ברצוננו להודות לחברי הצוות הניהולי מתקן מעבדה ודגים Pelegri, אשר סייעו להקל את הפרויקט הזה. תמיכה עבור פרויקט זה סופק על ידי NIH R56 GM065303 ו NIH 2 T32 GM007133 כדי ELW, NIH 5 F31 GM108449-02 ו NIH 2 T32 GM007133 כדי CCE, ו- NIH RO1 GM065303 כדי FP

כל דג הזברה טופלה בהתאם קפדנים עם תרגול חיה טוב, כפי שהוגדרה על ידי הגופים רווחי בעלי החיים לאומיים ו / או מקומי הרלוונטיים, וכל העבודה בבעלי החיים אושרה על ידי הוועדה המתאימה (אונ&#39; A3368-01 מספר האבטחה ויסקונסין-מדיסון). בעלי החיים יוחזקו בתנאים סטנדרטיים ב 26.5 מעלות צלזיוס. 1. טרום בחירה של נקבות הערה: ביציות יכולות נשים בוגרות משתרעות בדרך כלל מגוון של שלבים התפתחותיים, משלב I עד V (איור 2). טיהור הנקבות של ביציות קודמות באמצעות הזדווגות טבעית מוצלחת מגדילה את הסנכרון של היערכות ביצית, כפי שזה עתה בפיתוח ביציות להופיע בתור עוקבה 3, 14. בתוך כ 8 ימים לאחר טיהור, רוב הביציות נמצאות IV בשלב מוקדם, שבו הוא אופטימלי עבור החניכה של הבשלה במבחנה. סנכרון כזה מגדיל את התשואה של ביציות that יכול לעבור את התהליך המלא של הבשלה במבחנה, הקלת מניפולציה ניסויית. ראה 13 תיאורים קודמים לפרטים על הקמת דגי הזדווגויות זיווג ועל הרכב מים ודגים (כאן, 14 גרם של מלח ים 150 גרם של NaHCO 3 ל -1,000 ליטר של מים אוסמוזה הפוכים, pH 6.5-8.5 (טווח מועדף: 6.8 -7.5) לבין מוליכות של 180-360 מיקרו-שניות). ראה ואח &#39;ברנד. 13 מתכונים נוספים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמונה עד עשרה ימים לפני המניפולציה תרבות חוץ גופית, השתמשו ברשת דגים להעביר זכר יחיד דג נקבה אחת של זן הרצוי טנק ההזדווגות. קבוצות מרובות זוג. השאירו אותם בן לילה טנק ההזדווגות. אפשר להם להזדווג במהלך הערב ושעות אחר הצהריים של יום המחרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש נטו דגים להפריד את הנקבות כי להניב ביצים במהלך ההזדווגות ולמקם אותם למיכל נפרד. Feed הנקבות האלה פעמיים ביום עם תערובת מזון containing כ כמות שווה של ארטמיה פתיתי מזון לדגים. כמות המזון צריכה להיות מספיק כדי לספק כ 20 דקות, אבל לא יותר, זמן האכלה. </li></ol> 2. הכנת התבגרות בינונית הערה: כן בינוני התבגרות ביום הניסוי הבשל חוץ גופייה, בתוך 1 h של הסרת הביציות מן הנקבה (ראה סעיף 3). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 20 מ&quot;ל של מדיום L-15 של ליבוביץ עם-גלוטמין L, pH 7.0, צינור חרוטי 50 מ&quot;ל בתנאים סטריליים. תביאו אותו pH 9.0 עם 10 N NaOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 9 מיליליטר של מדיום L-15 של ליבוביץ, pH 9.0, כדי 2 צינורות חרוטים נפרדים 50 מיליליטר. לייבל 1 צינור &quot;+ DHP&quot; והשני &quot;-DHP.&quot; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשנת הצינור + DHP, להוסיף 10 μL של 17α-20β-dihydroxy-4 pregnen-3-אחד (DHP), 490 μL של DH 2 O, ו 500 μL של אלבומין 10% שור (BSA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשנת הצינור -DHP, להוסיף 100 μL של 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​gentamycin, 40081; L של DH 2 O, ו 500 μL של 10% BSA. </li></ol> 3. Dissection של ביציות וייזום של תרבות חוץ-גופית הערה: ניסוי התרבות במבחנה מתבצע עם נקבות שנבחרו מראש 8-10 ימים אחרי שהם משחררים ביצים באמצעות הזדווגות טבעית. השתמש בינוני בשל שנעשה באותו היום (ראה סעיף 2). ביציות בוגרות כראוי אם לנתיחה החלה סמוכות לסוף מחזור ימי הדגים (נקבע במעבדה על ידי תאורה מלאכותית שנקבע מראש במתקן הדגים) 13, ואולי מחקה תהליכים המתרחשים באמצעות הזדווגות טבעית. משמעות הדבר היא כי רוב השלבים פרוטוקול חייב להתבצע בשעות הערב אם הדגים הם שוכנו במתקן עם מחזור אור רגיל (למשל, מתחילה בצעד 3.2 בשעה 6 בערב במתקן עם תקופת האור 8 am כדי 10 בלילה), למרות עבודה בזמן תקופות אחרות אפשריות עם מחזור אור זמן שהוסט כראוי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן פתרון מניות 0.2% tricaine ב DH 2 O, שנאגר עד 7.0 pH עם 1 M טריס, pH 9.0, ולשמור את הפתרון הזה ב 4 ° C. זה יכול להיות מוכן מראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליזום את h הניסוי 0-4 לפני סוף מחזור האור היומי במתקן. בכוס 250 מ&quot;ל, להוסיף 20 מ&quot;ל של פתרון מניות 0.2% tricaine, pH 7.0, 80 מ&quot;ל של מים ודגים ומערבבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הנקבות שנבחר מראש פתרון tricaine ו להרדים אותם על ידי חשיפת יתר. השאר את הנקבות בפתרון tricaine עבור 15 דקות לאחר הפסקת תנועת זימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת כף, לאסוף את הדגים מורדמים מפתרון tricaine ולשטוף אותם בקצרה במים דגים. מניחים את הדג על גבי מגבת נייר כדי לספוג את עודפי המים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש סכין גילוח נקי לערוף את הדגים מורדמים ברמה של סנפיר החזה. בעזרת מספריים לנתח, לעשות חתך אורכים בצד הגחון של הדג, הרחבת המסוף הקדמי לאזור האנאלי. </li><li&gt; מניח את הדג על צלחת פטרי תחת מיקרוסקופ לנתח עם אור האירוע. בעזרת זוג מלקחיים לנתח, להעביר חלקים השחלה אל צלחת תרבות 35 x 10 מ&quot;מ המכיל 4 מ&quot;ל של מדיום L-15 של ליבוביץ + DHP. הערה: השחלות, אשר מכילות ביציות מתפתחות, תופענה מבנים אטומים וגבשושיים בתוך חלל הגוף הפנימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים לנתח, לנתק את הביציות בעדינות מן המוני זקיקים. מיין ביציות מוקדם בשלב IV (איור 2B; לפני התמוטטות GV, בגודל כמעט מירבית מאופיין הציטופלסמה כהה, אטום ו GV ברורה ממבט הממוקם סימטרית בתוך הביצית). בטל ביציות בשלבים מוקדמים יותר (איור 2 א) וביצי V הבמה שקופות, בוגרת (דומות לאלה באיור 2C אך נוכח השחלות לפני טיפול DHP). הערה: ביציות נבחרות התבגרות ב IV בשלב מוקדם, בשלב המוקדם שתוצאתו oocyt הבוגרת, השלב החמישיes אחרי התנאים תרבות במבחנה (איור 2C ו- D) 3. בגלל ביציות בשלב IV מייצרים מוצרים באופן פעיל, מניפולציה בשלב זה מאפשרת ביטוי של מוצרי אקסוגניים באמצעות הזרקת RNA או להפחתת תפקוד הגן באמצעות MOS הציג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש pipet כוס פסטר להעביר ביציות IV בשלב מוקדם כדי בצלחת תרבות הפלסטיק השני 35 x 10 מ&quot;מ המכיל 4 מ&quot;ל של מדיום L-15 של ליבוביץ + DHP. העבר כמויות מינימליות של המדיום -DHP אל צלחת ובה הפתרון + DHP. </li></ol> 4. microinjections ביצית הערה: מבודד בשלב IV ביציות עוברת בתהליך הבשלה במבחנה ניתן microinjected להציג ריאגנטים עבור מניפולציה תפקודית או ביטוי חלבון מתויג. את microinjection של ריאגנטים, כגון mRNA ו MOS (ראה סעיף 4), הוא בדרך כלל מתבצע כאשר הביציות עוברות במבחנת matuיחס במדיום + DHP, לפני defolliculation. אם תרצה, כדי לאפשר יותר זמן לנהל מניפולציות לפני הבשלת ביצית, הזריקות יכולות להתבצע גם במדיום -DHP, לפני ההבשלה, עבור h 2 לפחות. הם יועברו לאחר מכן עד בינוני + DHP. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן תעתיק באמצעות ערכת ביטוי סטנדרטית. להשאיר אותן -80 ° C כמו מניה 100-500 pg / μL להזרקה בריכוז סופי של 50-500 pg / μL (200 pg / μL מומלץ) במים רנ&quot;א-כיתה. כן MOS בריכוז של 4 ng / μL במים לפי הוראות היצרן. להזריק אותם בריכוזים סופיים של 2 ng / μL (או כפי שנקבע באופן אמפירי). הערה: זריקות בדרך כלל מבוצעים במדיום + DHP לפני defolliculation (ראה הערה בסעיף 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם מזריקים mRNA, מיד לפני ההזרקה, לדלל את ה- mRNA באמצעות מים כיתה RNA אוסמוזה הפוכה ו 0.2 M KCl להשיג פתרון סופי של 0.1 M KCl.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הזרקת MOS, מיד לפני ההזרקה, לדלל את MOS לריכוז הרצוי באמצעות מים אוסמוזה הפוכה ו 0.2 M KCl להשיג פתרון סופי של 0.1 M KCl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ידני להחזיק ביציות עם מלקחיים בסדר להזריק כ 1 NL לתוך ביציות בשלב IV מסוג פרא באמצעות מחט עשתה עם טפטף נימי משך-זכוכית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המחטים זכוכית על ידי משיכת צינורות זכוכית נימי מחומם, טעינת הפתרון להיות מוזרק, וגם לשבור את קצה המחט עם מלקחיים, כפי שתואר לעיל פרוטוקולים עבור זריקה רגילה לעוברי מוקדם דג הזברה 15. הערה: זה מועיל אם המחט יש להתחדד הדרגתי ולא פתאומי אחד; זה מאפשר יותר גמישות מבחינת המיקום של הפסקה קצה מחט וגם עוזר למנוע נזק לעובר מוזרק. שימוש באותה המחט פתרון באשר הזריקות העוברות, להתאים את עוצמת הקול מוזרק על ידי מראש בקביעההגדרות לחץ microinjector המייצרים את העוצמה הרצויה. ניתן לקבוע הגדרות אלה על ידי מדומה-הזרקת טיפת שמן מינרלי בשקופית כיול הבמה מיקרוסקופ (0.01 מ&quot;מ) והתאמת הגדרות microinjector להשיג בקוטר הרצוי בולוס של פתרון מוזרק, כפי שתואר לעיל 15. </li></ol></li></ol> 5. הבשלת הביצית ו Defolliculation הערה: במהלך הבשלת ביצית, הביציות תהפוכנה שקופות בהדרגה, אשר מאפשרת ההערכה של תנאי תרבות מוצלחים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך הדוגרים בשלה (ובמידת צורך, מוזרקות) ביציות במדיום + DHP ב 26.5 מעלות צלזיוס, מעת לעת הבדיקה (כל 30 דקות) כדי להבטיח כי הביציות להישאר שלמות עוברות התבגרות נאותה על ידי הפיכתו שקופה בהדרגה (ראה איור 2 ג) . <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר ביציות lysing עם פיפטה פסטר וזורקים אותםבכוס פסולת מעבדה כדי לשמור על האיכות של המדיום. חילופי בינוני התרבות עם כ-נפח מחצית בינונית טרי + DHP לשמור פתרון ברור, בהתאם לכמות לתמס ביצית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר בשל במבחנה להמשיך עד ברוב של הביציות להיות שקופים ויש לי GV כי הוא כבר לא נראה לעין (כ 2 h בטיפול DHP, ראו האיור 2C לעומת D). הצג אותם תחת מיקרוסקופ לנתח עם אופטיקה אור מועבר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את קרום הזקיקים החיצוני ביותר מכל ביצית התבגרה. שימוש במלקחיים חוץ-בסדר לעשות קרע בקרום הזקיקים באזור עם שטח מוגבר בין הביצית לבין הממברנה. לקלף חלק הממברנה לגלגל את הביצית מחוץ קרום תוך החזקת חלק מקולף. הערה: קרום כוריוני הבסיסי יהיה בדרך כלל להישאר בשיתוף הדוק עם הביצה במהלך תהליך זה; אחרי ביצת מעשהivation, היא מתרחבת כדי ליצור שכבת מגן על העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ביציות defolliculated בנפח מינימלי של המדיום (בדרך כלל, להעביר כ 5-10 ביציות בוגרות תוך פחות מ 20 μL) כדי בצלחת פטרי עם כמה טיפות של תרבות (+ DHP) בינוני ולהמשיך הפריה. </li></ol> 6. הפריה של ביציות בתרבית חוץ-גופית הערה: הפתרון הזרע על הקרח, הכין מתחת, תשמור העוצמה שלה במשך כ 2 h. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן פתרון זרע לקראת סוף שלב הבשלת ביצית ולפני defolliculation אשכים באמצעות מחמש זכרים ב 500 μL של הפתרון הנקס, כפי שתואר לעיל 16, 17. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 10-50 μL של פתרון הזרע אל ביציות defolliculated במדיום תרבות + DHP. חכו 10 s. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה, להוסיף כמה טיפות של עובריים (E3) בינוני ביציות. חכו 1 דקות ולאחר מכן לשטוף את plאכלו עם מדיום E3. הערה: הרכב בינוני E3 היא כדלקמן: 5 מ&quot;מ NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 מ&quot;מ CaCl 2, 0.33 מ&quot;מ MgSO 4, ו 1-5% מתילן בלו 13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 5.3, 6.2, ו 6.3 להשיג מספר גדול יותר של עוברים מופרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר העוברים מופרית לפתח. שימוש במיקרוסקופ לנתח עם אופטיקה האור המועבר לצפות להתקדמות בשלבים מחשוף כדי להבטיח הפריה מוצלחת, כפי שתואר לעיל עבור הפריה 17, וביום 18. </li></ol>

<ol>
	<li>Lindeman, R., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+maternal-effect+genes:+insights+into+fertilization,+early+cleavage+divisions,+and+germ+cell+determinant+localization+from+studies+in+the+zebrafish.">Vertebrate maternal-effect genes: insights into fertilization, early cleavage divisions, and germ cell determinant localization from studies in the zebrafish.</a> Mol Rep Dev. 77 (4), 299-313 (2010).</li><li>Abrams, E. W., Mullins, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+zebrafish+development:+it's+in+the+maternal+genes.">Early zebrafish development: it's in the maternal genes.</a> Curr Opin Genet Dev. 19 (4), 396-403 (2009).</li><li>Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+oocyte+culture-based+manipulation+of+zebrafish+maternal+genes.">In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes.</a> Dev Dyn. 242 (1), 44-52 (2013).</li><li>Selman, K., Petrino, T. R., Wallace, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+conditions+for+oocyte+maturation+in+the+zebrafish,+Brachydanio+rerio.">Experimental conditions for oocyte maturation in the zebrafish, Brachydanio rerio.</a> J Exp Zool. 269 (6), 538-550 (1994).</li><li>Fauvel, C., Omnes, M. H., Suquet, M., Normant, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+assessment+of+overripening+in+turbot+(Scophtalmus+maximus)+by+a+simple+pH+measurement.">Reliable assessment of overripening in turbot (Scophtalmus maximus) by a simple pH measurement.</a> Aquaculture. 117 (1-2), 107-113 (1993).</li><li>Lahnsteiner, F., Weismann, T., Patzner, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+of+the+ovarian+fluid+in+4+salmonid+speices:+Onchorhynchus+mykiss,+Salmo+trutta+flacustris,+Salvelinus+alpinus+and+Husho+hucho.">Composition of the ovarian fluid in 4 salmonid speices: Onchorhynchus mykiss, Salmo trutta flacustris, Salvelinus alpinus and Husho hucho.</a> Reprod Nutr Dev. 35 (5), 465-474 (1995).</li><li>Pati&#241;o, R., Bolamba, D., Thomas, P., Kumakura, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+external+pH+on+hormonally+regulated+ovarian+follicle+maturation+and+ovulation+in+Atlantic+croaker.">Effects of external pH on hormonally regulated ovarian follicle maturation and ovulation in Atlantic croaker.</a> Gen Comp Endocrinol. 141 (2), 126-134 (2005).</li><li>Seki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+reliable+in+vitro+maturation+system+for+zebrafish+oocytes.">Development of a reliable in vitro maturation system for zebrafish oocytes.</a> Reproduction. 135 (3), 285-292 (2008).</li><li>Selman, K., Wallace, R. A., Sarka, A., Qi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+oocyte+development+in+the+zebrafish,+Brachydanio+rerio.">Stages of oocyte development in the zebrafish, Brachydanio rerio.</a> J Morphol. 218 (2), 203-224 (1993).</li><li>Clelland, E., Peng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocrine/paracrine+control+of+zebrafish+ovarian+development.">Endocrine/paracrine control of zebrafish ovarian development.</a> Mol Cell Endocrinol. 312 (1-2), 42-52 (2009).</li><li>Kane, D. A., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+midblastula+transition.">The zebrafish midblastula transition.</a> Development. 119 (2), 447-456 (1993).</li><li>Kanagaraj, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Souffle/Spastizin+controls+secretory+vesicle+maturation+during+zebrafish+oogenesis.">Souffle/Spastizin controls secretory vesicle maturation during zebrafish oogenesis.</a> PLoS Genet. 10 (6), e1004449 (2014).</li><li>Brand, M., Granato, M., N&#252;sslein-Volhard, C., N&#252;sslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Keeping and raising zebrafish,Zebrafish - A Practical Approach. , 7-37 (2002).</li><li>Connoly, M. H., Dutkosky, R. M., Heah, T. P., Sayler, G. S., Henry, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+dynamics+of+oocyte+growth+and+vitellogenin+gene+expression+in+zebrafish+(Danio+rerio).">Temporal dynamics of oocyte growth and vitellogenin gene expression in zebrafish (Danio rerio).</a> Zebrafish. 11 (2), 107-114 (2014).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. (25), e1115 (2009).</li><li>Pelegri, F., Mullins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+for+mutations+affecting+adult+traits+and+parental-effect+genes.">Genetic screens for mutations affecting adult traits and parental-effect genes.</a> Meth Cell Biol. 104, 83-120 (2011).</li><li>Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ploidy+manipulation+of+zebrafish+embryos+with+Heat+Shock+2+treatment.">Ploidy manipulation of zebrafish embryos with Heat Shock 2 treatment.</a> J Vis Exp. , (2016).</li><li>Kimmel, C., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullman, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+in+the+zebrafish.">Stages of embryonic development in the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Eisen, J. S., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+morpholino+experiments:+don't+stop+making+antisense.">Controlling morpholino experiments: don't stop making antisense.</a> Development. 135 (10), 1735-1743 (2008).</li><li>Schulte-Merker, S., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Out+with+the+old,+in+with+the+new:+reassessing+morpholino+knockdowns+in+light+of+genome+editing+technology.">Out with the old, in with the new: reassessing morpholino knockdowns in light of genome editing technology.</a> Development. 141 (16), 3103-3104 (2014).</li><li>Dekens, M. P. S., Santoriello, C., Vallone, D., Frassi, G., Whitmore, D., Foulkes, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+regulates+the+cell+cycle+in+zebrafish.">Light regulates the cell cycle in zebrafish.</a> Curr Biol. 13 (23), 2051-2057 (2003).</li><li>Sakai, N., Burgess, S., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+in+vitro+fertilization+of+zebrafish+eggs+in+Hank's+saline+containing+bovine+serum+albumin.">Delayed in vitro fertilization of zebrafish eggs in Hank's saline containing bovine serum albumin.</a> Mol Mar Biotechnol. 6 (2), 84-87 (1997).</li><li>Pelegri, F., Mullins, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+for+mutations+affecting+adult+traits+and+parental-effect+genes.">Genetic screens for mutations affecting adult traits and parental-effect genes.</a> Meth Cell Biol. 135, (2016).</li><li>Lindeman, R. E., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+products+of+futile+cycle/lrmp+promote+centrosome-nucleus+attachment+in+the+zebrafish+zygote.">Localized products of futile cycle/lrmp promote centrosome-nucleus attachment in the zebrafish zygote.</a> Curr Biol. 22 (10), 843-851 (2012).</li><li>Nair, S., Marlow, F., Abrams, E., Kapp, L., Mullins, M., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromosomal+passenger+protein+Birc5b+organizes+microfilaments+and+germ+plasm+in+the+zebrafish+embryo.">The chromosomal passenger protein Birc5b organizes microfilaments and germ plasm in the zebrafish embryo.</a> PLoS Genetics. 9 (4), e1003448 (2013).</li><li>Eno, C., Solanki, B., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=aura+(mid1ip1l)+regulates+the+cytoskeleton+at+the+zebrafish+egg-to-embryo+transition.">aura (mid1ip1l) regulates the cytoskeleton at the zebrafish egg-to-embryo transition.</a> Development. 143 (9), 1585-1599 (2016).</li></ol>

יש המחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

הפרוטוקול הנ&quot;ל הוא המניפולציה של מוצרי גן לפני ההפריה, ובכך מאפשר לחקר מוצרי גן אימהיים בעובר דג הזברה מוקדם. מחקרים קודמים הצליחו להבשיל ביציות במבחנה 4; פרוטוקול זה עבר שינוי כדי לאפשר ההפריה הבאה של במבחנה התבגרה 8 ביציות. זה בתורו מאפשר הזרקה של חומרים כימיים עבור מניפולציה פונקציונלי להדמיה של מוצרים בירושה אימהי בעובר המוקדם 3. עובר נובע שיטה זו יכולה להיות בת קיימא ויכול לשרוד להיות מבוגרים פוריים. בניסויים ראשוניים, כמחצית עוברי המופרות נגזרים בהליך זה הייתה קיימא ביום 5 של פיתוח, כפי שהוערך על ידי אינפלציה בשלפוחית ​​שחייה בשלב זה, כמחצית שהפך בריאות, מבוגרים פורים (תצפיות לא פורסמו). ישנם מספרשלבים קריטיים של לשקול בפרוטוקול. ביציות בשלב המתאים ליזום התבגרות (IV בשלב מוקדם) ניתן מועשרות אם הנקבה כבר הזדווגו לאחרונה, אך לא לפני 8 DPP. באמצעות דגים שלא הזדווגו לאחרונה עלול לגרום מתנוונת ביצים 14, אשר לא עוברים התבגרות. נקבות שהזדווגו בתוך פחות מ 8 ימים תהיינה רוב של ביצים בשלב III או פחות, ובכך, את הביצים לא תבשלנה כהלכה במבחנה. שחלות אצל נשים שהזדווגו לפני 8 ימים תהיינה חלק אופטימלי של ביציות ב IV בשלב מוקדם. אלה יכולים להיות מוכרים על ידי האטימות שלהם ואת הנוכחות של GV בעמדה אקסצנטרית (האיור 2B). נחישות ביצית בשלב יכולה להיות גם בעזרת מדידת גודל, עם הביציות להציב לשקופית מיקרומטר בוגר תחת מיקרוסקופ לעומת הנחיות היערכות סטנדרטיות (לוח 1). עם זאת, ביציות IV בשלב מוקדם יש גודל כמעט מקסימאלי לעומת להתבגרביציות (מוכרות על ידי שקיפות והחוסר היחסי של GV; איור 2C) ומוכרים בקלות, כפי שתוארו לעיל, אשר בדרך כלל אינו המצריך של מדידת גודל ביצית ישירה. בשינה הבשלה במבחנה חייב להתחיל בתוך מספר שעות של סוף מחזור האור שאליו תורם ביצית האישה הם יתרגלו. ביציות לא יבשילו כהלכה, משתקף בשיעורי הפריה עניים, אם תורבתו בתקופת הבוקר של מחזור אור. סיבת תלות היממה של שיטת הבשלת הביצית במבחנה אינה מובנת אך סביר משקפת הטיות יממה בסיסיות התבגרות ביצת in vivo מעורבת ביטוי גני אופניים במהלך oogenesis 21. סיבה נפוצה עבור ביציות שלא עוברים מוצלח הבשל במבחנה למרות היערכות ביצית הראויה היא כי DHP פג. הורמון DHP יפוג בדרך כלל אחרי שנה, וכדי להבטיח את האפקטהתבגרות אייב, האצווה העבודה צריכה להיות מוחלפת בתוך 9 חודשים של שימוש. ההזרקה של ביציות היא עוד צעד קריטי כאשר מטרת השיטה היא המניפולציה הפונקציונלית של מוצרים אימהיים. יש הליך זה דרישות שונות מאלה עבור זריקות רגילות הביצית המופרית ב 0-30 MPF. אחד ממרכיבי המפתח של הזרקת הביצית הוא הצורך לבצע את זריקות בתנאים שאינם להוביל הפעלת ביצה מוקדמת, כגון במדיום L-15 של ליבוביץ 22, 23. מכיוון שהם מוטמעים השחלות, ביציות התבגרות גם להוות אתגר מסוים כדי הזרקה. הפרוטוקול הנ&quot;ל מרמז מתנער ביציות ראשונות מן ההשחלות ואז אוחזים זה ניתק ביצית בנפרד עם מלקחיים בזמן ההזרקה. טכניקה זו עובדת היטב ומאפשרת ביציות טרום מיון בשלב המתאים עם טיפול מינימאלי. יכולות לשמש גם שיטות חלופיות, כגוןכמו: i) ביציות צבת לתוך זריקה רגילה שקתות agarose 15, שבו הקירות האנכיים של תמיכת שוקת הביצית במהלך ההזרקה (ב שיטה חלופית זו, הביציות צריכות להיות מועברות צלחות הזרקה תוך שמר במדיום בשל חוץ גופייה) ו- II יכול להיות מוחזקת) המאפשר הביציות להישאר למסת השחלות מצורפות, אשר עם מלקחיים במהלך ההזרקה כדי למנוע מגע עם הביצית המוזרקת (בגישה זו, הביציות צריכות להיות מנותקות לאחר הזרקה היא להקל חשיפת DHP ולאפשר defolliculation שלהם חיוני, כשלעצמו עבור IVF). למרות האתגר הספציפי הזה, ביציות בשלב IV ניתן חדרו בקלות עם מחט הזריקה, סביר כי קרום כוריוני בשלב זה אינו מפותח 9 במלואו. מגבלה אחת של פרוטוקול ההתבגרות הנוכחי היא כי בתנאים בשלים במבחנה מקדמת פיתוח ביצית נאהיכול לא ייווצר כאשר הביצית הבשלה הוא יזם בשלבים מוקדמים יותר בשלב IV. הביציות להיות מוכשרות כדי להגיב DHP ידי עובר התבגרות כאשר הם מגיעים בקוטר של 520 מיקרומטר, אשר מתרחש במהלך השלב III (vitellogenesis, מתאים למגוון 340-ל-690-מיקרומטר) 9. עם זאת, בתרבות תוצאות ביציות בשלב III ביציות שאינן מוסמכים להפריה 3. רק ביציות אשר במבחנה תרבות היא יזמה ב IV הבמה (איור 2B) יכול להתפתח ביציות בוגרות, שלב V (איור 2C ו- D). זה עשוי להיות קשור לעובדה שלב III הוא חיוני לצמיחה vitellogenesis ואת הביצית 9. לפיכך, ההליך הבשלת הביצית במבחנה המוצגת במאמר זה אמור לשמש רק עם אוכלוסייה החל שלב IV ביציות (B), ולא עם ביציות בשלבים מוקדמים (שלבים I - III; e Figur <strאונג&gt; 2A). מאותה הסיבה, הליך זה מוגבל גנים באים לידי ביטוי בשלב IV או במאוחר. המניפולציה התפקודית של גנים שמוצריה הביעו מוקדם יותר עשויה במקום יש להסתמך על שיטות גנטיות (ראה להלן). שיפורים שיטות ההתבגרות תרבות במבחנה עשוי בעתיד לאפשר התחלת culturing הביצית בשלבים מוקדמים יותר, ובכך להרחיב את הכוח של הגישה הבשלה חוץ גופית. מגבלה נוספת של השיטה המוצגת היא defolliculation, אשר חיונית בשלבים הבאים המעורבים הפריה, וכיום היא צעד שער הגבלה בהליך. קרום פוליקולרית הוא שכבה שקופה סביב הביצית מתפתחת, וההסרה יכולה להיות מייגעת. אם הקרום הזה לא יוסר לחלוטין, הביצה לא תהפוך תופעל באופן מלא מופרה. זה שהובהר ע&quot;י הכישלון הסיסי להרחיב את הפיתוח של להציב סדיר, תלם דמוי structures (pseudocleavages), מאפיין של עוברים מופרים 11. שיטות defolliculation אנזימתי כגון collagenase, כפי שמוצג ב Xenopus, נוסו. עם זאת, בידיים שלנו, הטכניקה הזו לא הצליחה, ולכן אנו מסתמכים על defolliculation ידנית. מכיוון defolliculation הידנית היא עתיר עבודה זמן רב, קשה לקבל קבוצות גדולות של ביצים מופרות לאחר הבשלת ביצית חוץ גופייה. בשל ההגבלה הזמנית שהוטלה על ידי defolliculation הידנית, אנחנו כרגע לדשן כמה ביצי defolliculated, בוגרת בכל פעם, בקבוצות קטנות של 5-10 ביצים. השילוב של defolliculation אנזימטי עם הליך זה היה משמעותי צפוי להגדיל את התשואה שלה וקלות הכוללת שימוש. למרות העוברים הנוצרים לאחר הפריית מבחנה ביציות -matured יכול להיות מבוגרים קיימא, נציין כי לאחר הפריה חוץ גופית, לחלק מעוברי לעשות<html> לא מחלקים בדרך כלל או מבעוד מועד. בימים אלו אנו בחירה לקווים אשר ההתפשטות כולל סיבובים של הבשלת ביצית חוץ גופייה, אשר עלול לגרום דפוסים חזקים יותר של התפתחות עוברית נגזר באמצעות שיטה זו. ההליך אפשר עבור ההצלה הברורה או להדמיה של לוקליזציה חלבון במשך מספר המוטציות 24, 25. עם זאת, עבור גנים מסוימים, הרגולציה של ביטוי המוצר עשויה להיות מכרעת, כך המוצרים הביעו ידי מוזרק mRNA עשויים להוביל לתוצאות משתנות 26. כמו כן, חשוב להיות מודעים כל הפקדים (למשל, עוברים מוזרק עם ריאגנטים בעלי תכונות דומות לאלו ששימשו בניסוי עדיין הם חזו לא לייצר השפעה, כגון MOS שליטה או RNAs קידוד עבור חלבונים אינרטי בלבד, כגון כמו GFP), כפי השתנות בסיסית עשויה להוביל למסקנות לא תקינות. NT &quot;&gt; גישה המעורבת מניפולציה במבחנה ואחריו הפריה שימושי במיוחד במקרה של מוצרים שהופקדו אימהי, שבו הגישה הסטנדרטית של הזרקת RNA, MOS, או חלבון לתוך הביצית המופרית לא יכול להפחית מוצרים ביעילות שנצברה כבר בתוך הביצה. שיטות אחרות שפותחו לאחרונה, כגון דור קריספר-מוטציה, הם גם יעילות ביצירת תנאי מוטציה בגנים הביעו אימהי 26. עם זאת, שיטה זו דורשת את הצמיחה של כמה דורות של דגים. טכניקת הבשלת ביצית במבחנה מאפשרת מניפולציה תפקודית מהירה ללמוד את הפונקציה של גנים הביעו אימהי, כולל ההצלה phenocopy של מוטציות אימהית-השפעה, כמו גם הביטוי של רנ&quot;א וחלבונים בעובר המוקדם.

במהלך הפיתוח של בעלי חיים, מוצרי גן פיקדונות אמא (למשל, RNAs, חלבונים, ביומולקולות אחרות) לתוך הביצה; מוצרים אלה הם חשובים עבור תהליכים תאיים מוקדם מיד לאחר הפריה 1, 2. המניפולציה של הביטוי והתפקוד של מוצרים אימהיים היא בדרך כלל לא יעילה כשמשתמש בגישה סטנדרטית ההזרקה של חומרים כימיים לביצים מופרות 3. זאת משום שרוב RNAs וחלבונים מיוצרים על ידי הביצית במהלך oogenesis, כך שמוצרים אימהיים טעון מראש כבר נמצאים בתוך הביצית בשלה. מוצרים קודמים כאלה הם אטומים מציאה פונקציונלית עם סוכני מיקוד גן, כגון oligos antisense Morpholino (MOS), כי MOS למקד את ה- mRNA, לא החלבון הקודם שכבר קיים הביצה על הפריה. בנוסף, תהליכים עובריים מוקדמים רבים קורים מהר מדי לאחר ההפריה להיות influenCED ידי מוצרי חלבון נגזרים RNA מוזרק לתוך הביצית המופרית, כמו רנ&quot;א לא יכול להיות מיוצר מהר מספיק כדי להשפיע על האירועים הראשונים של עובר. מאותה הסיבה, מתויג תערובות חלבון הביעו באמצעות הזרקת mRNA לתוך הביצית המופרית לא יכול להיות מיוצר בזמן להדמיה במהלך התפקיד הפעיל שלהם בעובר המוקדם. ההזרקה לתוך ביציות בוגרות נמתחות לפני הפעלת ביצה אפשרית אך קשורה בנושאים טכניים דומים: ביציות בשלות כזו כבר טעונות מראש עם חלבון אימהי, והם לא יהיו פעילים translationally (כלומר, לייצר חלבון מן התמלילים אקסוגניים) עד אחרי הביצה הַפעָלָה. מסיבות אלה, המניפולציה של מוצרי גן אימהיים הפועל העובר מוקדם בדרך כלל צריכה להתבצע במהלך oogenesis ב הביצית הבשלה. כפי גישה אחת התגברות על קשיים אלה, בשיטות הבשלה חוץ גופית, המאפשרות להבשלה של OOCytes מ IV הבמה כדי היווצרות הביצה, הוקמו דג הזברה. שיטות מוקדם מותרות הבשלה במבחנה, אך הביצים בוגרות וכתוצאה היו לא מוכשרות להפריה 4. לאחר מכן, המניפולציה של תנאי התרבות מן ניטראלי 9.0 pH, מחקה את pH הבסיסי של נוזל ההשחלות נמצא מיני דגים 5, 6, מותר להפריה אמינה במבחנה (IVF) לאחר במבחנת התבגרות 7, 8. ואכן, במבחנה ביציות -matured יכול להניב עוברים קיימא כי לבגרות וכי הם פוריים 3, 8. שיטה משופרת הותאמה נוספת לכלול המניפולציה התפקודית של גנים של האם, את הביטוי של חלבונים מתויגים במהלך oogenesis דג הזברה באמצעות ביטוי חיצוני, בתיווך MO פונקציונלי להפיל ב מחצלתuring שלב IV ביציות 3 (איור 1). Oogenesis הזברה מציג מספר שלבים אופייניים המובילים להיווצרות של ביציות בוגרות 9 (ראה טבלה 1 עבור מדריך מהיר בשלבים השונים oogenesis). בקצרה, פיתוח הביצית היא ביוזמת הבמה ואני ביציות והיא נעצרה בשלב diplotene של לי prophase של המיוזה. ביציות אלו עוברים צמיחה באמצעות שעתוק פעיל (יזם בשלבים IA ו- IB), היווצרות של alveoli קליפת המוח (הידוע גם בשם גרגרי קליפת המוח, יזם בשלב II), ו vitellogenesis (יזם בשלב III). צמיחת ביצית תושלם במהלך השלב הרביעי, כאשר המיוזה לי קורות חיים, וכתוצאה מכך את פירוק גרעין הביצית, המכונה השלפוחית ​​הנבטיה (GV). לאחר מכן, המיוזה הוא נעצר שוב metaphase השנייה. השלמת צמיחה הביצית ומעצר meiotic בשלב IV מוביל למשל V לשלב בוגרז 9. הסרת קרום הזקיקים מתרחשת במהלך שחרור הביצית לתוך לומן של השחלה 10 והוא חיוני הפריה והפעלה ביצה ראויה. לאחר הביצים נמתחות מאמם במהלך הזדווגות טבעית, הם הופכים הופעלו. דג הזברה, חשיפה למים מספיקה להפעלת ביצה מלאה, ללא קשר לנוכחות של זרע 11. בתנאים במבחנה מאפשר כרגע להבשלה של ביציות משלב מוקדם IV-אשר ניתן לזהות לפי הגודל (690-730 מיקרומטר), בנוכחות GV גדול בעמדה האסימטרית, ואת מראה אטום לחלוטין עקב הצטברות של חלבוני חלמון (איור 2B) A הביצה הבמה V הבוגרת, מאופיינת GV מפורק לחלוטין וחדר מראה שקוף בשל חלמון עיבוד חלבון 12 (איור 2 ג). בגישה זו, כולה שחלות המשךביציות aining בשלבים שונים של פיתוח יוסרו נקבות. ביציות רשאים לפתח 17α-20β-dihydroxy-4 pregnen-3-אחד (DHP), א-גרימת ההתבגרות יעיל הורמון 8. במהלך תקופה זו, ביציות התבגרות ניתן להשפיע באמצעות הזרקה של ביטוי (למשל, הכתיר, במבחנה -transcribed תעתיקי) או לעשות פעולות של גנטיקה סוכנים (למשל, MOS). שכבת הזקיקים לא לשפוך ספונטנית לקראת סוף תקופת ההתבגרות, אז זה חייב להיות מוסר באופן ידני. לאחר defolliculation, הפריה חוץ גופיית מושגת על ידי מפעילת הפעלת ביצה באמצעות חשיפת הביצים למים (נוכח עוברי (E3 בינוני)) 13 ו פתרון זרע. Zygotes וכתוצאה לעבור התפתחות עוברית ולאפשר בהערכת היכולת של טיפולים כדי לתפעל תפקוד גן אימהי והן עבור להדמיה והניתוח של מוצרים אימהיים מתויגים ( <strong&gt; איור 3).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Zebrafish mating boxes</td>
			<td>Aqua Schwarz</td>
			<td>SpawningBox1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4-7H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>63138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Western Chemical</td>
			<td>Tricaine-D (MS 222)</td>
			<td>FDA approved (ANADA 200-226)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td>to prepare 1 M Tris pH 9.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>920-1</td>
			<td>to prepare 1 M Tris pH 9.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fish net (fine mesh) (4-5 in)</td>
			<td>PennPlax</td>
			<td>(ThatFishThatPlace # 212370)</td>
			<td>available in ThatFishThatPlace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic spoon</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>available in most standard stores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14091-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>SS</td>
			<td>available from Fine Science Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting stereoscope (with transmitted light source)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ645</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reflective light source (LED arms)</td>
			<td>Fostec</td>
			<td>KL1600 LED</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plates 10 cm diameter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes 1.5 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow spatula</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depression glass plate</td>
			<td>Corning Inc</td>
			<td>722085 (Fisher cat. No 13-748B)</td>
			<td>available from Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>06-666-11</td>
			<td>available from Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer stop watch</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash bottle</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>24020500</td>
			<td>available from Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beakers, 250 ml (2)</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>1000250</td>
			<td>available from Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;z L-15 medium</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221465</td>
			<td>for pH&#39;ing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>17alph-20beta-dihyroxy-4-pregnen-3-one (DHP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection Apparatus</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>FemtoJet</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Tubing for injection needles</td>
			<td>FHC</td>
			<td>30-30-1</td>
			<td>or equivalent, Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID with fiber, 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>Model P-87</td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipetor (1-20 &#181;l range) with tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipetor (20 - 200 &#181;l range) with tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipetor (100 - 1000 &#181;l range) with tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes 15ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes 50ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic pipette 10 ml with bulb</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic pipette 20 ml with bulb</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope stage Calibration Slide 0.01 mm</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>MR095</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents for fish water:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Ocean Salt</td>
			<td>Drs. Foster &#38; Smith</td>
			<td>&#160;CD-116528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate (cell culture tested)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents for E3 medium:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2, dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4, heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>63138-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene Blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9140-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fish Food:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frozen brine shrimp</td>
			<td>Brine Shrimp Direct</td>
			<td>FBSFKG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramin Flakes</td>
			<td>Drs. Foster &#38; Smith</td>
			<td>16623</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional manipulation of maternal gene products using in vitro oocyte maturation in zebrafish

אירועים הסלולר המתרחשים בשלבים המוקדמים של התפתחות עוברית חיה מונעים על ידי מוצרי גן נגזר אימהי שהופקדו לתוך הביצית מתפתחת. בגלל האירועים הללו מסתמכים על מוצרים אימהיים אשר בדרך כלל לפעול בקרוב מאוד לאחר ההפריה-כי preexist בתוך הביצה, הגישות סטנדרטיות ביטוי וצמצום פונקציונלי מעורבות ההזרקה של חומרים כימיים לתוך הביצית המופרית הן בדרך כלל לא יעילות. במקום זאת, מניפולציות כאלה חייבות להתבצע במהלך oogenesis, לפני או במהלך ההצטברות של מוצרים אימהיים. מאמר זה מתאר בפירוט פרוטוקול להבשלה במבחנה של ביציות דג הזברה בשלה הפריה חוץ גופית הבאים שלהם, מניב עוברים קיימא כי לבגרות. שיטה זו מאפשרת המניפולציה הפונקציונלית של מוצרים אימהיים במהלך oogenesis, כגון הביטוי של מוצרים עבור הצלת פנוטיפי ו להדמית מבנה מתויג, כמו גםזה הפחתה של תפקוד הגן באמצעות סוכנים-גנטיקה הפוכה.

כדי לקבוע אם ההליך המתואר לעיל מצליח, העוברים ניתן להבחין בשלבים המחשופים כדי לאשר את המראה של דפוס המחשוף הסטריאוטיפי מוקדם העוברי 18, כמו גם 24 שעות לאחר הפריה (hpf) כדי לאשר את ההתפתחות התקינה תכנית הגוף הבסיסית. הליך זה מאפשר המניפולציה של מוצרים אימהיים ללימודים תפקודיים באמצעות ההזרקה של חומרים כימיים, כגון תעתיק ו MOS, במהלך פיתוח ביצית. מניפולציה של מוצרים אימהיים ללימודים תפקודיים: קידוד mRNA עבור wild-type ומוצרים מוטציה ניתן להזריק לתוך מבחנה ביציות התבגרות כדי לבדוק את ההשפעה של המניפולציה של תפקוד הגן האימהי במהלך המיוזה ואת בשלבים עובריים מוקדמים. לדוגמא, עובר wild-type ניתן להזריק עם אינטרנטmRNA LD-הסוג כדי לבדוק את ההשפעה של ביטוי יתר של מוצר, או עם RNA המוטציה לבדוק דומיננטיות פוטנציאל (למשל, לזכות של פונקציה ו antimorphic) תופעות בתהליכים אלה. ביציות בתרבות במבחנה מסוגלות לייצר חלבון מ- mRNA אקסוגניים ברחבי פיתוח ביצית, כפי שמוצג על ידי הביטוי של GFP מ- mRNA המוזרק, אם כי רק ביציות כי ליזום תנאי תרבות בשלב IV של oogenesis יכולה להתפתח ביציות V לשלב בוגר (איור 2B -2D, ראה גם יאיר ואח. 3). הביטוי של מוצר מסוג פרא דרך mRNA מוזרק גם אינסטרומנטלי למען הצלתה של מוטציות אימהי-אפקט לאשר זהות הגן במהלך שיבוט מיקומית 3, 24. במקרה זה, ה- mRNA מסוג פרא מוזרק לתוך ביציות מנשים מוטציה הומוזיגוטים לבדוק אם מוצרים מסוג פרא יכול להציל את פנוטיפ מוטנטי. זו הצלה גנטית מתוארת &lt;strong&gt; איור 3A-3C, שבו מוזרק mRNA AurB מוצג להציל את ההשפעות פנוטיפי של מוטציה בגן המקביל שלה, האי הסלולר (CEI) (איור 3A-3C). העוברים מקבוצה מלאה מותר גם לפתח להראות את פנוטיפ מוטנטי המקביל 3. RNA Mutant ניתן להזריק גם לתוך ביציות מוטציה כדי לבדוק אם המוצר מוטציה שומרת פונקציה חלקית על ידי השוואת מידת הצלה לנזקים שנגרמו עקב המוצר wild-type. ביטוי חלבון מן mRNA מוזרק לתוך ביציות מתפתחות נראה להתרחש עם עיכוב מעט או ללא. ביטוי GFP החזק הוא ציין בתוך 2 h של ההזרקה של ה- mRNA המתאים, ללא קשר לשלב ההתפתחותי של ביצית 3 (איור 2B-2D; ראה גם תאיר ואח 3.). מוצרים כגון mCherry:Sas6 ו Birc5b (Motley): GFP ניתן להבחין מיד לאחר ההפריה ובמהלך מחזור התא העוברי הראשון 3, 25. ההזרקה של ה- mRNA במהלך oogenesis גם מובילה את הייצור של חלבון זה, ללא קשר המחצית המתויגת התמזגה, הוא פונקציונלי מייד לאחר הפריה, כפי שמוצגים במקרה של מוצרים אימהיים עבור אי הסלולר / 3 aurB, מחזור עקר / lrmp 24, ו מוטלים / bir5b 25. תרגום-חסימת גם MOS השפעה מיד לאחר ההפריה, כפי שמוצג על מחזור עקר / Lrmp 3 ו בשלבים מאוחרים יותר של העובר, כמו במקרה של משימה בלתי אפשרית / dhx16 3. אחוי-חסימת MOS, כאשר מוזרקים ביציות התבגרות, אולי לא יהיה השפעה על תפקוד אימהי, ככל הנראה עקב שכבר כיום תעתיק אימהי בוגר ביציות בשלב IV &lt;sup class = &quot;Xref&quot;&gt; 3. דור של morphants: בעת שימוש MO המתאים גן עם מוטציה כבר-מזוהה, פנוטיפ morphant צפוי לחקות את פנוטיפ מוטנטי. Morphants מושווה עובר uninjected ולאלה מוזרקים עם סטנדרט, לשלוט MO. הזרקה של morpholino חסימת התרגום מצליח phenocopy את פנוטיפ מוטנטי ידוע 3, כפי שמוצג על ידי הזרקה של Lrmp MO לתוך ביציות, אשר מחקה את פנוטיפ מוטנטי של המוטציה המקביל, מחזור סרק (איור 3D-F). הספציפי של MOS ניתן לקבוע באמצעות אותו הגישות בשימוש בעת הזרקת MOS לעוברים (שנבחן בעבר) 19, 20. ביטוי של חלבוני היתוך שכותרתו fluorescently: mRNA קידוד למוצרי הגן של עניין התמזגו חלבוני ניאון (למשל, ה- GFP ו mCherry) יכול גם להיות מוזרק לתוך או wild-type או ביציות מוטציה לדמיין את המוצרים המתאימים בתוך העובר מוקדם (כלומר, המשקף דפוס לוקליזציה subcellular; איור 3G ו 3H). תעתיקי קידוד עבור תערובות דומות אך מעורבי האלל המוטנטי יכולים לבוא לידי ביטוי באופן דומה כדי לבדוק אם המוטציה משפיעה בשום localizations התת-תאי פוטנציאל. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55213/55213fig1.jpg" /> איור 1: In Vitro הביצית הבשלה. תרשים סכמטי המציג את השלבים השונים הכרוכים הבשלת הביצית במבחנה. נקבות בוגרות הם שנבחרו מראש על-נחת ביצה 8 ימים לפני ההליך, כדי לטהר אותם ביצים שכבר התבגרו וכדי פרוMote פיתוח ביצית חדש. השחלות, המכילה ביציות מתפתחות, יוסרו נקבות והועברו מדיום המכיל את DHP ההורמון לגרום הבשלת ביצית במבחנה. לאחר ההסרה מן הנקבות ומייד לפני או במהלך הבשלת ביצית, ביציות ניתן להזריק עם מוצרי RNA ריאגנטים אחרים עבור המניפולציה התפקודית של גורמים אימהיים. ביציות בוגרות הם defolliculated ידני מופרים במבחנה עם פתרון זרע להניב עוברים מופרים, קיימא. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55213/55213fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55213/55213fig2.jpg" /> איור 2: In Vitro ביצית בשל ביטוי של מוצרי מ- mRNA המוזרק. (א) ביציות בשלבי I-III, שנצפו שחלותנקבות 4 ימים שלאחר טיהור (DPP). (ב) ביציות בשלב IV, שנצפו שחלות מהנקבות.&quot; 8 DPP. השלפוחית ​​הנבטיה (GV, ראש החץ) נראית בבירור ואת תופסת תפקיד אקסצנטרי. השלב השלישי ביציות ב (א) גם להפגין GV ברורה ממבט ראשון, אבל הוא נמצא מרוכז בתוך הביצית. ביציות שלב IV ב (ב) יש גודל כי הוא קרוב מירבית בהשוואה לזו של ביציות בוגרות ב (ג). (C ו- D) ביציות בשלב V (להבשיל ביציות) לאחר 2 h בתנאים הבשלה במבחנה יזם בשלב IV, כמו (B), והזריקו במהלך ההתבגרות עם קידוד GFP, במבחנה עיבד ה- mRNA (C, האור הנראה רק; D, כיסוי של האור הנראה הקרינה GFP). GV היא כבר לא נראית לעין ביציות בשלב V, אשר גם פחות אטום מאשר ביציות בשלב IV. ביציות מוזרקות לבטא חלבון ה- GFP (D). Defolliculation של ביציות בשלב IV בוגרות היא described בסעיף בפרוטוקול. סרגל קנה מידה = 300 מיקרומטר. כל לוחות הועתקו, באישור, מן נאיר ואח 3. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55213/55213fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55213/55213fig3.jpg" /> איור 3: שיבושים ו ויזואליזציה של מוצרים אימהיים דרך במבחנת ביצית בשלה. (A - C) החילוץ של פנוטיפ אימהי-השפעה הנגרמת על ידי מוטציה B סלולר האי / אורורה באמצעות הזרקה של mRNA מסוג פרא aurB לתוך ביציות בשלב IV CEI / aurB. תמונות ממוזגות מראות נוף חיה של 65 blastodiscs MPF הקבוע, דמיין עם נוגדנים אנטי-האס-קטנין להדגיש ממברנות (ירוק), נוגדנים אנטי-α-טובולין כדי לציין מיקרוטובולים (אדום), ו DAPI לייעד DNA (כחול). (א) הצטברות β-קטנין בעוברים מהסוג פרא, מעידה על התבגרות תלם נורמלית. (ב) העובר CEI / aurB מן הביצית בשלב IV uninjected CEI / aurB מציגה התלמים חלקית, בסיסי אשר אינם צוברים β-קטנין. (ג) הצילה CEI / עובר aurB מן ביצית CEI / aurB הוזרקה mRNA מהסוג פרא aurB מראה הצטברות β-קטנין חזקה בבית התלמים. (D - F) Phenocopy של אפקט אימהי הנגרמת על ידי מוטציה מחזור עקר / lrmp מן הזרקה של Lrmp morpholino לתוך הבמה IV ביציות. תמונות ממוזגות מראות נוף חיה של 70 blastodiscs קבוע MPF, דמיין עם נוגדנים אנטי-γ טובולין כדי לציין centrosomes (אדום) ו DAPI לייעד DNA (כחול). (ד) עובר מסוג פרא, כל מקורביו גרעין עם טובולין γ, סמן חומר centrosomal. (E) ב מוטנטים FUE אימהי-השפעה, פיוז&#39;ן pronuclear נכשל, וכתוצאה מכך בשתיים עד שלוש מדבקות תוויות DNA התואמות-גרעינים פרו הורית unfused וגוף הקוטב עבור המיוזה השנייה. (ו) morphants Lrmp, שבו הפונקציה Lrmp אימהי מעוכבת, גרעינים להיכשל באופן דומה לחלק ובנוסף, אינם מקשרים עם טובולין γ. (G ו- H) ויזואליזציה של המוצר אימהי המיוצר בעובר המוקדם. Sass6-mCherry חלבון מ- mRNA אקסוגניים מוזרק לתוך הבמה IV ביציות מבצע לוקליזציה של צנטריול. תמונות ממוזגות מראות נוף חיה של 40 blastodiscs קבוע MPF, דמיין עם נוגדנים אנטי-γ טובולין להדגיש centrosomes (ירוק), קרינת mCherry כדי לציין Sass6 (אדום), ו DAPI לייעד DNA (כחול). (G) הביע Sass6-mCherry חלבון מבצע לוקליזציה של מוקדים שכותרתו ידי הסמן centrosome γ טובולין באתרי איגוף הגרעין (חיצים). (H </stתמונה זהה רונג&gt;), מראה רק Sass6-mCherry ו DAPI לבהירות. את העוברים (G ו- H) הם קבועים, אבל הקרינה של מוצרים הביעו, כגון תערובות mCherry, יכולה להיות גם ציינה עובר לחיות (לא מוצג). בר סולם = 100 מיקרומטר AF ו 10 מיקרומטר G ו- H. כל לוחות הועתקו, באישור, מן נאיר ואח 3. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55213/55213fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שלבי oogenesis </td><td> ביצית קוטר (מיקרומטר) </td><td> ציון דרך מפתח (ים) </td></tr><tr><td> 1A - Prefollicle </td><td> 7 עד 20 </td><td> ייזום של שעתוק פעיל, הצטברות של nucleoli </td></tr><tr><td> 1B - זקיק </strong&gt; </td><td> 20 כדי 140 </td><td> Decondensation של הכרומוזומים </td></tr><tr><td> שני - נֹאדִית קורטיקלי </td><td> 140 כדי 340 </td><td> ייצור alveoli קורטיקלי </td></tr><tr><td> III - Vitellogenesis </td><td> 340 כדי 690 </td><td> החשכת ooplasm ידי הצטברות של חלבון ושומנים חלמון מבשר </td></tr><tr><td> IV מוקדם - הבשלת הביצית </td><td> 690 כדי 730 (טווח תחתון) </td><td> לוקליזציה אסימטרית של שלפוחית ​​נבטיה </td></tr><tr><td> IV מוקדם - הבשלת הביצית </td><td> 690 כדי 730 (טווח עליון) </td><td> שלפוחית ​​רמינל נעלמת, מעצר בבית metaphase II </td></tr><tr><td> V - ביצית למבוגרת </td><td> ~ 750 </td><td> Ooplasm / חלמון הופך שקוף </td></tr></tbody></table> טבלה 1: ציוני דרך של התפתחות הביצית זברהדג.

Watch this Scientific Journal Video about Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish at JoVE.com

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

פרוטוקול אופטימיזציה עבור הבשלה חוץ גופית של ביציות דג הזברה המשמש מניפולציה של מוצרים הגן האימהי מוצג כאן.

מניפולציה פונקציונלית של מוצרים אימהיים הגן באמצעות<em&gt; במבחנה</em&gt; הבשלת ביצית דג הזברה

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into ...

functional-manipulation-maternal-gene-products-using-vitro-oocyte

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

11.3K Views.  University of Wisconsin-Madison.  פרוטוקול אופטימיזציה עבור הבשלה חוץ גופית של ביציות דג הזברה המשמש מניפולציה של מוצרים הגן האימהי מוצג כאן. 

Video: Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during oogenesis. In order to study roles of such maternal factors in early embryonic development, it is desirable to manipulate their functions from the very beginning of embryonic development. Conventional ways of gene interference are achieved by injection of antisense oligonucleotides (oligos) or mRNA into fertilized eggs, enabling under- or over-expression of specific proteins, respectively. However, these methods normally require more than several hours until protein expression is affected, and, hence, the interference of gene functions is not effective during early embryonic stages. Here, we introduce an experimental system in which expression levels of maternal proteins can be altered before fertilization. Xenopus laevis oocytes obtained from ovaries are defolliculated by incubating with enzymes. Antisense oligos or mRNAs are injected into defolliculated oocytes at the germinal vesicle (GV) stage. These oocytes are in vitro matured to eggs at the metaphase II (MII) stage, followed by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). By this way, up to 10% of ICSI embryos can reach the swimming tadpole stage, thus allowing functional tests of specific gene knockdown or overexpression. This approach can be a useful way to study roles of maternally stored factors in early embryonic development.

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

We describe methods of manipulating Xenopus laevis immature oocytes, in vitro maturation of oocytes to eggs, and intracytoplasmic sperm injection. This protocol allows degradation of some maternal proteins and overexpression of genes of interest at fertilization, and hence is valuable to study roles of specific factors in early embryonic development.

ומניפולציה<em&gt; במבחנה</em&gt; ההבשלה של<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; ביציות, ואחריו הזרקת Intracytoplasmic זרע, לחקר התפתחות העוברית

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers. To robustly and efficiently identify oncogenic &#8220;drivers&#8221; among these tumors and define their complex relationships with concurrent genetic alterations during tumor pathogenesis remains a daunting task. Recently, zebrafish have emerged as an important animal model for studying human diseases, largely because of their ease of maintenance, high fecundity, obvious advantages for in vivo imaging, high conservation of oncogenes and their molecular pathways, susceptibility to tumorigenesis and, most importantly, the availability of transgenic techniques suitable for use in the fish. Transgenic zebrafish models of cancer have been widely used to dissect oncogenic pathways in diverse tumor types. However, developing a stable transgenic fish model is both tedious and time-consuming, and it is even more difficult and more time-consuming to dissect the cooperation of multiple genes in disease pathogenesis using this approach, which requires the generation of multiple transgenic lines with overexpression of the individual genes of interest followed by complicated breeding of these stable transgenic lines. Hence, use of a mosaic transient transgenic approach in zebrafish offers unique advantages for functional genomic analysis in vivo. Briefly, candidate transgenes can be coinjected into one-cell-stage wild-type or transgenic zebrafish embryos and allowed to integrate together into each somatic cell in a mosaic pattern that leads to mixed genotypes in the same primarily injected animal. This permits one to investigate in a faster and less expensive manner whether and how the candidate genes can collaborate with each other to drive tumorigenesis. By transient overexpression of activated ALK in the transgenic fish overexpressing MYCN, we demonstrate here the cooperation of these two oncogenes in the pathogenesis of a pediatric cancer, neuroblastoma that has resisted most forms of contemporary treatment.

The goal of this study is to demonstrate how the mosaic transgenesis strategy can be used in zebrafish to rapidly and efficiently assess the relative contributions of multiple oncogenes in tumor initiation and progression in vivo.

פסיפס דג הזברה Transgenesis לניתוח הגנום פונקציונלי של גנים שיתופיים מועמד בפתוגנזה גידול

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers.  To robustly and efficiently ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

ניתוח של יושרה שריר שלד דג הזברה זחלים עם אוונס הכחול צבע

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in abundance, may not be secreted but tethered to the signaling cell(s), or may require the presence of binding partners or upstream regulatory molecules. Thus in a search for gene products capable of eliciting an early lens-inductive response in competent ectoderm, we utilized an expression cloning system that would allow identification of paracrine or juxtacrine factors as well as transcriptional or other regulatory proteins. Pools of mRNA were injected into Xenopus oocytes, and responding tissue placed directly on the oocytes and co-cultured. Following functional cloning of ldb1 from a neural plate stage cDNA library based on its ability to elicit the expression of the early lens placode marker foxe3 in lens-competent animal cap ectoderm, we characterized the mRNA expression pattern, and assayed developmental progression following overexpression or knockdown of ldb1. This system is suitable in a very wide variety of contexts where identification of an inducer or its upstream regulatory molecules is sought using a functional response in competent tissue.

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

We describe a Xenopus oocyte and animal cap system for the expression cloning of genes capable of inducing a response in competent ectoderm, and discuss techniques for the subsequent analysis of such genes. This system is useful in the functional identification of a wide range of gene products.

שיבוט פונקציונלי שימוש<em&gt; Xenopus</emמערכת ביטוי ביצית&gt;

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, specifically the generation of homozygous gynogenetic diploids is useful in genetic analysis because it allows the direct production of homozygotes from a single heterozygous mother. This article describes a modified protocol for ploidy duplication based on a heat pulse during the first cell cycle, Heat Shock 2 (HS2). Through inhibition of centriole duplication, this method results in a precise cell division stall during the second cell cycle. The precise one-cycle division stall, coupled to unaffected DNA duplication, results in whole genome duplication. Protocols associated with this method include egg and sperm collection, UV treatment of sperm, in vitro fertilization and heat pulse to cause a one-cell cycle division delay and ploidy duplication. A modified version of this protocol could be applied to induce ploidy changes in other animal species.

A modified protocol for ploidy manipulation uses a heat shock to induce a one-cycle stall in cytokinesis in the early embryo. This protocol is demonstrated in the zebrafish but may be applicable to other species.

מניפולציה ploidy של עוברי דג הזברה עם חום 2 הלם טיפול

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, ...

Maturation of Human Stem Cell-derived Cardiomyocytes in Biowires Using Electrical Stimulation

Human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hPSC-CMs) have been a promising cell source and have thus encouraged the investigation of their potential applications in cardiac research, including drug discovery, disease modeling, tissue engineering, and regenerative medicine. However, cells produced by existing protocols display a range of immaturity compared with native adult ventricular cardiomyocytes. Many efforts have been made to mature hPSC-CMs, with only moderate maturation attained thus far. Therefore, an engineered system, called biowire, has been devised by providing both physical and electrical cues to lead hPSC-CMs to a more mature state in vitro. The system uses a microfabricated platform to seed hPSC-CMs in collagen type I gel along a rigid template suture to assemble into aligned cardiac tissue (biowire), which is subjected to electrical field stimulation with a progressively increasing frequency. Compared to nonstimulated controls, stimulated biowired cardiomyocytes exhibit an enhanced degree of structural and electrophysiological maturation. Such changes are dependent upon the stimulation rate. This manuscript describes in detail the design and creation of biowires.

The cardiac biowire platform is an in vitro method used to mature human embryonic and induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hPSC-CM) by combining three-dimensional cell cultivation with electrical stimulation. This manuscript presents the detailed setup of the cardiac biowire platform.

התבגרות של האדם גזע גזע נגזר Cardiomyocytes ב ביאוירס באמצעות גירוי חשמלי

Human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hPSC-CMs) have been a promising cell source and have thus encouraged the investigation of their ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled by multiple mechanisms that include the Spindle Assembly Checkpoint (SAC). The SAC is part of a complex feedback system that is responsible for prevention of a cell progress through mitosis unless all chromosomal kinetochores have attached to spindle microtubules. Chromosomal lagging and abnormal chromosome segregation is an indicator of dysfunctional cell cycle control checkpoints and can be used to measure the genomic stability of dividing cells. Deregulation of the SAC can result in the transformation of a normal cell into a malignant cell through the accumulation of errors during chromosomal segregation. Implementation of the SAC and the formation of the kinetochore complex are tightly regulated by interactions between kinases and phosphatase such as Protein Phosphatase 2A (PP2A). This protocol describes live cell imaging of lagging chromosomes in mouse embryonic fibroblasts isolated from mice that had a knockout of the PP2A-B56&#947; regulatory subunit. This method overcomes the shortcomings of other cell cycle control imaging techniques such as flow cytometry or immunocytochemistry that only provide a snapshot of a cell cytokinesis status, instead of a dynamic spatiotemporal visualization of chromosomes during mitosis.

This protocol describes an easy and convenient method to label and visualize live chromosomes in mitotic cells using Histone2B-GFP BacMam 2.0 label and a spinning disc confocal microscopy system.

תא חי הדמיה של הפרדה בין כרומוזום במהלך מיטוזה

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell types include enzyme-secreting acinar cells, an arborized ductal system responsible for the transportation of enzymes to the gut, and hormone-producing endocrine cells. 
Endocrine beta-cells are the sole cell type in the body that produce insulin to lower blood glucose levels. Diabetes, a disease characterized by a loss or the dysfunction of beta-cells, is reaching epidemic proportions. Thus, it is essential to establish protocols to investigate beta-cell development that can be used for screening purposes to derive the drug and cell-based therapeutics. While the experimental investigation of mouse development is essential, in vivo studies are laborious and time-consuming. Cultured cells provide a more convenient platform for screening; however, they are unable to maintain the cellular diversity, architectural organization, and cellular interactions found in vivo. Thus, it is essential to develop new tools to investigate pancreatic organogenesis and physiology.
Pancreatic epithelial cells develop in the close association with mesenchyme from the onset of organogenesis as cells organize and differentiate into the complex, physiologically competent adult organ. The pancreatic mesenchyme provides important signals for the endocrine development, many of which are not well understood yet, thus difficult to recapitulate during the in vitro culture. Here, we describe a protocol to culture three-dimensional, cellular complex mouse organoids that retain mesenchyme, termed pancreatoids. The e10.5 murine pancreatic bud is dissected, dissociated, and cultured in a scaffold-free environment. These floating cells self-assemble with mesenchyme enveloping the developing pancreatoid and a robust number of endocrine beta-cells developing along with the acinar and the duct cells. This system can be used to study the cell fate determination, structural organization, and morphogenesis, cell-cell interactions during organogenesis, or for the drug, small molecule, or genetic screening.

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Here, we present a protocol to generate insulin expressing 3D murine pancreatoids from free-floating e10.5 dissociated pancreatic progenitors and the associated mesenchyme.

דור של אינסולין נטולת לגרדום, תלת מימדי לבטא Pancreatoids העכבר אבות הלבלב במבחנה

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart after apex resection or cryoinjury, making it an important model organism for heart regeneration study. However, the lack of loss-of-function methods for adult organs has restricted insights into the mechanisms underlying heart regeneration. RNA interference via different delivery systems is a powerful tool for silencing genes in mammalian cells and model organisms. We have previously reported that siRNA-encapsulated nanoparticles successfully enter cells and result in a remarkable gene-specific knockdown in the regenerating adult zebrafish heart. Here, we present a simple, rapid, and efficient protocol for the dendrimer-mediated siRNA delivery and gene-silencing in the regenerating adult zebrafish heart. This method provides an alternative approach for determining gene functions in adult organs in zebrafish and can be extended to other model organisms as well.

It remains a major challenge to develop conditional gene-knockout or effective gene-knockdown in adult zebrafish organs. Here we report a protocol for performing nanoparticle-mediated siRNA gene-silencing in adult zebrafish heart, thus providing a new loss-of-function method for studying adult organs in zebrafish and other model organisms.

בתיווך Nanoparticle siRNA ג'ין להחרשת בלב דג זברה למבוגרים

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

להמחיש את צומת ואת צלחת Notochordal Gastrulating עוברי העכבר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה כל הר Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...