The authors would like to acknowledge Alexandra Quackenbush for assisting with surgical procedures during filming of the video protocol, Hadley Holden for histological support, Sonali Jindal for input on tumor and liver pathology during method development, and Breanna Caruso for critical review of the manuscript. The D2A1 and D2.OR mammary tumor cells were a gift from Dr. Ann Chambers, the D2A1-GFP tumor cells were a gift from Dr. Jeffrey Green, and the 4T1 tumor cells were a gift from Dr. Heide Ford. The OHSU Advanced Light Microscopy Core at the Jungers Center was utilized for imaging. The work included in this manuscript includes funding from NIH/NCI NRSA F31CA186524 (to ETG) and NIH/NCI 5R01CA169175 (to PS).

The authors have nothing to disclose and declare no competing financial interests.

מודל ההזרקה לוריד פורטל עכבר Balb / c מתיר המחקר של נגעי סרטן שד בכבד בהיעדר גרורות רב-איבר מבלבלים וב שורה מוסמכת חיסונית באופן מלא. הפרוטוקול שלנו הוא קידום של הליכים כירורגיים שפורסמו בעבר המאפשרים גישת וריד השער עבור הזרקה של תאים סרטניים באופן ישיר לתוך הכבד 16,55,56. קידום אחת עשינו הוא להפחית את מספר התאים סרטניים מוזרקים באופן משמעותי מן ≥ 1 x 10 5 תאים / הזרקה 16,55,56 עד ≤ 10,000 תאים סרטניים / הזרקה. יש לנו גם הרחיב את המודל לחקר גרורות סרטן השד אל הכבד. שימוש בפרוטוקול זה, שתי שורות תאי סרטן שד עם פוטנציאל גרורתי ידוע לפתח גרורות בכבד עם חביון קצר יותר מאשר קו תאים סרטניים חלב שלו יותר. יתר על כן, בנקודות זמן מוקדמות, תאים סרטניים מופצים ברחבי parenchyma הכבד כקבוצות יחידות או קטנות של ce היחידLLS לאחר הזרקת תאים סרטניים. המודל צפוי במטרה לענות על שאלות של יעילות גרורתי כולל extravasation תאים סרטניים, הישרדות התא, תרדמת, ושגשוגם - כל פנוטיפים שתורמים להתפתחות של מחלה גרורתית מיקרו גרורתי וגלויה בכבד. חשוב לשקול היבטים רבים של פרוטוקול הזרקה לווריד פורטל לפני ייזום מחקרים. בזהירות להחליט על שורות תאים, ריכוז תא, מספר תאים הכולל, נקודות קצה עניין על בסיס מחקרי גישוש קטנים מומלץ בחום. יתר על כן, שימוש מארחים מוסמכים חיסוניים שורות תאי syngeneic הוא בעל חשיבות עליונה להבנת אינטראקציות תא מארח-גידול. חדש שפותח &quot;הראש זוהר&quot; עכבר מבטא eGFP ו בלוציפראז מבלוטת יותרת המוח הקדמית הוא כלי חשוב עבור ביטול תגובות לארח אקסוגניים eGFP ו בלוציפראז, חלבונים משמשים לעתים קרובות כדי לתייג קווי חלב גידול 75 </sup&gt;. שימוש בעכבר &quot;הראש זוהר&quot; ו syngeneic מתויג תאים סרטניים יקלו זיהוי קל של תאים מופצים יחיד מוקדי micrometastatic ידי IHC ללא החשש של תגובות דלקתיות כדי eGFP או בלוציפראז. בדומה לכך, בחירת אסטרטגיות ניהול כאב בקפידה כדי להבטיח אנטי מינימאליים או השפעה פרו-גידול מן משטר הטיפול התרופתי מומלצת בחום. צעדים קריטיים בפרוטוקול זה הנם עמיד בתנאים סטריליים ברחבי ניתוחים על מנת להבטיח הידבקות דבר זה אינו קורה, כמו זה יהיה לבלבל כל תוצאות. כמו כן, חשוב כי המחט ממוקמת כראוי וריד הפורטל על מנת להבטיח כי תאים סרטניים מועברים אל הכבד. תרגול הפרוטוקול עם צבעים כגון דיו הודו יעזור עם בעיה זו. צמיחת גידול באתר עור החתך היא האינדיקטור הטוב ביותר כי מיקום מחט פסול התרחש. לבסוף, זה קריטי, כי איבוד דם מעורק הפורטל נשלט כראוי וחדל לפני לחלוטין suturing החיה. שימוש גזה עוצרת דמום מאוד מפחית את הסיכון של איבוד דם בלתי מבוקר מעורק הפורטל לאחר הזרקה. בידיים שלנו, תמותה הקשורים פרוצדורליים בשל איבוד דם מן הזריקה הבאה וריד שער הופחת מ -30% ל 2% של עכברים עם השימוש גזה עוצר דמום. חשוב לציין כי מודל הזרקה לווריד פורטל לא לשכפל את מפל גרורתי מלא, אך הוא מוגבל לחקר extravasation תאים סרטניים, אינטראקציות נישה תאים סרטניים הבאים extravasation והתפתחות הגידול. מודלים במדויק לשכפל את מפל גרורה המלא אל הכבד, כגון מתרחש בחולים, יש צורך דחוף. מגבלה נוספת של המודל הזרקה לווריד פורטל היא שזה בתוהו בשל השפעת הניתוח על המארח, בריפוי פצעים ידוע להשפיע התקדמות המחלה 76,77. מודל ההזרקה לוריד הפורטל מהווה שיפור על הזרקה אחרתמודלים ללמוד גרורות בכבד, כולל intracardiac ומודלים intrasplenic. באופן ספציפי, מודל הזרקה לווריד הפורטל מאפשר לחקר מגוון גדול של התקדמות המחלה מאשר הדגם intracardiac, אשר מוגבל לעתים קרובות על ידי גרורות במקביל ברקמות אחרות. יתר על כן, מודל וריד השער לא מסובך על ידי הסרת הטחול, כפי שנעשה במודל intrasplenic. מודל ההזרקה לוריד פורטל עשוי להוכיח כלי שימושי לחקר גרור בכבד בכלל. גרורות בכבד הוא האתר השכיח ביותר של גרורות אדנוקרצינומה הכוללת, עם צמיחה גבוהה במיוחד נרשמה סרטן הלבלב (85% בגרורות הם אל הכבד), המעי הגס אדנוקרצינומה של הרקטום (&gt; 70%), כמו גם הקיבה הוושט (&gt; 30 %) 1. למרות מודלי גידול ספונטניים orthotopic העיקריים של אדנוקרצינומה לבלב ומעי גס יותר בקלות גרורה בכבד 78,79, מודל ההזרקה לוריד הפורטל עשוי provדואר שימושי להבנת התהליך גרורתי של הסרטן אלה כפי במסירה מבוקרת של תאים סרטניים מאפשר הערכות ביוכימיים, מולקולריות היסטולוגית בזמנים מוגדרים לאחר הגעת תאים סרטניים. לסיכום, מודל ההזרקה לוריד הפורטל מהווה שיפור חשוב על מודלים גרורים בכבד זמין של סרטן השד, ויכול גם להיות ישים בתחום הגרור בכבד בכלל.

סרטן שד גרור אל הכבד הכבד הוא אתר משותף של גרורות סרטן השד, יחד עם עצם וריאות 1-3. גרורה בכבד בחולי סרטן השד הוא גורם פרוגנוסטי בלתי תלוי לתוצאות עניות מאוד 4,5, כמו חציון הישרדות של חולות סרטן השד עם גרורות טווחי כבד מפני 4.8 עד 15 חודשים 6-9. לעומת זאת, חולות סרטן שד עם ריאות או גרורות בעצמות בעלי סיכויי הישרדות חציוני של 9 עד 27.4 חודשים 8,9 ו 16.3 כדי 56 חודשים 8,10-12, בהתאמה. גרורה היא תהליך רב שלבים, המכונה מפל גרורתי, אשר מתחיל עם הפצת תאים סרטניים ב הגידול הראשוני ונגמר תמותה חולה בשל זריעת התולדה של מחזורי גידול תאים בתוך איבר רחוק 13-15. במודלים של מכרסמים של גרורות חשפו כי המפל גרורתי הוא יעיל להפליא, עם אך ורק 0.02 - 10%תאים סרטניים במחזור הקמת גרורות גלויות 16,17. אחת צוואר בקבוק עיקרי של יעילות גרורתי מוכתב על ידי microenvironments הרקמה הייחודי אתרים משניים, בשם נישות גרורתי 18, המדגיש את החשיבות של גרורות אתר ספציפי הבנה. הנישה גרורתי הוא ייחודי באתר להישנות, והוא, בין היתר, המאופיינת בתצהיר של חלבונים תאי מטריקס ברורים 19,20, חדירה של אוכלוסיות תאים חיסוניים שונים 21-23, הומאוסטזיס רקמות שינו כולל ייצור dysregulated של ציטוקינים רבים, כמוקינים, ואת גורמי גדילה 15,18,24,25. לכן, הבנה של הנישה גרורתי הרקמות הספציפית מקדימה הבנה של איך למקד מחלה גרורתית. עם זאת, מודלים חזקים של גרורות בכבד חסרים. יתר על כן, מודלים משופרים של גרורות בכבד יהיו חיוניים לזיהוי מטרות רומן וטיפולים יעילים עבור wi חולות סרטן השדגרורות בכבד ה. הוקם מודלים לחקר סרטן שד גרור אל הכבד כיום דגמים זמינים ללמוד הופעת גרורות סרטן השד אל הכבד כולל xenografts תאים סרטניים האנושי בעכברים נפגעים חיסוניים. מודלים אלה משתמשים בדרך כלל שורות תאי סרטן שד אנושיים-למד היטב כגון MCF-7 ו מד&quot;א- MB-231 ו עירום, Rag1 - / -, או המארחים murine נפגעת SCID החיסונית 26-29. מודלי xenograft לספק את היתרון של מעורבי שורות תאים אנושיים שמקורם הסרטן, עם זאת, בהתחשב הייסוף האחרון עבור תאים חיסוניים גרור 30-32 ובהתנגדות טיפולית 33-35, בחקר גרורות שורה מוסמכת חיסונית מלא הוא בעל חשיבות עליון. מודלים ללמוד גרורות סרטן שד בכבד מארחים מוסמכים חיסוניים כוללים הזרקת orthotopic של תאים סרטניים syngeneic (למשל, 4T1 שורות תאי D2A1) לתוך כרית שומן החלב, עם או בלי כירורגיתכריתה של הגידול הראשוני, והערכה הבאה של גרורות 36-38. מן ראוי לציין כי שיעור גרורות בכבד ממודלי השתלת orthotopic הוא נמוך מאוד או לא קיים בהשוואה לאתרים גרורתי אחרים כגון ריאות 39,40, או מתרחש לאחר גרורות ריאות היא הוקמו, שמסבך בחקר הגרור בכבד ספציפי 37,39 . explants הגידול ממודלים סרטן השד ספונטנית מהונדסים גנטית ניתן מחדש מוזרק לתוך רפידות שומן החלב של המארחים תמימים תאים סרטניים syngeneic. לדוגמא, נמסר לאחרונה כי גידולים ספונטניים מעכברי K14 Cre ECad f / f P53 f / f, איזה דגם פולשני סרטן השד לובולרי, לפתח גידולים כאשר הוא מוזרק orthotopically לתוך מארחי wildtype. בעקבות כריתה כירורגית של גידולים אלה ברגע שהם מגיעים 15 מ&quot;מ 2, 18% מהעכברים התקדמו כבד גרור 40,41. גישה שלישית מודל שימושים גרורות בכבדגרורות ספונטניות בעכברים מהונדסים גנטי. עד כה, דיווחים של מודלים בעכברים ספונטניים של גרורות סרטן שד שהתפשטו בקלות אל הכבד אינם שכיחים. יוצאים מן הכלל הן H19-IGF2, את p53 FP / FP MMTV-Cre Wap-Cre, ואת P53 K14 Cre ECad f / f f / f במודלים של עכברים מהונדסים גנטית, שבו גרורות בכבד מפתחת אצל אחוז נמוך של עכברים 38,41- 43. וכך, בעוד מודלי עכברים מהונדסים גנטי להקל על המחקר של כל השלבים של המפל גרורתי, מתן מודלי עצמה רלוונטיים קליני, הם מוגבלים בשל שיעורים נמוכים של גרורות בכבד 38. מודלים גרורים כמה לעקוף את השלבים הראשוניים של מפל גרורתי לרבות הפצת תאים סרטניים מהגידול הראשוני ו intravasation. מודלים אלה מאפשרים חקירת השלבים המאוחרים של המפל גרורתי, מן extravasation להקמת גידולים באתרים משניים. intמודל הזרקת racardiac מספק תאים סרטניים לתוך החדר השמאלי, אשר מפיץ תאים סרטניים לתוך מערכת הדם באמצעות האאורטה. הזרקת intracardiac דורש הדמיה אולטרסאונד מונחה של הזריקה או שיטות הדמיה אחרות כגון פליטת אור בלוציפראז מתויג תאים כדי לאשר זריקה מוצלחת. הזרקת תאים סרטנית באמצעות החדר השמאלי עלולה לגרום עצם, מוח, ריאות, ו / או גרורה בכבד, בקרב גופים אחרים 44-48. בגלל גרורות רבות-איבר, עכברים אלה זקוקים לעתים קרובות כדי להיות מורדמים לפני ההתפתחות גרורה בכבד גלוי, שלילת היכולת לחקור צמיחת גרורתי מלאה בתוך הכבד. גישה חלופית באופן משמעותי מצמצמת את ההתפתחות גרורה רב באתר היא מודל הזרקת intrasplenic. הזרקת Intrasplenic מספק תאים סרטניים דרך וריד הטחול המתחבר עם וריד מצע המעי העליון להפוך את וריד שער 49,50. ניתן לנטר בעלי חיים עבור outgrowth של גרורות בכבד בגלל היווצרות של גרורות באתרים אחרים היא נדירה, וכתוצאה מכך, את הבריאות הכללית של החיה נשמרת 49,50. עם זאת, חשוב לציין כי המודל intrasplenic דורש כריתת טחול להימנע גידולים הטחול 49,50, הליך אשר משפיע תפקוד מערכת החיסון. לדוגמא, פגיעת reperfusion איסכמיה לבבית מאופיינת חדיר תת מונוציטים Ly6C + שמקורן הטחול אחראי phagocytic ופעילות פרוטאוליטים במהלך ריפוי הפצע הבא איסכמיה 51,52. עם כריתת טחול, קיימת ירידה שנצפתה אוכלוסיות מונוציטים המסייעים איחוי פצעים 52. יתר על כן, כריתת טחול הוכח להפחית את צמיחת הגידול הראשוני וגרורות ריאות במודל סרטן ריאות מסוג תאים שאינם קטנים, במיוחד באמצעות צמצום מספר מחזורי התוך הגידול CCR2 + CD11b + Ly6C + myelo monocyticid תאים 53. בנוסף, כריתת טחול לאחר ההזרקה intrasplenic של תאי סרטן המעי הגס הביא רמות נמוכות של תאי הרג טבעיים אנטי סרטניים בבלוטות הלימפה mesenteric ו -54 גרורות בכבד גבוהות. לסיכום, ממצאים אלה מראים כי כריתת טחול פוגעת התפקיד של מערכת החיסון עם השלכות מאוחרות גורל תא גרורתי. פורטל וריד דגם הזרקה של כבד גרור כדי לחקור גרורות סרטן שד בכבד שורה מוסמכת חיסונית באופן מלא, בתנאי שבה עכברים אינם נמצאים בסיכון עקב גרורות רבות-איבר, מודל הזרקה לוריד פורטל פותחתה. מודלי הזרקת Intraportal שמשו בעבר כדי ללמוד גרורות בכבד של שורות תאי המעי גס 55,56 ומלנומה 16; כאן אנו מתארים יישום של זריקת intraportal מודל גרורות תאים סרטניים חלב syngeneic. ניתן להשתמש במודל זה כדי ללמודבשלבים מאוחרים יותר של מפל גרורתי כולל extravasation תאי סרטן השד וזריעה, החלטות גורל תאים סרטניים לגבי מוות / התפשטות / תרדמת, ואת תולדה לתוך נגעים גלוי. במודל זה, שורות תאים סרטניים חלב syngeneic מוזרקות דרך וריד הפורטל של עכברות חיסוניות מוסמכות Balb / c, שיטה המספק תאים סרטניים ראשית וישירות אל הכבד ללא הסרת הטחול. כדי לפתח מודל זה, השימוש של שורות תאים סרטניים ארבעה החלב כי טווח יכולת גרורתי שלהם מהנמוך לגבוה הועסקו: D2.OR, D2A1, ו 4T1, ו מועסקים D2A1 מתוייגים עם חלבון פלואורסצנטי ירוק (D2A1-GFP) כדי לחקור מוקדם בזמן נקודות לאחר הזרקת תאים סרטניים. 4T1 היא שורת תאים גרורתי מאוד נגזר הגידול 410.4 שהתעוררו ספונטני עכבר MMTV + Balb / c נקבה 36,37 גרורות אל הריאות, הכבד, המוח, ואת עצם גידולים ראשוניים כרית שומן החלב 39,57,58. D2A1 תאים סרטניים werהדואר גם במקור נגזר גידול חלב ספונטני לארח Balb / c לאחר ההשתלה של תאי גולת המכתשית hyperplastic D2, והם אשרו להיות גרורתי מן הגידול הראשוני אל הריאות 59,60. D2.OR תאים סרטניים הם קו אחותו הלא-גרורתי לקו D2A1, ואף שהם לברוח הגידול הראשוני ומגיעים אתרים משניים, שהם כמעט ולא להקים גרורות מרוחקות 60,61. בנוסף, חשוב להימנע שימוש בתרופות לטיפול בכאב מועסק בדרך כלל כולל תרופות סטרואידיות נוגדות דלקת לא סטרואידיות (NSAIDs) במהלך או לאחר ההליך הכירורגי. יש NSAIDs פעילות אנטי גידולית בסרטן השד מסוימים 62-65, וכמה סוגים של NSAIDs מעלה את הסיכון לרעילות כבדית 66,67, פוטנציאל להתפשר בחקר גרורות בכבד ואת נישה גרורתי בכבד. יתר על כן, מחקרים מראים כי NSAIDs משפיע ישירות על המיקרו-סביבת הרקמות, הפחתת שלוחה פרו-גרורתיחלבונים מטריצה racellular tenascin-C 68 ו קולגן סיבי 62,65. לחלופין, את השימוש של נגזר אופיואידים, עצירות, שימש בגלל יעילותו בניהול מכרסם כאב 69 ובשל חוסר ראיות שיש אופיואידים פעילות אנטי גידולית 70. מודל הזרקת פורטל וריד זו הוטב כרכי הזרקה קטנים של 5 - 10 μl כדי למנוע ניזק מיותר אל הכבד. המודל היה מותאם גם לכלול מחטים עם קוטר קטן יותר (≥ 32 מד) ושימוש גזה עוצר דמום מיד לאחר ההזרקה כדי להקטין את איבוד הדם במהלך ההליך. בניגוד פרמטרי הזרקה המותאם אלה, מספרים סלולריים צריכים להיקבע על בסיס פרטני, מבוססים על פוטנציאל tumorigenic של הקו הסלולרי. עם זאת, החל מ ≤ 10,000 תאים / הזרקה עבור מחקרים ארוך טווח מומלץ. עבור נקודות קצה קצרות (למשל, 24 שעות לאחר הזרקה) הרבה יותר תאים סרטניים (למשל,1 x 10 5 - 1 x 10 6) ניתן להשתמש אם מוצדק. לסיכום, מודל ההזרקה לוריד פורטל המפורט כאן מהווה כלי שימושי לחקר גרורות סרטן השד בכבד עוקף מספר המגבלות של מודלים גרורים בכבד אחרים. מודל זה הופך לפשוט מחקר של extravasation תאים סרטניים, זריעה, החלטות גורל מוקדמות של הישרדות, התפשטות, תרדמת, ואת תולדה גרורתית מארחי murine מוסמכות חיסוניים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1001">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">1 ml Syringe w/ 26-gauge Needle</td>
			<td style="width:159px;">BD Syringe</td>
			<td style="width:152px;">309597</td>
			<td style="width:435px;">For subcutaneous buprenorphine injection; use caution, sharp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Alcohol Prep Pads</td>
			<td style="width:159px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:152px;">06-669-62</td>
			<td style="width:435px;">For cleaning of abdomen prior to surgical incision</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">All Purpose Sponges, Sterile</td>
			<td style="width:159px;">Kendall</td>
			<td style="width:152px;">8044</td>
			<td style="width:435px;">4&#34; x 4&#34;, use dipped in sterile saline to keep large and small intestines protected and hydrated during surgery</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Artificial Tears</td>
			<td style="width:159px;">Rugby</td>
			<td style="width:152px;">370114</td>
			<td style="width:435px;">Mineral oil 15%, white petrolatum 83%; use to protect eyes during surgery</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Buprenorphine HCl, 0.3 mg/ml</td>
			<td style="width:159px;">Mfg. by Reckitt Benckiser</td>
			<td style="width:152px;">NDC-12496-0757-1</td>
			<td style="width:435px;">Use at 0.05 - 0.1 mg/kg body weight, 1-2x daily for 72 hours, injected subcutaneously</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Bupivacaine HCl, 0.5% (5 mg/ml)</td>
			<td style="width:159px;">Mfg. by Humira Inc</td>
			<td style="width:152px;">NDC-04091163-01</td>
			<td style="width:435px;">Use at 0.5%, 1x immediately after surgery, 10 ul injected subcutaneously at incision site&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">anti-CD45 antibody</td>
			<td style="width:159px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:152px;">550539</td>
			<td style="width:435px;">Use in multiplex immunofluorescence to exclude leukocytes in identification of metastatic foci</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Celox&#8482; Rapid Hemostatic Gauze</td>
			<td style="width:159px;">Medtrade Products Ltd.</td>
			<td style="width:152px;">FG08839011</td>
			<td style="width:435px;">Cut into 5mm&#178; pieces, use to stop blood flow out of the portal vein with pressure following injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Chemical Depilatory</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:435px;">Use to remove hair from surgical area; multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Chlorhexidine, 2% Solution</td>
			<td style="width:159px;">Vet One</td>
			<td style="width:152px;">1CHL008</td>
			<td style="width:435px;">Use caution, do not get chlorhexidine in mucous membranes or ears of the mouse</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">anti-CK18 antibody</td>
			<td style="width:159px;">Abcam</td>
			<td style="width:152px;">ab53118</td>
			<td style="width:435px;">Use in multiplex immunofluorescence to identify metastatic foci</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Cotton Tipped Applicators, Sterile</td>
			<td style="width:159px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:152px;">23-400-114</td>
			<td style="width:435px;">6&#34; Wooden Shaft 2 pc/envelope</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">DMEM, High-Glucose</td>
			<td style="width:159px;">HyClone</td>
			<td style="width:152px;">SH30243.01</td>
			<td style="width:435px;">Cell culture media base for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Dry Glass Bead Sterilizer</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:435px;">Use between surgeries to sterilize stainless steel tools, use caution, extremely hot; multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Ethanol, 70% solution</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:435px;">Use caution flammable; use to clean surgical area as needed; multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:159px;">HyClone</td>
			<td style="width:152px;">SH30071.03</td>
			<td style="width:435px;">Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines, use at 10% in DMEM high glucose</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Gauze, Sterile</td>
			<td style="width:159px;">Kendall</td>
			<td style="width:152px;">2146</td>
			<td style="width:435px;">2&#34; x 2&#34;, use dipped in chlorhexidine 2% solution for cleaning of abdomen prior to surgical incision</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">anti-Green Fluorescent Protein antibody</td>
			<td style="width:159px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:152px;">BA0702</td>
			<td style="width:435px;">Use to stain for GFP tagged D2A1 or other mammary tumor cell lines</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:257px;">L-Glutamine 200 mM (100X)</td>
			<td style="width:159px;">Gibco</td>
			<td style="width:152px;">25030-081</td>
			<td style="width:435px;">Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines, use at 2 mM (1x) in DMEM high glucose</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Heating Pad, x2-3</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:435px;">Use to maintain body heat during surgery and recovery; multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:159px;">Hausser Scientific</td>
			<td style="width:152px;">1483</td>
			<td style="width:435px;">For use in cell culture to count cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Hemostatic Forceps</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:435px;">Stainless steel; multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">anti-Heppar-1 antibody</td>
			<td style="width:159px;">Dako</td>
			<td style="width:152px;">M7158</td>
			<td style="width:435px;">Use in multiplex immunofluorescence to exclude hepatocytes in identification of metastatic foci</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Insulin Syringe, 0.3 ml, 29-gauge</td>
			<td style="width:159px;">BD&#160;&#160;</td>
			<td style="width:152px;">324702</td>
			<td style="width:435px;">For bupivacaine injection at suture site; use caution, sharp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:159px;">Piramal</td>
			<td style="width:152px;">NDC-66794-017-25</td>
			<td style="width:435px;">Administered at 2.5%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Isoflurane Vaporizer</td>
			<td style="width:159px;">VetEquip</td>
			<td>911103</td>
			<td style="width:435px;">Use caution, vaporizes anesthetic gases</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Light Source</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:435px;">Use for visualizing the surgical field; multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Neutral buffered formalin, 10%</td>
			<td style="width:159px;">Anatech Ltd.</td>
			<td style="width:152px;">135</td>
			<td style="width:435px;">Use caution, toxic; use as a tissue fixative for metastasis endpoints and assesment of metastatic burden by histology</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Opal&#8482; 4-color fIHC kit</td>
			<td style="width:159px;">PerkinElmer, Inc.</td>
			<td style="width:152px;">NEL794001KT</td>
			<td style="width:435px;">Use for multiplex immunofluorescence of Heppar-1/CD45/CK18 to detect metastases in murine liver</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Operating Scissors</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:435px;">Stainless steel; use caution, sharp; multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Penicillin/Streptomycin, 100x</td>
			<td style="width:159px;">Corning</td>
			<td style="width:152px;">30-002-Cl</td>
			<td style="width:435px;">Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines, use at 1x in DMEM high glucose</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Phosphate-buffered Saline</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:435px;">Use at 1x for resuspending tumor cells prior to injection, multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Removable Needle Syringe, 25 ul, Model 1702</td>
			<td style="width:159px;">Hamilton</td>
			<td style="width:152px;">7654-01</td>
			<td style="width:435px;">For portal vein injection; use caution, paricularly while working with tumor cell-loaded needles, sharp when needle is attached</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Scalpel handle</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:435px;">Stainless steel; multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Scalpel blade, #15</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:435px;">Carbon steel, sterile, size 15; multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:257px;">Small Hub Removable Needles, 32-gauge</td>
			<td style="width:159px;">Hamilton</td>
			<td style="width:152px;">7803-04</td>
			<td style="width:435px;">For portal vein injection, 1&#34; length, point style 4, 12&#176;angle, 33- to 34-gauge reusable needles can also be used; use caution, paricularly while working with tumor cell loaded needles, sharp</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Sodium Hypochlorite</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:435px;">Use caution, corrosive; use at 10% to disinfect workspace and surfaces, multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Sterile Saline</td>
			<td style="width:159px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:152px;">BP358-212</td>
			<td style="width:435px;">0.9% NaCl solution; alternatively, can be homemade and sterile filtered</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Surgical Gloves, Sterile</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:435px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Sutures, Sterile&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Ethicon</td>
			<td style="width:152px;">J310H</td>
			<td style="width:435px;">4-0 27&#34; coated vicryl w/ 22 mm 1/2c taper ethalloy needle; use caution, sharp</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Table Top Portable Anesthesia Machine</td>
			<td style="width:159px;">VetEquip</td>
			<td>901801</td>
			<td style="width:435px;">Use with isoflurane vaporizer for mouse anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Thumb Dressing Forceps</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:435px;">Stainless steel, serrated, blunted; multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Towel Drapes, Sterile&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Dynarex</td>
			<td style="width:152px;">4410</td>
			<td style="width:435px;">18&#34; x 26&#34;, to cover heating pad and provide a sterile workspace during surgery</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:159px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:152px;">T10282</td>
			<td style="width:435px;">For use in cell culture to assess viability, use 1:1 with cells in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Trypsin/EDTA, 0.05% (1x)</td>
			<td style="width:159px;">Gibco</td>
			<td style="width:152px;">25300-054</td>
			<td style="width:435px;">Use in cell culture to detach tumor cells from tissue culture plates</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a portal vein injection model to study liver metastasis of breast cancer

סרטן השד הוא הגורם המוביל לתמותה מסרטן בנשים ברחבי העולם. גרורות בכבד מעורב למעלה מ 30% מהמקרים עם גרורות סרטן השד, וכתוצאה מכך תוצאות העניים עם שיעורי ההישרדות החציוני של רק 4.8 - 15 חודשים. במודלים של מכרסמים הנוכחיים של גרורות סרטן השד, כולל xenograft תא גידול הראשוני ומודלי גידול ספונטניים, לעתים רחוקות גרורים בכבד. Intracardiac ומודלים הזרקת intrasplenic אל לגרום גרורות בכבד, אולם ניתן מבולבל מודלים אלה על ידי גרורות המשני באתר במקביל, או על ידי חסינות נפגעת כתוצאה הסרת הטחול להימנע צמיחת גידולים באזור הזריקה. כדי לענות על הצורך של מודלים גרורים בכבד השתפרו, שיטת הזרקת murine פורטל וריד המספקת תאים סרטניים ראשית וישירות אל כבד פותחתה. מודל זה מספק תאים סרטניים בכבד ללא סיבוכים של גרורות בו-זמניות באיברים אחרים או הסרה של הטחול. ההצטרפותפרוטוקול פורטל וריד imized מעסיק כרכי הזרקה קטנים של 5 - 10 μl, ≥ 32 מחטי מד, ו גזה עוצר דמום באזור הזריקה לשלוט על אובדן דם. גישת ההזרקה לוריד פורטל Balb / c עכברות באמצעות שלוש שורות גידול חלב syngeneic משתנה פוטנציאל גרורתי נבדק; תאי 4T1 גבוהים גרורתי, מתון-גרורתי תאי D2A1, ותאי D2.OR נמוכים גרורתי. ריכוזי ≤ 10,000 תאים / תוצאות ההזרקה חביון של ~ 20 - 40 ימים לפיתוח של גרורות בכבד עם קווי גרורתי 4T1 ו D2A1 גבוה, ו&gt; 55 ימים עבור הקו D2.OR פחות אגרסיבי. מודל זה מייצג כלי חשוב ללמוד גרורות סרטן השד אל הכבד, ועשויים לחול על סוגי סרטן אחרים כי גרורות לעיתים קרובות אל הכבד כולל המעי הגס וסרטן הלבלב אדנוקרצינומה.

מודל ההזרקה לוריד פורטל, שבו תאים סרטניים מועברים ישירות אל הכבד באמצעות הליך כירורגי, מאפשר הזרקה של תאי גידול לתוך וריד השער. בתנאי חיטוי, ב עכבר הרדים, מצוין ~ חתך ניתוחי 1 אינץ נעשה בצד השמאלי של העכבר בין המטוסים החציוני ועל sagittal, החל רק מעל למישור של הפטמה בלוטת חלב מפשעתי הרביעית וכלה בדיוק מתחת לצלעות . המעיים גדולים וקטנים הם משכו בעדינות דרך חתך לספק הדמיה של וריד השער (איור 1 א). זיהוי אנטומי מדויק של וריד פורטל הזרקה תוך-פורטל מוצלח יכול להיות מאושר על ידי תרגול פרוטוקול הזרקת בדיו או צבע דומה. הזרקת נכון דרך וריד הפורטל תגרום הדיו מועבר מיד ובאופן ספציפי אל הכבד, ולא לגרום התפשטות דיו הודו אל הריאות (figuמחדש 1B). יתר על כן, באמצעות העכבר D2A1 תאים החלב הגידול מתויג עם GFP, פיזור של תאים סרטניים בתוך הכבד ניכר בגיל תשעים דקות לאחר ההזרקה, המאשר משלוח הזרקה לווריד פורטל אל הכבד (תרשים 1C). בהגדלה גבוהה יותר מתברר כי ב 90 דקות לאחר ההזרקה, תאים סרטניים נמצאים בתוך sinusoids, כמו גם בתוך parenchyma הכבד בסמיכות השלשות פורטל, שם הדם פורטל וריד נכנס הכבד (תרשים 1C). נתונים אלה מראים כי extravasation גידול התא הפעיל מתרחש ב 90 דקות הזרקת תא שלאחר הגידול. יחדיו, נתונים אלה מאשרים כי מודל ההזרקה לוריד פורטל מספק את עוצמת הזריקה ישירות אל הכבד, עם תאי דיו או גידול פזור הכבדה אין תחבורה ניכרת של נפח הזרקה אל הריאות. כדי להעריך חוסנו של המודל הזרקה לווריד פורטל, שלושה separאכול שורות תאים סרטניים חלב עכבר syngeneic נבדקו בעכברי Balb / c נקבה בוגרת. קווי גידול חלב אלה נבחרו על סמך ההתנהגות המאופיינת שלהם במודלי כרית שומן חלב וכוללים את קו 4T1 תאים אגרסיווי גרורתי מאוד, קו D2A1 גרורתי פחות אגרסיווי, וקו D2.OR הנמוך / לא גרורתי 37,61,73 , 74. 2,000 ו -10,000 תאים לכל הזרקה נבדקו ללא הבדלים בולטים בזמן להתפתחות גרורה גלוי עם ריכוזי תא הנמוכים אלה. עבור מחקרים אלה סמנים פונדקאיים של גרורות שמשו כגון חוסר טיפוח, חיוורון, וירידה במשקל כדי להצדיק necropsy, שעליו קיומו או אי קיומו של גרורות בכבד אושר על ידי הערכה חזותית של הכבד ואיברים אחרים כדי לאשר משלוח תוך-פורטל . נתונים אלה מאשרים דיווחים קודמים כי שורות תאי 4T1 ו D2A1 לייצג קווי גידול חלב אגרסיביים יותר, שיעורי הישרדות ללא גרורות קצרות הם נצפו לעומת עכברים שהוזרקועם קו D2.OR פחות אגרסיבי (איור 2 א). עכברים הוזרקו תאים סרטניים 4T1 או D2A1 פיתח גרורות בכבד גלויה על ידי ~ 30 - 40 ימים לאחר ההזרקה, וכמה פיתח גרורות מוקדם ככל 18 ימים לאחר ההזרקה (איור 2 א), ואילו רק עכבר אחד הוזרקו תאים D2.OR היה גרורה בכבד גלוי מפותח עד סוף המחקר, אשר היה 60 - 65 ימי הזרקת תא שלאחר גידול. גרורות לאחר מכן אושרו על ידי חתך דרך הכבד ב 250 מיקרומטר רמות וניתוח hematoxylin ו eosin (H &amp; E) סעיפים מוכתם (תרשים 2B-D). בנוסף לגילוי גרור גלוי בכבד העכבר, מודל וריד שער יכול גם להיות מנוצל ללימוד אירועים קודמים במפל גרורתי כולל זיהוי של תאים בודדים / צבירי תאים הבאים extravasation, היווצרות של נגעי מייקרו גרורתי. immunofluorescence מכתים Multiplex שמשכדי לזהות 4T1, D2A1, ותאי הגידול החלב D2.OR בכבד כשהם נוכחים כמו תאים בודדים או נגעים מיקרו-גרורות, כמו H &amp; E אינה מספיקה כדי לאשר את קיומו של נגעים קטנים. 3A איור מראה Balb / c עכבר כבד נציג עם מוקדים המשוערת micrometastatic של תאי D2A1 גידול כי הם חיוביים עבור CK18 קרטין אפיתל, שליליים על CD45 סמן הפאן החיסוני, ושליליים עבור סמן hepatocyte Heppar-1. Hepatocytes גם להכתים חיובי עבור CK18, הדבר מחייב שימוש Heppar-1 בלוח מכתים זה. הערה חשובה אחת היא שתא מרת צינור אפיתל וכבד ובתאים להכתים חיובי עבור CK18, מחייב אפליה זהירה בין תאים סרטניים ודרכי מרה, במיוחד כאשר מעריכים אזורי periportal (איור 3 א). חלופה זמנית immunofluorescence לזהות תאים בודדים יופצו מוקדי micrometastatic היא לנצל קווי גידול חלב syngeneic מתויגים עם פלואורסצנטי ירוק משופרחלבון (eGFP) ו / או בלוציפראז ולבצע IHC עבור התג (תרשים 1C). בשל החיסוני של eGFP, בלוציפראז, וחלבונים אחרים, זה חיוני כדי להשתמש במודלים של עכברים אשר tolerized לחלבונים אלה, כגון עכבר &quot;זוהר הראש&quot; מוסמכות החיסונית רומן מבטא eGFP ו בלוציפראז בבלוטת יותרת המוח הקדמית 75. עבור זיהוי נגעים macrometastatic קווי syngeneic מתויגות כגון קו הגידול D2A1, את immunofluorescence זמנית CK18 / Heppar-1 / CD45 הוא אידיאלי (איור 3 ב). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54903/54903fig1.jpg" /> איור 1: הזרקת Portal Vein מספקת תאים סרטניים ישירות אל הכבד. א) הזרקה לווריד פורטל; החתך הוא עשה בין החציון ומטוסי sagittal שמאל, מלמעלה המטוס של הפטמה בלוטת חלב מפשעתי הרביעית וכלה ממש מתחת רי<html> כלוב ב. B) Balb / c כבד עם הזרקת PBS (משמאל). בעקבות הזרקת דיו הודו דרך וריד הפורטל, הכבד (באמצע) אבל לא הריאה (מימין) תופס דיו. C) תמונות בסעיף נציג דקה של תאים סרטניים החלב עכבר D2A1 מתויג עם GFP בתוך הכבד עכבר Balb / c ב 90 דקות לאחר ההזרקה של 1 x 10 6 תאים סרטניים דרך וריד הפורטל. כבדי תוקנו בפורמלין, פרפין מוטבע, מחולק, ומוכתמת עם נוגדן אנטי- GFP לגילוי תאים סרטניים. פנל עליון מראה תאים סרטניים צבועים בחום כהה (חיצים) המפוזרים בתוך הכבד, כוכבית מציינת מכתים hepatocyte הלא ספציפית סביב ורידים מרכזיים; סרגל = 300 מיקרומטר. פנלים תחתונים מראים תמונות נציג של תאים סרטניים ב 90 דקות לאחר ההזרקה עדיין קשורה קשר הדוק עם כלי דם; סרגל = 50 מיקרומטר. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54903/54903fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> class = &quot;jove_content&quot; FO: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54903/54903fig2.jpg" /> איור 2: תולדה של שורות תאים סרטניים עכבר חלב בכבד בעקבות הזרקת Portal Vein. א) עקום Kaplan-Meier מראים שיעורי הישרדות ללא-גרורות עכברים שהוזרק עם 2,000-10,000 4T1, D2A1, או תאים סרטניים חלב עכבר D2.OR. עכברים הוזרקו תאים סרטניים וכן פיקוח על סימנים של גרורות כולל חוסר הטיפוח, עיניו בהירות, שינויים במשקל. גרורה אושרה בשעת necropsy ועל ידי H &amp; E על סעיפים היסטולוגית של הכבדים. N = 2 4T1 2,000 תאים; 2 4T1 10,000 תאים. N = 2 D2A1 2,000 תאים; 3 D2A1 10,000 תאים. N = 3 D2.OR 2,000 תאים; 3 D2.OR 10,000 תאים. נציג H &amp; E תמונות של B) 4T1 נגעים ב 21 ימים לאחר ההזרקה של 10,000 תאים, C) נגעים D2A1 ב 26 ימים לאחר ההזרקה של 10,000 תאים סרטניים, ו- D) D2.OR נגעים ב59 ימים לאחר הזרקה של 10,000 תאים; סולם ברים = 75 מיקרומטר. נגעים דומים נצפו כאשר 2,000 4T1 או D2A1 תאים סרטניים הוזרקו. אין נגעים התגלו עם 2,000 תאים D2.OR. אין ראיות של גרורות באיברים אחרים או החתך באתר כירורגית באו לידי ביטוי בכל עכבר על מחקרים אלה. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54903/54903fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54903/54903fig3.jpg" /> איור 3: איתור של תאים בודדים גרורתי נגעים בכבד העכבר באמצעות Multiplex Immunofluorescence. א) immunofluorescence זמנית נציג של תאים סרטניים D2A1 בתוך הכבד עכבר Balb / c ב 90 דקות לאחר ההזרקה באמצעות מודל הזרקה לווריד פורטל. המכתים נעשה באמצעות ערכה זמנית. משמאל לימין תערוכות DAPI; CD45 לציון לויקוציטים; Heppar-1 עד מרץk hepatocytes; ו CK18 לסמן תאים סרטניים, hepatocytes, אפיתל צינור המרה. תמונה ממוזגת מציגה מקבץ משוער של CK18 + Heppar-1 - CD45 - התאים סרטניים D2A1 קשר הדוק עם שלישיית פורטל. חץ = תאים סרטניים D2A1, כוכבית = האפיתל מר צינור; סרגל = 25 מיקרומטר. ב) נגע גרורתי נציג הגלוי D2A1 באמצעות אותה חלונית מכתימה כמו תאים סרטניים א הם CK18 + ואילו hepatocytes סמוך CK18 + Heppar-1 +; סרגל = 25 מיקרומטר. תמונות נתפסו על מיקרוסקופ עם 20 x 0.8, 40 x 1.3, ו -60 x 1.4 מטרות מצלמת CCD, באמצעות תוכנת מיקרוסקופ. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54903/54903fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer at JoVE.com

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

A surgical procedure was developed to deliver mammary tumor cells to the murine liver via portal vein injection. This model permits investigation of late stages of liver metastasis in a fully immune competent host, including tumor cell extravasation, seeding, survival, and metastatic outgrowth in the liver.

מודל הזרקת Portal Vein לחקר גרור בכבד של סרטן השד

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

a-portal-vein-injection-model-to-study-liver-metastasis-breast

Research

JoVE Journal

Cancer Research

40.3K Views.  Oregon Health and Science University. A surgical procedure was developed to deliver mammary tumor cells to the murine liver via portal vein injection. This model permits investigation of late stages of liver metastasis in a fully immune competent host, including tumor cell extravasation, seeding, survival, and metastatic outgrowth in the liver. 

Video: A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Intra-iliac Artery Injection for Efficient and Selective Modeling of Microscopic Bone Metastasis

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely used intra-cardiac and intra-tibial injections, IIA injection brings several advantages. First, it can deliver a large quantity of cancer cells specifically to hind limb bones, thereby providing spatiotemporally synchronized early-stage colonization events and allowing robust quantification and swift detection of disseminated tumor cells. Second, it injects cancer cells into the circulation without damaging the local tissues, thereby avoiding inflammatory and wound-healing processes that confound the bone colonization process. Third, IIA injection causes very little metastatic growth in non-bone organs, thereby preventing animals from succumbing to other vital metastases, and allowing continuous monitoring of indolent bone lesions. These advantages are especially useful for the inspection of progression from single cancer cells to multi-cell micrometastases, which has largely been elusive in the past. When combined with cutting-edge approaches of biological imaging and bone histology, IIA injection can be applied to various research purposes related to bone metastases.

This manuscript provides the detailed procedure of intra-iliac artery (IIA) injection, a technique to deliver cancer cells specifically to hind limb tissues including bones to establish experimental bone metastases. Although initially established with breast tumor models, this protocol can be easily extended to other cancer types.

הזרקת עורק Intra-כסל עבור דוגמנות יעילה וסלקטיבי של מיקרוסקופיים עצם גרור

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely ...

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. However, little is known about the heterogeneity of liver metastases, and animal models capable of evaluating the development of individual metastatic colonies are needed. Here, we present an advanced model of hepatic metastases that provides the ability to quantitatively visualize the development of individual tumor clones in the liver and estimate their growth kinetics and colonization efficiency. We generated a panel of monoclonal derivatives of HCT116 human colorectal cancer cells stably labeled with luciferase and tdTomato and possessing different growth properties. With a splenic injection followed by a splenectomy, the majority of these clones are able to generate hepatic metastases, but with different frequencies of colonization and varying growth rates. Using the In Vivo&#160;Imaging System (IVIS), it is possible to visualize and quantify metastasis development with in vivo luminescent and ex vivo fluorescent imaging. In addition, Diffuse Luminescent Imaging Tomography (DLIT) provides a 3D distribution of liver metastases in vivo. Ex vivo fluorescent imaging of harvested livers provides quantitative measurements of individual hepatic metastatic colonies, allowing for the evaluation of the frequency of liver colonization and the growth kinetics of metastases. Since the model is similar to clinically observed liver metastases, it can serve as a modality for detecting genes associated with liver metastasis and for testing potential ablative or adjuvant treatments for liver metastatic disease.

The ability of metastatic clones to colonize distant sites depends on their proliferation capacity and/or their ability to survive in the host microenvironment without significant proliferation. Here, we present an animal model that allows quantitative visualization of both types of liver colonization by metastatic clones.

מתקדם במודל חיה של גרורה גסה בכבד: טכניקות הדמיה ונכסים של משובטים גרורתי

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

Intracarotid Cancer Cell Injection to Produce Mouse Models of Brain Metastasis

Metastasis, the spread and growth of malignant cells at secondary sites within a patient&#39;s body, accounts for &#62; 90% of cancer-related mortality. Recently, impressive advances in novel therapies have dramatically prolonged survival and improved quality of life for many cancer patients. Sadly, incidence of brain metastatic recurrences is fast rising, and all current therapies are merely palliative. Hence, good experimental animal models are urgently needed to facilitate in-depth studies of the disease biology and to assess novel therapeutic regimens for preclinical evaluation. However, the standard in vivo metastasis assay via tail vein injection of cancer cells produces predominantly lung metastatic lesions; animals usually succumb to the lung tumor burden before any meaningful outgrowth of brain metastasis. Intracardiac injection of tumor cells produces metastatic lesions to multiple organ sites including the brain; however, the variability of tumor growth produced with this model is large, dampening its utility in evaluating therapeutic efficacy. To generate reliable and consistent animal models for brain metastasis study, here we describe a procedure for producing experimental brain metastasis in the house mouse (Mus musculus) via intracarotid injection of tumor cells. This approach allows one to produce large number of brain metastasis-bearing mice with similar growth and mortality characteristics, thus facilitating research efforts to study basic biological mechanisms and to assess novel therapeutic agents.

Brain metastasis has become an urgent unmet medical need as its incidence has increased while therapeutic options have remained palliative. Creating experimental animal models of brain metastasis via intracarotid arterial injection of cancer cells facilitates mechanistic studies of the disease biology and evaluation of novel intervention regimens.

Cell הזרקת הסרטן Intracarotid לייצר מודלי עכבר של המוח גרור

Metastasis, the spread and growth of malignant cells at secondary sites within a patient&#39;s body, accounts for &#62; 90% of cancer-related mortality. ...

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor cells with a natural matrix and continual flow of nutrients, as well as a model that shows the interaction of tumor cells with normal cellular components and a natural matrix. The acellular ex vivo lung model is created by isolating a rat heart-lung block and removing all the cells using the decellularization process. The right main bronchus is tied off and tumor cells are placed in the trachea by a syringe. The cells move and populate the left lung. The lung is then placed in a bioreactor where the pulmonary artery receives a continual flow of media in a closed circuit. The tumor grown on the left lung is the primary tumor. The tumor cells that are isolated in the circulating media are circulating tumor cells and the tumor cells in the right lung are metastatic lesions. The cellular ex vivo lung model is created by skipping the decellularization process. Each model can be used to answer different research questions.

Here, we present a protocol for an ex vivo lung cancer model that mimics the steps of tumor progression and helps to isolate a primary tumor, circulating tumor cells, and metastatic lesions.

דגם לונג acellular וסלולריות ללמוד גרורות הגידול

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less aggressive breast tumors, the 5-year survival rate of TNBC patients is 77% due to their characteristic drug-resistant phenotype and metastatic burden. Toward this end, murine models have been established aimed at identifying novel therapeutic strategies limiting TNBC tumor growth and metastatic spread. This work describes a practical guide for the TNBC orthotopic model where MDA-MB-231 breast cancer cells suspended in a basement membrane matrix are implanted in the fourth mammary fat pad, which closely mimics the cancer cell behavior in humans. Measurement of tumors by caliper, lung metastasis assessment via in vivo and ex vivo imaging, and molecular detection are discussed. This model provides an excellent platform to study therapeutic efficacy and is especially suitable for the study of the interaction between the primary tumor and distal metastatic sites.

This work presets an advanced protocol to accurately assess tumor loading by detection of green fluorescent protein and bioluminescence signals as well as the integration of quantitative molecular detection technique.

לומדת משולשת סרטן השד שלילי באמצעות אורתובנושא שד סרטן השד מודל

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification and testing of novel therapeutic targets that will facilitate the development of better treatments for metastatic disease requires preclinical in vivo models. Demonstrated here is a syngeneic mouse model for assaying breast cancer metastatic colonization and subsequent growth. Metastatic cancer cells are stably transduced with viral vectors encoding firefly luciferase and ZsGreen proteins. Candidate genes are then stably manipulated in luciferase/ZsGreen-expressing cancer cells and then the cells are injected into mice via the lateral tail vein to assay metastatic colonization and growth. An in vivo imaging device is then used to measure the bioluminescence or fluorescence of the tumor cells in the living animals to quantify changes in metastatic burden over time. The expression of the fluorescent protein allows the number and size of metastases in the lungs to be quantified at the end of the experiment without the need for sectioning or histological staining. This approach offers a relatively quick and easy way to test the role of candidate genes in metastatic colonization and growth, and provides a great deal more information than traditional tail vein metastasis assays. Using this approach, we show that simultaneous knockdown of Yes associated protein (YAP) and transcriptional co-activator with a PDZ-binding motif (TAZ) in breast cancer cells leads to reduced metastatic burden in the lungs and that this reduced burden is the result of significantly impaired metastatic colonization and reduced growth of metastases.

The described approach combines experimental tail vein metastasis assays with in vivo live animal imaging to allow real-time monitoring of breast cancer metastasis formation and growth in addition to the quantification of metastasis number and size in the lungs.

שימוש משולב של הזנב וריד גרורה Assays ובזמן אמת ב Vivo הדמיה כדי לכמת מושבת סרטן השד ונטל בריאות

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous metastasis models are available. Thus, the experimental metastasis model involving tail-vein injection of suitable cell lines is a mainstay of metastasis research. When cancer cells are injected into the lateral tail-vein, the lung is their preferred site of colonization. A potential limitation of this technique is the accurate quantification of the metastatic lung tumor burden. While some investigators count macrometastases of a pre-defined size and/or include micrometastases following sectioning of tissue, others determine the area of metastatic lesions relative to normal tissue area. Both of these quantification methods can be exceedingly difficult when the metastatic burden is high. Herein, we demonstrate an intravenous injection model of lung metastasis followed by an advanced method for quantifying metastatic tumor burden using image analysis software. This process allows for investigation of multiple end-point parameters, including average metastasis size, total number of metastases, and total metastasis area, to provide a comprehensive analysis. Furthermore, this method has been reviewed by a veterinary pathologist board-certified by the American College of Veterinary Pathologists (SEK) to ensure accuracy.

Intravenous injection of cancer cells is often used in metastasis research, but the metastatic tumor burden can be difficult to analyze. Herein, we demonstrate a tail-vein injection model of metastasis and include a novel approach to analyze the resulting metastatic lung tumor burden.

ניתוח פתולוגי של גרורות ריאות בעקבות הזרקת וריד זנב לרוחב של תאים סרטניים

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. The leading cause of breast cancer related deaths is the metastatic burden. Therefore, preclinical models for breast cancer need to analyze metastatic burden to be clinically relevant. The 4T1 breast cancer model provides a spontaneously-metastasizing, quantifiable mouse model for stage IV human breast cancer. However, most 4T1 protocols quantify the metastatic burden by manually counting stained colonies on tissue culture plates. While this is sufficient for tissues with lower metastatic burden, human error in manual counting causes inconsistent and variable results when plates are confluent and difficult to count. This method offers a computer-based solution to human counting error. Here, we evaluate the protocol using the lung, a highly metastatic tissue in the 4T1 model. Images of methylene blue-stained plates are acquired and uploaded for analysis in Fiji-ImageJ. Fiji-ImageJ then determines the percentage of the selected area of the image that is blue, representing the percentage of the plate with metastatic burden. This computer-based approach offers more consistent and expeditious results than manual counting or histopathological evaluation for highly metastatic tissues. The consistency of Fiji-ImageJ results depends on the quality of the image. Slight variations in results between images can occur, thus it is recommended that multiple images are taken and results averaged. Despite its minimal limitations, this method is an improvement to quantifying metastatic burden in the lung by offering consistent and rapid results.

We describe a more consistent and expeditious method to quantify lung metastasis in the 4T1 breast cancer model by using Fiji-ImageJ.

שימוש בניתוח תמונה מבוסס מחשב כדי לשפר את כימות גרורות הריאות במודל סרטן השד 4T1

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

A Murine Ommaya Xenograft Model to Study Direct-Targeted Therapy of Leptomeningeal Disease

Leptomeningeal disease (LMD) is an uncommon type of central nervous system (CNS) metastasis to the cerebral spinal fluid (CSF). The most common cancers that cause LMD are breast and lung cancers and melanoma. Patients diagnosed with LMD have a very poor prognosis and generally survive for only a few weeks or months. One possible reason for the lack of efficacy of systemic therapy against LMD is the failure to achieve therapeutically effective concentrations of drug in the CSF because of an intact and relatively impermeable blood-brain barrier (BBB) or blood-CSF barrier across the choroid plexus. Therefore, directly administering drugs intrathecally or intraventricularly may overcome these barriers. This group has developed a model that allows for the effective delivery of therapeutics (i.e., drugs, antibodies, and cellular therapies) chronically and the repeated sampling of CSF to determine drug concentrations and target modulation in the CSF (when the tumor microenvironment is targeted in mice). The model is the murine equivalent of a magnetic resonance imaging-compatible Ommaya reservoir, which is used clinically. This model, which is affixed to the skull, has been designated as the &#34;Murine Ommaya.&#34; As a therapeutic proof of concept, human epidermal growth factor receptor 2 antibodies (clone 7.16.4) were delivered into the CSF via the Murine Ommaya to treat mice with LMD from human epidermal growth factor receptor 2-positive breast cancer. The Murine Ommaya increases the efficiency of drug delivery using a miniature access port and prevents the wastage of excess drug; it does not interfere with CSF sampling for molecular and immunological studies. The Murine Ommaya is useful for testing novel therapeutics in experimental models of LMD.

Here, we describe a murine xenograft model that functionally resembles an Ommaya reservoir in patients. We developed the Murine Ommaya to study novel therapeutics for the universally fatal leptomeningeal disease.

מודל קסנוגרפט של מורין אומאיה לחקר טיפול ישיר ממוקד במחלת לפטומינגיאל

Leptomeningeal disease (LMD) is an uncommon type of central nervous system (CNS) metastasis to the cerebral spinal fluid (CSF). The most common cancers ...

Modeling Brain Metastasis Via Tail-Vein Injection of Inflammatory Breast Cancer Cells

Metastatic spread to the brain is a common and devastating manifestation of many types of cancer. In the United States alone, about 200,000 patients are diagnosed with brain metastases each year. Significant progress has been made in improving survival outcomes for patients with primary breast cancer and systemic malignancies; however, the dismal prognosis for patients with clinical brain metastases highlights the urgent need to develop novel therapeutic agents and strategies against this deadly disease. The lack of suitable experimental models has been one of the major hurdles impeding advancement of our understanding of brain metastasis biology and treatment. Herein, we describe a xenograft mouse model of brain metastasis generated via tail-vein injection of an endogenously HER2-amplified cell line derived from inflammatory breast cancer (IBC), a rare and aggressive form of breast cancer. Cells were labeled with firefly luciferase and green fluorescence protein to monitor brain metastasis, and quantified metastatic burden by bioluminescence imaging, fluorescent stereomicroscopy, and histologic evaluation. Mice robustly and consistently develop brain metastases, allowing investigation of key mediators in the metastatic process and the development of preclinical testing of new treatment strategies.

We describe a xenograft mouse model of breast cancer brain metastasis generated via tail-vein injection of an endogenously HER2-amplified inflammatory breast cancer cell line.

מידול גרורות במוח באמצעות הזרקת ורידים בזנב של תאי סרטן שד דלקתיים

Metastatic spread to the brain is a common and devastating manifestation of many types of cancer. In the United States alone, about 200,000 patients are ...