עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהאקדמיה של פינלנד [315948, 314387 ל- N.K.]; קרן סיגריד ג'וסליוס [ל-נ.ק., ג'יי.טי]; קרן אמיל אלטונן [לג'יי-איי.M,ט.ל.]; תוכנית הדוקטורט של טורקו לרפואה מולקולרית [S.C.-M., O.O.].

תחזוקת עכברי מעבדה וכל הניסויים בבעלי חיים נעשו בהתאם להנחיות ולתקנות הרלוונטיות לטיפול ולשימוש בחיות מעבדה באוניברסיטת טורקו.
1. הכנת צינוריות חצי-היקפיות למיקרו-דיסקציה
<ol><li>להקריב עכבר זכר בוגר (≥8 שבועות, testis 80–120 מ"ג בהתאם למתח ולגיל) באמצעות CO2 חנק ואחריו נקע בצוואר הרחם. הערה: העכבר צריך להיות בוגר מינית, ועדיף לפחות 8 שבועות. דפוס transillumination של עכברים צעירים שונה ממבוגר כי הגל של אפיתל חצי-חצי עדיין לא הוקמה במלואה, ואת העיתוי של הגל הראשון של spermatogenesis הוא ברור21,22. חוסר זרע מאריך בעכברים זכרים בני 4 שבועות מונע את השימוש בהם למיקרו-דיסקציה בסיוע טרנסילומינציה. כל זני העכבר כי יש spermatogenesis נורמלי ניתן להשתמש.</li>
	<li>לרסס את הבטן הגחונית עם 70% אתנול. פתח את החלל abdominopelvic באמצעות מספריים סטריליים, מה שהופך פתח בצורת V.</li>
	<li>משיכת כרית השומן האפידילית עם מלקחיים סטריליים, לאתר את האשכים, לנתח אותם באמצעות מספריים ומניחים אותם על צלחת פטרי סטרילית 100 מ"מ המכיל PBS. הערה: כדי לשמור על סטריליות, ודא שכל כלי המעבדה והכלים הכירורגיים סטריליים.</li>
	<li>באמצעות מספריים עדינים לתמצת את האשכים על ידי חיתוך חריץ אלבוג'יניאה טוניקה, גיליון סיבי עבה עוטפת את האשכים. ואז לקרוע את tunica פתוח באמצעות זוג מלקחיים. כפה את הצינוריות על ידי לחיצה עם מלקחיים ולזרוק את tunica. הערה: בעת השלכת טוניקה, זה עשוי להיות מועיל עבור כמה יישומים במורד הזרם כי האשכים arteria מוסר יחד עם טוניקה. הימנע מפגיעה בצינורות החצי-חופניים.</li>
	<li>מעבירים את הצינוריות החצי-חצי לצלחת פטרי חדשה ויוצקים מספיק PBS סטרילי כדי לכסות את תחתית צלחת הפטרי. לאחר מכן, בעדינות למשוך את הצינוריות לגזרים אבל למנוע פגיעה tubules. הערה: לחץ מכני רב מדי יעכב את דפוס הטרנסילומינציה וישפיע על הכדאיות של הרקמה ועל הארכיטקטורה התאית שלה. הצינוריות יכולות גם להיות מעובדות עבור immunostainings הר שלם מנקודה זו ללא היערכות (3B). לפעמים זה מספיק כדי להגדיר את השלב בדיעבד על ידי הכללת נוגדנים נגד חלבונים לידי ביטוי בידול spermatogonia, כגון SALL4, c-KIT ו DNMT3A18,23. צפיפות הזרע היא מדד שלב אמין יחסית (איור 2).</li>
</ol>2. מיקרו-דיסקציה בסיוע טרנסילומינציה
<ol><li>מניחים את צלחת פטרי תחת מיקרוסקופ ניתוח בחוזקה על ידי הקלטת אותו לבמה. הערה: חשוב להקליט היטב את צלחת פטרי כדי למנוע את התנועה שלה אשר יכול לגרום ערבוב של קטעי tubule מבוים למחצה שנאספו.</li>
	<li>כדי לחשוף את דפוס ספיגת האור של tubules חצי חצי בפוקוס, ודא כי המדגם מואר מלמטה ואת האור עובר דרך המדגם, כלומר, הוא transilluminated. הערה: כמות האור שנספגת/מפוזרת היא יחסית לרמת עיבוי הכרומטין בזרעים מאריכים והצרור שלהם בתוך הצינור החצי-חצי- צינורית: ככל שהתמצית יותר, כך האור נספג יותר, כלומר, נראה כהה יותר.</li>
	<li>הכירו את תבנית ספיגת האור של שלבים שונים כמתואר באיור 2, איור 5A ואיור S1 על ידי הזזה קפדנית של חבילות של צינוריות באמצעות מלקחיים עדינים. הערה: השלבים תמיד עוקבים זה אחר זה בסדר הגיוני, ויוצרים את גל האפיתל החצי-שנתי. עם זאת, חשוב לדעת כי הכיוון של הגל spermatogenic מדי פעם מתהפך ולאחר מכן חוזר שוב (הידוע גם בשם אפנונים4,9 ),לפעמיםמסבך את ההליך. כמו כן, אורך כל שלב, במונחים של כמה מ"מ של tubule, משתנה במידה ניכרת.</li>
	<li>בזהירות להרים את tubule של עניין באמצעות מלקחיים עם קצה מכור, ולאחר מכן לחתוך קטע של אורך מתאים באמצעות מספריים microdissection (ראה וידאו משלים 1). וו בקצה המלקחיים מקל על ההרמה וההחזקה של צינורית ומסייע במניעת סחיטה. הערה: אורך המקטעים שיש לחתוך תלוי ביישומים במורד הזרם. לאיסוף חתיכות טובולה במאגר של שלב מסוים לניתוח חלבון או רנ"א12,13 (II-V, VII-VIII ו- IX-XI, איור 5B) האורך הוא בדרך כלל 2-5 מ"מ. כאשר נעשה שימוש בהפקת פנול-כלורופורם סטנדרטית, ניתן להפיק כ-200 ng של RNA מ-1 מ"מ של טובול. עבור כתמי הרכבה שלמים של מקטעי tubule מבוימים, אורך המקטעים צריך להיות >5 מ"מ. עבור ההכנות סקווש אורך המקטעים לא יעלה על 1-2 מ"מ כי התאים באמצע הקטע עלול להיכשל לצאת אם ארוך מדי. השתמש בסולם מ"מ מתחת לצלחת פטרי למדידה מדויקת של אורך הצינור.</li>
</ol>3. חיסון של הכנות שונות
<ol><li>הכנת סקווש: אימות במה וחיסון הערה: חתיכות tubule ספציפי שלב ניתן למעוך על שקופית מיקרוסקופ עם זכוכית כיסוי לבצע ניתוח מורפולוגי של תאים חיים על ידי מיקרוסקופיה ניגוד פאזה ו immunostaining הבאים. למתחילים מומלץ להשתמש בגישה זו כדי לאמת את השלבים בעת היכרות עם שיטת microdissection בסיוע transillumination.<ol>
<li>לאסוף את הקטע בנפח של 10 μL באמצעות פיפטה ולהעביר אותו על שקופית מיקרוסקופ.</li>
		<li>למעוך את הצינורית על ידי הנחת כיסוי (20 ממ x 20 ממ) בזהירות על הצינור. כתוצאה מכך, תאים יזרמו החוצה את הצינור ויוצרים מונולאי תא חי. מניחים נייר סינון על קצה זכוכית הכיסוי כדי להקל על התפשטות התאים. הימנע ממועך את התאים יותר מדי כדי לשמור אותם בחיים.</li>
		<li>נטר את התפשטות התאים תחת מיקרוסקופ. השתמש במיקרוסקופ עם ניגודיות פאזה במטרה 40x כדי לאמת זיהוי שלב על-ידי בדיקת סוגי התאים הקיימים (איור 2, איור S2).</li>
		<li>לאחר שהתאים התפשטו כדי ליצור מונולייר עגול משני קצות הצינור, טובלים את המגלשה לתוך מיכל המכיל חנקן נוזלי תוך החזקתו במלקחיים. שמור אותו שקוע במשך 10 שניות. לחלופין, הניחו את המגלשה על צלחת קרח יבשה להקפאה.</li>
		<li>הסר את זכוכית הכיסוי על ידי היפוך אותו באמצעות אזמל.</li>
		<li>ללא דיחוי, המשיכו עם הקיבעון והניחו במהירות את השקופית במיכל עם 90% אתנול למשך 2-5 דקות. הערה: ודא הכנת סקווש לא להפשיר לפני הצבת אותו 90% אתנול. מתקנים אחרים יכולים לשמש גם, כגון אצטון, במשך 10 דקות.</li>
		<li>יבש באוויר ומאחסן בטמפרטורת החדר (RT) (עד כמה ימים) או ב -80 מעלות צלזיוס (לטווח ארוך).</li>
		<li>עבור immunostaining, לאחר לתקן את הדגימות ב 4% paraformaldehyde (PFA) במשך 10 דקות ב RT.</li>
		<li>יש לשטוף ב-PBS ולחלחל עם 0.1% טריטון X-100 ב-PBS למשך 5 דקות.</li>
		<li>יש לשטוף ב-PBS ולצייר טבעת גריז סביב כל דגימת סקווש.</li>
		<li>הוסף 50-100 μL של 10% BSA (אלבומין סרום שור) ב 0.1% Tween ב PBS (PBST) בתוך טבעת השומן ולחסום דגימות במשך 30 דקות ב RT.</li>
		<li>הסר את פתרון BSA ודגר עם נוגדן ראשוני מדולל ב 10% BSA ב PBST עבור 1 שעה ב RT.</li>
		<li>לשטוף 3x במשך 5 דקות עם PBST.</li>
		<li>דגירה עם נוגדן משני מדולל ב 10% BSA ב PBST. הערה: כדי להכתים את האקרוזומים, ניתן להדגיר את הדגימות בנוגדן אגלוטינין בוטנים (PNA, 1:1000) ב- 10% BSA ב- PBST למשך שעה אחת ב- RT (איור S3) במקום נוגדנים ראשוניים ומשניים ספציפיים.</li>
		<li>לשטוף 3x במשך 5 דקות כל אחד עם PBST, לשטוף עם PBS ולהרכיב עם תושב המכיל DAPI.</li>
	</ol></li>
	<li>חיסון בהר שלם של צינוריות חצי-חופפות הערה: הפרוטוקול שלהלן מתאר כתמי הרכבה שלמים עבור מקטעי צינורית בשלבים (משלב 2.4). אם חוקר רוצה לבצע צביעה שלמה ללא אחסון זמני (משלב 1.5), שים לב להערות ב- 3.2.1 ו- 3.2.7.<ol>
<li>באמצעות פיפטה, להעביר את מקטעי tubule (משלב 2.4) ב PBS קר כקרח לתוך צינור חרוט 15 מ"ל ולאפשר להם משקעים על קרח. הערה: אם משתמשים בצינורות לא מתויגים מ-1.5, מפרידים את הצינוריות בצלחת פטרי על ידי צנרת למעלה ובחזרה לצלחת מוטה מספר פעמים. השתמש פיפטה 1-mL עם קצה לחתוך. שלב זה נועד לפתוח את מבנה הרקמה. עם זאת, הימנע צינור יותר מדי כפי שהוא עלול לגרום נזק tubules. משקעים של צינוריות ייקח כמה עשרות שניות. שברי צינורית קטנים, תאים ביניים ופסולת תאים נשארים בסופרנאטנט.</li>
		<li>הסר בזהירות את supernatant (SN) על ידי pipetting או עם שאיפה. מוסיפים 10 מ"ל של PBS קר כקרח ומערבבים על ידי היפוך.</li>
		<li>אפשר משקעים ולאחר מכן הסר SN כמו קודם.</li>
		<li>הוסף 5 מ"ל של 4% PFA ותקן במשך 5 שעות על שולחן מסתובב (20-30 סל"ד) ב +4 מעלות צלזיוס. הערה: זמן הקיבעון תלוי בחלבונים המעניינים ובלוקליזציה התת-תאית שלהם. עבור חלבונים גרעיניים ציטופלזמיים, קיבוע 2 שעות הוא בדרך כלל מספיק, עם זאת, סמני קרום, כגון GFRα1 (אלפא קולטן משפחת GDNF 1; איור 6א',ב),תיהנה מקיבעון ארוך יותר, עד 6 שעות.</li>
		<li>אפשר משקעים, להסיר SN (PFA) כמו קודם, ולשטוף בקצרה על ידי הוספת 10 מ"ל של PBS והפך את הצינור.</li>
		<li>אפשר משקעים, להסיר SN כמו קודם, ולחזור על שלב שטיפת PBS שלוש פעמים לפחות 10 דקות כל אחד על שולחן מסתובב ב +4 מעלות צלזיוס ולהמשיך עם כתמים או לאחסן ב +4 מעלות צלזיוס. הערה: אם תנאי העבודה סטריליים ולנקות את הדגימות ניתן לאחסן ולהשתמש בהם לפחות כמה שבועות. לחלופין, הוסיפו נתרן אזיד לריכוז סופי של 0.02% (w/v) מתמיסת 2% למניה כדי לסייע בשימור הצינוריות לפני האחסון ב-4 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>באמצעות פיפטה של 1 מ"ל, העבר מקטעי צינורית קבועים של 10-20 לצינור עגול של 2 מ"ל. אפשר משקעים ולהסיר SN. הערה: אם עובדים עם צינוריות ארוכות שלא בוימו, יוצקים את הצינוריות על צלחת פטרי ומשתמשים במספריים זעירים ומלקחיים חותכים מקטעים של כ-5-20 מ"מ. מקטעים ארוכים מדי יסתבכו במהלך הליך הכתם, ואילו מקטעים קצרים מדי יאבדו בקלות.</li>
		<li>הוסף 1 מ"ל של 2% BSA + 10% FBS (סרום שור עוברי) ב 0.3% טריטון X-100 ב PBS (PBSX). חסום למשך שעה אחת לפחות בטבלה מסתובבת (20-30 סל"ד) ב- RT.</li>
		<li>לשטוף עם 1 מ"ל של PBSX, להסיר SN על ידי pipetting ולהוסיף 250 μL של נוגדן ראשוני מדולל 1% BSA ב PBSX (1:100-1:2000 דילול). דגירה במשך 2 שעות ב RT או לילה ב +4 מעלות צלזיוס על שולחן מסתובב (20-30 סל"ד).</li>
		<li>הסר את פתרון הנוגדנים על ידי pipetting ולשטוף את tubules עם 1 מ"ל של PBSX כאמור לעיל. יש לשטוף שלוש פעמים ב-PBSX על שולחן מסתובב (20-30 סל"ד) ב-RT. הערה: לאחר שטיפה ראשונה זו ניתן להשאיר את הדגימה למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס במידת הצורך.</li>
		<li>הסר SN ולהוסיף 250 μL של נוגדן משני מדולל 1% BSA ב PBSX (בדרך כלל 1:500 דילול של נוגדן תווית פלואורסצנטית). מכסים בנייר כסף ומדגירה על שולחן מסתובב (20-30 סל"ד) ב-RT למשך שעה.</li>
		<li>חזור על 3.2.10.</li>
		<li>לבסוף להסיר SN ויוצקים את tubules למגלשת מיקרוסקופ. יש להפריד בעדינות ולסדר צינוריות ברצועות ליניאריות בעזרת טיפים להעמסת ג'ל. מסננים את המאגר העודף ומוסיפים מדיום הרכבה וכיסוי. הערה: הימנע ייבוש של tubules בעת סידור אותם. מכתים נגד של הגרעינים עם DAPI אינו הכרחי ברוב המקרים. לאטום את קצה הכיסוי עם לק כדי למנוע ייבוש מדגם והידרדרות. ניתן לאחסן שקופיות למשך שבוע עד שבועיים ב- +4 °C (60 °F) לפני ההדמיה.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>M&#228;kel&#228;, J. A., Toppari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testis+Physiology:+Seminiferous+Cycle.">Testis Physiology: Seminiferous Cycle.</a> Encyclopedia of Reproduction. , (2018).</li><li>Oakberg, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duration+of+spermatogenesis+in+the+mouse+and+timing+of+stages+of+the+cycle+of+the+seminiferous+epithelium.">Duration of spermatogenesis in the mouse and timing of stages of the cycle of the seminiferous epithelium.</a> The American Journal of Anatomy. 99 (3), 507-516 (1956).</li><li>Clermont, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+spermatogenesis+in+mammals:+seminiferous+epithelium+cycle+and+spermatogonial+renewal.">Kinetics of spermatogenesis in mammals: seminiferous epithelium cycle and spermatogonial renewal.</a> Physiological Reviews. 52 (1), 198-236 (1972).</li><li>Perey, B., Clermont, Y., Leblond, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+wave+of+the+seminiferous+epithelium+in+the+rat.">The wave of the seminiferous epithelium in the rat.</a> American Journal of Anatomy. 108 (1), 47-77 (1961).</li><li>de Lima e Martins Lara, N., Costa, G., Avelar, G., Lacerda, S., Hess, R., Fran&#231;a, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testis+Physiology-Overview+and+Histology.">Testis Physiology-Overview and Histology.</a> Encyclopedia of Reproduction. , (2018).</li><li>Leblond, C. P., Clermont, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition+of+the+stages+of+the+cycle+of+the+seminiferous+epithelium+in+the+rat.">Definition of the stages of the cycle of the seminiferous epithelium in the rat.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 55 (4), 548-573 (1952).</li><li>Parvinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+seminiferous+epithelium.">Regulation of the seminiferous epithelium.</a> Endocrine Reviews. 3 (4), 404-417 (1982).</li><li>Kotaja, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+isolation+and+characterization+of+stage-specific+spermatogenic+cells+for+cellular+and+molecular+analysis.">Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis.</a> Nature Methods. 1 (3), 249-254 (2004).</li><li>Nakata, H., Sonomura, T., Iseki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+analysis+of+seminiferous+tubules+and+spermatogenic+waves+in+mice.">Three-dimensional analysis of seminiferous tubules and spermatogenic waves in mice.</a> Reproduction. 154 (5), 569-579 (2017).</li><li>Russell, L. D., Ettlin, R. A., SinhaHikim, A. P., Clegg, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histological and histopathological evaluation of the testis. , (1990).</li><li>Parvinen, M., Hecht, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+living+spermatogenic+cells+of+the+mouse+by+transillumination-phase+contrast+microscopic+technique+for+"in+situ"+analyses+of+DNA+polymerase+activities.">Identification of living spermatogenic cells of the mouse by transillumination-phase contrast microscopic technique for "in situ" analyses of DNA polymerase activities.</a> Histochemistry. 71 (4), 567-579 (1981).</li><li>Ventel&#228;, S., M&#228;kel&#228;, J. A., Kulmala, J., Westermarck, J., Toppari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+regulation+of+a+stage-specific+stem+cell+niche+enriched+by+Nanog-positive+spermatogonial+stem+cells+in+the+mouse+testis.">Identification and regulation of a stage-specific stem cell niche enriched by Nanog-positive spermatogonial stem cells in the mouse testis.</a> Stem Cells. 30 (5), 1008-1020 (2012).</li><li>Faisal, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+USF1+is+required+for+maintenance+of+germline+stem+cells+in+male+mice.">Transcription factor USF1 is required for maintenance of germline stem cells in male mice.</a> Endocrinology. 160 (5), 1119-1136 (2019).</li><li>Wright, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+stage-specific+proteins+synthesized+by+rat+seminiferous+tubules.">Identification of stage-specific proteins synthesized by rat seminiferous tubules.</a> Biology of Reproduction. 29 (1), 257-270 (1983).</li><li>Johnston, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+gene+expression+is+a+fundamental+characteristic+of+rat+spermatogenic+cells+and+Sertoli+cells.">Stage-specific gene expression is a fundamental characteristic of rat spermatogenic cells and Sertoli cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (24), 8315-8320 (2008).</li><li>Toppari, J., Bishop, P. C., Parker, J. W., diZerega, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+flow+cytometric+analysis+of+mouse+seminiferous+epithelium.">DNA flow cytometric analysis of mouse seminiferous epithelium.</a> Cytometry. 9 (5), 456-462 (1988).</li><li>M&#228;kel&#228;, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signalling+promotes+germ+cell+survival+in+the+rat+testis.">Hedgehog signalling promotes germ cell survival in the rat testis.</a> Reproduction. 142 (5), 711-721 (2011).</li><li>La, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+dynamic+undifferentiated+cell+states+within+the+male+germline.">Identification of dynamic undifferentiated cell states within the male germline.</a> Nature Communications. 9 (1), 04827 (2018).</li><li>Toppari, J., Parvinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+rat+seminiferous+tubular+segments+from+defined+stages+of+the+epithelial+cycle+morphologic+and+immunolocalization+analysis.">In vitro differentiation of rat seminiferous tubular segments from defined stages of the epithelial cycle morphologic and immunolocalization analysis.</a> Journal of Andrology. 6 (6), 334-343 (1985).</li><li>Parvinen, M., Vanha-Perttula, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+enzyme+quantitation+of+the+stages+of+the+seminiferous+epithelial+wave+in+the+rat.">Identification and enzyme quantitation of the stages of the seminiferous epithelial wave in the rat.</a> The Anatomical Record. 174 (4), 435-449 (1972).</li><li>Kluin, P. M., Kramer, M. F., de Rooij, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis+in+the+immature+mouse+proceeds+faster+than+in+the+adult.">Spermatogenesis in the immature mouse proceeds faster than in the adult.</a> International Journal of Andrology. 5 (3), 282-294 (1982).</li><li>Yoshida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+round+of+mouse+spermatogenesis+is+a+distinctive+program+that+lacks+the+self-renewing+spermatogonia+stage.">The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage.</a> Development. 133 (8), 1495-1505 (2006).</li><li>Chan, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+stem+cell+activity+is+sustained+by+SALL4-dependent+silencing+of+distinct+tumor+suppressor+genes.">Germline stem cell activity is sustained by SALL4-dependent silencing of distinct tumor suppressor genes.</a> Stem Cell Reports. 9 (3), 956-971 (2017).</li><li>Lokka, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation,+localization+and+functions+of+macrophages+during+the+development+of+testis.">Generation, localization and functions of macrophages during the development of testis.</a> Nat Commun. 11 (1), 4375 (2020).</li><li>M&#228;kel&#228;, J. A., Toppari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testis+physiology:+Spermatogenic+cell+syncytium.">Testis physiology: Spermatogenic cell syncytium.</a> Encyclopedia of Reproduction. , (2018).</li><li>Griswold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis:+The+commitment+to+meiosis.">Spermatogenesis: The commitment to meiosis.</a> Physiological Reviews. 96 (1), 1-17 (2016).</li><li>M&#228;kel&#228;, J. A., Toppari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis.">Spermatogenesis.</a> Endocrinology of the Testis and Male Reproduction. , 1-39 (2017).</li><li>Ventela, S., Toppari, J., Parvinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+organelle+traffic+through+cytoplasmic+bridges+in+early+spermatids+of+the+rat:+mechanisms+of+haploid+gene+product+sharing.">Intercellular organelle traffic through cytoplasmic bridges in early spermatids of the rat: mechanisms of haploid gene product sharing.</a> Molecular Biology of the Cell. 14 (7), 2768-2780 (2003).</li><li>Parvinen, M., Parvinen, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+movements+of+the+chromatoid+body.+A+possible+transport+mechanism+for+haploid+gene+products.">Active movements of the chromatoid body. A possible transport mechanism for haploid gene products.</a> The Journal of Cell Biology. 80 (3), 621-628 (1979).</li><li>Parvinen, M., S&#246;derstr&#246;m, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+rotation+and+formation+of+synapsis.">Chromosome rotation and formation of synapsis.</a> Nature. 260 (5551), 534-535 (1976).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

שיטת microdissection בסיוע transillumination שתיארנו לעיל מאפשרת גישה מוכוונת שלב לחקר זרע. Spermatogenesis הוא תהליך מסונכרן מאוד, וכל הצעדים העיקריים במהלך הבידול spermatogenic מוסדרים ומבוצעים באופן תלוי שלב, כגון מחויבות בידול (בשלבים VII-VIII), הופעת מיוזיס (VII-VIII), חטיבות מיוטיות (XII), הופעת התארכות זרע (VIII) ו זרע (VIII)1,26,27. הניתוח מונחה הבמה מספק כלי רב עוצמה ללמוד אירועים מסוימים אלה המוגבלים לשלבים ספציפיים של spermatogenesis ולכן נמצא רק בשלבים מוגדרים של מחזור האפיתל חצי. מאסטרינג השיטה לוקח קצת תרגול ושימוש במיקרוסקופ ניתוח באיכות טובה ותנאי תאורה נאותים הם המפתח להצלחה. יישום שיטה זו כחלק ערכת הכלים היומיומית יש יכולת לשפר באופן משמעותי את ההשפעה ואת הרלוונטיות הביולוגית של מחקר על תפקודי הרבייה הגברית על ידי מתן ניתוח מדויק יותר של אירועים מולקולריים במהלך spermatogenesis.
כל זני העכבר WT שלמדנו מציגים תבנית טרנסילומינציה דומה ומציגים אסוציאציות תאים שמורות בשלבים של מחזור האפיתל החצי-שנתי. בתנאי כי בידול spermiogenic של תאי נבט אינו שונה באופן גס מעכברי WT, אותו הדבר חל גם על כל המודלים בעכבר נוקאאוט כי למדנו. יתר על כן, זה יכול להיות מיושם על מינים אחרים המציגים סידור סגמנטי אורך של שלבים של מחזור אפיתל למחצה7. עם זאת, לא ניתן להשתמש במינים עם שלבים לא סגמנטיים (כגון בני אדם). בהתחשב בתפקיד המהותי של עיבוי כרומטין בהארכת זרע בהגדרת דפוס הטרנסילומינציה, ברור כי כל רגולציה שגויה של תהליך זה בהכרח תעכב את יישום שיטה זו. בעכברים צעירים ומבוגרים צעירים (5-6 שבועות) דפוס transillumination עדיין לא הוקמה במלואה, ולכן, רק עכברים מעל 8 שבועות יש להשתמש. חשוב גם לזכור כי סחיטה ומשיכת הצינוריות בהכרח לפגוע בדפוס transillumination כי זה מעוות את הארכיטקטורה התאית בתוך האפיתל חצי.
מקטעי השחפת המבודדים למחצה יכולים גם להיות תרבותיים המאפשרים התבוננות אקס ויוו ומניפולציה של תהליכים מצמד זרע, כולל מיוזיס. כדי להבטיח את הכדאיות של הרקמה ולמנוע השפלה RNA וחלבון, יש לאסוף את הדגימות ולעבד אותן לא יותר משעתיים לאחר הקרבת העכבר. עבור תרבות ex vivo של tubules חצי, הזמן מהקרבה לתחילת התרבות לא יעלה על 1 שעה. השלמות של שברי tubule בדרך כלל ניתן לשמור עד 72 שעות במבחנה אם נקצר כראוי.
השלב של מחזור האפיתל החצי-חצי יכול להיות מאומת ואף מוגדר בצורה מדויקת יותר באמצעות מיקרוסקופיית פאזה-ניגודיות של הכנות סקווש16. מיקרוסקופיה מבוצעת על תאים חיים, אשר מספק מימד נוסף לתוך הניתוח ומאפשר תצפית של organelle או תנועות תא בשלבים ספציפיים של spermatogenesis28,29,30. מיקרוסקופיית ניגודיות פאזה מספקת היערכות מדויקת לכשל חיסוני עוקב, המאפשר ניתוח מפורט מאוד של ביטוי החלבון ודינמיקת לוקליזציה במהלך spermatogenesis, כולל שינויים ספציפיים לשלב.
בעוד תאים משתחררים מההקשר האפיתל בהכנות סקווש, immunostainings הר שלם של מקטעי tubule לאפשר את המחקר של תאים spermatogenic בסביבה הפיזיולוגית שלהם. לכן, ההכנות להרכבה שלמה עשויות לספק הדמיה טובה יותר של ארכיטקטורת הצינור החצי-צינורית והמגעים הבין-תאיים שלה מאשר חיסון על חתכים. חשוב לציין, היערכות בסיוע transillumination של מקטעי tubule לפני immunostaining עושה את הגישה אפילו יותר חזק על ידי הכללת מידע על השלב הספציפי של קטע נתון. הכתמת הרכבה שלמה היא כלי שימושי במיוחד לחקר תאים בפריפריה של צינוריות חצי-צינוריות, כגון תאי מיואידים פריטובולריים, מקרופאגים פריטובולריים וזרעונים, אך עשויה גם לפתוח תובנות חדשניות על מחקר על תאי נבט מיוטיים ופוסט-מיוטיים.

בידול של תאי נבט זכר מ spermatogonia דיפלואידית כדי זרע haploid בוגרת, כלומר, spermatogenesis, הוא תהליך מורכב המתרחש באפיתל של צינוריות למחצה באשכים של אדם בוגר מינית1. צאצאים מיטוטיים של זרע A1 הראשון לחלק חמש פעמים כדי להרחיב את האוכלוסייה המחויבת לבידול, ואז להזין מיוזיס כמו זרע שבסופו של דבר להוליד זרע haploid. בידול של זרעונים עגולים לתוך זרע, כלומר, spermiogenesis, כרוך בשינויים מורכבים במורפולוגיה הסלולר, כולל דחיסה גרעינית ובניית מבנים ספציפיים לזרע כגון האקרוזום ואת הלקאה. בעכבר, כל התהליך של spermatogenesis לוקח 35 ימים כדי להשלים2,3.
בכל אזור נתון, האפיתל החצי-שנתי מארח עד חמש קבוצות של תאי נבט מבדילים בתוספת תאי גזע/אב נבט ותאי סרטולי סומטיים1. תאי נבט מבדילים יוצרים שכבות קונצנטריות שהרכבן צפוי, ותאי הפלואיד בשלב נתון של התפתחות תמיד מקשרים לסוגים מסוימים של זרעוניםוזרעונים 4,5. לכן, כל חתך רוחב של צינור מארח קבוצות של תאי נבט של הרכב קבוע. אסוציאציות תאים ספציפיות אלה מוגדרות כשבי האפיתל החצי-שנתי. שלבים כשלעצמם אינם מציגים מצבים דמויי נקודת צ'ק-פוינט עומדים, אך מתפתחים ללא הרף כאשר הבידול של קבוצות תאי הנבט מתקדם בסנכרון1,2,6. בעכברים, ישנם 12 שלבים (I-XII)2 המסודרים באופן מגזרי לאורך הציר האורך של הצינורית החצי-שנתית, והם עוקבים זה אחר זה בסדר הגיוני ובכך יוצרים את גל האפיתל החצי-שנתי, או גל זרע7,8,9 ( איור1). השלמת spermatogenesis לוקח ארבעה מחזורים, ושכבות היררכיות או קבוצות של תאים נבט הבחנה בתוך כל חתך צינור חצי צינורי הם מחזור חצי שנתי אחד בנפרד זה מזה. אורך המחזור תלוי במינים ובלעכבר כל מחזור לוקח 8.6 ימים10.
ניתן לזהות את השלבים על בסיס ההרכב התאי והארגון של האפיתל החצי-חצי-חצי-היסטולוגי בסעיפי האשכים ההיסטולוגיים5 (איור 1 ואיור 2). עם זאת, ניתוח היסטולוגי הוא מייגע, זמן רב ודורש תיקון וכתמים, ולכן לא יכול להיות מיושם על רקמה חיה. חשוב לציין, בימוי יכול להתבצע גם על רקמה חיה תחת מיקרוסקופ דיסקציה על ידי ניצול דפוסי ספיגה/פיזור אור מובהקים המוצגים על ידי שלבים שונים של המחזור (איור 2). היכולת של כל שלב לספוג ולפזר אור היא יחסית לרמת עיבוי הכרומטין של זרעונים פוסט-מיוטיים מאוחרים שכל מארח שלב נתון ואריזת תאים אלה בחבילות7,11. בידול זרע, כלומר,spermiogenesis, מחולק עוד יותר 16 שלבים התפתחותיים, כולל 8 שלבים של זרע עגול (שלב 1-8) ו 8 שלבים של זרע מאריך (שלבים 9-16) בידול (איור 1). שלב 9-11 זרע מאריך (שלב IX-XI) להציג רק רמה נמוכה של עיבוי כרומטין וכתוצאה מכך כמות נמוכה של אור נספג. עיבוי כרומטין מתחיל בשלב 11 זרעונים (שלב XI), ובשלב 15-16 זרעונים מאריכים (שלב IV-VIII) מכילים כרומטין מרוכז במלואו, ולכן מפגינים ספיגת אור מקסימלית (איור 3). כרומטין צריך להיות מרוכז על מנת להיות ארוז בחוזקה לתוך ראש הזרע. גורמים נוספים התורמים לתבנית ספיגת האור הם מיקום של זרעונים מאריכים בתוך האפיתל (בסיסי לעומת אפיקלי) וחבילה של זרעונים מאריכים (מבוטא בשלבים II-V)11 (איור 3). חבילות נתפסות כנקודות באמצע הצינוריות ופסים בקצוות תחת מיקרוסקופ ניתוחי ככל שהכרומטין מרוכז יותר, כך הנקודה /פס11כהים יותר.
מאמר זה מתאר את השימוש בשיטת מיקרו-דיסקציה בסיוע טרנסילומינציה לבידוד מקטעי צינורית חצי-היקפיים המייצגים שלבים ספציפיים של מחזור האפיתל החצי-שנתי. לאחר בידוד, מקטעי tubule מבוימים יכולים להיות כפופים לניתוחים שונים במורד הזרם, כולל RNA ביוכימי וניתוחי חלבון12,13,14,15, cytometry זרימה16, לשעבר vivo tubule תרבות17 ו immunostaining18. כאן אנו מספקים גם פרוטוקולים מפורטים במורד הזרם כדי להכין מונוליירים מעוכים של מקטעי tubule מבוימים לניתוח מורפולוגי של תאים חיים ו immunostaining הבאים, כמו גם immunostainings הר שלם של מקטעי tubule. זרימת העבודה על קצה המזלג מתוארת באיור 4.
שיטת המיקרו-דיסקציה בסיוע transillumination מאפשרת זיהוי ובידוד מדויקים של תאי נבט בשלבים ספציפיים של בידול הודות להרכב התאי המסונכרן של השלבים. חשוב לציין, זה גם מאפשר את המחקר של אירועים תלויי במה במהלך spermatogenesis על רקמה חיה. בהתחשב בהיעדר מודלים מדרגיים במבחנה עבור spermatogenesis, שיטה זו יש גם יתרון ייחודי של מתן מחקרים התפתחותיים וטוקסיקולוגיים ממוקדים לטווח קצר על מקטעי צינורית ספציפיים לבמה ex vivo12,17. בעוד אנו מתארים את השיטה כאן עבור העכבר, אותו הליך יכול להיות מיושם על כל מין יונקים עם סידור אורך ומגזרי של שלבי אפיתל למחצה, כגון החולדה4,7,15,19,20.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cover glass 20x20 mm</td>
			<td>Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>11961988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon conical tube 15-ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>grease pen (ImmEdge)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slide Superfrost Plus</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22-037-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafolmaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (100-mm)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11503387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P36962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhodamine-labelled Peanut agglutinin (PNA)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>RL-1072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transillumination-assisted dissection of specific stages of the mouse seminiferous epithelial cycle for downstream immunostaining analyses

Spermatogenesis הוא תהליך בידול ייחודי שבסופו של דבר מעורר את אחד מסוגי התאים המובהקים ביותר של הגוף, הזרע. התמיינות של תאי נבט מתרחשת בכיסים הציטופלזמיים של תאי סרטולי סומטיים המארחים 4 עד 5 דורות של תאי נבט בו זמנית ומתאמים ומסנכרנים את התפתחותם. לכן, ההרכב של סוגי תאי נבט בתוך חתך הוא קבוע, ואסוציאציות תאים אלה ידועים גם בשם שלבים (I-XII) של מחזור האפיתל החצי-חצי. חשוב לציין, ניתן לזהות שלבים גם מצינורות חצי-חצי שלמים המבוססים על מאפייני ספיגת האור/פיזור הדיפרנציאליים שלהם שנחשפו על ידי טרנסילומינציה, והעובדה שהשלבים עוקבים זה אחר זה לאורך הצינור בסדר מספרי. מאמר זה מתאר שיטת מיקרו-דיסקציה בסיוע טרנסילומינציה לבידוד מקטעי צינורית חצי-חצי-היקפיים המייצגים שלבים ספציפיים של מחזור אפיתל חצי-היקפי של העכבר. תבנית ספיגת האור של צינוריות חצי-היקפיות נבדקת תחילה תחת מיקרוסקופ ניתוק, ולאחר מכן מקטעי צינורית המייצגים שלבים ספציפיים נחתכים ומשמשים ליישומים במורד הזרם. כאן אנו מתארים פרוטוקולים immunostaining עבור הכנות סקווש ספציפיות לשלב עבור מקטעי tubule שלמים. שיטה זו מאפשרת לחוקר להתמקד באירועים ביולוגיים המתרחשים בשלבים ספציפיים של spermatogenesis, ובכך לספק כלי ייחודי למחקרים התפתחותיים, טוקסיקולוגיים וציטולוגיים של זרע ומנגנונים מולקולריים בסיסיים.

Watch this Scientific Journal Video about Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses at JoVE.com

Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses

פרוטוקול זה מתאר מיקרו-דיסקציה בסיוע טרנסילומינציה של מקטעים של צינוריות עכבר בוגרות למחצה המייצגות שלבים ספציפיים של מחזור אפיתל חצי-היקפי, וסוגי תאים בו, וחיסון לאחר מכן של תכשירי סקווש ומקטעי צינור שלמים.

ניתוח בסיוע Transillumination של שלבים ספציפיים של מחזור האפיתל החצי-שנתי של העכבר לניתוחים Immunostaining במורד הזרם

Spermatogenesis is a unique differentiation process that ultimately gives rise to one of the most distinct cell types of the body, the sperm. ...

transillumination-assisted-dissection-specific-stages-mouse

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Developmental Biology

Unit 1

The Reproductive System

SCIENTISTS IN ACTION

6.8K Views.  University of Turku, Turku, Finland. פרוטוקול זה מתאר מיקרו-דיסקציה בסיוע טרנסילומינציה של מקטעים של צינוריות עכבר בוגרות למחצה המייצגות שלבים ספציפיים של מחזור אפיתל חצי-היקפי, וסוגי תאים בו, וחיסון לאחר מכן של תכשירי סקווש ומקטעי צינור שלמים.

Video: Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses

Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to the next generation. So far, molecular studies of this morphological transition have been hampered by the lack of a method allowing adequate separation of these important steps of spermatid differentiation for subsequent analyses. Earlier attempts at proper gating of these cells using flow cytometry may have been difficult because of a peculiar increase in DNA fluorescence in spermatids undergoing chromatin remodeling. Based on this observation, we provide details of a simple flow cytometry scheme, allowing reproducible purification of four populations of mouse spermatids fixed with ethanol, each representing a different state in the nuclear remodeling process. Population enrichment is confirmed using step-specific markers and morphological criterions. The purified spermatids can be used for genomic and proteomic analyses.

We describe a sorting strategy for mouse spermatids using flow cytometry. Spermatids are sorted into four highly pure populations, including round (spermiogenesis steps 1-9), early elongating (spermiogenesis steps 10-12), late elongating (spermiogenesis steps 13-14) and elongated spermatids (spermiogenesis steps 15-16). DNA staining, size and granulosity are used as selection parameters.

שלב מסוים מיון של Spermatids העכבר על ידי cytometry הזרימה

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. Although many efforts have been made to reveal the underlying mechanisms of decidualization, the exact signaling between the epithelial cells that are in contact with the embryo and the underlying stromal cells remains poorly understood. Therefore, studying decidualization in a way that takes both the epithelial and stromal cells into account could improve our knowledge about the molecular details of decidualization. For this purpose, in vivo models of artificial decidualization are physiologically the most relevant; however, manipulation of intercellular communication is limited. Currently, in vitro cultures of endometrial stromal cells are being used to investigate the modulation of decidualization by several signaling molecules. Conventionally, human or mouse endometrial stromal cells are used. However, the availability of human samples is very often limited. Furthermore, the use of murine tissues is accompanied with variety in the method of culturing. This study presents a validated and standardized method to obtain pure Endometrial Epithelial Cell (EEC) and Stromal Cell (ESC) cultures using adult intact mice treated with estrogen for three consecutive days. The protocol is optimized to improve the yield, viability, and purity of the cells and was further extended in order to study decidualization in a coculture of EEC and ESC. This model may be suitable to exploit the importance of both cell types in decidualization and to evaluate the contribution of significant signaling molecules secreted by EEC or ESC during the intercellular communication.

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

This study presents a standardized and validated method for the isolation and culture of primary mouse endometrial stromal and epithelial cells, which can be used in a coculture system to study in vitro decidualization.

בידוד של עכבר רירית הרחם אפיתל סטרומה תאים עבור<em&gt; במבחנה</em&gt; Decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types that are distinct not only in molecular and morphological features but also in physiological properties. These differences reflect their diverse functions, which together establish the necessary microenvironment for the post-testicular sperm development in the epididymal lumen. The understanding of the biophysical properties of the epididymal epithelial cells is critical for revealing their functions in sperm and reproductive health, under both physiological and pathophysiological conditions. While their functional properties have yet to be fully elucidated, the epididymal epithelial cells can be studied using the patch-clamp technique, a tool for measuring the cellular events and the membrane properties of single cells. Here, we describe the methods of cell isolation and whole-cell patch-clamp recording to measure the electrical properties of primary dissociated epithelial cells from the rat cauda epididymides.

We present a protocol that combines cell isolation and whole-cell patch-clamp recording to measure the electrical properties of the primary dissociated epithelial cells from the rat cauda epididymides. This protocol allows for investigation of the functional properties of primary epididymal epithelial cells to further elucidate the physiological role of the epididymis.

כל תא תיקון מהדק הקלטות של תאים אפיתל העיקרי מבודדים מן האברדימיס

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney development, the two progenitor tissues, the ureteric bud and the metanephric mesenchyme, communicate and reciprocally induce cellular mechanisms to eventually form the collecting system and the nephrons of the kidney. As mammalian embryos grow intrauterine and therefore are inaccessible to the observer, an organ culture has been developed. With this method, it is possible to study epithelial-mesenchymal interactions and cellular behavior during kidney organogenesis. Furthermore, the origin of congenital kidney and urogenital tract malformations can be investigated. After careful dissection, the metanephric rudiments are transferred onto a filter that floats on culture medium and can be kept in a cell culture incubator for several days. However, one must be aware that the conditions are artificial and could influence the metabolism in the tissue. Also, the penetration of test substances could be limited due to the extracellular matrix and basal membrane present in the explant.
One main advantage of organ culture is that the experimenter can gain direct access to the organ. This technology is cheap, simple, and allows a large number of modifications, such as the addition of biologically active substances, the study of genetic variants, and the application of advanced imaging techniques.

This protocol describes a method for isolating and culturing metanephric rudiments from mouse embryos.

דיספציה ותרבות של כליה עובריים עכבר

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate embryonic origins and functions &#8212; the neurohypophysis and the adenohypophysis. The developing mouse pituitary gland is tiny and delicate with an elongated oval shape. A coronal section is preferred to display both the adenohypophysis and neurohypophysis in a single slice of the mouse pituitary.
The goal of this protocol is to achieve proper pituitary coronal sections with well-preserved tissue architectures from developing mice. In this protocol, we describe in detail how to dissect and process pituitary glands properly from developing mice. First, mice are fixed by transcardial perfusion of formaldehyde prior to dissection. Then three different dissecting techniques are applied to obtain intact pituitary glands depending on the age of mice. For fetal mice aged embryonic days (E) 17.5 - 18.5 and neonates up to 4 days, the entire sella regions including the sphenoid bone, gland, and trigeminal nerves are dissected. For pups aged postnatal days (P) 5 - 14, the pituitary glands connected with trigeminal nerves are dissected as a whole. For mice over 3 weeks old, the pituitary glands are carefully dissected free from the surrounding tissues. We also display how to embed the pituitary glands in a proper orientation by using the surrounding tissues as landmarks to obtain satisfying coronal sections. These methods are useful in analyzing histological and developmental features of pituitary glands in developing mice.

We present a protocol to dissect pituitary glands and prepare pituitary coronal sections from developing mice.

ניתוח והכנת פרוסה הילתית בפיתוח העכבר בלוטת יותרת המוח

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate ...

A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during meiosis can lead to infertility, pregnancy loss or genetic defects. Commencing at the onset of puberty and continuing throughout adulthood, continuous semi-synchronous waves of spermatocytes undergo spermatogenesis and ultimately form haploid sperm. The first wave of mouse spermatocytes undergoing meiotic initiation appear at day 10 post-partum (10 dpp) and are released into the lumen of seminiferous tubules as mature sperm at 35 dpp. Therefore, it is advantageous to utilize mice within this developmental time-window in order to obtain highly enriched populations of interest. Analysis of rare cell stages is more difficult in older mice due to the contribution of successive spermatogenic waves, which increase the diversity of the cellular populations within the tubules. The method described here is an easily implemented technique for the cytological evaluation of the cells found within the seminiferous tubules of mice, including spermatogonia, spermatocytes, and spermatids. The tubule squash technique maintains the integrity of isolated male germ cells and allows examination of cellular structures that are not easily visualized with other techniques. To demonstrate the possible applications of this tubule squash technique, spindle assembly was monitored in spermatocytes progressing through the prophase to metaphase I transition (G2/MI transition). In addition, centrosome duplication, meiotic sex chromosome inactivation (MSCI), and chromosome bouquet formation were assessed as examples of the cytological structures that can be observed using this tubule squash method. This technique can be used to pinpoint specific defects during spermatogenesis that are caused by mutation or exogenous perturbation, and thus, contributes to our molecular understanding of spermatogenesis.

The goal of this tubule squash technique is to rapidly assess cytological features of developing mouse spermatocytes while preserving cellular integrity. This method allows for the study of all stages of spermatogenesis, and can be easily implemented alongside other biochemical and molecular biological approaches for the study of mouse meiosis.

טכניקה סקווש צנורית וכמה לניתוח Cytological של יצירת זרע שימוש במודל עכבר

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during ...

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, including insulin-secreting &#946; cells, are differentiated from common endocrine progenitors during the embryonic stage. Immature endocrine cells expand via cell proliferation and mature during a long postnatal developmental period. However, the mechanisms underlying these processes are not clearly defined. Single-cell RNA-sequencing is a promising approach for the characterization of distinct cell populations and tracing cell lineage differentiation pathways. Here, we describe a method for the single-cell RNA-sequencing of isolated pancreatic &#946; cells from embryonic, neonatal and postnatal pancreases.

We describe a method for the isolation of endocrine cells from embryonic, neonatal and postnatal pancreases followed by single-cell RNA sequencing. This method allows analyses of pancreatic endocrine lineage development, cell heterogeneity and transcriptomic dynamics.

Transcriptomic תא בודד ניתוחים של תאים בלבלב האנדוקרינית העכבר

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and simple protocol to detect protein expression during craniofacial morphogenesis/pathogenesis using mouse craniofacial tissues as examples. The protocol consists of preparation and cryosectioning of tissues, indirect immunofluorescence, image acquisition, and quantification. In addition, a method for preparation and cryosectioning of undecalcified hard tissues for immunostaining is described, using craniofacial tissues and long bones as examples. Those methods are key to determine the protein expression and morphological/anatomical changes in various tissues during craniofacial morphogenesis/pathogenesis. They are also applicable to other tissues with appropriate modifications. Knowledge of the histology and high quality of sections are critical to draw scientific conclusions from experimental outcomes. Potential limitations of this methodology include but are not limited to specificity of antibodies and difficulties of quantification, which are also discussed here.

Here, we present a detailed protocol to detect and quantify protein levels during craniofacial morphogenesis/pathogenesis by immunostaining using mouse craniofacial tissues as examples. In addition, we describe a method for preparation and cryosectioning of undecalcified hard tissues from young mice for immunostaining.

הכנה לרקמה וכתמים של רקמות הגולגולת והעצמות הבלתי מתויטות

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the epidermis of mouse skin. There are seven important steps: separation of the epidermis from the dermis, digestion of the epidermis, staining of the epidermal cell populations with cisplatin, sample barcoding, staining with metal tagged antibodies for cell cycle markers and proteins of interest, detection of metal-tagged antibodies by mass cytometry, and the analysis of expression in the various cell cycle phases. The advantage of this approach over histological methods is the potential to assay the expression pattern of &#62;40 different markers in a single cell at different phases of the cell cycle. This approach also allows for the multivariate correlation analysis of protein expression that is more quantifiable than histological/imaging methods. The disadvantage of this protocol is that a suspension of single cells is needed, which results in the loss of location information provided by the staining of tissue sections. This approach may also require the inclusion of additional markers to identify different cell types in crude cell suspensions. The application of this protocol is evident in the analysis of hyperplastic skin disease models. Moreover, this protocol can be adapted for the analysis of specific sub-type of cells (e.g., stem cells) by the addition of lineage-specific antibodies. This protocol can also be adapted for the analysis of skin cells in other experimental species.

This protocol describes how to isolate skin keratinocytes from mouse models, to stain with metal-tagged antibodies, and to analyze stained cells by mass cytometry in order to profile the expression pattern of proteins of interest in the different cell cycle phases.

בידוד וכתמים של העור העכבר Keratinocytes עבור ניתוח מחזור התא הספציפי של חלבון הביטוי הסלולרי על ידי המוני הקיקומטריה

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

Dissection, Culture and Analysis of Primary Cranial Neural Crest Cells from Mouse for the Study of Neural Crest Cell Delamination and Migration

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ability to study cell movements and differentiation in vivo is still very difficult. Neurocristopathies, or disorders of the neural crest lineage, are particularly challenging to study due to a lack of accessibility of key embryonic stages and the difficulties in separating out the neural crest mesenchyme from adjacent mesodermal mesenchyme. Here, we set out to establish a well-defined, routine protocol for the culture of primary cranial neural crest cells. In our approach we dissect out the mouse neural plate border during the initial neural crest induction stage. The neural plate border region is explanted and cultured. The neural crest cells form in an epithelial sheet surrounding the neural plate border, and by 24 h after explant, begin to delaminate, undergoing an epithelial-mesenchymal transition (EMT) to become fully motile neural crest cells. Due to our two-dimensional culturing approach, the distinct tissue populations (neural plate versus premigratory and migratory neural crest) can be readily distinguished. Using live imaging approaches, we can then identify changes in neural crest induction, EMT and migratory behaviors. The combination of this technique with genetic mutants will be a very powerful approach for understanding normal and pathological neural crest cell biology.

This protocol describes the dissection and culture of cranial neural crest cells from mouse models, primarily for the study of cell migration. We describe the live imaging techniques used and the analysis of speed and cell shape changes.

חיתוך, תרבות וניתוח של הגולגולת הראשי ציצה עצביים תאים מעכבר לחקר של ציצה של תא העצבים העצבי והגירה

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ...