Name: indirect immunofluorescence on frozen sections of mouse mammary gland
Uploaded: 2015-12-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland at JoVE.com

המחברים מודים למתקן גרעין ההדמיה INRA MIMA2 (INRA, UMR1198, Jouy-en-Josas) וצוות של יחידת IERP (UE 0,907, INRA, Jouy-en-Josas) לטיפול בבעלי חיים ומתקנים. כמו כן, אנו רוצים להודות לIH מאת&#39;ר, MC נוויל וס Tooze שספק לנו antibodie מאוד שימושי.

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

IHC הוא שיטה ניסיונית יחסית פשוטה וישירה בתרגום אנטיגן בסעיפים רקמות, שתלוי בעיקר באינטראקציות epitope-נוגדן ספציפיים. למרות מספר גדול של פרוטוקולים המשמש בתרגום חלבון על ידי IIF, הליבה של הליכים אלה היא כמעט תמיד זהה. עם זאת, יש כמה היבטים קריטיים שיכול מאוד להשפיע על התוצ?...

בלוטת החלב היא איבר אקסוקרינית יונקים טיפוסי שעיקר תפקידו הוא לייצר חלב כדי להאכיל תינוקות. הפיתוח של רקמת השד מתרחש בעיקר לאחר לידה ומאופיינת בתהליך ייחודי שבו האפיתל פולש סטרומה שמסביב. רקמה זו עוברת שינויים רבים (צמיחה, בידול ורגרסיה), במיוחד במהלך החיים הבוגרים, במקביל עם וריאציות במצב פוריות (איור 1). בנוסף למורפולוגיה הכוללת של הרקמה, פרופורציות סוגי תאים שונים, כמו גם ההסדר שלהם בתוך בלוטת החלב של לשנות באופן דרמטי במהלך פיתוח 1-5. במהלך חיים עובריים, אפיתל החלב נובע מהקווים חלב החלב, אשר מוגדרים על ידי עיבוי וריבוד קל של האאקטודרם, בין הגפיים הקדמי ואחוריים בכל צד של קו האמצע סביב יום עוברי 10.5 (E10.5) (איור 1 א ).על E11.5, קו חלב שובר לתוך placodes הבודד, אשר ממוקמים באופן סימטרי לאורך קו חלב החלב במקומות לשחזור, וmesenchyme מסביב מתחיל להתעבות. Placodes מתחיל לשקוע עמוק יותר לתוך הדרמיס וmesenchyme החלב מארגן בשכבות קונצנטריות סביב ניצן החלב (E12.5-E14.5). נכון לE15.5, האפיתל החלב, מתחיל להתרבות ולהאריך כדי ליצור את הנבט הראשוני שדוחף דרך mesenchyme החלב לכרית השומן. הנבט הראשוני מתפתח לומן חלול עם פתיחה לעור, מסומנת על ידי ההיווצרות של נדן הפטמה. על E18.5, צינור ההארכה גדל לתוך כרית השומן ומסועף למערכת ductal arborized קטנה הקיפה בכרית השומן. פיתוח הוא למעשה נעצר ובלוטת החלב הבסיסית נשארה morphogenetically שקטה עד גיל ההתבגרות. בעובר ממין זכר, ההפעלה של קולטני אנדרוגן מובילה לניוון של הניצנים, שייעלמועל ידי E15.5. נכון לE18, פיתוח החלב מפסיק עד גיל ההתבגרות 6-9. בלידה, בלוטת החלב מטפחת מערכת ductal בסיסית שמתארכת וסניפים לאט (צמיחת איזומטרי). בתחילת גיל התבגרות, מבנים כדוריים הממוקמים בקצוות של הצינורות הנקראים ניצני מסוף הסוף (TEBs), נוצרים משכבה חיצונית של תאי כובע וליבה רב שכבתית פנימית של תאים (תאי גוף). מבנים אלה הם שגשוג ביותר ולחדור לרקמות שמסביב סטרומה בתגובה לאותות הורמונליים. הפצת נשק בתוך תוצאות TEBs בהתארכות ductal, בשילוב עם הסתעפות המורפוגנזה. תהליך זה מוביל להקמתה של רשת arborized אפיתל בסיסית הנובעת מהפטמה (איור 1, גיל ההתבגרות). ב ~ 10-12 שבועות לאחר הלידה, כאשר האפיתל פלש כל כרית השומן, הרחבתה עוצרת ונעלמת TEBs. פיתוח ductal אז עובר שינויים דינמיים, כלומר, successiיש התפשטות ונסיגה של תאי האפיתל על פי מחזורי ייחום 10 (איור 1, מבוגר). מתחילת ההריון, רקמת החלב עוברת צמיחה חשובה ושינויים מורפולוגיים להתכונן להנקה. אפיתל החלב בהרחבה להתרבות ולהבדיל, שמוביל לרשת tubulo-alveolar מסועף מאוד. במקביל, תאי אפיתל החלב (MECs) הפכו מקוטבים ומסוגלים לסנתז ולהפריש מוצרי חלב. MECs לארגן למבנים רבים מכתשיים (acini) שמוקפים בתאי myoepithelial התכווצות והתאגד בסטרומה המורכבת מרקמות חיבור ושומן, כלי דם ומסוף עצב (איור 1, הריון). יתר על כן, בצד הבסיסי של MECs נמצא בקשר הדוק עם הקרום במרתף (מטריקס), ויחסי גומלין בין שני גופים אלה בחוזקה להסדיר שתי פונקצית המורפוגנזה והפרשה של האמאאפיתל ר&quot;י 11-13. כל התהליכים האלה מסתמכים על הפעולה של רמזים סביבתיים שונים, שהחשוב ביותר הם hormones14, גורמים אוטוקריני ומטריקס. לדוגמא, פרוגסטרון גורם נרחב 15 וalveologenesis ש, בשילוב עם פרולקטין (PRL) הסתעפות בצד 16,17, מקדם ושומר על הבידול של alveoli. בנוסף לסטרואידים וPRL18, ציטוקינים ומסלולי איתות הקשורים בהתפתחות (Wnt וNotch מסלולי איתות) הם מעורבים גם במחויבות שושלת החלב ופיתוח 19-21. בסוף ההריון, MECs luminal מתחיל לייצר חלב עשיר בחלבון הידוע כקולוסטרום בלומן של alveoli. בנוסף, פרוגסטרון פועל על חדירות אפיתל ומאז צמתים ההדוקים עדיין פתוחים, קולוסטרום נמצא גם בזרם הדם האימהי. לאחר המלטה, mammarאפיתל y תופס כמעט את כל החלב בלוטת הנפח ומאורגן ביותר (איור 2, אפיתל החלב). יחידות ייצור חלב, כלומר alveoli (איור 2, נֹאדִית), נוצרות על ידי monolayer של תאים מקוטבים החלב אפיתל הפרשה (MESCs), עם קרום הפלזמה פסגתם תיחום לומן. Alveoli לארגן את עצמם לאוניות שמקובצות לאונות מחוברות לצינורות המנקזים חלב לסביבה החיצונית (איור 2, אונה). הנקה מתרחשת, כלומר., MESCs להתחיל להפריש כמויות שופעות של חלב, מופעלות בעיקר על ידי הירידה בהורמוני שליה (בעיקר פרוגסטרון) (איור 1, הנקה). גני חלבון חלב מופעלים בקורס זמן זמני מוגדר החל הריון להנקת 9,22,23, בעיקר בתגובה לPRL יותרת המוח שוחרר בזמן היניקה. במקביל, אנשי קשר בין MESCs ומטריקס שני לעורר synt חלבון חלבhesis באמצעות אותות שמתווכים באמצעות האינטראקציות בין integrins וlaminin 24,25 הסלולריים, ולדכא אפופטוזיס בMESCs 26,27. מסלולי איתות אלה יגרמו להפעלה של יזמי גן חלבון חלב 28 דרך ההפעלה של שעתוק ספציפי גורמי 29. קשר תאי תאים הם חשוב גם להיבטים מסוימים של בידול לרבות הקמת קוטביות הפסגה והפרשת הווקטורים של מוצרי חלב. צמתים הדוקים קרובים במהירות לאחר תחילת ההנקה וMESCs דק לתזמר את הספיגה של מולקולות מהדם, כמו גם את הסינתזה, התחבורה וההפרשה של מרכיבי חלב, בתגובה לדרישות התזונתיות של ילודים. בזמן היניקה, ההתכווצות של התאים המקיפים את myoepithelial alveoli מתרחשת בתגובה לאוקסיטוצין וגורמת לשחרור חלב דרך הצינורות ולפטמה. חלב הוא נוזל מורכב שמכיל חלבונים (בעיקרcaseins), סוכרים (בעיקר לקטוז), שומנים ומינרלים, כמו גם מולקולות ביו כגון נוגדנים (IgA), גורמי גדילה והורמונים. Caseins מסונתזים, התאסף במבנים על-מולקולריים, כלומר קזאין מיצלות, מועבר לאורך מסלול ההפרשה, ולאחר מכן שוחרר על ידי exocytosis, כלומר, שילוב של שלפוחית ​​הפרשה המכיל קזאין (SVS) עם קרום הפלזמה הפסגה של המסקלין (איור 2). תנועה תאית מסתמכת על חילופי חומרים בין תאים הקרומיים וכרוכה מסיס N-ethylmaleimide רגיש Fusion (NSF) חלבון קובץ מצורף (SNAP) קולטן (מלכודת) 30,31. חלבוני מלכודת המשפחה מחולק במלכודות לפוחי (V-מלכודות), הנמצאות בקרום השלפוחית, ומלכודות יעד (t-מלכודות), מקומיות על קרומי היעד. על ידי רוכס דרך תחומים סליל המפותל שלהם, למלכודות לא V- ולהרכיב כדי ליצור חבילה מורכבת ארבעה-סליל מאוד יציב, המכונה המורכב מלכודת דואר. מורכב זו מקדמת את השילוב של שני bilayers שומנים היריב על ידי הבאת אותם בהדרגה לקרבה 30,32. לאחר מכן, מתחמי מלכודת הם ניתקו על ידי triphosphatase אדנוזין NSF וחלבוני SNAP ומלכודת חלבון מתאם שלה ממוחזרים בחזרה לתא מוצאם 33. מעניין, כל חלבון מלכודת בעיקר מתגורר בתאים סלולריים שונים וזיווג מלכודת עשויה לתרום לספציפיות של אירועי היתוך תאיים 34. המחקרים קודמים מצביעים על כך שלפחות Synaptosomal הקשורים חלבון 23 (SNAP23) וחלבון שלפוחיות קרום הקשורים 8 (VAMP8), וsyntaxins (STX) -7 ו-12 לשחק תפקיד בexocytosis קזאין 35,36. חלבונים אלה יש גם נמצאים בקשר עם חלק השומנים חלב, כלומר, שומן חלב כדוריות (MFGs) 37. המודל הרווח הנוכחי מניח כי טיפות cytoplasmic שומנים (CLDs) נוצרות על ידי ההצטברות של l הניטרליipids (בעיקר triacylglycerols ואסטרים סטרולים) וכולסטרול נובע מהתזונה האימהית בין שני העלונים של קרום reticulum endoplasmic (ER) 38-41. CLDs הגדול נוצרים, לפחות בחלקו, על ידי השילוב של CLDs הקטן יותר, תוך העברתו לצד הפסגה של MESCs שבו הם שוחררו כMFGs (1-10 מיקרומטר בקוטר) על ידי ניצנים, שעטופה בקרום הפלזמה פסגת המסקלין 40-42. הנקה מפסיקה אחרי הגורים נגמלים וMESCs למות בהדרגה על ידי אפופטוזיס, שהוביל לנסיגה של רקמת השד בחזרה למצב התבגרות (איור 1, פוף). Immunofluorescence (IF) הוא שיטת מעבדה האנליטית נפוצה בשימוש כמעט בכל ההיבטים של ביולוגיה, הן במחקר ואבחון קליני ב. אם ניתן לבצע טכניקות בסעיפי רקמות (אימונוהיסטוכימיה, IHC) או תא (immunocytochemistry, ICC) דגימות. גישה זו עוצמה מסתמכת על השימוש בניאוןנוגדנים שכותרתו כי דווקא להיקשר לאנטיגן של עניין (במישרין או בעקיפין), ובכך מאפשרים ההדמיה של רקמות ההפצה שלה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. אותות הקרינה בעיקר תלויים באיכות ובריכוז של הנוגדנים וטיפול נכון של הדגימה. פרוטוקול פשוט immunofluorescence העקיף (IIF) מוצג לזהות מוצרי חלב (caseins וMFGs) וחלבונים מעורבים בהפרשת מוצר חלב (butyrophilin (BTN1), מלכודת חלבונים) בחלקים קפואים של רקמת שד עכבר (איור 3). בעוד פרוטוקול זה מספק סקירת IHC מלאה, החל מאיסוף רקמות לאחר טיפול תמונה, ביקורתי וצעדים אופציונליים, כמו גם כמה המלצות טכניות גם הוצג ונדון.

<table><tbody><tr><td>Dissection</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pins</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scalpel and adapted blades</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Towel paper</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue sample preparation</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (pH7.4)</td><td>Sigma</td><td>P-3813</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA, 32% EM grade, 100 ml)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714-S</td><td>personnal protection equipment required WARNING: this product will expose you to Formaldehyde Gas, a chemical known to cause cancer</td></tr><tr><td>OCT compound/Tissue Tek</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose (D-saccharose)</td><td>VWR</td><td>27480.294</td><td></td></tr><tr><td>Plastic molds</td><td>Dominique Dutscher</td><td>39910</td><td></td></tr><tr><td>Liquid nitrogen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryostat/sample support</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>CM3050S</td><td></td></tr><tr><td>Razor blades (SEC35)</td><td>Thermo Scientific</td><td>152200</td><td></td></tr><tr><td>Slide box</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass slides Superfrost/Superfrost Ultra Plus</td><td>Thermo Scientific</td><td>10143560W90/1014356190</td><td></td></tr><tr><td>Brushes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IHC</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td>Super Pap Pen</td><td>Sigma</td><td>Z377821-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Permanent marker (black)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mM NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl in PBS</td><td>Sigma</td><td>A-0171</td><td></td></tr><tr><td>0.1 M glycine in PBS</td><td>VWR</td><td>24403.367</td><td></td></tr><tr><td>Antigen Retrieval solution: Tris 100 mM 5% urea pH9.6</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heater (up to 100&amp;deg;C)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield (anti-fading mounting medium) without DAPI/with DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000/H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips 22x50mm (microscopy grade)</td><td>VWR</td><td>CORN2980-225</td><td></td></tr><tr><td>Nail polish</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primary antibodies</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td>Rabbit anti-mouse caseins (#7781; 1:50 dilution)</td><td>generously gifted by M.C. Neville (University of Colorado Health Sciences&lt;br/&gt; Center, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-cytokeratin 8 (CK8, clone 1E8, 1:50 dilution)</td><td>Biolegend (Covance)</td><td>MMS-162P</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-cytokeratin 14 (CK14, cloneLL002, 1:50 dilution)</td><td>Thermo Scientific</td><td>MS-115-P0/P1</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-butyrophilin (1:300 dilution)</td><td>generously gifted by I.H. Mather (Department of Animal and Avian Sciences University of Maryland College Park, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-Stx6 (1:50 dilution)</td><td>generously gifted S. Tooze&lt;br/&gt; (Cancer Research UK, London Research Institute, London, UK)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-VAMP4 (1:50 dilution)</td><td>Abcam</td><td>ab3348</td><td></td></tr><tr><td>Secondary antibodies</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td>Rhodamine-conjugated goat anti-rabbit IgG (H + L) (1:300 dilution)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>111-025-003</td><td></td></tr><tr><td>Counterstains</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td>Bodipy 493/503</td><td>Life Technologies (Molecular Probes)</td><td>D-3922</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4-6-diamidino-2-phenylindole)</td><td>Life Technologies (Molecular Probes)</td><td>D-1306</td><td></td></tr><tr><td>Observation/Image capture</td><td>&lt;span style=&quot;line-height: 20.8px;&quot;&gt;Company&lt;/span&gt;</td><td>Catalog Number</td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td>conventional fluorescence microscope</td><td>Leica Leitz DMRB&lt;br/&gt; microscope</td><td></td><td>Standard filters for FITC, Rhodamine&lt;br/&gt; and DAPI emissions,&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; &amp;times;63 oil-immersion objective (NA 1.3), DP50 imaging camera (Olympus), Cell&amp;circ;F software (Olympus)</td></tr><tr><td>Laser Scanning Microscope (confocal microscopy)</td><td>Zeiss LSM&lt;br/&gt; 510 microscope</td><td></td><td>Plan-Apochromat &amp;times;63 oil-immersion objective (NA 1.4),&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; CLSM 510 software,&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; Confocal facilities, MIMA2 Platform, INRA Jouy-en-Josas, France, http://mima2.jouy.inra.fr/mima2)</td></tr><tr><td>Image treatment</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td>ImageJ 1.49k software</td><td></td><td></td><td>Free software</td></tr></tbody></table>

indirect immunofluorescence on frozen sections of mouse mammary gland

immunofluorescence העקיף משמש כדי לזהות ולאתר חלבוני עניין ברקמה. הפרוטוקול המובא כאן מתאר שיטה שלמה ופשוטה לגילוי חיסוני של חלבונים, העכבר המניקים בלוטת החלב שנלקח כדוגמא. פרוטוקול להכנת דגימות הרקמה, במיוחד בנוגע לנתיחה של בלוטת החלב עכבר, קיבעון רקמות וחתך רקמה קפוא, מפורט. פרוטוקול סטנדרטי לבצע immunofluorescence העקיף, כולל שלב אחזור אנטיגן אופציונאלי, מוצג גם. ההתבוננות בסעיפי הרקמות שכותרתו כמו גם רכישת תמונה ופוסט-טיפולים גם מוצגים. הליך זה נותן סקירה מלאה, מהאוסף של רקמת חיה ללוקליזציה הסלולרית של חלבון. למרות ששיטה כללית זה יכול להיות מיושמת על דגימות רקמה אחרות, זה צריך להיות מותאם לכל זוג נוגדן רקמה / העיקרית למד.

בלוטת החלב היא בלוטה תת עורית הממוקמת לאורך מבנה הגחון של שני החזה והבטן במכרסמים. המיקום של חמישה הזוגות של בלוטות של העכבר במהלך ההריון מוצג באיור 4. המורפולוגיה של בלוטת החלב באופן דרמטי משתנה במהלך התפתחותו, המשקף שינויים פונקציונליים הנדרשים להכ...

Watch this Scientific Journal Video about Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland at JoVE.com

Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

פרוטוקול immunofluorescence העקיף המתואר במאמר זה מאפשר זיהוי והלוקליזציה של חלבונים בבלוטת החלב עכבר. שיטה שלמה ניתן להכין דגימות בלוטת החלב, לבצע אימונוהיסטוכימיה, לתמונת סעיפי רקמות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי, ולשחזר תמונות.

Immunofluorescence עקיף על סעיפים קפואים של עכבר בלוטת החלב

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

indirect-immunofluorescence-on-frozen-sections-of-mouse-mammary-gland

Research

JoVE Journal

Biology

36.8K Views.  INRA.  פרוטוקול immunofluorescence העקיף המתואר במאמר זה מאפשר זיהוי והלוקליזציה של חלבונים בבלוטת החלב עכבר. שיטה שלמה ניתן להכין דגימות בלוטת החלב, לבצע אימונוהיסטוכימיה, לתמונת סעיפי רקמות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי, ולשחזר תמונות. 

Video: Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification

Normal mammary gland development may be altered by exposure to environmental toxicants and pharmaceutical products, excessive exposure to hormones, and genetic alterations. Mammary gland whole mounts are an inexpensive method to capture the progression of morphological changes that may arise after exposure. However, in later life, when abnormalities are more prone to develop, sole reliance on this one method may not always provide enough information to make a proper diagnosis of the abnormality. Historically, in chemical test guideline studies, a single mammary gland is removed at necropsy and prepared as a hematoxylin and eosin (H&#38;E)-stained section. The incorporation of contralateral mammary whole-mount collection and analysis decreases the likelihood of a false-negative assessment. Evaluation of the whole mount is limited by the presence of one or two entire mammary glands on a slide, and in some cases, the abnormalities observed in the whole mount are not uniformly represented in the H&#38;E section.&#160; The goal of this study was to develop a protocol for converting coverslipped mammary whole mounts to H&#38;E-stained sections so that lesions that would otherwise have been missed or that are difficult to diagnose can be identified. Here, we detail a method to produce a high-quality, paraffin-embedded H&#38;E section from a mammary gland that was initially prepared as a whole mount. In comparison to a tissue that was intentionally prepared for H&#38;E sectioning, the whole mount requires additional preparation for tissue removal and processing. However, this method is considered inexpensive, as it requires common lab reagents and little additional time. As a result, this method can provide invaluable information on how chemical and environmental exposures alter normal mammary development, as well as display changes that occur because of genetic modifications.

We developed a method to successfully remove, process, section, and stain, for histopathological evaluation, mammary tissue that had originally been fixed on slides as whole mounts. This method may promote the collection and evaluation of mammary gland whole mounts in reproductive and developmental test guideline studies.

חתך בלוטות החלב שלמות מלא עבור זיהוי הנגע

Normal mammary gland development may be altered by exposure to environmental toxicants and pharmaceutical products, excessive exposure to hormones, and ...

Cancer Research

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, suprabasal, and stratum corneum layers. The precise localization within the epidermis of a particular protein lends clues toward its functional role within the epidermis. In this chapter, we describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory. Paraffin sections generally provide much better morphology, hence, superior results and photographs; however, not all antibodies will work with the harsh fixation and treatment involved in their processing. Therefore, the protocol for frozen sectioning is also included. Within paraffin sectioning, two fixation protocols are described (Bouin's and paraformaldehyde); the choice of fixative will be directly related to the antibody specifications and may require another fixing method.

We describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory.

אימונוהיסטוכימיה על סעיפים פרפין של האפידרמיס עכבר באמצעות נוגדנים פלורסנט

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

Analysis of Protein-protein Interactions and Co-localization Between Components of Gap, Tight, and Adherens Junctions in Murine Mammary Glands

Cell-cell interactions play a pivotal role in preserving tissue integrity and the barrier between the different compartments of the mammary gland. These interactions are provided by junctional proteins that form nexuses between adjacent cells. Junctional protein mislocalization and reduced physical associations with their binding partners can result in the loss of function and, consequently, to organ dysfunction. Thus, identifying protein localization and protein-protein interactions (PPIs) in normal and disease-related tissues is essential to finding new evidences and mechanisms leading to the progression of diseases or alterations in developmental status. This manuscript presents a two-step method to evaluate PPIs in murine mammary glands. In protocol section 1, a method to perform co-immunofluorescence (co-IF) using antibodies raised against the proteins of interest, followed by secondary antibodies labeled with fluorochromes, is described. Although co-IF allows for the demonstration of the proximity of the proteins, it does make it possible to study their physical interactions. Therefore, a detailed protocol for co-immunoprecipitation (co-IP) is provided in protocol section 2. This method is used to determine the physical interactions between proteins, without confirming whether these interactions are direct or indirect. In the last few years, co-IF and co-IP techniques have demonstrated that certain components of intercellular junctions co-localize and interact together, creating stage-dependent junctional nexuses that vary during mammary gland development.

Intercellular junctions are requisites for mammary gland stage-specific functions and development. This manuscript provides a detailed protocol for the study of protein-protein interactions (PPIs) and co-localization using murine mammary glands. These techniques allow for the investigation of the dynamics of the physical association between intercellular junctions at different developmental stages.

ניתוח אינטראקציות חלבון חלבון שיתוף לוקליזציה בין רכיבי פערים, צמודים, ו adherens צמתים Murine בלוטות החלב

Cell-cell interactions play a pivotal role in preserving tissue integrity and the barrier between the different compartments of the mammary gland. These ...

Developmental Biology

In Vivo Gene Delivery into Mouse Mammary Epithelial Cells Through Mammary Intraductal Injection

Mouse mammary glands comprise ductal trees, which are lined by epithelial cells and have one opening at the tip of each nipple. The epithelial cells play a major role in mammary gland function and are the origin of most mammary tumors. Introducing genes of interest into mouse mammary epithelial cells is a critical step in evaluating gene function in epithelial cells and generating mouse mammary tumor models. This goal can be accomplished through the intraductal injection of a viral vector carrying the genes of interest into the mouse mammary ductal tree. The injected virus subsequently infects mammary epithelial cells, bringing in the genes of interest. The viral vector can be lentiviral, retroviral, adenoviral, or adenovirus-associated viral (AAV). This study demonstrates how a gene of interest is delivered into mammary epithelial cells through mouse mammary intraductal injection of a viral vector. A lentivirus carrying GFP is used to show stable expression of a delivered gene, and a retrovirus carrying Erbb2 (HER2/Neu) is used to demonstrate oncogene-induced atypical hyperplastic lesions and mammary tumors.

In Vivo Gene Delivery into Mouse Mammary Epithelial Cells Through Mammary Intraductal Injection

The present protocol describes intraductal injection of viral vectors via the teat to deliver genes of interest into the mammary epithelial cells.

ב Vivo העברת גנים לתאי אפיתל חלב עכבר באמצעות הזרקה intraductal חלב

Mouse mammary glands comprise ductal trees, which are lined by epithelial cells and have one opening at the tip of each nipple. The epithelial cells play ...

Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has a broad spectrum of applications. Detection of antigens allows for characterization and identification of multiple cell types. Located above the kidneys and encapsulated by a layer of mesenchymal cells, the adrenal gland is an endocrine organ composed by two different tissues with different embryological origins, the mesonephric intermediate mesoderm-derived outer cortex and the neural crest-derived inner medulla. The adrenal cortex secretes steroids (i.e., mineralocorticoids, glucocorticoids, sex hormones), whereas the adrenal medulla produces catecholamines (i.e., adrenaline, noradrenaline). While conducting adrenal research, it is important to be able to distinguish unique cells with different functions. Here we provide a protocol developed in our laboratory that describes a series of sequential steps required for obtaining immunofluorescence staining to characterize the cell types of the adrenal gland. We focus first on the dissection of the mouse adrenal glands, the microscopic removal of periadrenal fat followed by the fixation, processing and paraffin embedding of the tissue. We then describe sectioning of the tissue blocks with a rotary microtome. Lastly, we detail a protocol for immunofluorescent staining of adrenal glands that we have developed to minimize both non-specific antibody binding and autofluorescence in order to achieve an optimal signal.

Here we present a method to isolate adrenal glands from mice, fix the tissues, section them, and perform immunofluorescence staining.

בידוד, קיבוע, Immunofluorescence הדמיה של העכבר בלוטת יותרת הכליה

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has ...

Immunology and Infection

A Rapid Method for Multispectral Fluorescence Imaging of Frozen Tissue Sections

Multispectral fluorescence imaging on formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues enables the detection of multiple markers in a single tissue sample that can provide information about antigen coexpression and spatial distribution of the markers. However, a lack of suitable antibodies for formalin-fixed tissues may restrict the nature of markers that can be detected. In addition, the staining method is time-consuming. Here we describe a rapid method to perform multispectral fluorescence imaging on frozen tissues. The method includes the fluorophore combinations used, detailed steps for the staining of mouse and human frozen tissues, and the scanning, acquisition, and analysis procedures. For staining analysis, a commercially available semiautomated multispectral fluorescence imaging system is used. Through this method, up to six different markers were stained and detected in a single frozen tissue section. The machine learning analysis software can phenotype cells that can be used for quantitative analysis. The method described here for frozen tissues is useful for the detection of markers that cannot be detected in FFPE tissues or for which antibodies are not available for FFPE tissues.

We describe a rapid staining method to perform multispectral imaging on frozen tissues.

שיטה מהירה לדימות מרובה ספקטרלי של רקמות קפואות

Multispectral fluorescence imaging on formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues enables the detection of multiple markers in a single tissue sample ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal architecture. Here, a small pocket below the skin was created using Mayo scissors, allowing separation of the glands within the subcutaneous tissue from the underlying peritoneum. Visualization of the glands was aided by the use of 3.5x-R surgical micro loupes. The pelt was inverted and pinned back allowing identification of the intact mammary fat pads. Each of the #4 abdominal glands was bluntly dissected by sliding the scalpel blade laterally between the subcutaneous layer and the glands. Immediately post-harvest, glands were placed in 10% neutral buffered formalin for subsequent tissue processing. Excision of the entire gland is advantageous because it primarily eliminates the risk of excluding important tissue-wide interactions between ductal epithelial cells and other microenvironmental cellular populations that could be missed in a partial biopsy. One drawback of the methodology is the use of serial sections from fixed tissues which limits analyses of ductal morphogenesis and protein expression to discrete locations within the gland. As such, changes in ductal architecture and protein expression in 3 dimensions (3D) is not readily obtainable. Overall, the technique is applicable to studies requiring whole intact murine mammary glands for downstream investigations such as developmental ductal morphogenesis or breast cancer.

Here, we present a protocol for the isolation of whole, intact mouse mammary glands to investigate extracellular matrix (ECM) expression and ductal morphology. Mouse #4 abdominal glands were extracted from 8-10 week old female nulliparous mice, fixed in neutral buffered formalin, sectioned and stained using immunohistochemistry for ECM proteins.

בידוד של בלוטות מוגדלות ללא פגע, כל עכבר לניתוח של בלוטת מורפולוגיה וביטוי מטריצה חוץ-תאית

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

Longitudinal Intravital Microscopy Using a Mammary Imaging Window with Replaceable Lid

The branched structure of the mammary gland is highly dynamic and undergoes several phases of growth and remodeling after birth. Intravital microscopy in combination with skin flap surgery or implantation of imaging windows has been used to study the dynamics of the healthy mammary gland at different developmental stages. Most mammary imaging technologies are limited to a time frame of hours to days, whereas the majority of mammary gland remodeling processes occur in time frames of days to weeks. To study mammary gland remodeling, methods that allow optical access to the tissue of interest for extended time frames are required. Here, an improved version of the titanium mammary imaging window with a replaceable lid (R.MIW) is described that allows high-resolution imaging of the mammary gland with a cellular resolution for up to several weeks. Importantly, the R.MIW provides tissue access over the entire duration of the intravital imaging experiment and could therefore be used for local tissue manipulation, labeling, drug administration, or image-guided microdissection. Taken together, the R.MIW enables high-resolution characterization of the cellular dynamics during mammary gland development, homeostasis, and disease.

This protocol describes a novel mammary imaging window with a replaceable lid (R.MIW). Intravital microscopy after implantation of the R.MIW allows for longitudinal and multi-day imaging of the healthy and diseased mammary gland with a cellular resolution during the different developmental stages.

מיקרוסקופיה תוך-ורידית אורכית באמצעות חלון הדמיה של יונקים עם מכסה הניתן להחלפה

The branched structure of the mammary gland is highly dynamic and undergoes several phases of growth and remodeling after birth. Intravital microscopy in ...

Intravital Subcellular Microscopy of the Mammary Gland

The mammary gland constitutes a model par excellence for investigating epithelial functions, including tissue remodeling, cell polarity, and secretory mechanisms. During pregnancy, the gland expands from a primitive ductal tree embedded in a fat pad to a highly branched alveolar network primed for the formation and secretion of colostrum and milk. Post-partum, the gland supplies all the nutrients required for neonatal survival, including membrane-coated lipid droplets (LDs), proteins, carbohydrates, ions, and water. Various milk components, including lactose, casein micelles, and skim-milk proteins, are synthesized within the alveolar cells and secreted from vesicles by exocytosis at the apical surface. LDs are transported from sites of synthesis in the rough endoplasmic reticulum to the cell apex, coated with cellular membranes, and secreted by a unique apocrine mechanism. Other preformed constituents, including antibodies and hormones, are transported from the serosal side of the epithelium into milk by transcytosis. These processes are amenable to intravital microscopy because the mammary gland is a skin gland and, therefore, directly accessible to experimental manipulation. In this paper, a facile procedure is described to investigate the kinetics of LD secretion in situ, in real-time, in live anesthetized mice. Boron-dipyrromethene (BODIPY)665/676&#160;or monodansylpentane are used to label the neutral lipid fraction of transgenic mice, which either express soluble EGFP (enhanced green fluorescent protein) in the cytoplasm, or a membrane-targeted peptide fused to either EGFP or tdTomato. The membrane-tagged fusion proteins serve as markers of cell surfaces, and the lipid dyes resolve LDs &#8805; 0.7 &#181;m. Time-lapse images can be recorded by standard laser scanning confocal microscopy down to a depth of 15-25 &#181;m or by multiphoton microscopy for imaging deeper in the tissue. The mammary gland may be bathed with pharmacological agents or fluorescent dyes throughout the surgery, providing a platform for acute experimental manipulations as required.

<meta charset="utf8"></head><body>מיקרוסקופיה תת-תאית תוך חיונית של בלוטת החלב

The present protocol describes a facile technique for the intravital imaging of the lactating mouse mammary gland by laser scanning confocal and multiphoton microscopy.

מיקרוסקופיה תת-תאית תוך חיונית של בלוטת החלב

The mammary gland constitutes a model par excellence for investigating epithelial functions, including tissue remodeling, cell polarity, and secretory ...

Immunofluorescence עקיף על סעיפים קפואים של עכבר בלוטת החלב

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

חתך בלוטות החלב שלמות מלא עבור זיהוי הנגע

אימונוהיסטוכימיה על סעיפים פרפין של האפידרמיס עכבר באמצעות נוגדנים פלורסנט

ניתוח אינטראקציות חלבון חלבון שיתוף לוקליזציה בין רכיבי פערים, צמודים, ו adherens צמתים Murine בלוטות החלב

ב Vivo העברת גנים לתאי אפיתל חלב עכבר באמצעות הזרקה intraductal חלב

בידוד, קיבוע, Immunofluorescence הדמיה של העכבר בלוטת יותרת הכליה

שיטה מהירה לדימות מרובה ספקטרלי של רקמות קפואות

בידוד של בלוטות מוגדלות ללא פגע, כל עכבר לניתוח של בלוטת מורפולוגיה וביטוי מטריצה חוץ-תאית

מיקרוסקופיה תוך-ורידית אורכית באמצעות חלון הדמיה של יונקים עם מכסה הניתן להחלפה

מיקרוסקופיה תת-תאית תוך חיונית של בלוטת החלב

מיקרוסקופיה תת-תאית תוך חיונית של בלוטת החלב