Name: preparation of primary mixed glial cultures from adult mouse spinal cord tissue
Uploaded: 2016-11-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
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Adult spinal cord mixed cultures were first developed using rats with grant support from an NIH/NIDA R01 award (PI De Leo) and an NIH T32 training grant (PI Green). These methods were further adapted for mouse spinal cords with support from the following grants: NIH/NIDA 5K01DA023503 (PI Cao), NIH/NINDS 5R21NS066130 (PI Cao), and NIH/NIGMS P20GM103643 (PI Meng). The authors would also like to thank Dr. Alejandro M. S. Mayer, Department of Pharmacology, Chicago College of Osteopathic Medicine, for his technical help in obtaining microglia-rich mixed glial cells.

다음 프로토콜은 뉴 잉글랜드 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다. 다음 프로토콜은 4 성인 마우스 척수에서 아교 문화를 준비입니다. 무균 조건 하에서 문화 후드에서 솔루션 1. 준비 <ol><li> 배양 배지를 준비 : 이글 미디어 (cDMEM) DMEM을 함유하는 완전한 둘 베코 변형 10 % 태아 소 혈청 (FBS), 2 mM L- 글루타민, 100 IU / ㎖ 페니실린 (4.5 g / L의 포도당), 100 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신 250 NG / ㎖의 암포 테리 신 B, 및 50 μM 2- 머 캅토 에탄올 (2-ME는, 1.1.1 참조). 믹스와 다른 모든 구성 요소를 소독 필터링하고 FBS를 추가합니다. 4 오 ℃에서 배양 배지를 저장 <ol><li> 50 ㎜ × 2-ME / 인산 완충 식염수 (PBS) 스톡 용액을 제조 하였다 : 100 ㎕를 추가 농축 2 ME 28.6 1X PBS mL를 필터 소독 (용액을 4 ℃로 저장 될 수로 (14.3 M) 몇 달). 유문화 미디어의 1,000 mL의 2-ME 원액의 자체 1 mL를. </li></ol></li><li> 밀도 구배 매체의 제조 <ol><li> 주식 등장 밀도 구배 매체 용액을 제조 하였다 (예를 들어, 100 % 퍼콜) 1 부 배 정규 멸균 PBS 9 부 멸균 스톡 밀도 구배 매체 (예를 들어, 퍼콜) 발. </li><li> 20 %의 밀도 구배 매체 (예를 들면, 1X PBS 40 mL로 100 % 밀도 구배 배지 10 mL)을 만들기 위해 정기적 1X 멸균 PBS로 (1.2.1 제) 100 % 밀도 구배 매체를 희석 4에서 보관 오 C. 세포 배양을 준비하기 전에, 실온 (RT) 내지 20 % 밀도 구배 매체를 준비한다. </li></ol></li><li> 파파인 해리 시스템에서 용액의 제조 주 : 파파인 해리 시스템은 자료 표에서 확인할 수있다. (자체 조립 포함) 다른 유사한 분리 키트를 사용할 수도있다. 모든 compone국세청은 멸균해야합니다. <ol><li> ovomucoid 억제제 혼합물 (분말)에 얼의 균형 소금 솔루션 (EBSS)의 32 ML을 추가합니다. </li><li> 하나 파파인 바이알 (분말)에 EBSS 5 mL를 추가합니다. 10 분 동안 또는 파파인이 용해 될 때까지 37 O를 C의 물을 욕조에있는 파파인 병을 놓습니다. </li><li> 한 DNase의 바이알 (분말)에 EBSS 500 μL를 추가합니다. 부드럽게 섞는다. </li><li> 파파인 유리 병에 DNase의 솔루션 (위) 250 μL를 추가합니다. </li><li> 필요한 상기 파파인 / DNase의 혼합물 (마우스 척수 당 파파인 / DNase의 혼합물을 약 800 μL)의 총량을 계산 및 조직 분해 (단계 3.2)에 대한 50 ㎖ 튜브에 필요한 혼합물을 옮긴다. 적어도 2 주 동안 4 ° C에서 원래 유리 병에 남은 저장합니다. </li><li> 필요할 때까지 얼음에 키트의 모든 구성 요소를 유지합니다. </li></ol></li><li> 척수 수집 튜브를 준비 하나 멸균 15ml의 튜브를 5 ㎖ 행크 균형 염 용액 (HBSS로의 상기 파파인 해리 시스템에서,0; 1X PBS와 척수)와 하나의 멸균 15 ML의 튜브를 수집 (5 ML의 주사기를 채우는) 단계 2.4를 참조하십시오. 또한, HBSS의 5 mL로 한 멸균 페트리 접시 (35mm 또는 60mm)를 준비하고 문화 후드에 보관합니다. </li></ol> 2. 척수 컬렉션 주 : 모든 장비는 멸균해야합니다. IACUC 승인 지정된 지역에서 컬렉션을 수행합니다. <ol><li> 수확 마우스 척수에 대한 다음과 같은 도구를 얻 바로 날카로운 / 무딘 18 cm 수술 가위, 12 cm 표준 메스 (# 3 고체), 탄소 강철 멸균 메스 블레이드 # 10, 작은 동물 decapitator, 12 cm 표준 곡선 겸자 및 멸균 20G 바늘 5 ml 주사기에 부착. </li><li> CO 2 동물을 안락사 마우스 헤드와 70 % 에탄올 (EtOH 중)과 후방 영역 소독. </li><li> decapitator과 동물의 목을 벨. 근육 층을 노출시키는 하부 후면 중간 세로 절개를. 하다엉덩이 수준에서 척추 칼럼을 통해 깨끗한 절개는 멸균 바로 수술 가위 (18cm)와 (또한 척추 열을 덮고있는 근육 층을 통해 절단). </li><li> 일회용 신선한 닦아 장에 동물을 배치합니다. 조심스럽게 주동이쪽으로 척추에 (멸균 1X PBS (단계 1.4)로 가득 찬 5 ML의 주사기에 부착) 20 G 바늘을 삽입합니다. 아래로 단단히 동물을 잡고 신속하게 주사기를 밀어 넣습니다. 전체 척수는 자궁 끝에서 나올 것이다. HBSS를 함유하는 15 ㎖의 튜브에 척수 수집. </li><li> 마우스의 나머지 단계를 반복 2.4. 각 동물 사이에, 70 % EtOH로 모든 중고 악기를 소독. 주 : 일반적으로, 12- 웰 플레이트는 매 4 마우스 척수 (4.3 참조)에 대해 설정 될 수있다. </li></ol> 단일 세포 현탁액 3. 준비 참고 : 무균 모든 것을 유지하기 위해 문화 후드의 단계 3과 4를 수행합니다. <ol><li> HBSS 함유 배양 접시 (단계 1.4)에 모든 척추 코드를 전송합니다. 멸균 가위와 집게로 많은 훌륭한, 작은 조각으로 척수의 각을 잘라. 이것이 상기 제조 된 희석 된 바와 같이 무균 핀셋 또는 10 ㎖ 피펫을 사용하여 제조 된 파파인 / DNase의 효소 혼합물 (단계 1.3.5)를 함유하는 50 mL의 원뿔 관 척수 조직을 트랜스퍼 (효소 혼합물로 HBSS를 추가하지 효소 용액과 효소의 성능이 저하 될 수 있습니다). </li><li> 섞어 부드럽게 튜브를 소용돌이. 궤도는 150 rpm으로 진탕 배양기 / 쉐이커에 1 시간 동안 37 ℃로 튜브를 품어. </li><li> 와류 튜브 다시 격렬 상기 해리를 촉진하기 위해 5 ㎖ 피펫을 사용하여 조직과 효소 용액을 씹다. </li><li> RT에서 5 분 동안 300 XG에 15 mL의 원심 분리 튜브에 세포 현탁액을 전송. </li><li> 원심 분리 동안, 재구성 알부민 ovomucoid INH 300 μL와 2.7 mL의 EBSS를 혼합멸균 튜브에 ibitor 용액 (1.3.1). DNase의 용액 (단계 1.3.3)의 150 μL를 추가합니다. </li><li> 원심 분리 후, 상등액을 제거하고 (단계 3.5) 상기 제조 한 용액과 세포 펠렛을 재현 탁. 소용돌이 잘 세포 펠렛을 깰 수 있습니다. </li><li> 세포 현탁액에 재구성 알부민 ovomucoid 방지 액 (단계 1.4.1)의 3 ML을 추가합니다. 실온에서 6 분 70 XG에 원심 분리기 세포. (막 조각을 포함) 상층 액을 제거합니다. </li></ol> 단일 세포 현탁액에서 미엘린 4. 또한 제거 <ol><li> 제동없이 RT에서 30 분 동안 800 XG에서 세포 펠렛을 방해 부드럽게 세포 펠렛을 함유하는 튜브에 와동 (단계 1.2.2에서 제조) 20 % 밀도 구배 매체 8 mL를 넣어 원심 분리. 조심스럽게 이물질 (주로 수초)과 상층 액의 상단 층을 제거하지만, 펠렛을 유지한다. </li><li> resuspendi로 세포를 씻어, 밀도 구배의 잔해를 제거하려면희석 된 cDMEM 8 ㎖ (1 부 cDMEM 2 부분 HBSS)으로 세포 펠렛 겨. 4 O ℃에서 10 분 동안 400 XG에 세포를 원심 분리기 상등액을 제거하고 동일한 방식으로 희석 된 cDMEM (위)로 다시 세포를 세척 하였다. 를 파종 할 때까지 얼음 세포를 유지합니다. </li><li> 상층 액을 제거하고 배양 배지에서 세포 펠렛을 재현 탁 (cDMEM이와 함께 제공되는 2-ME (단계 1.1에서 준비)). 한 12 웰 플레이트를 들어, 3 ㎖ × 4 (사용하는 마우스의 수) + 2 mL의 = 14 mL의 미디어를 사용합니다. 이것은 전체 판에 충분한 세포 현탁액 (12 웰)가 확인되며, 웰 당 평균 셀 수와 배양 소교 콘텐츠를 결정하는데 이용 될 수있는 추가 우물을 제공한다. 배양 용기의 다른 형태가 사용되는 경우, 비례 적으로 필요한 배양 배지의 총 체적을 계산한다. </li><li> 12 웰 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액 1 ㎖를 추가한다. </li><li> 5 % CO 2 35.9 ℃로 세포를 품어. </li><l4 D 후 (: 1, 4, 8, 11, 다음 날 12 일에 세포를 사용하여 일반적으로 D에 미디어를 변경) - 난&gt; D 1에 용지를 (흡입을 통해 이전 용지를 제거) 변경 후 매 3입니다. 주 : 1 일째에 배양 의한 척수 조직으로부터 잔류 미엘린에 파편 상당량 함유 할 수있다; 따라서, 1 일에 미디어를 변경 (자세한 내용은 토론 참조)을 권장합니다. D (12)에 잘 당 약 10 만 세포를 12 웰 플레이트에가, 14 셀 일반적으로 D 12에서 80 % 합류하고 일반적으로 D (14)에 의해 100 % 합류 근처가 될 수 - 문화 (12)은 D 사이의 치료를위한 준비 . </li></ol><img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54801/54801fig4.jpg" /> 그림 2 :. 혼합 아교 세포 문화의 설립 후 다른 시간에 혼합 된 아교 세포의 대표 이미지를 기본 척수 혼합 된 아교 세포는 성인 C57BL / 6 마우스에서 제조 하였다. 대표 이미지도금 후 아교 문화의 진행 상황을 보여줍니다. 1 일에, 일부 세포는 배양 접시에 부착하지만, 대부분은 여전히 ​​둥근된다. 부동 세포와 중요한 파편 많은도 있습니다. 4 일에, 세포의 대부분은 배양 플레이트에 부착된다. 세포는 눈에 보이는 프로세스와 분지 나타납니다. 세포는 산발적으로 분포되어 문화는 현재 약 20 ~ 30 %의 합류이다. 일 8시, 문화 50-60 %의 합류 사이. 문화의 일부 영역은 세포의 큰 패치가 있습니다. 문화의 다른 영역은 세포의 스파 스 성장을해야합니다. 패치 내에서 일부 세포는 &quot;광장 같은&quot;모습에 걸릴. 12 일째에, 배양 물 (여기에 도시 된 이미지에서, 약 90 %의 융합 성) 또는 80 % 이상 융합 성이다. 셀이 시점에서 성장의 로그 단계에와 12-14 실험의 신경교 세포를 사용하기위한 최적의 시간이다 일 사이입니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54801/54801fig4large.jpg" target="_blank">을 보려면 여기를 클릭하십시오</a>이 그림의 더 큰 버전. <ol start="7"><li> 안티 마우스 CD45 및 안티 마우스 CD11b를 단일 클론 항체의 조합을 사용하여 표준 형광 활성화 된 셀 정렬 (FACS) 염색 프로토콜 (11)를 통해 별도의 우물에서 세포를 (4.3 단계)를 사용하여 미세 아교 내용을 검사합니다. CD45 + CD11b를 + 세포는 미세 아교 세포로 식별됩니다. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

는 모든 단계를 포함한 실험 간 재현성있는 결과를 얻기 위해 일관된 방식으로 일정 변화 매체를 수행하는 것이 중요하다. 다음 단계는 우수한 품질의 성인 혼합 된 아교 세포를 얻기에 특히 중요하다. 효소 소화는이 프로토콜의 중요한 측면이다. 이 조직 조각을 단일 세포 현탁액을 얻기 위해서 잘 소화하는 것이 중요하다. 그러나, 오버 소화 상당히 적은 세포에서 발생합니...

만성 통증은 최대 $ (635) 10 억의 추정 연간 비용으로, 미국에서 약 1 억 성인에 영향을 미치는 심각한 건강 문제이다. 증거 확보는 신경 병증 통증, 만성 통증이 가장 파괴 한 가지의 개발 척수 신경교 세포의 상당한 기여를 표시하고있다. 적절한 시험 관내 배양 시스템은 세포 및 분자 수준에서 신경교 세포의 역할을 조사 크게 도움이 될 것이다. 현재 연구에서 사용되는 시험 관내 신경교 배양 시스템은 신생아 마우스 또는 쥐의 뇌 피질 조직 유래 주로 아교 세포를 포함하는 불멸화 및 신생아 마우스로부터 유도 된 아교 세포주 또는 일차 신경교 세포를 쥐. 신생아 세포 따라서를 제공, 추가 (주로 성상 세포 및 미세 아교 세포) 신경 교세포로 분화 할 수있는 미분화 세포의 큰 숫자를 포함실험 사용 3 bundant 세포. 그러나, 우리의 이전 연구는 신생아의 뇌 신경 교세포는 리포 폴리 사카 라이드 (LPS) 자극에 성인 척수 아교 세포에서 크게 다르게 반응 것으로 나타났습니다. 예를 들면, 인터루킨 (IL)는 -4 신생아의 뇌 신경교 4 비교 성숙한 래트 척수에서 신경교 (NO)의 생산 LPS 유도 된 산화 질소에 대한 억제 효과를 강화 표시됩니다. 또한, 유전자 관련 펩타이드 (CGRP) 칼시토닌 신경 펩티드에 의한 자극에 따라 케모카인 생산의 프로파일은, (5. 참고 문헌에 기술 된 방법) 신생 마우스의 뇌 신경교 사이 말할 나위 다른 성인 마우스 척수 신경교 (도 1). 확립 된 세포주를 사용 및 유지 관리가 용이하고 단시간에 다수의 셀을 제공 할 수있다. 일반적으로, 세포주를 생성하거나 6, 7, 또는 다음의 제 (예 널리 사용 소교 세포주 BV2 등) 바이러스 - 매개 불멸화 시스템을 사용하는 불멸화자발 변환의 전자 식별 (예 성상 세포주 C8-D1A 및 소교 세포주 C8-B4)를 8, 9 세포주 개별적 성상 세포 및 미세 아교 세포의 분자 적 특징을 연구하는데 우수하다.; 그러나, 세포주에서 얻어진 결과는 항상 주요 세포 또는 생체 내 조건에서의 추가 확인을 요구한다. 또한 설치류의 척수 아교에서 유래하는 아교 세포주 보고서가 없었던 것을 주목해야한다. 신경 병증 성 통증, 성인 쥐 혼합 신경교 배양 (4)를 생성하는 데 사용되는 이전에보고 된 방법을 적용하여 개발 된 성인 마우스 척수로부터 유래 배양 시스템 (5)의 개발 척수 신경교 세포의 역할을 조사하는 데 도움 . 마우스 척수 폐해 문화는 더 최근에 (10)를 정제하고,이 문서에 자세히 설명되어 있습니다. 성인 척수 혼합 폐해 문화의 C는 특정 연구의 요구에 맞게 선택된 균주로부터 마우스를 확립하고, 세포를 배양 개시 게시 d는 최대 21 명까지 배양 유지할 수있다. 이 방법뿐만 아니라 -associated 근 위축성 측삭 경화증 (ALS), 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) 감각 신경 병증, 복수 등의 척수 내 병리학 적 변화를 포함하는 다양한 신경 질환의 연구에서, 신경병 통증의 연구에 사용될 수있다 경화증 (MS).

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modification of Eagle&amp;rsquo;s media (DMEM) with 4.5 g/L glucose</td><td>Lonza</td><td>12-709F</td><td>The cDMEM media is a standard, widely used culture media. Individual researchers can decide where to purchase the DMEM and all other components used to make cDMEM media.</td></tr><tr><td>L-Glutamine (100x)</td><td>Lonza</td><td>17-605E</td><td>The L-glutamine is a standard, widely used component for various culture media. Individual researchers can decide where to purchase L-glutamine.</td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic Solution (100x)</td><td>Corning-Mediatech</td><td>30-004-CI</td><td>This is a combination of penicillin, streptomycin and Amphotericin formulated to contain 10,000 units/mL penicillin G, 10 mg/mL streptomycin sulfate and 25 &amp;micro;g/mL amphotericin B. Individual researchers can decide where to purchase individual components.</td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol (2-ME)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td>A BioReagent, suitable for cell culture, molecular biology and electrophoresis.</td></tr><tr><td>Papain dissociation system</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LK003150</td><td>Individual components of this kit can be purchased separately.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Health Care</td><td>17-0891-01</td><td>Percoll is sold as sterile solution. Undiluted Percoll can be re-autoclaved if needed.</td></tr><tr><td>Lab-line incubator/shaker&amp;nbsp;</td><td>Barstead/Lab-line</td><td>MaxQ4000&amp;nbsp;</td><td>This is the incubator/shaker we have currently. Other types of shakers can be used instead.</td></tr><tr><td>Lipopolysaccharides, &lt;em&gt;Salmonella Minnesota&lt;/em&gt; Re595</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-9764</td><td>Other strains of LPS can also induce glial responses. The magnitude of the responses though, may vary.</td></tr><tr><td>Mouse IL-6 DuoSet ELISA&amp;nbsp;</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>DY406</td><td>Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.</td></tr><tr><td>Mouse TNF-alpha DuoSet ELISA</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>DY410</td><td>Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.</td></tr><tr><td>Mouse IP-10 (CXCL10) DuoSet ELISA</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>DY466</td><td>Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.</td></tr><tr><td>Mouse MCP-1 (CCL2) ELISA Opteia set</td><td>BD Biosciences</td><td>555260</td><td>Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.</td></tr><tr><td>Mouse chemokine Q-Plex</td><td>Quansys Biosciences</td><td>120251MS</td><td>This product was not available for in-house assay at the time. Instead, we sent out samples to the manufacturer for analysis.</td></tr><tr><td>APC-anti-mouse-CD45 (clone 30-F11)</td><td>eBioscience</td><td>17-0451</td><td>Antibody of the same clone but from other vendors can be used.</td></tr><tr><td>FITC-anti-mouse-CD11b (clone M1/70)</td><td>eBioscience</td><td>11-0112</td><td>Antibody of the same clone but from other vendors can be used.</td></tr><tr><td>Accuri C6 flow cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>BD Accuri C6&amp;nbsp;</td><td>Each individual Researcher can use any flow cytometer he or she prefers.</td></tr><tr><td>FlowJo software</td><td>Tree Star, Inc.</td><td>FlowJo7.6.5</td><td>Each individual Researcher can use any analysis software he or she prefers.</td></tr></tbody></table>

preparation of primary mixed glial cultures from adult mouse spinal cord tissue

척수 신경교 반응은 신경 병증 통증의 발전에 크게 기여하는 것이 잘 인정되었다. 세포 및 분자 수준에서 신경교 활동에 대한 상당한 정보를 시험 관내 세포 배양 시스템을 통해 얻어진다. 사용 된 시험 관내 시스템은 주로 신생아의 뇌 피질 조직으로부터 유도 된 일차 신경교 포함 및 세포주 불멸. 그러나, 이러한 시스템은 생체 내에서 척수 신경교 세포의 특성을 반영하지 않을 수있다. 더 나은 생체 상태를 반영 배양 시스템을 이용하여 말초 신경 손상 - 유도 된 신경 병증 통증의 개발 척수 신경교 세포의 역할을 조사하기 위해, 우리 실험실에서 기본 척수 혼합 신경교 배양을 설정하는 방법을 개발했다 성인 마우스. 간단히, 척수는 성인 쥐에서 수집하고 굴과 수초 제거하여 파파인 소화를 통해 처리됩니다성만 구배 매체. 단일 세포 현탁액은 35.9 오 ℃에서 2- 머 캅토 에탄올 (2-ME) 보충 완전한 둘 베코의 변형 이글 미디어 (cDMEM)에서 배양 이러한 배양 조건은 혼합 아교 세포의 성장을 위해 특별히 최적화된다. 이러한 조건 하에서, 셀 (12) 사이의 실험에 사용될 준비가 - 14 일 배양의 설립 (D 0) 후 (셀이 기간 동안 로그 단계에서 일반적 임) 및 D (21)까지의 배양 조건에서 유지 될 수있다. 이 배양 시스템은 다양한 물질 및 제제로 자극시 척수 신경교 세포의 반응을 조사하기 위해 사용될 수있다. 신경 병성 통증 외에,이 시스템은 척수 신경교 세포의 병리학 적 변화를 포함하는 다른 질병의 폐해 반응을 연구하는데 사용될 수있다.

이 방법은 마우스 및 래트에서 모두 혼합 아교 세포를 제조 할 수있다. 세포가 마우스 척수에서 파생 된 때 문화의 D (12) 이후 개시에 12 웰 플레이트에 웰 당 평균 총 세포 수는 물론 당 약 10 만 세포와 상대적으로 안정해야한다. 이 방법에서 얻은 신경교 세포 물질 및 관심 제의 투여시 성인 척수 신경교 응답을 검사하도록 설계된 실험에 사용될 수있다. (3)가 ?...

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Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

신경 병성 통증의 개발 척수 신경교 세포의 병리학 적 변화를 수반한다. 시험관 내에서 이들 세포를 공부 성인 척수 조직으로부터 유래 설계된 신뢰성 신경교 배양 시스템이 부족하다. 따라서, 우리는 성인 마우스 척수 조직에서 차 혼합 된 아교 문화를 설정하는 방법을 여기에 표시됩니다.

성인 마우스 척수 조직에서 차 혼합 폐해 문화의 준비

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.5K 조회수.  University of New England.  신경 병성 통증의 개발 척수 신경교 세포의 병리학 적 변화를 수반한다. 시험관 내에서 이들 세포를 공부 성인 척수 조직으로부터 유래 설계된 신뢰성 신경교 배양 시스템이 부족하다. 따라서, 우리는 성인 마우스 척수 조직에서 차 혼합 된 아교 문화를 설정하는 방법을 여기에 표시됩니다. 

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Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue

Microglia account for approximately 12% of the total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered the major cell types of the nervous system, microglia play a significant role in normal brain physiology by monitoring tissue for debris and pathogens and maintaining homeostasis in the parenchyma via phagocytic activity 1,2. Microglia are activated during a number of injury and disease conditions, including neurodegenerative disease, traumatic brain injury, and nervous system infection 3. Under these activating conditions, microglia increase their phagocytic activity, undergo morpohological and proliferative change, and actively secrete reactive oxygen and nitrogen species, pro-inflammatory chemokines and cytokines, often activating a paracrine or autocrine loop 4-6. As these microglial responses contribute to disease pathogenesis in neurological conditions, research focused on microglia is warranted.
	Due to the cellular heterogeneity of the brain, it is technically difficult to obtain sufficient microglial sample material with high purity during in vivo experiments. Current research on the neuroprotective and neurotoxic functions of microglia require a routine technical method to consistently generate pure and healthy microglia with sufficient yield for study. We present, in text and video, a protocol to isolate pure primary microglia from mixed glia cultures for a variety of downstream applications. Briefly, this technique utilizes dissociated brain tissue from neonatal rat pups to produce mixed glial cell cultures. After the mixed glial cultures reach confluency, primary microglia are mechanically isolated from the culture by a brief duration of shaking. The microglia are then plated at high purity for experimental study.
	The principle and protocol of this methodology have been described in the literature 7,8. Additionally, alternate methodologies to isolate primary microglia are well described 9-12. Homogenized brain tissue may be separated by density gradient centrifugation to yield primary microglia 12. However, the centrifugation is of moderate length (45 min) and may cause cellular damage and activation, as well as, cause enriched microglia and other cellular populations. Another protocol has been utilized to isolate primary microglia in a variety of organisms by prolonged (16 hr) shaking while in culture 9-11. After shaking, the media supernatant is centrifuged to isolate microglia. This longer two-step isolation method may also perturb microglial function and activation. We chiefly utilize the following microglia isolation protocol in our laboratory for a number of reasons: (1) primary microglia simulate in vivo biology more faithfully than immortalized rodent microglia cell lines, (2) nominal mechanical disruption minimizes potential cellular dysfunction or activation, and (3) sufficient yield can be obtained without passage of the mixed glial cell cultures.
	It is important to note that this protocol uses brain tissue from neonatal rat pups to isolate microglia and that using older rats to isolate microglia can significantly impact the yield, activation status, and functional properties of isolated microglia. There is evidence that aging is linked with microglia dysfunction, increased neuroinflammation and neurodegenerative pathologies, so previous studies have used ex vivo adult microglia to better understand the role of microglia in neurodegenerative diseases where aging is important parameter. However, ex vivo microglia cannot be kept in culture for prolonged periods of time. Therefore, while this protocol extends the life of primary microglia in culture, it should be noted that the microglia behave differently from adult microglia and in vitro studies should be carefully considered when translated to an in vivo setting.

Isolating primary microglia from the cellular heterogeneity of the brain is essential to investigate their role in both physiological and pathological conditions. This protocol describes a mechanical isolation and mixed cell culture technique that provides high yield and high purity, viable primary microglial cells for in vitro study and downstream applications.

신생아 쥐 뇌 조직의 혼합 Glial 세포 배양의 기본 Microglia 격리

Microglia account for approximately 12% of the  total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered  the major ...

연구

면역학 및 감염병학

Derivation of Glial Restricted Precursors from E13 mice

This is a protocol for derivation of glial restricted precursor (GRP) cells from the spinal cord of E13 mouse fetuses. These cells are early precursors within the oligodendrocytic cell lineage. Recently, these cells have been studied as potential source for restorative therapies in white matter diseases. Periventricular leukomalacia (PVL) is the leading cause of non-genetic white matter disease in childhood and affects up to 50% of extremely premature infants. The data suggest a heightened susceptibility of the developing brain to hypoxia-ischemia, oxidative stress and excitotoxicity that selectively targets nascent white matter. Glial restricted precursors (GRP), oligodendrocyte progenitor cells (OPC) and immature oligodendrocytes (preOL) seem to be key players in the development of PVL and are the subject of continuing studies. Furthermore, previous studies have identified a subset of CNS tissue that has increased susceptibility to glutamate excitotoxicity as well as a developmental pattern to this susceptibility. Our laboratory is currently investigating the role of oligodendrocyte progenitors in PVL and use cells at the GRP stage of development. We utilize these derived GRP cells in several experimental paradigms to test their response to select stresses consistent with PVL. GRP cells can be manipulated in vitro into OPCs and preOL for transplantation experiments with mouse PVL models and in vitro models of PVL-like insults including hypoxia-ischemia. By using cultured cells and in vitro studies there would be reduced variability between experiments which facilitates interpretation of the data. Cultured cells also allows for enrichment of the GRP population while minimizing the impact of contaminating cells of non-GRP phenotype.

This protocol outlines the derivation of Glial Restricted Precursors from fetal spinal cords and maintained in vitro either for transplantation or for the study of oligodendrocytic lineage.

E13 생쥐에서 Glial 제한된 엽 성의 전구 물질의 유도

This is a protocol for derivation of glial restricted precursor (GRP) cells from the spinal cord of E13 mouse fetuses. These cells are early precursors ...

신경과학

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

신생아와 성인 중추 신경계에서 배양 소교 세포

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine neonates for the isolation of glial subpopulations. The purpose of the procedure is to dissociate microglia, oligodendrocyte progenitor cells (OPCs), and astrocytes from cortical, cerebellar, brainstem, and spinal cord tissue to facilitate further in vitro analysis. The CNS region isolation procedures allow for the determination of regional heterogeneity among glia in multiple cell culture systems. Rapid CNS region isolation is performed, followed by the mechanical removal of meninges to prevent meningeal cell contamination of glia. This protocol combines gentle tissue dissociation and plating on a specified matrix designed to preserve cell integrity and adherence. Isolating mixed glia from multiple CNS regions provides a comprehensive analysis of potentially heterogenous glia while maximizing the use of individual experimental animals. Additionally, following dissociation of regional tissue, mixed glia are further divided into multiple cell types including microglia, OPCs, and astrocytes for use in either single cell type, cell culture plate inserts, or co-culture systems. Overall, the demonstrated techniques provide a comprehensive protocol of broad applicability for careful dissection of four individual CNS regions from murine neonates and includes methods for the isolation of three individual glia cell types to examine regional heterogeneity in any number of in vitro cell culture systems or assays.

Here we present a protocol for in vitro isolation of multiple glial cell populations from a mouse CNS. This method allows for the segregation of regional microglia, oligodendrocyte precursor cells, and astrocytes to study the phenotypes of each in a variety of culture systems.

여러 중추 신경계 영역에서 쥐 아교 세포의 해부 및 분리

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine ...

Primary Microglia Isolation from Postnatal Mouse Brains

Microglia are the mononuclear phagocytes in the central nervous system (CNS), which play key roles in maintaining homeostasis and regulating the inflammatory process in the CNS. To study the microglial biology in vitro, primary microglia show great advantages compared to immortalized microglial cell lines. However, microglia isolation from the postnatal mouse brain is relatively less efficient and time-consuming. In this protocol, we provide a quick and easy-to-follow method to isolate primary microglia from the neonatal mouse brain. The overall steps of this protocol include brain dissection, primary brain cell culture, and microglia isolation. Using this approach, researchers can obtain primary microglia with high purity. In addition, the harvested primary microglia were able to respond to the lipopolysaccharides challenge, indicating they retained their immune function. Collectively, we developed a simplified approach to efficiently isolate primary microglia with high purity, which facilitates a wide range of microglial biology investigations&#160;in vitro.

Primary cell culture is one of the primarily used approaches for studying microglial biology in vitro. Here, we developed a method for simple and rapid microglia isolation from the mouse postnatal day 1 (P1) to P4.

Microglia are the mononuclear phagocytes in the central nervous system (CNS), which play key roles in maintaining homeostasis and regulating the ...

프리온 유발 염증을 줄이기 위한 AdMSCs 및 신경교세포 공동 배양

Adipose-Derived Mesenchymal Stromal Cells Co-Cultured with Primary Mixed Glia to Reduce Prion-Induced Inflammation

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are potent regulators of inflammation through the production of anti-inflammatory cytokines, chemokines, and growth factors. These cells show an ability to regulate neuroinflammation in the context of neurodegenerative diseases such as prion disease and other protein misfolding disorders. Prion diseases can be sporadic, acquired, or genetic; they can result from the misfolding and aggregation of the prion protein in the brain. These diseases are invariably fatal, with no available treatments.
One of the earliest signs of disease is the activation of astrocytes and microglia and associated inflammation, which occurs prior to detectable prion aggregation and neuronal loss; thus, the anti-inflammatory and regulatory properties of MSCs can be harvested to treat astrogliosis in prion disease. Recently, we showed that adipose-derived MSCs (AdMSCs) co-cultured with BV2 cells or primary mixed glia reduce prion-induced inflammation through paracrine signaling. This paper describes a reliable treatment using stimulated AdMSCs to decrease prion-induced inflammation.
A heterozygous population of AdMSCs can easily be isolated from murine adipose tissue and expanded in culture. Stimulating these cells with inflammatory cytokines enhances their ability to both migrate toward prion-infected brain homogenate and produce anti-inflammatory modulators in response. Together, these techniques can be used to investigate the therapeutic potential of MSCs on prion infection and can be adapted for other protein misfolding and neuroinflammatory diseases.

저자 스포트라이트: 프리온 질환 연구의 발전에 대한 통찰력

Adipose-derived mesenchymal stromal cells (AdMSCs) have potent immunomodulatory properties useful for treating diseases associated with inflammation. We demonstrate how to isolate and culture murine AdMSCs and primary mixed glia, stimulate AdMSCs to upregulate anti-inflammatory genes and growth factors, assess migration of AdMSCs, and co-culture AdMSCs with primary mixed prion-infected glia.

프리온 유발 염증을 줄이기 위해 원발성 혼합 신경교세포와 공동 배양된 지방 유래 중간엽 기질 세포

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are potent regulators of inflammation through the production of anti-inflammatory cytokines, chemokines, and growth ...

Efficient Extraction of Astrocytes and Microglia from the Adult Mouse Spinal Cord

Isolation of Pure Astrocytes and Microglia from the Adult Mouse Spinal Cord For In Vitro Assays and Transcriptomic Studies

Astrocytes and microglia play pivotal roles in central nervous system development, injury responses, and neurodegenerative diseases. These highly dynamic cells exhibit rapid responses to environmental changes and display significant heterogeneity in terms of morphology, transcriptional profiles, and functions. While our understanding of the functions of glial cells in health and disease has advanced substantially, there remains a need for in vitro, cell-specific analyses conducted in the context of insults or injuries to comprehensively characterize distinct cell populations. Isolating cells from the adult mouse offers several advantages over cell lines or neonatal animals, as it allows for the analysis of cells under pathological conditions and at specific time points. Furthermore, focusing on spinal cord-specific isolation, excluding brain involvement, enables research into spinal cord pathologies, including experimental autoimmune encephalomyelitis, spinal cord injury, and amyotrophic lateral sclerosis. This protocol presents an efficient method for isolating astrocytes and microglia from the adult mouse spinal cord, facilitating immediate or future analysis with potential applications in functional, molecular, or proteomic downstream studies.

저자 스포트라이트: Isolation of Glial Cells from the Adult Mouse Spinal Cord 

This protocol outlines the isolation of purified astrocytes and microglia from the adult mouse spinal cord, facilitating subsequent applications such as RNA analysis and cell culture. It includes detailed cell dissociation methods and procedures designed to enhance both the quality and yield of isolated cells.

Isolation of Pure Astrocytes and Microglia from the Adult Mouse Spinal Cord For In Vitro Assays and Transcriptomic Studies( 체외 분석 및 전사체 연구를 위한 성인 마우스 척수에서 순수 성상교세포 및 미세아교세포의 분리)

Astrocytes and microglia play pivotal roles in central nervous system development, injury responses, and neurodegenerative diseases. These highly dynamic ...

성인 마우스 척수 조직에서 차 혼합 폐해 문화의 준비

요약

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이 비디오의 챕터

신생아 쥐 뇌 조직의 혼합 Glial 세포 배양의 기본 Microglia 격리

E13 생쥐에서 Glial 제한된 엽 성의 전구 물질의 유도

신생아와 성인 중추 신경계에서 배양 소교 세포

여러 중추 신경계 영역에서 쥐 아교 세포의 해부 및 분리

Primary Microglia Isolation from Postnatal Mouse Brains

프리온 유발 염증을 줄이기 위해 원발성 혼합 신경교세포와 공동 배양된 지방 유래 중간엽 기질 세포

프리온 유발 염증을 줄이기 위해 원발성 혼합 신경교세포와 공동 배양된 지방 유래 중간엽 기질 세포

프리온 유발 염증을 줄이기 위해 원발성 혼합 신경교세포와 공동 배양된 지방 유래 중간엽 기질 세포

Isolation of Pure Astrocytes and Microglia from the Adult Mouse Spinal Cord For In Vitro Assays and Transcriptomic Studies( 체외 분석 및 전사체 연구를 위한 성인 마우스 척수에서 순수 성상교세포 및 미세아교세포의 분리)

Isolation of Pure Astrocytes and Microglia from the Adult Mouse Spinal Cord For In Vitro Assays and Transcriptomic Studies( 체외 분석 및 전사체 연구를 위한 성인 마우스 척수에서 순수 성상교세포 및 미세아교세포의 분리)