המחברים מודים למתקן גרעין ההדמיה INRA MIMA2 (INRA, UMR1198, Jouy-en-Josas) וצוות של יחידת IERP (UE 0,907, INRA, Jouy-en-Josas) לטיפול בבעלי חיים ומתקנים. כמו כן, אנו רוצים להודות לIH מאת&#39;ר, MC נוויל וס Tooze שספק לנו antibodie מאוד שימושי.

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

IHC הוא שיטה ניסיונית יחסית פשוטה וישירה בתרגום אנטיגן בסעיפים רקמות, שתלוי בעיקר באינטראקציות epitope-נוגדן ספציפיים. למרות מספר גדול של פרוטוקולים המשמש בתרגום חלבון על ידי IIF, הליבה של הליכים אלה היא כמעט תמיד זהה. עם זאת, יש כמה היבטים קריטיים שיכול מאוד להשפיע על התוצ?...

בלוטת החלב היא איבר אקסוקרינית יונקים טיפוסי שעיקר תפקידו הוא לייצר חלב כדי להאכיל תינוקות. הפיתוח של רקמת השד מתרחש בעיקר לאחר לידה ומאופיינת בתהליך ייחודי שבו האפיתל פולש סטרומה שמסביב. רקמה זו עוברת שינויים רבים (צמיחה, בידול ורגרסיה), במיוחד במהלך החיים הבוגרים, במקביל עם וריאציות במצב פוריות (איור 1). בנוסף למורפולוגיה הכוללת של הרקמה, פרופורציות סוגי תאים שונים, כמו גם ההסדר שלהם בתוך בלוטת החלב של לשנות באופן דרמטי במהלך פיתוח 1-5. במהלך חיים עובריים, אפיתל החלב נובע מהקווים חלב החלב, אשר מוגדרים על ידי עיבוי וריבוד קל של האאקטודרם, בין הגפיים הקדמי ואחוריים בכל צד של קו האמצע סביב יום עוברי 10.5 (E10.5) (איור 1 א ).על E11.5, קו חלב שובר לתוך placodes הבודד, אשר ממוקמים באופן סימטרי לאורך קו חלב החלב במקומות לשחזור, וmesenchyme מסביב מתחיל להתעבות. Placodes מתחיל לשקוע עמוק יותר לתוך הדרמיס וmesenchyme החלב מארגן בשכבות קונצנטריות סביב ניצן החלב (E12.5-E14.5). נכון לE15.5, האפיתל החלב, מתחיל להתרבות ולהאריך כדי ליצור את הנבט הראשוני שדוחף דרך mesenchyme החלב לכרית השומן. הנבט הראשוני מתפתח לומן חלול עם פתיחה לעור, מסומנת על ידי ההיווצרות של נדן הפטמה. על E18.5, צינור ההארכה גדל לתוך כרית השומן ומסועף למערכת ductal arborized קטנה הקיפה בכרית השומן. פיתוח הוא למעשה נעצר ובלוטת החלב הבסיסית נשארה morphogenetically שקטה עד גיל ההתבגרות. בעובר ממין זכר, ההפעלה של קולטני אנדרוגן מובילה לניוון של הניצנים, שייעלמועל ידי E15.5. נכון לE18, פיתוח החלב מפסיק עד גיל ההתבגרות 6-9. בלידה, בלוטת החלב מטפחת מערכת ductal בסיסית שמתארכת וסניפים לאט (צמיחת איזומטרי). בתחילת גיל התבגרות, מבנים כדוריים הממוקמים בקצוות של הצינורות הנקראים ניצני מסוף הסוף (TEBs), נוצרים משכבה חיצונית של תאי כובע וליבה רב שכבתית פנימית של תאים (תאי גוף). מבנים אלה הם שגשוג ביותר ולחדור לרקמות שמסביב סטרומה בתגובה לאותות הורמונליים. הפצת נשק בתוך תוצאות TEBs בהתארכות ductal, בשילוב עם הסתעפות המורפוגנזה. תהליך זה מוביל להקמתה של רשת arborized אפיתל בסיסית הנובעת מהפטמה (איור 1, גיל ההתבגרות). ב ~ 10-12 שבועות לאחר הלידה, כאשר האפיתל פלש כל כרית השומן, הרחבתה עוצרת ונעלמת TEBs. פיתוח ductal אז עובר שינויים דינמיים, כלומר, successiיש התפשטות ונסיגה של תאי האפיתל על פי מחזורי ייחום 10 (איור 1, מבוגר). מתחילת ההריון, רקמת החלב עוברת צמיחה חשובה ושינויים מורפולוגיים להתכונן להנקה. אפיתל החלב בהרחבה להתרבות ולהבדיל, שמוביל לרשת tubulo-alveolar מסועף מאוד. במקביל, תאי אפיתל החלב (MECs) הפכו מקוטבים ומסוגלים לסנתז ולהפריש מוצרי חלב. MECs לארגן למבנים רבים מכתשיים (acini) שמוקפים בתאי myoepithelial התכווצות והתאגד בסטרומה המורכבת מרקמות חיבור ושומן, כלי דם ומסוף עצב (איור 1, הריון). יתר על כן, בצד הבסיסי של MECs נמצא בקשר הדוק עם הקרום במרתף (מטריקס), ויחסי גומלין בין שני גופים אלה בחוזקה להסדיר שתי פונקצית המורפוגנזה והפרשה של האמאאפיתל ר&quot;י 11-13. כל התהליכים האלה מסתמכים על הפעולה של רמזים סביבתיים שונים, שהחשוב ביותר הם hormones14, גורמים אוטוקריני ומטריקס. לדוגמא, פרוגסטרון גורם נרחב 15 וalveologenesis ש, בשילוב עם פרולקטין (PRL) הסתעפות בצד 16,17, מקדם ושומר על הבידול של alveoli. בנוסף לסטרואידים וPRL18, ציטוקינים ומסלולי איתות הקשורים בהתפתחות (Wnt וNotch מסלולי איתות) הם מעורבים גם במחויבות שושלת החלב ופיתוח 19-21. בסוף ההריון, MECs luminal מתחיל לייצר חלב עשיר בחלבון הידוע כקולוסטרום בלומן של alveoli. בנוסף, פרוגסטרון פועל על חדירות אפיתל ומאז צמתים ההדוקים עדיין פתוחים, קולוסטרום נמצא גם בזרם הדם האימהי. לאחר המלטה, mammarאפיתל y תופס כמעט את כל החלב בלוטת הנפח ומאורגן ביותר (איור 2, אפיתל החלב). יחידות ייצור חלב, כלומר alveoli (איור 2, נֹאדִית), נוצרות על ידי monolayer של תאים מקוטבים החלב אפיתל הפרשה (MESCs), עם קרום הפלזמה פסגתם תיחום לומן. Alveoli לארגן את עצמם לאוניות שמקובצות לאונות מחוברות לצינורות המנקזים חלב לסביבה החיצונית (איור 2, אונה). הנקה מתרחשת, כלומר., MESCs להתחיל להפריש כמויות שופעות של חלב, מופעלות בעיקר על ידי הירידה בהורמוני שליה (בעיקר פרוגסטרון) (איור 1, הנקה). גני חלבון חלב מופעלים בקורס זמן זמני מוגדר החל הריון להנקת 9,22,23, בעיקר בתגובה לPRL יותרת המוח שוחרר בזמן היניקה. במקביל, אנשי קשר בין MESCs ומטריקס שני לעורר synt חלבון חלבhesis באמצעות אותות שמתווכים באמצעות האינטראקציות בין integrins וlaminin 24,25 הסלולריים, ולדכא אפופטוזיס בMESCs 26,27. מסלולי איתות אלה יגרמו להפעלה של יזמי גן חלבון חלב 28 דרך ההפעלה של שעתוק ספציפי גורמי 29. קשר תאי תאים הם חשוב גם להיבטים מסוימים של בידול לרבות הקמת קוטביות הפסגה והפרשת הווקטורים של מוצרי חלב. צמתים הדוקים קרובים במהירות לאחר תחילת ההנקה וMESCs דק לתזמר את הספיגה של מולקולות מהדם, כמו גם את הסינתזה, התחבורה וההפרשה של מרכיבי חלב, בתגובה לדרישות התזונתיות של ילודים. בזמן היניקה, ההתכווצות של התאים המקיפים את myoepithelial alveoli מתרחשת בתגובה לאוקסיטוצין וגורמת לשחרור חלב דרך הצינורות ולפטמה. חלב הוא נוזל מורכב שמכיל חלבונים (בעיקרcaseins), סוכרים (בעיקר לקטוז), שומנים ומינרלים, כמו גם מולקולות ביו כגון נוגדנים (IgA), גורמי גדילה והורמונים. Caseins מסונתזים, התאסף במבנים על-מולקולריים, כלומר קזאין מיצלות, מועבר לאורך מסלול ההפרשה, ולאחר מכן שוחרר על ידי exocytosis, כלומר, שילוב של שלפוחית ​​הפרשה המכיל קזאין (SVS) עם קרום הפלזמה הפסגה של המסקלין (איור 2). תנועה תאית מסתמכת על חילופי חומרים בין תאים הקרומיים וכרוכה מסיס N-ethylmaleimide רגיש Fusion (NSF) חלבון קובץ מצורף (SNAP) קולטן (מלכודת) 30,31. חלבוני מלכודת המשפחה מחולק במלכודות לפוחי (V-מלכודות), הנמצאות בקרום השלפוחית, ומלכודות יעד (t-מלכודות), מקומיות על קרומי היעד. על ידי רוכס דרך תחומים סליל המפותל שלהם, למלכודות לא V- ולהרכיב כדי ליצור חבילה מורכבת ארבעה-סליל מאוד יציב, המכונה המורכב מלכודת דואר. מורכב זו מקדמת את השילוב של שני bilayers שומנים היריב על ידי הבאת אותם בהדרגה לקרבה 30,32. לאחר מכן, מתחמי מלכודת הם ניתקו על ידי triphosphatase אדנוזין NSF וחלבוני SNAP ומלכודת חלבון מתאם שלה ממוחזרים בחזרה לתא מוצאם 33. מעניין, כל חלבון מלכודת בעיקר מתגורר בתאים סלולריים שונים וזיווג מלכודת עשויה לתרום לספציפיות של אירועי היתוך תאיים 34. המחקרים קודמים מצביעים על כך שלפחות Synaptosomal הקשורים חלבון 23 (SNAP23) וחלבון שלפוחיות קרום הקשורים 8 (VAMP8), וsyntaxins (STX) -7 ו-12 לשחק תפקיד בexocytosis קזאין 35,36. חלבונים אלה יש גם נמצאים בקשר עם חלק השומנים חלב, כלומר, שומן חלב כדוריות (MFGs) 37. המודל הרווח הנוכחי מניח כי טיפות cytoplasmic שומנים (CLDs) נוצרות על ידי ההצטברות של l הניטרליipids (בעיקר triacylglycerols ואסטרים סטרולים) וכולסטרול נובע מהתזונה האימהית בין שני העלונים של קרום reticulum endoplasmic (ER) 38-41. CLDs הגדול נוצרים, לפחות בחלקו, על ידי השילוב של CLDs הקטן יותר, תוך העברתו לצד הפסגה של MESCs שבו הם שוחררו כMFGs (1-10 מיקרומטר בקוטר) על ידי ניצנים, שעטופה בקרום הפלזמה פסגת המסקלין 40-42. הנקה מפסיקה אחרי הגורים נגמלים וMESCs למות בהדרגה על ידי אפופטוזיס, שהוביל לנסיגה של רקמת השד בחזרה למצב התבגרות (איור 1, פוף). Immunofluorescence (IF) הוא שיטת מעבדה האנליטית נפוצה בשימוש כמעט בכל ההיבטים של ביולוגיה, הן במחקר ואבחון קליני ב. אם ניתן לבצע טכניקות בסעיפי רקמות (אימונוהיסטוכימיה, IHC) או תא (immunocytochemistry, ICC) דגימות. גישה זו עוצמה מסתמכת על השימוש בניאוןנוגדנים שכותרתו כי דווקא להיקשר לאנטיגן של עניין (במישרין או בעקיפין), ובכך מאפשרים ההדמיה של רקמות ההפצה שלה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. אותות הקרינה בעיקר תלויים באיכות ובריכוז של הנוגדנים וטיפול נכון של הדגימה. פרוטוקול פשוט immunofluorescence העקיף (IIF) מוצג לזהות מוצרי חלב (caseins וMFGs) וחלבונים מעורבים בהפרשת מוצר חלב (butyrophilin (BTN1), מלכודת חלבונים) בחלקים קפואים של רקמת שד עכבר (איור 3). בעוד פרוטוקול זה מספק סקירת IHC מלאה, החל מאיסוף רקמות לאחר טיפול תמונה, ביקורתי וצעדים אופציונליים, כמו גם כמה המלצות טכניות גם הוצג ונדון.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:756px;" width="755">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Dissection</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:236px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Pins</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Ethanol</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Scissors</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel and adapted blades</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Ice</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Towel paper</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Tissue sample preparation</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Phosphate Buffered Saline (pH7.4)</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td>P-3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Paraformaldehyde (PFA, 32% EM grade, 100 ml)</td>
			<td style="width:155px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714-S</td>
			<td>personnal protection equipment required WARNING: this product will expose you to Formaldehyde Gas, a chemical known to cause cancer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OCT compound/Tissue Tek</td>
			<td style="width:155px;">Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose (D-saccharose)</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td>27480.294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Plastic molds</td>
			<td style="width:155px;">Dominique Dutscher</td>
			<td>39910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Liquid nitrogen</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Cryostat/sample support</td>
			<td style="width:155px;">Leica&#160;</td>
			<td>CM3050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Razor blades (SEC35)</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Scientific</td>
			<td>152200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Slide box</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Glass slides Superfrost/Superfrost Ultra Plus</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Scientific</td>
			<td>10143560W90/1014356190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Brushes</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">IHC</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Super Pap Pen</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td>Z377821-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Permanent marker (black)</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:239px;">50 mM NH4Cl in PBS</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td>A-0171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">0.1 M glycine in PBS</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td>24403.367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Antigen Retrieval solution: Tris 100 mM 5% urea pH9.6</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Heater (up to 100&#176;C)</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Vectashield (anti-fading mounting medium) without DAPI/with DAPI</td>
			<td style="width:155px;">Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000/H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Glass coverslips 22x50mm (microscopy grade)</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td>CORN2980-225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Nail polish</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Primary antibodies</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:239px;">Rabbit anti-mouse caseins (#7781; 1:50 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">generously gifted by M.C. Neville (University of Colorado Health Sciences 
			Center, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Mouse anti-cytokeratin 8 (CK8, clone 1E8, 1:50 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">Biolegend (Covance)</td>
			<td>MMS-162P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Mouse anti-cytokeratin 14 (CK14, cloneLL002, 1:50 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Scientific</td>
			<td>MS-115-P0/P1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:239px;">Rabbit anti-butyrophilin (1:300 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">generously gifted by I.H. Mather (Department of Animal and Avian Sciences University of Maryland College Park, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:239px;">Rabbit anti-Stx6 (1:50 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">generously gifted S. Tooze 
			(Cancer Research UK, London Research Institute, London, UK)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Rabbit anti-VAMP4 (1:50 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">Abcam</td>
			<td>ab3348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Secondary antibodies</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:239px;">Rhodamine-conjugated goat anti-rabbit IgG (H + L) (1:300 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>111-025-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Counterstains</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Bodipy 493/503</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies (Molecular Probes)</td>
			<td>D-3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">DAPI (4-6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies (Molecular Probes)</td>
			<td>D-1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Observation/Image capture</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:239px;">conventional fluorescence microscope</td>
			<td style="width:155px;">Leica Leitz DMRB 
			microscope</td>
			<td></td>
			<td style="width:236px;">Standard filters for FITC, Rhodamine 
			and DAPI emissions,&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; &#215;63 oil-immersion objective (NA 1.3), DP50 imaging camera (Olympus), Cell&#710;F software (Olympus)</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:239px;">Laser Scanning Microscope (confocal microscopy)</td>
			<td style="width:155px;">Zeiss LSM 
			510 microscope</td>
			<td></td>
			<td style="width:236px;">Plan-Apochromat &#215;63 oil-immersion objective (NA 1.4),&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; CLSM 510 software,&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Confocal facilities, MIMA2 Platform, INRA Jouy-en-Josas, France, http://mima2.jouy.inra.fr/mima2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Image treatment</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ 1.49k software</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td>Free software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

indirect immunofluorescence on frozen sections of mouse mammary gland

immunofluorescence העקיף משמש כדי לזהות ולאתר חלבוני עניין ברקמה. הפרוטוקול המובא כאן מתאר שיטה שלמה ופשוטה לגילוי חיסוני של חלבונים, העכבר המניקים בלוטת החלב שנלקח כדוגמא. פרוטוקול להכנת דגימות הרקמה, במיוחד בנוגע לנתיחה של בלוטת החלב עכבר, קיבעון רקמות וחתך רקמה קפוא, מפורט. פרוטוקול סטנדרטי לבצע immunofluorescence העקיף, כולל שלב אחזור אנטיגן אופציונאלי, מוצג גם. ההתבוננות בסעיפי הרקמות שכותרתו כמו גם רכישת תמונה ופוסט-טיפולים גם מוצגים. הליך זה נותן סקירה מלאה, מהאוסף של רקמת חיה ללוקליזציה הסלולרית של חלבון. למרות ששיטה כללית זה יכול להיות מיושמת על דגימות רקמה אחרות, זה צריך להיות מותאם לכל זוג נוגדן רקמה / העיקרית למד.

בלוטת החלב היא בלוטה תת עורית הממוקמת לאורך מבנה הגחון של שני החזה והבטן במכרסמים. המיקום של חמישה הזוגות של בלוטות של העכבר במהלך ההריון מוצג באיור 4. המורפולוגיה של בלוטת החלב באופן דרמטי משתנה במהלך התפתחותו, המשקף שינויים פונקציונליים הנדרשים להכ...

Watch this Scientific Journal Video about Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland at JoVE.com

Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

פרוטוקול immunofluorescence העקיף המתואר במאמר זה מאפשר זיהוי והלוקליזציה של חלבונים בבלוטת החלב עכבר. שיטה שלמה ניתן להכין דגימות בלוטת החלב, לבצע אימונוהיסטוכימיה, לתמונת סעיפי רקמות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי, ולשחזר תמונות.

Immunofluorescence עקיף על סעיפים קפואים של עכבר בלוטת החלב

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

indirect-immunofluorescence-on-frozen-sections-of-mouse-mammary-gland

Research

JoVE Journal

Biology

36.4K Views.  INRA.  פרוטוקול immunofluorescence העקיף המתואר במאמר זה מאפשר זיהוי והלוקליזציה של חלבונים בבלוטת החלב עכבר. שיטה שלמה ניתן להכין דגימות בלוטת החלב, לבצע אימונוהיסטוכימיה, לתמונת סעיפי רקמות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי, ולשחזר תמונות. 

Video: Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, suprabasal, and stratum corneum layers. The precise localization within the epidermis of a particular protein lends clues toward its functional role within the epidermis. In this chapter, we describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory. Paraffin sections generally provide much better morphology, hence, superior results and photographs; however, not all antibodies will work with the harsh fixation and treatment involved in their processing. Therefore, the protocol for frozen sectioning is also included. Within paraffin sectioning, two fixation protocols are described (Bouin's and paraformaldehyde); the choice of fixative will be directly related to the antibody specifications and may require another fixing method.

We describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory.

אימונוהיסטוכימיה על סעיפים פרפין של האפידרמיס עכבר באמצעות נוגדנים פלורסנט

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of dome shaped cell structures referred to as mammospheres 1. The HC11 cell line has been employed as a model system for the study of regulation of mammary lactogenic differentiation both in vitro and in vivo 2. The HC11 cells differentiate and synthesize milk proteins in response to treatment with lactogenic hormones. Following the growth of HC11 mouse mammary epithelial cells to confluence, lactogenic differentiation was induced by the addition of a combination of lactogenic hormones including dexamethasone, insulin, and prolactin, referred to as DIP. The HC11 cells induced to differentiate were photographed at times up to 120 hours post induction of differentiation and the number of mammospheres that appeared in each culture was enumerated. The size of the individual mammospheres correlates with the degree of differentiation and this is depicted in the images of the differentiating cells.

HC11 lactogenic differentiation can be characterized by the formation of domed structures referred to as mammospheres. The structures can be enumerated by phase contrast microscopy to aid in quantifying lactogenic differentiation.

תאים אפיתל עכבר החלב טופס Mammospheres במהלך התמיינות Lactogenic

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland undergoes extensive modeling and re-modeling, alter susceptibility to carcinogen-induced mammary tumors. Similar findings have been described in humans: for example, high birthweight increases later risk of developing breast cancer, and dietary intake of soy during childhood decreases breast cancer risk. It is thought that these prenatal and postnatal dietary modifications induce persistent morphological changes in the mammary gland that in turn modify breast cancer risk later in life. These morphological changes likely reflect epigenetic modifications, such as changes in DNA methylation, histones and miRNA expression that then affect gene transcription . In this article we describe how changes in mammary gland morphology can predict mammary cancer risk in rats. Our protocol specifically describes how to dissect and remove the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology according to three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use the data to predict risk of developing mammary cancer.

Our protocol describes how to dissect the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology using three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use these results to predict mammary cancer risk in rats which were exposed to dietary modifications in utero or during prepuberty.

שינויים במורפולוגיה בלוטת החלב ואת הסיכון לסרטן השד אצל חולדות

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

מדורים פרפין-Embedded קפואים של תסיסנית סקס שרירים

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of saliva into the oral cavity. Serous and mucous acinar cells are the protein and mucous producing factories of the gland respectively, and represent the origin of saliva production. Once synthesised, the various enzymatic and other proteinaceous components of saliva are secreted through a series of ductal cells bearing epithelial-type morphology, until the eventual expulsion of the saliva through one major duct into the cavity of the mouth. The composition of saliva is also modified by the ductal cells during this process.
In the manifestation of diseases such as Sj&ouml;gren's syndrome, and in some clinical situations such as radiotherapy treatment for head and neck cancers, saliva production by the glands is dramatically reduced 1,2. The resulting xerostomia, a subjective feeling of dry mouth, affects not only the ability of the patient to swallow and speak, but also encourages the development of dental caries and can be socially debilitating for the sufferer.
The restoration of saliva production in the above-mentioned clinical conditions therefore represents an unmet clinical need, and as such several studies have demonstrated the regenerative capacity of the salivary glands 3-5. Further to the isolation of stem cell-like populations of cells from various tissues within the mouse and human bodies 6-8, we have shown using the described method that stem cells isolated from mouse salivary glands can be used to rescue saliva production in irradiated salivary glands 9,10. This discovery paves the way for the development of stem cell-based therapies for the treatment of xerostomic conditions in humans, and also for the exploration of the salivary gland as a microenvironment containing cells with multipotent self-renewing capabilities.

An optimized protocol for the isolation of stem cells from the mouse salivary gland is described. The method employs enzymatic and mechanical digestion, and permits isolation of salispheres containing cells with characteristics of stem cells.

בידוד של בלוטת הרוק עכבר תאים גזע

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves composed of a number of terminal duct lobular units made of secretory alveoli and converging ducts1. In mice, a similar architecture is observed at pregnancy in which ducts and alveoli are interspersed within the connective tissue stroma. The mouse mammary gland epithelium is a tree like system of ducts composed of two layers of cells, an inner layer of luminal cells surrounded by an outer layer of myoepithelial cells denoted by the confines of a basement membrane2. At birth, only a rudimental ductal tree is present, composed of a primary duct and 15-20 branches. Branch elongation and amplification start at the beginning of puberty, around 4 weeks old, under the influence of hormones3,4,5. At 10 weeks, most of the stroma is invaded by a complex system of ducts that will undergo cycles of branching and regression in each estrous cycle until pregnancy2. At the onset of pregnancy, a second phase of development begins, with the proliferation and differentiation of the epithelium to form grape-shaped milk secretory structures called alveoli6,7. Following parturition and throughout lactation, milk is produced by luminal secretory cells and stored within the lumen of alveoli. Oxytocin release, stimulated by a neural reflex induced by suckling of pups, induces synchronized contractions of the myoepithelial cells around the alveoli and along the ducts, allowing milk to be transported through the ducts to the nipple where it becomes available to the pups 8. Mammary gland development, differentiation and function are tightly orchestrated and require, not only interactions between the stroma and the epithelium, but also between myoepithelial and luminal cells within the epithelium9,10,11. Thereby, mutations in many genes implicated in these interactions may impair either ductal elongation during puberty or alveoli formation during early pregnancy, differentiation during late pregnancy and secretory activation leading to lactation12,13. In this article, we describe how to dissect mouse mammary glands and assess their development using whole mounts. We also demonstrate how to evaluate myoepithelial contractions and milk ejection using an ex-vivo oxytocin-based functional assay. The effect of a gene mutation on mammary gland development and function can thus be determined in situ by performing these two techniques in mutant and wild-type control mice.

This method describes how to dissect and assess mammary gland development and function from mice. Excised mammary glands are assessed for the degree of development using whole mount while milk ejection is evaluated using an oxytocin-based myoepithelial cell contraction assay.

הערכת התפתחות בלוטת החלב פונקציה ועל מודלים עכבר

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation between cells within a tissue. Isolation of pure cardiomyocyte populations through a collagenase perfusion of mouse hearts facilitates the generation of single cell microarrays for whole transcriptome gene expression, or qPCR of specific targets using nanofluidic arrays. We describe here a procedure to examine single cell gene expression profiles of cardiomyocytes isolated from the heart. This paradigm allows for the evaluation of metrics of interest which are not reliant on the mean (for example variance between cells within a tissue) which is not possible when using conventional whole tissue workflows for the evaluation of gene expression (Figure 1). We have achieved robust amplification of the single cell transcriptome yielding micrograms of double stranded cDNA that facilitates the use of microarrays on individual cells. In the procedure we describe the use of NimbleGen arrays which were selected for their ease of use and ability to customize their design. Alternatively, a reverse transcriptase - specific target amplification (RT-STA) reaction, allows for qPCR of hundreds of targets by nanofluidic PCR. Using either of these approaches, it is possible to examine the variability of expression between cells, as well as examining expression profiles of rare cell types from within a tissue. Overall, the single cell gene expression approach allows for the generation of data that can potentially identify idiosyncratic expression profiles that are typically averaged out when examining expression of millions of cells from typical homogenates generated from whole tissues.

Single cell expression profiling allows the detailed gene expression analysis of individual cells. We describe methods for the isolation of cardiomyocytes, and preparing the resulting lysates for either whole transcriptome microarray or qPCR of specific targets.

פרופיל תא יחיד תעתיק של cardiomyocytes עכבר למבוגרים

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Intraductal Injection for Localized Drug Delivery to the Mouse Mammary Gland

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of genes within the mammary epithelium has been difficult to achieve due to the lack of appropriate targeting molecules that are independent of developmental stages such as pregnancy and lactation. Herein, we describe a technique for localized delivery of reagents to the mammary gland at any stage in adulthood via intraductal injection into the nipples of mice. The injections can be performed on live mice, under anesthesia, and allow for a non-invasive and localized drug delivery to the mammary gland. Furthermore, the injections can be repeated over several months without damaging the nipple. Vital dyes such as Evans Blue are very helpful to learn the technique. Upon intraductal injection of the blue dye, the entire ductal tree becomes visible to the eye. Furthermore, fluorescently labeled reagents also allow for visualization and distribution within the mammary gland. This technique is adaptable for a variety of compounds including siRNA, chemotherapeutic agents, and small molecules.

A protocol for the non-invasive intraductal delivery of aqueous reagents to the mouse mammary gland is described. The method takes advantage of localized injection into the nipples of mammary glands targeting mammary ducts specifically. This technique is adaptable for a variety of compounds including siRNA, chemotherapeutic agents and small molecules.

הזרקת intraductal עבור משלוח סמים מקומיים לעכבר החלב בלוטת

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal architecture. Here, a small pocket below the skin was created using Mayo scissors, allowing separation of the glands within the subcutaneous tissue from the underlying peritoneum. Visualization of the glands was aided by the use of 3.5x-R surgical micro loupes. The pelt was inverted and pinned back allowing identification of the intact mammary fat pads. Each of the #4 abdominal glands was bluntly dissected by sliding the scalpel blade laterally between the subcutaneous layer and the glands. Immediately post-harvest, glands were placed in 10% neutral buffered formalin for subsequent tissue processing. Excision of the entire gland is advantageous because it primarily eliminates the risk of excluding important tissue-wide interactions between ductal epithelial cells and other microenvironmental cellular populations that could be missed in a partial biopsy. One drawback of the methodology is the use of serial sections from fixed tissues which limits analyses of ductal morphogenesis and protein expression to discrete locations within the gland. As such, changes in ductal architecture and protein expression in 3 dimensions (3D) is not readily obtainable. Overall, the technique is applicable to studies requiring whole intact murine mammary glands for downstream investigations such as developmental ductal morphogenesis or breast cancer.

Here, we present a protocol for the isolation of whole, intact mouse mammary glands to investigate extracellular matrix (ECM) expression and ductal morphology. Mouse #4 abdominal glands were extracted from 8-10 week old female nulliparous mice, fixed in neutral buffered formalin, sectioned and stained using immunohistochemistry for ECM proteins.

בידוד של בלוטות מוגדלות ללא פגע, כל עכבר לניתוח של בלוטת מורפולוגיה וביטוי מטריצה חוץ-תאית

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

תא הטרנס-הפנימית המוני הזרקה של תאי גזע עובריים מוביל שיעור גבוה יותר של Chimerism

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...