nuovo e vigorosamente triturare soluzione enzimatica con il tessuto utilizzando una mL pipetta 5 per promuovere ulteriormente la dissociazione. </li><li> Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 ml e centrifugare a 300 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Durante la centrifugazione, mescolare 2,7 mL EBSS con 300 ml di ricostituito inh albumina-ovomucoidsoluzione ibitor (1.3.1) in una provetta sterile. Aggiungere 150 ml di soluzione di DNasi (fase 1.3.3). </li><li> Dopo la centrifugazione, rimuovere il supernatante e risospendere il pellet cellulare con la soluzione così preparata (punto 3.5). Vortex bene per rompere il pellet. </li><li> Aggiungere 3 ml di soluzione ricostituita di albumina-ovomucoid inibitore (fase 1.4.1) alla sospensione cellulare. cellule centrifugare a 70 xg per 6 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante (che contiene frammenti di membrana). </li></ol> 4. ulteriore rimozione della mielina dalla cella singola sospensione <ol><li> Aggiungere 8 ml di terreni gradiente di densità 20% (preparato secondo il punto 1.2.2) nella provetta contenente il pellet cellulare, vortex delicatamente per disturbare il pellet e centrifugare le cellule a 800 xg per 30 min a RT senza frenare. Rimuovere con attenzione lo strato superiore di detriti (per lo più mielina) e il surnatante, ma mantenere il pellet. </li><li> Per rimuovere residui del gradiente di densità, lavare le cellule resuspending il pellet cellulare con 8 mL di una cDMEM diluito (1 parte cDMEM e 2 parti HBSS). Centrifugare le cellule a 400 xg per 10 min a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e lavare le cellule di nuovo con il cDMEM diluito (sopra) nello stesso modo. Mantenere le cellule in ghiaccio fino al loro semina. </li><li> Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in terreni di coltura (cDMEM fornito con 2-ME (preparata al punto 1.1)). Per un 12-pozzetti, usare 3 ml x 4 (numero di topi utilizzati) + 2 ml = 14 ml di media. Questo farà sì che vi sia sospensione cellulare sufficiente per l&#39;intera piastra (12 pozzetti) e fornirà per pozzi aggiuntivi che possono essere utilizzati per determinare il numero di cellule per pozzetto medio e il contenuto microglia della cultura. Se vengono utilizzati altri tipi di recipienti di coltura, calcola il volume totale dei terreni di coltura necessaria proporzionalmente. </li><li> Aggiungere 1 ml di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una piastra 12 pozzetti. </li><li> Incubare le cellule a 35,9 ° C con 5% di CO 2. </li><li&gt; Modifica dei media (rimuovere vecchi media tramite aspirazione) su D 1 e poi ogni 3 - 4 D in seguito (in genere a cambiare la media su D: 1, 4, 8, e 11, e quindi utilizzare le celle il giorno 12). NOTA: Il giorno 1, la cultura può contenere significative quantità di detriti a causa della mielina residuo dal tessuto del midollo spinale; in tal modo, cambiando i media il giorno 1 è raccomandata (si veda la discussione per ulteriori informazioni). Le culture sono pronto per il trattamento tra il D 12 - 14. Le cellule sono di solito 80% confluenti in D 12 e può essere vicino al 100% confluenti da D 14. In genere, il D 12, ci sono circa 100.000 cellule per bene in un 12-pozzetti . </li></ol><img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54801/54801fig4.jpg" /> Figura 2:. Immagini rappresentative di cellule gliali miste in tempi diversi dopo l&#39;istituzione della cultura glia mista glia misti midollo spinale primarie sono stati preparati da adulti topi C57BL / 6. immagini rappresentativemostrare lo stato di avanzamento della cultura gliali dopo la placcatura. Al giorno 1, alcune cellule sono attaccati alla piastra di coltura, ma sono ancora in gran parte intorno. Ci sono anche molte cellule galleggianti e detriti significativa. Al giorno 4, la maggior parte delle cellule sono attaccati alla piastra di coltura. Le cellule appaiono ramificata con i processi visibili. Le cellule sono sporadicamente distribuite e culture sono circa il 20-30% confluenti in questo momento. Al giorno 8, le culture sono tra il 50-60% confluenti. Alcune aree delle culture hanno grandi macchie di cellule. Altre aree delle culture hanno una crescita scarsa di cellule. Alcune cellule all&#39;interno delle zone assumono un aspetto &quot;piazza-like&quot;. Al giorno 12, le culture sono uguali o superiore a 80% confluenti (circa il 90% confluenti nell&#39;immagine mostrato qui). Cellule sono in fase di log di crescita in questo momento e tra giorni 12-14 è il momento ottimale per l&#39;utilizzo delle cellule gliali per gli esperimenti. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54801/54801fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare un</a>grande versione di questa figura. <ol start="7"><li> Esaminare il contenuto utilizzando cellule microgliali dai pozzetti supplementari (punto 4.3) tramite standard di celle a fluorescenza-attivato (FACS) protocollo di colorazione 11 utilizzando la combinazione di anti-topo-CD45 e anticorpi monoclonali anti-topo CD11b. Cellule CD45 + CD11b + sono identificati come microglia. </li></ol>

<ol>
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T., Maddula, S., Bell, H., Cao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+calcitonin+gene-related+peptide+and+CCL2+production+in+CD40-mediated+behavioral+hypersensitivity+in+a+model+of+neuropathic+pain.">Involvement of calcitonin gene-related peptide and CCL2 production in CD40-mediated behavioral hypersensitivity in a model of neuropathic pain.</a> Neuron Glia Biol. 7 (2-4), 117-128 (2011).</li><li>Blasi, E., Barluzzi, R., Bocchini, V., Mazzolla, R., Bistoni, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+of+murine+microglial+cells+by+a+v-raf+/+v-myc+carrying+retrovirus.">Immortalization of murine microglial cells by a v-raf / v-myc carrying retrovirus.</a> J Neuroimmunol. 27 (2), 229-237 (1990).</li><li>Bocchini, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immortalized+cell+line+expresses+properties+of+activated+microglial+cells.">An immortalized cell line expresses properties of activated microglial cells.</a> J Neurosci Res. 31 (4), 616-621 (1992).</li><li>Alliot, F. O., Marty, M. C., Cambier, D., Pessac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spontaneously+immortalized+mouse+microglial+cell+line+expressing+CD4.">A spontaneously immortalized mouse microglial cell line expressing CD4.</a> Dev Brain Res. 95 (1), 140-143 (1996).</li><li>Alliot, F. O., Pessac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+cell+clones+derived+from+established+cultures+of+8-day+postnatal+mouse+cerebella.">Astrocytic cell clones derived from established cultures of 8-day postnatal mouse cerebella.</a> Brain Res. 306 (1-2), 283-291 (1984).</li><li>Malon, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+content-dependent+inhibitory+effects+of+calcitonin+gene-related+peptide+(CGRP)+on+murine+retroviral+infection+of+glial+cells.">Microglial content-dependent inhibitory effects of calcitonin gene-related peptide (CGRP) on murine retroviral infection of glial cells.</a> J Neuroimmunol. 279, 64-70 (2015).</li><li>Cao, L., DeLeo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNS+Infiltrating+CD4(+)+T+lymphocytes+Contribute+to+Murine+Spinal+Nerve+Transection-Induced+Neuropathic+Pain.">CNS Infiltrating CD4(+) T lymphocytes Contribute to Murine Spinal Nerve Transection-Induced Neuropathic Pain.</a> Eur J Immunol. 38 (2), 448-458 (2008).</li><li>Mayer, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+a+short-term+in+vitro+exposure+to+the+marine+toxin+domoic+acid+on+viability,+tumor+necrosis+factor-alpha,+matrix+metalloproteinase-9+and+superoxide+anion+release+by+rat+neonatal+microglia.">Effect of a short-term in vitro exposure to the marine toxin domoic acid on viability, tumor necrosis factor-alpha, matrix metalloproteinase-9 and superoxide anion release by rat neonatal microglia.</a> BMC Pharmacol. 1, 7 (2001).</li><li>Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+the+distribution+and+morphology+of+microglia+in+the+normal+adult+mouse+brain.">Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain.</a> Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).</li><li>Rock, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Microglia+in+Central+Nervous+System+Infections.">Role of Microglia in Central Nervous System Infections.</a> Clin Microbiol Rev. 17 (4), 942-964 (2004).</li><li>Yang, I., Han, S. J., Kaur, G., Crane, C., Parsa, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Microglia+in+Central+Nervous+System+Immunity+and+Glioma+Immunology.">The Role of Microglia in Central Nervous System Immunity and Glioma Immunology.</a> J Clin Neurosci. 17 (1), 6-10 (2010).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

È fondamentale per eseguire tutte le operazioni, tra cui il supporto cambiando pianificazione in modo coerente per ottenere risultati riproducibili tra esperimenti. I seguenti passaggi sono particolarmente critico per ottenere un&#39;eccellente qualità adulta glia misto. La digestione enzimatica è un aspetto importante di questo protocollo. E &#39;fondamentale che i pezzi di tessuto sono ben digeriti in modo da ottenere una sospensione di cellule singole. Tuttavia, over-digestione comport...

Il dolore cronico è un grave problema di salute che colpisce circa 100 milioni di adulti negli Stati Uniti, con un costo annuo stimato di un massimo di $ 635.000.000.000 1. Prove di montaggio ha indicato un contributo significativo di cellule gliali cordone spinale nello sviluppo del dolore neuropatico, uno dei più devastanti tipi di dolore cronico 2. Una corretta vitro sistema di coltura in aiuterebbe in maniera significativa nelle indagini ulteriormente i ruoli delle cellule gliali a livello cellulare e molecolare. Attualmente, le vitro gliali sistemi di coltura utilizzati dai ricercatori includono cellule gliali principalmente derivate da tessuti corticali di topo o ratto cervelli neonatali e immortalati linee di cellule gliali derivate da topo neonatale o ratto cellule gliali primarie. cellule neonatali contengono un numero significativo di cellule indifferenziate che possono essere ulteriormente differenziate in cellule gliali (soprattutto astrociti e microglia), fornendo così uncellule bundant per l&#39;utilizzo sperimentale 3. Tuttavia, il nostro studio precedente ha dimostrato che il cervello neonatale cellule gliali hanno risposto significativamente diverso dalle cellule gliali cordone spinale adulto su lipopolisaccaride (LPS) stimolazione. Ad esempio, l&#39;interleuchina (IL) -4 visualizzata migliorata effetti inibitori sulla ossido nitrico LPS-indotta (NO) la produzione nel ratto adulto midollo spinale glia rispetto al neonatale cervello glia 4. Inoltre, i profili di produzione di chemochine su di stimolazione da parte di un neuropeptide, la calcitonina peptide correlato al gene (CGRP), sono indiscutibilmente differenti tra topo neonatale glia cervello (metodi descritti in Rif. 5) e di topo adulto midollo spinale glia (Figura 1). Linee cellulari stabilizzate sono facili da usare e mantenere e possono fornire un gran numero di cellule in un breve periodo di tempo. In generale, immortalate linee cellulari vengono generati sia utilizzando un sistema immortalizzazione virus-mediata (ad esempio la linea di cellule microgliali diffuso BV2) 6, 7 o dopo the l&#39;identificazione di trasformazione spontanea (come la linea cellulare astrociti C8-D1A e la linea di cellule microgliali C8-B4) 8, 9 linee cellulari sono eccellenti in studio delle caratteristiche molecolari di astrociti e microglia individualmente.; tuttavia, i risultati ottenuti da linee cellulari richiedono sempre ulteriore validazione in cellule primarie o in condizioni in vivo. Va inoltre notato che non c&#39;è stata una relazione di una linea cellulare gliale derivato da un roditore glia del midollo spinale. Per aiutare indagare il ruolo delle cellule cavo gliali spinale nello sviluppo del dolore neuropatico, un sistema di coltura derivato dal topo adulto midollo spinale è stato sviluppato adattando un metodo precedentemente segnalato utilizzato per generare ratto adulto colture gliali miste 4, 5 . La cultura gliale midollo spinale di topo è stata ulteriormente raffinata recente 10 ed è descritta in dettaglio in questo articolo. Adulti midollo spinale mescolato culture gliali cun essere stabilita con un mouse da ceppi selezionati che si adattano alle esigenze di un particolare studio, e le cellule possono essere mantenute in coltura per un massimo di 21 D postare l&#39;inizio della cultura. Questo metodo può essere usato in studi di dolore neuropatico, nonché in ricerche di varie malattie neurologiche che comportano cambiamenti patologici all&#39;interno del midollo spinale, come la sclerosi laterale amiotrofica (SLA), virus dell&#39;immunodeficienza umana (HIV) -associated neuropatia sensoriale, e multipla La sclerosi (MS).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="2053">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:489px;">Dulbecco&#8217;s modification of Eagle&#8217;s media (DMEM) with 4.5g/L glucose</td>
			<td style="width:277px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">12-709F</td>
			<td style="width:1168px;">The cDMEM media is a standard, widely used culture media. Individual researcher can decide where to purchase the DMEM and all other component used to make cDMEM media.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">L-Glutamine (100x)</td>
			<td style="width:277px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">17-605E</td>
			<td>The L-glutamine is a standard, widely used component for various culture media. Individual researcher can decide where to purchase L-glutamine.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:489px;">Antibiotic-Antimycotic Solution (100x)</td>
			<td style="width:277px;">Corning-Mediatech</td>
			<td style="width:119px;">30-004-CI</td>
			<td>This is a combination of penicillin, streptomycin and Amphotericin formulated to contain 10,000 units/ml penicillin G, 10 mg/ml streptomycin sulfate and 25 &#181;g/ml amphotericin B. Individual researcher can decide where to purchase individual component.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">2-mercaptoethanol (2-ME)</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M3148</td>
			<td>A BioReagent, suitable for cell culture, molecular biology and electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Papain dissociation system</td>
			<td style="width:277px;">Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LK003150</td>
			<td>Individual components of this kit can be purchased separately.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:489px;">Percoll</td>
			<td>GE Health Care</td>
			<td style="width:119px;">17-0891-01</td>
			<td>Percoll is sold as sterile solution. Undiluted Percoll can be re-autoclaved if needed.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:489px;">Lab-line incubator/shaker&#160;</td>
			<td style="width:277px;">Barstead/Lab-line</td>
			<td style="width:119px;">MaxQ4000&#160;</td>
			<td>This is the incubator/shaker we have currently. Other types of shakers can be used instead.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:489px;">Lipopolysaccharides, Salmonella Minnesota Re595&#160;</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L-9764</td>
			<td>Other strains of LPS can also induce glial responses. The magnitude of the responses may vary.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">Mouse IL-6 DuoSet ELISA&#160;</td>
			<td style="width:277px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">DY406</td>
			<td>Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">Mouse TNF-alpha DuoSet ELISA</td>
			<td style="width:277px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">DY410</td>
			<td>Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">Mouse IP-10 (CXCL10) DuoSet ELISA</td>
			<td style="width:277px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">DY466</td>
			<td>Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">Mouse MCP-1 (CCL2) ELISA Opteia set</td>
			<td style="width:277px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">555260</td>
			<td>Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">Mouse chemokine Q-Plex</td>
			<td style="width:277px;">Quansys Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">120251MS</td>
			<td>This product was available for in-house assay at the time. Instead, we sent out samples to the manufacturer for analysis.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">APC-anti-mouse-CD45 (clone 30-F11)</td>
			<td style="width:277px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">17-0451</td>
			<td>Antibody of the same clone but from other vendors can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">FITC-anti-mouse-CD11b (clone M1/70)</td>
			<td style="width:277px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">11-0112</td>
			<td>Antibody of the same clone but from other vendors can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">Accuri C6 flow cytometer</td>
			<td style="width:277px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">BD Accuri C6&#160;</td>
			<td>Each individual Researcher can use any flow cytometer he or she prefers.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">FlowJo software</td>
			<td style="width:277px;">Tree Star, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">FlowJo7.6.5</td>
			<td>Each individual Researcher can use any analysis software he or she prefers.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of primary mixed glial cultures from adult mouse spinal cord tissue

È stato ben accettato che midollo spinale risposte gliali contribuiscono significativamente allo sviluppo del dolore neuropatico. Informazioni enorme per quanto riguarda attività gliali a livello cellulare e molecolare è stata ottenuta attraverso sistemi di colture cellulari in vitro. I sistemi in vitro utilizzati, includono principalmente glia primarie derivate da tessuto corticale cerebrale neonatale e immortalati linee cellulari. Tuttavia, questi sistemi potrebbero non riflettere le caratteristiche delle cellule gliali cordone spinale in vivo. Per studiare ulteriormente il ruolo delle cellule del cavo gliali spinale nello sviluppo del nervo periferico dolore neuropatico lesione indotta utilizzando un sistema di coltura che riflette meglio la condizione in vivo, il nostro laboratorio ha sviluppato un metodo per stabilire primaria del midollo spinale culture gliali miste da topi adulti. In breve, il midollo spinale si raccolti da topi adulti e trattati tramite digestione papaina seguita dalla rimozione mielina con tanelità-pendenza media. Sospensioni cellulari singoli sono coltivate in mezzi di Eagle modificato di Dulbecco completa (cDMEM) supplementato con 2-mercaptoetanolo (2-ME) a 35,9 ° C. Queste condizioni di coltura sono state ottimizzate specificamente per la crescita delle cellule gliali miste. In queste condizioni, le cellule sono pronte per essere utilizzati per la sperimentazione tra 12 - 14 d (cellule di solito sono in fase di log durante questo tempo) dopo la creazione della coltura (D 0) e possono essere tenuti in condizioni di coltura fino a D 21. Questo sistema di coltura può essere usato per studiare le risposte delle cellule gliali cordone spinale dopo stimolazione con varie sostanze e agenti. Inoltre dolore neuropatico, questo sistema può essere usato per studiare le risposte gliali in altre malattie che coinvolgono alterazioni patologiche di cellule gliali cordone spinale.

Questo metodo può essere utilizzato per preparare cellule gliali miste sia da topi e ratti. Il numero di cellule totale medio per bene in un 12-pozzetti su D 12 post-iniziale della cultura dovrebbe essere relativamente stabile, con circa 100.000 cellule per bene quando le cellule sono derivate da midollo spinale di topo. Le cellule gliali ottenute da questo metodo possono essere utilizzati in esperimenti che sono stati progettati per esaminare adulti spinale risposte cavo gliali la somm...

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Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

Lo sviluppo del dolore neuropatico comporta alterazioni patologiche delle cellule gliali cordone spinale. Un affidabile sistema di coltura gliali derivate da tessuto del midollo spinale adulto e progettato per studiare queste cellule in vitro è carente. Pertanto, mostriamo qui come stabilire colture gliali miste primarie di topo adulto tessuto del midollo spinale.

Preparazione delle colture gliali miste primarie da adulti mouse spinale tessuto del midollo

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.5K Views.  University of New England.  Lo sviluppo del dolore neuropatico comporta alterazioni patologiche delle cellule gliali cordone spinale. Un affidabile sistema di coltura gliali derivate da tessuto del midollo spinale adulto e progettato per studiare queste cellule in vitro è carente. Pertanto, mostriamo qui come stabilire colture gliali miste primarie di topo adulto tessuto del midollo spinale. 

Video: Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissezione e la cultura di neuroni embrionali commissurali da midollo spinale

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Ricerca

Neuroscienze

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to network properties. We show how to prepare viable oblique slices of the spinal cord of young mice (P2 - P11). In this preparation, the motoneurons retain&#160;their axons coming out from the ventral roots of the&#160;spinal cord. Stimulation of these axons elicits back-propagating action potentials invading the motoneuron&#160;somas and exciting the motoneuron&#160;collaterals within the spinal cord. Recording of antidromic action potentials is an immediate, definitive and elegant way to characterize motoneuron identity, which surpasses&#160;other identification methods. Furthermore, stimulating the motoneuron collaterals is a simple and reliable way to excite the collateral targets of the motoneurons within the spinal cord, such as other motoneurons or Renshaw cells. In this protocol, we present antidromic recordings from the motoneuron somas as well as Renshaw cell excitation, resulting from ventral root stimulation.

We show how to prepare oblique slices of the spinal cord in young mice. This preparation allows for the stimulation of the ventral roots.

La preparazione di Oblique Spinal Cord Fette per ventrale Root Stimolazione

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

zebrafish<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Preparazione per elettrofisiologiche Le registrazioni da spinale sensoriali e motori neuroni

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

Isolamento e cultura dei neuroni del midollo spinale da topi neonatali

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Imaging di attività neurale nella corteccia somatosensoriale primaria utilizzando Thy1-topi transgenici GCaMP6s

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated digital vaporizer is utilized to achieve a stable plane of anesthesia at a low-flow rate of isoflurane. A single vertebral spine is removed, and a commercially available cover-glass is overlaid on a thin agarose bed. A 3D-printed plastic backplate is then affixed to the adjacent vertebral spines using tissue adhesive and dental cement. A stabilization platform is used to reduce motion artifact from respiration and heartbeat. This rapid and clamp-free method is well-suited for acute multi-photon fluorescence microscopy. Representative data are included for an application of this technique to two-photon microscopy of the spinal cord vasculature in transgenic mice expressing eGFP:Claudin-5 &#8212; a tight junction protein.

This protocol describes implantation of a glass window onto the spinal cord of a mouse to facilitate visualization by intravital microscopy.

Laminectomia e impianto della finestra del cavo spinale nel mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a powerful tool for studying transcriptional profiles of cells, particularly in heterogeneous tissues such as the central nervous system. However, dissociation methods required for single cell sequencing can lead to experimental changes in the gene expression and cell death. Furthermore, these methods are generally restricted to fresh tissue, thus limiting studies on archival and bio-bank material. Single nucleus RNA sequencing (snRNA-Seq) is an appealing alternative for transcriptional studies, given that it accurately identifies cell types, permits the study of tissue that is frozen or difficult to dissociate, and reduces dissociation-induced transcription. Here, we present a high-throughput protocol for rapid isolation of nuclei for downstream snRNA-Seq. This method enables isolation of nuclei from fresh or frozen spinal cord samples and can be combined with two massively parallel droplet encapsulation platforms.

Here, we present a protocol to rapidly isolate high-quality nuclei from the fresh or frozen tissue for downstream massively parallel RNA sequencing. We include detergent-mechanical and hypotonic-mechanical tissue disruption and cell lysis options, both of which can be used for isolation of nuclei.

Isolamento dei Nuclei del midollo spinale adulto per il sequenziamento massivamente parallelo Single-nucleo RNA

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

Consegna intra-arteriosa di cellule staminali neurali al cervello di ratto e topo: applicazione all'ischemia cerebrale

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. Microglia can adopt a large spectrum of activation phenotypes. Moreover, microglia that endorse pro-inflammatory phenotype is associated with both neurodevelopmental and neurodegenerative disorders. In vitro studies are widely used in research to evaluate potential therapeutic strategies in specific cell types. In this context studying microglial activation and neuroinflammation in vitro using primary microglial cultures is more relevant than microglial cell lines or stem-cell-derived microglia. However, the use of some primary cultures might suffer from a lack of reproducibility. This protocol proposes a reproducible and relevant method of magnetically isolating microglia from neonate pups. Microglial activation using several stimuli after 4 h and 24 h by mRNA expression quantification and a Cy3-bead phagocytic assay is demonstrated here. The current work is expected to provide an easily reproducible technique for isolating physiologically relevant microglia from juvenile developmental stages.

Primary microglia cultures are commonly used to evaluate new anti-inflammatory molecules. The present protocol describes a reproducible and relevant method to magnetically isolate microglia from neonate pups.

Isolamento magnetico di cellule microgliali da topo neonato per colture cellulari primarie

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. ...

Electromagnetic Controlled Closed-Head Model of Mild Traumatic Brain Injury in Mice

Highly reproducible animal models of traumatic brain injury (TBI), with well-defined pathologies, are needed for testing therapeutic interventions and understanding the mechanisms of how a TBI alters brain function. The availability of multiple animal models of TBI is necessary to model the different aspects and severities of TBI seen in people. This manuscript describes the use of a midline closed head injury (CHI) to develop a mouse model of mild TBI. The model is considered mild because it does not produce structural brain lesions based on neuroimaging or gross neuronal loss. However, a single impact creates enough pathology that cognitive impairment is measurable at least 1 month after injury. A step-by-step protocol to induce a CHI in mice using a stereotaxically guided electromagnetic impactor is defined in the paper. The benefits of the mild midline CHI model include the reproducibility of the injury-induced changes with low mortality. The model has been temporally characterized up to 1 year after the injury for neuroimaging, neurochemical, neuropathological, and behavioral changes. The model is complementary to open skull models of controlled cortical impact using the same impactor device. Thus, labs can model both mild diffuse TBI and focal moderate-to-severe TBI with the same impactor.

The protocol describes mild traumatic brain injury in a mouse model. In particular, a step-by-step protocol to induce a mild midline closed head injury and the characterization of the animal model is fully explained.

Modello elettromagnetico controllato a testa chiusa di lieve lesione cerebrale traumatica nei topi

Highly reproducible animal models of traumatic brain injury (TBI), with well-defined pathologies, are needed for testing therapeutic interventions and ...