עבודה זו נתמכה על ידי DP2OD008470 מענק NIH.

הנהלים לעבודה עם עוברי דג הזברה מתוארים בפרוטוקול זה אושרו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים באוניברסיטת נוטרדאם. פתרון ההכנה של 1. רינגר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך פתרון של 116 מ&quot;מ NaCl, 2.9 מ&quot;מ KCl, 3.6 מ&quot;מ CaCl 2, ו 5 Hepes מ&quot;מ עם H 2 O ultrapure באמצעות ערבוב מתמיד כדי למנוע כל משקעים מלח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הוספת מלחים ואילו הפתרון עדיין ערבוב, להוסיף 100 יחידות / פניצילין לכל מ&quot;ל ולכל מיליליטר 100 מיקרוגרם סטרפטומיצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הוספת כל האנטיביוטיקה ומלחים, לבצע עיקור מסנן של הפתרון והחנות במכל סטרילי. הערה: N-Phenylthiourea ניתן להוסיף (1-פניל-2-thiourea) או PTU לפתרון של רינגר לחסום את ההיווצרות של פיגמנט בעוברים מושתלים חרוז ללא השלכות שליליות לבריאות עובר. כדי להכין פתרון החסימה / פיגמנטציה רינגר, להשתמש concentration של PTU 0.003%. בשל הריכוז הנמוך של PTU יש להוסיף מומלץ כי נפח גדול יותר של תמיסת רינגר להתבצע, L לפחות 1, כדי להימנע מהוספת כמויות זעירות של אבקת PTU. להוסיף PTU בשלב 1.2, ואילו פתרון ערבוב. </li></ol> 2. Tricaine פתרון הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 גרם של אתיל-3 aminobenzoate מלח methanesulfonate (Tricaine) לליטר של פתרון בתוספת 0.1 M טריס, ממניות 1 M מאוזנים לpH של 9.5 ועשה עם ultrapure H 2 O. הערה: Tricaine ישמש להרדים את עוברי דג הזברה בנקודת הזמן הרצוי לassay פנוטיפים השתלת חרוז. </li></ol> 3. E3 פתרון הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך פתרון של 0.25 M NaCl, 10 מ&quot;מ KCl, 12.5 מ&quot;מ CaCl 2, ו16.6 מ&quot;מ MgSO 4-1 ליטר מים ultrapure ליצור 1 ליטר של E3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של מתילן בלו לפתרון E3 לעכב פטריית צמיחה. </li></ol>4. מחטי משיכת להעברת Microbead <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש זכוכית בורוסיליקט אש מלוטשת עם נימה בOD: 1.0 מ&quot;מ, מזהה: 0.5 מ&quot;מ, באורך של 10 סנטימטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים זכוכית borosilicated לחולץ micropipette להכין מחטים עדינות. הערה: ארבעה הממדים הבאים יכולים לשמש כנקודת התחלה כדי למשוך את המחטים: החום = 540, משוך = 245, מהירות = 200, והזמן = 125. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שהפיל מספר מספיק של מחטים, חנות בפלסטיק מכוסה פטרי מנות, ממוקמות על רצועות של פלסטלינה או דבק כדי למנוע שבירת קצה המחט, עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקצץ את קצה המחט לגודל הרצוי משעמם, להשתמש זוג מלקחיים בסדר להבקיע סופו של המחט. הערה: גודל שעם מחט ישתנה בהתאם לגודל microbead מנוצל כמו גם העדפות טיפול משתמש. נקודת התחלה טובה היא גדלים נשאו מלאכה בטווח שבין 100 ל -200 מיקרומטר אם microbeads החל 50-100 מיקרומטר ישמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PRIOr להשתמש, להכניס את המחט הגזוז לבעל צינור נימי אופנה מכשיר העברת microbead הושלם. </li></ol> 5. זיף / לאש כלי הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג זיף, להשתלח, או חתיכה עדיין חברה קטנה אחרת של חוט שיער טבעי או סינטטי. חותך ליד הבסיס של החוט בזווית של 45 מעלות. לדבוק הזיף לקצה micropipette P-1000 באמצעות דבק דבק ברור קבוע. </li></ol> 6. Microbead השרשה מגש הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 2 גרם של agarose עם פתרון של E3 100 מיליליטר לעשות 2% agarose ג&#39;ל E3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים את פתרון agarose 2% 1 דקות ו -30 שניות בארלנמייר 250 מיליליטר, מתערבל את הבקבוק כל 30 שניות כדי למנוע את הג&#39;ל ממבעבע מעל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את המכסה של צלחת פטרי x 15 מ&quot;מ 60 מ&quot;מ ומניח אותו בצלחת גדולה יותר 150 מ&quot;מ x 15 מ&quot;מ עם הפנים כלפי מעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את הג&#39;ל agarose החם לתוך צלחת פטרי x 15 מ&quot;מ 150 מ&quot;מ, והקפד לעגן אתהמכסה של הצלחת קטנה עם האצבע. הערה: אפשר בשכבה דקה של agarose מתחת למכסה של הצלחת קטנה יותר כדי להסיר עיבוי שיהווה בעת מזיגת ג&#39;ל; זה יהפוך את חרוזים קלים יותר לראות תחת מיקרוסקופ לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כagarose מתקרר, אבל לפני שהוא מבצרים, למקם את התבנית היטב בג&#39;ל. זה יאפשר למיקום קל של העוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב: על מנת למנוע בועות בבארות, הנח את התבנית לאט בזווית עד שהוא צף על גבי ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות microspatula, להסיר בזהירות את התבנית היטב פעם ג&#39;ל יש הקרושה. להוסיף פתרון E3 ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. </li></ol> אוסף 7. העובר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תאי הזדווגות, מופרדים על ידי מחיצות, על ידי מילוי אותם עם מים במערכת, ולאחר מכן הצבת זכר בוגר דג הזברה (ים) וזוגות נשים (ים) בתאים O / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף ביצים מופרות באמצעות מסננת רשת תיל דקה (שלבים עובריים ישתנו מעט). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפקיד את הביציות המופרות ב, צלחת פטרי בקוטר 10 סנטימטרים נקייה על ידי הפיכת המסננת הפוכה ושטיפתו עם זרם עדין של E3 עד אין ביצים שנותרו במסננת, ויש כ 25 מיליליטר של תמיסת E3 בצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר איסוף, לחלק את הביצים לכמה מנות (כ 50-60 ביצים לכל צלחת), כדי למנוע צפיפות, אשר עלול להוביל לאי-סנכרון התפתחותית בתוך המצמד ולעשות איסוף נקודות פעמים הרצויות קשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עובר בפתרון E3 על 28.5 מעלות צלזיוס, כדי לאפשר הערכה התפתחותית על פי סדרת בימוי דג הזברה סטנדרטית 40. הערה: עובר צריך להיות מועבר לE3 / PTU ב 24 שעות שלאחר הפריה (hpf) כדי למנוע התפתחות פיגמנט אם מניפולציות בשלבים מבוגרים מחייבות בהירות אופטית. </li></ol> 8. חרוז השרשה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה microbeads בריכוז מולקולת מבחן רצוי או של הרכב המקבילolution למועד שנקבע בנפח מתאים. הערה: החוקר יכול להשתמש בכלים סטריליים פטרי הנעים 3-6 סנטימטר קוטר, או צלחות רב גם, אשר שניהם מאפשרות הדמיה של microbeads בתוך הפתרון. זמן עשוי להשתנות בהתאם לסוג והכמות של מולקולה של עניין, והחוקר צריך להתייחס ליצרן או המלצות שפורסמו לתקופת דגירה והיבטים אחרים, כגון רגישות לאור וטמפרטורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שעובר הגיע לנקודת הזמן ההתפתחותי הרצויה, להסיר את העוברים מchorions שלהם באמצעות מלקחיים בסדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עובר בפתרון רינגר המסונן עם אנטיביוטיקה במשך 10 דקות כדי להסתגל להם הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד עוברי הסתגלות, להעביר את microbeads לתוך צלחת microbead שוכנת בתוך מגש ההשתלה ולשטוף אותם בפתרון רינגר במשך 10 דקות. הערה: שתל חרוזים בתוך 50 דקות לאחר שהגיע נקודה זו. w זהחולה להקטין את הסבירות לכך שאחד יהיה להשתיל חרוז עם ריכוז קטן של המולקולה של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערך העוברים לתוך הבארות של מגש השתלת microbead, דואג לכוון אותם כל כך באזור של עניין שבו microbead יהיה מושתל הוא נגיש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך קטן בעובר באמצעות מחט טונגסטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את microbead על העובר באמצעות פיפטה העברת microcapillary: מדכאת את הנורה של פיפטה, משוך בעדינות את microbead לטור הנימים, ולאחר מכן שחרר את הלחץ להעביר את microbead ביעד הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכלי זיף / שוט כדי למקם את microbead בתוך העובר. הערה: הקפד למקם את microbead לתוך הרקמה מהאתר של חתך כך microbead לא יגורש מן העובר כפי שמרפא. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

במאה השנים האחרונות, את ההבנה של דפוסי תכנית הגוף וorganogenesis עברה התקדמות מונומנטלית. טכניקות מניפולציה רקמה היו קריטיות בחשיפת מידע חשוב על תהליכים החיוניים אלה. הנדסה גנטית היא אחת מהשיטות הנפוצות ביותר לבירור תפקוד גן, ושיטות ניתוח פסיפס, כגון השתלת תאים, מספקות גישות שימושיות להבין אוטונומיה של תפקוד גן. השתלת Microbead מספקת מקום אחר לחקור כיצד מולקולות מסוימות לשנות דינמיקה התפתחותית, כשיטת זו מאפשרת לחוקר לשנות סביבת רקמות מקומית על ידי החדרת מולקולות או מעכבי איתות. מגוון של microbeads שונה זמין מסחרי, שבגדלים שונים ומאפיינים פיזיים אחרים קיימים (למשל, תשלום) כך שהם יכולים להיות מועסקים על מנת לתנאי הניסוי של עניין. לכן, על ידי השתלת microbeads שהם ספוגים בחלבון או חמיקאל של עניין בתוך האורגניזם, חוקרים יכולים לחקור השפעות מקומיות במהלך פיתוח ולמצוא קשרים בין הגן או המולקולה של עניין ופנוטיפ המסוים הביולוגי (ים). מחקרים כמו זה שבוצע על ידי ואדה ועמיתיו השתמש השתלת microbead כדי להעריך את ההשפעה של איתות הקיפוד גדל בדפוסי שלד בneurocranium הקדמי (ANC) בדג הזברה 23. מחקרים קודמים הראו כי שישה נדרשים להיווצרות ANC 14. חוקרי microbeads מצופה ששש שימוש זיהו שאות זו מקדמת היווצרות סחוס בANC. תהליך השתלת microbead שימש כדי להדגים קשר ברור בין איתות הקיפוד והיווצרות סחוס בANC. דוגמא נוספת מפתח של טכניקת המניפולציה רקמה זו בדג הזברה הוא ציינה במחקרים שבם מדענים חקרו את שליטת תעתיק של Erythroblastoma עשרים והשש f (ETS) תחוםמולקולה קשורה-ETS שחקנים (ERM) וactivator Polyoma משפר 3 (Pea3) על ידי איתות FGF במהלך התפתחות מוח דג הזברה מוקדמת 19. באמצעות ניסויי השתלת microbead, הם הצליחו להראות שFgf8 וFgf3 ectopically יכולים להפעיל ביטוי של ERM וpea3. הדוגמות הללו ממחישות את התועלת של microbeads לספק תובנות מנגנוני ההתפתחות שמשתפים פעולה במהלך היווצרות רקמה, שיכול להיות מאופיין היטב על ידי השימוש בשיטות להערכת ביטוי גנים 41. לפיכך, השתלת microbead יכולה להיות שיטת קיימא לחקור רקמות אחרות, כגון המזודרם ביניים (IM) אשר נותן עלייה לכליות. באופן ספציפי, זה יסייע במחקרים התפתחותיים כליות, כדי לחקור כיצד מולקולות שונות משפיע נפרון פילוח 42 וtubulogenesis 43,44, תהליכים שהם הבינו רק באופן שטחי בהווה. יתר על כן, השתלת microbead החלה לשמש להרבעהתהליכי התחדשות y בדג הזברה 29] ויכולים להיות מותאמים לשימוש עם כל מספר של דגמי התחדשות איבר, כגון אבלציה הלייזר הבאה של רקמות עובריות כמו נפרון 45 או בשילוב עם שיטות שגובשו לבצע מחקר עם המבנים המבוגרים המקבילים 46-49. לבסוף, יש השתלת microbead הפוטנציאל לשמש במודלים של מחלות אנושיות, כגון סרטן 50,51 או רקמת ניוון 52,53. בפרוטוקול הנוכחי, אנחנו מדגימים את השיטה של השתלת microbead בעוברי דג הזברה, שגם תוארה באופן דומה על ידי חוקרים אחרים, אבל לא הראתה באמצעות פרוטוקולי וידאו 1. בעזרת תרגול מינימאלי הצלחנו להשתיל microbeads בשיעור של כ 8-10 עוברים / שעה, המתייחס הכדאיות של הליך זה פעם אחת החוקר יש קצת ניסיון. התוצאות הראו במסמך זה מדגימות חרוזים של ד השוניםיכול להיות מושתל imensions בשלבים מוקדמים, וכי עם טיפול, טכניקת מניפולציה רקמה זו יכולה להיות מיושמת עם הפרעה פיזית מינימאלית לעובר. שיפור אחד שיש להדגיש הוא השימוש בכלי זיף / שוט כדי למקם את microbead לעובר. חתיכה זולה יחסית ופשוטה זו של ציוד היא בערך באותו הקוטר כמו microbead, קל להשיג ומסייע להאיץ את תהליך ההשתלה. הזיף / השוט ניתן לחתוך לאורך רצוי כדי לייצר חברה עדיין כלי טיפול בחרוז עדין, תלוי במיומנות חוקר והעדפה. לבסוף, בעוד שתארנו כאן כיצד לתפעל פיזי microbeads ועוברי דג הזברה לבצע השתלה, פרוטוקול זה אינו מתאר נהלי טיפול ספציפיים לסמים או פפטידים שונים. באופן כללי, צריך להיות מושתל microbeads טיפול כימי לבעלי החיים עם האינטרס של המשטר, כדי למנוע תופעות לא רצויות באזורים אחרים של האורגניזם, וחוקרים צריכים להיות גם בנוצר על חששות בטיחות האפשריים הקשורים בכימיקלים כגון לפני ביצוע מחקריהם. לסיכום, יש לנו הפגנו שיטת השתלת microbead יחסית פשוטה ויעילה עם מגוון רחב של יישומים תוך שימוש בחומרים שאינם זמינים במעבדה. סופו של דבר, אנו מקווים שמדריך זה יסייע לחוקרים הטבע העדין של מניפולציה רקמות דג הזברה.

חוקרי ביולוגיה התפתחותית לנצל מגוון רחב של שיטות סלולריות, מולקולריות, וגנטיות לחשוף את המנגנונים ששולטים באופן האורגניזם נוצר. בין גישות אלה, מניפולציה רקמות היא כלי מרכזי בפענוח שאלות מורכבות על גורל תא, תנועה סלולרית, והארגון של רקמות. דרך אחת לשנות סביבות רקמות מקומיות היא באמצעות היישום כירורגית של microbeads המשמשים כדי לספק מקור מוקד של חלבונים או מולקולות איתות אחרות 1. סוג זה של מניפולציה ניסויית יושם באופן נרחב במודלים קלאסיים חוליות אמבריולוגיה, כגון צפרדע וחומוס 2. דג הזברה הפכה אורגניזם מודל חוליות חשוב לחקר organogenesis וגם מספקת יתרונות רבים ייחודיים לדוגמנות מחלה 3-5 כפי שהם חולקים שימור גנטי גבוה עם בני אדם 6. ב, השקיפות האופטית מסוימת ולשעברפיתוחן פנימי של עובר דג הזברה מציע נקודת מבט שאין כמוהו לתצפית של ontogeny הרקמה 3-5. היישום של מסך גנטי קדימה בקנה מידה גדולה יצר מאגר עוצמה של זנים מוטנטים דג הזברה למחקר נוסף 7,8, וזיהוי של טכניקות הקרנה חלופיות שניתן לבצע ביעילות בקנה מידה מופחתת במעבדות בודדות 9,10. בהמשך עבודה ניסויית עם דג הזברה כבר מתאפשרת באמצעות התקדמות בשיטות מהונדסים גנטיות ולהפוך גישות 11,12, כמו גם גנטיקה כימית 13-15. טכניקות מניפולציה רקמה, כגון היישום של microbeads, לא היו מועסקים באופן נרחב בדג הזברה, אבל בכל זאת לספק כלי שימושי להבנה נוספת איתות תא במהלך התפתחות. השתלת Microbead נעשתה שימוש כדי לחקור את תהליכי היווצרות של איבר ברשתית דג הזברה16,17, 18 לב, מוח 19-22, עצבי פסגה 23, ו24,25 סנפיר. במחקרים אלה ואחרים, חרוזים יושמו במהלך ההתפתחות להבין את דיפוזיה של מולקולות איתות 26, איך להשפיע הדרגתיים תא הגירה 27 ודפוסים צירי 28. לאחרונה, microbeads כבר נוצל כדי להעריך מנגנוני התחדשות במבוגרים דג הזברה 29. במחקרים התפתחותיים, למשל, עבודת microbead דג הזברה סיפקה תובנות לתוך מנגנוני היווצרות איבר באמצעות מחקרים של 25 סנפיר החזה. ניצן סנפיר חזה דג הזברה הוא הומולוגי לניצן forelimb ב -30 העכבר וחומוס 31. יש ניצן איבר חוליות שני צמתים איתות חיוניים: אזור פעילות קיטוב (ZPA) שקובע את הציר הקדמי-אחורי ל- דרך הביטוי של קיפוד סוניק (ששש) ומטרות גן קופסא מבנה במורד הזרם,ורכס ectodermal הפסגה (AER) נכח בקצה איבר הניצן, הפועל להקמה הפרוקסימלי לזהות הדיסטלי של האיבר דרך ביטוי של גורמי גדילת פיברובלסטים (Fgfs). על ידי השתלת microbeads FGF נספג מוטציות גנטיות ששש דג הזברה, חוקרים זיהה FGF כחיוני להתקדמות מחזור התא והצמיחה של איבר החוליות 25. בנוסף ל מפלים FGF ושש מאותת כי לבסס את זהות positional, מחקריו החלוציים באמצעות ניצן איבר החומוס מזוהה חומצה רטינואית (RA) כמולקולה שיכול לחקות את הפעולה של אזור הקיטוב להקים קדמי לאחוריים זהות 32. ניסויים אלה מעורבים הצבת רצועות קטנות של נייר Whatman ספוג-RA לאיבר החומוס להעריך דפוסי ספרה 32. יתר על כן, חוקרים ביצעו מחקרים אלגנטיים אחרים המעסיקים את השימוש בmicrobeads, השתלת תאים, ואקסוגנייםטיפולי דלקת מפרקים שגרונית בדג הזברה לקבוע כי RA פועל למתן רמזי positional ארוך טווח במוח האחורי והמזודרם 28 דג הזברה. עם זאת, כיום שאלות רבות נותרו על התפקידים של איתות גורמים כמו FGF ודלקת מפרקים שגרוני בהיבטים רבים של פיתוח חוליות. השפעות האיתות של דלקת מפרקים שגרונית, מתנהג כמו מורפוגן, להשפיע איברים רבים 33, כמו לב פיתוח 34 ואבות הכליות, דלקת מפרקים שגרונית שבי מציין תאי כליה הפרוקסימלי הקלד גורל 35-39. הבנה נוספת של נושאים כגון יכולה להפיק תועלת משמעותית ממחקרי ניסויים תוך שימוש בטכניקות מניפולציה רקמות והשתלת microbead. בעוד פחות מחקרים שבוצעו עם השתלת microbead בדג הזברה, בהשוואה לדגמים כמו החומוס, אלה שבוצעו היו מאוד אינפורמטיבי. אחת סיבות למיעוט השתלת microbead המבוסס על מחקר בעובר דג הזברה היא likely הרעיון שיש אתגרים טכניים קשים, בהתבסס על הגודל של העובר, המהווה מכשול לביצוע מניפולציות בהצלחה כזו. עם זאת, השתלת microbead בעוברי דג הזברה ניתן ללמוד עם תרגול וסיוע באמצעות תצפית חזותית של הטכניקה, ולכן יכולה להיות רדוף כאמצעי לחקור את המנגנונים של פיתוח. הנה, אנחנו מדגימים את היישום המדויק של microbead לעובר דג הזברה, אשר יכול להיות מנוצל לביצוע מגוון רחב של מבחני על היווצרות רקמה והמורפוגנזה סלולרית.

<table><tbody><tr><td>Sodium Chloride</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB01915</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB01652</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00366</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Life Science</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333-20ML</td><td></td></tr><tr><td>N-Phenylthiourea (PTU)</td><td>Aldrich Chemistry</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate (Tricaine)</td><td>Fluka Analytical</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td>BF100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown Micropipette puller</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td>Mo. P097</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Methylene Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td></td></tr><tr><td>250 ml Erlenmeyer Flask</td><td>Fischer Scientific</td><td>FB-500-250</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25373-085</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25373-100</td><td></td></tr><tr><td>150 mm x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25373-187</td><td></td></tr><tr><td>Saint-Gobain Chemware Microspatula</td><td>Fischer Scientific</td><td>21-401-50B</td><td></td></tr><tr><td>P-1000 Micropipette tips</td><td>Fischer Scientific</td><td>2707402</td><td></td></tr><tr><td>Low Temperature Incubator</td><td>Fischer Scientific</td><td>11 690 516DQ</td><td></td></tr><tr><td>Dimethly Sulfoxide</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00435</td><td></td></tr><tr><td>Microbeads (45-106 &amp;micro;m)</td><td>Biorad</td><td>140-1454 AG1-X8</td><td></td></tr><tr><td>Microbeads (45 &amp;micro;m)</td><td>Polysciences</td><td>7314</td><td></td></tr><tr><td>Micro Dissecting Tweezer</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5010</td><td></td></tr><tr><td>Tungsten Needle</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-6065</td><td></td></tr><tr><td>Capillary tube holder</td><td>Globe Scientific Inc.&amp;nbsp;</td><td>51674</td><td></td></tr></tbody></table>

microbead implantation in the zebrafish embryo

דג הזברה התפתחה כמערכת מודל גנטית יקרת ערך לחקר ביולוגיה ומחלות התפתחותיות. דג הזברה לשתף רמה גבוהה של שימור הגנומי, כמו גם דמיון בתהליכים תאיים, מולקולריים, ופיסיולוגיים, עם חוליות אחרות כולל בני אדם. במהלך ontogeny המוקדם, עוברי דג הזברה הם שקופים אופטי, המאפשרים לחוקרים לחזות את הדינמיקה של organogenesis באמצעות סטראו פשוט. השתלת Microbead היא שיטה המאפשרת מניפולציה של רקמות באמצעות השינוי של גורמים בסביבה מקומית. זה מאפשר לחוקרים assay את ההשפעות של כל מספר של מולקולות איתות של עניין, כגון פפטידים מופרשים, בנקודות מרחב ובזמן ספציפיות בעובר המתפתח. כאן, אנו פרטנו פרוטוקול לכיצד לתפעל וחרוזים שתל במהלך התפתחות מוקדמת דג הזברה.

כמה סוגים של כלי מניפולציה שימושיים לטיפול בmicrobeads ביישומי מחקר (איור 1). בנוסף, עובש agarose פשוט עם בארות קטנות יכול להיות מנוצל כדי להחזיק את עובר דג הזברה, שהוא חיוני לביצוע ניסויים אלה במועד והיעיל (איור 1). השתלת microbead יכולה להתבצע במיקום המרחבי ושלב זמני של ריבית, המאפשר לחוקרים כדי לצמצם חלון ספציפי של פעולה למולקולה של עניין. כאן, microbeads אחת הושתלו לתוך עוברי דג הזברה בשלב ניצן זנב או בנקודות זמן מאוחר יותר במהלך שלבי somitogenesis (איור 3). שני microbeads בגדלים שונה, שטף עם הפתרון של רינגר לבד, שימש בהפגנת פרוטוקול זה (איור 3 א, 3 ב ו3C). השתלת microbead זה בהעדר כל מצומדותמולקולות קטנות מוכיחות כי השתלת חרוז יכולה להיות מושגת ללא תופעות מורפולוגיות גולמית במהלך ההתפתחות התקינה של עובר דג הזברה (איור 4). בניסויים עלולים להיתקל בקשיים בתמרון microbead לתוך חור ניקוב נעשה על ידי מחט טונגסטן גבי העובר. כדי להשיג טיפול טוב יותר של microbead להציב פעם אחת בעובר על ידי מיקרו-המחט, ניתן להשתמש זיף / כלי שוט. זה יכול להיות בעל מבנה עם באופן טבעי לשפוך חתולים או כלבי שפם, למרות שיכולים להיות מנוצל חוטי שוט טבעי או סינטטי אחרים (איור 1). דחיפה עדינה של microbead גם עם מחט טונגסטן או כלי הזיף צריכה לראות את microbead לשקוע הפתרון של רינגר של העובש. ברגע שmicrobead שקע לתוך תבניתו יש להעביר למרחקים גדולים במידת צורך באמצעות מחט טונגסטן ופעם אחת על גבי עובר כלי המחט או זיף יכול לשמש לposition microbead לעובר. ההצלחה של השתלת microbead ניתן למדוד באופן מיידי באמצעות הדמיה בסטראו, כחרוז יישאר ממוקמת ביציבות ברקמות. כדי להעריך את עמדת חרוז לאורך זמן, כל דגימת עובר ניתן הדמיה באמצעות צילום בזמן קורס בשידור חי או בדיקה במרווחים תקופתיים (כמתואר באיור 4) כדי להבטיח שמיקום חרוז לא עבר על משך הניסוי בשל רקמת אנדוגני המורפוגנזה. הבנת עמדתו של חרוז לאורך הזמן היא קריטית לפרשנות מושכלת ביותר של תוצאות, כגון הערכת ההשפעה של מולקולה קטנה ברקמות יעד או תהליך התפתחותי. השימוש בצעדים מעל אלה יספקו סביבה אידיאלית שבלהשתיל microbeads לעובר דג הזברה בזמן ומיקום רצויים. מניסיוננו, למשתמשים מתחילים בפרוטוקול השתלת microbead זה בדרך כלל צברו ne המיומנותcessary לבצע השתלה כירורגית עקבית של microbeads לעובר דג הזברה לאחר שבוע אחד של כ בפועל. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig1.jpg" /> כלי 1. איור משמשים לביצוע השתלת microbead. () מגש השתלת חרוז (משמאל, בקוטר 15 סנטימטרים) עם תבניות עובר (משמאל) ומגש דגירה microbead (בצד ימין, 6 סנטימטרים קוטר). מגש עבודה זו מאפשר לחוקר מניח את העוברים לכיוון הרצוי להשתלת microbead, ויש לי microbeads מוכן להשתלה בסמיכות לתחנת מיקרוסקופ. Microbeads צריך להיות מודגרות במולקולה קטנה (ים) ו / או כלי רכב ולאחר מכן לשטוף בצלחת microbead נפרדת (מימין) לפני הצבה אותם לתוך מגש השתלת חרוז שממוקם מתחת לתחנת מיקרוסקופ. (ב) שני זוגות מלקחיים בסדר ישמשו כדי להסיר את Choriעל מקיף כל עובר דג הזברה וגם לשבור את סופו של מחט microcapillary. (ג) מחט טונגסטן יועסק לעשות לנקב יפה מאוד לעובר דג הזברה שלמצב microbead. (ד) פיפטה העברת microcapillary תשמש להרים ולמקם microbead על גבי עובר דג הזברה בסמוך למקום לנקב. (ה) הזיף / כלי השוט יאפשר המיצוב העדין של microbead לאתר החתך בתוך העובר שנעשה בעבר על ידי מחט טונגסטן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig2.jpg" /> איור 2. סכמטי של הליך השתלת microbead. () מגש השתלת microbead עם soaki microbeadsng בפתרון לשטוף הרצוי שהוקם לפי תחנת סטראו, ואת העוברים ממוקמים ברקמות תפנינה כלפי מעלה. (ב) באמצעות מחט טונגסטן, חתך קטן לעובר יכול להתבצע עם תנועה עדיין תקיפה קלה. (ג) בעזרת פיפטה העברת microcapillary, microbead הרצוי ניתן לאסוף מתא הדגירה microbead במגש, ממוקם בצד הימין, והובא לתא השמאלי שבו אזור העבודה העובר נמצא. Microbead צריך להיות מופקד בסמוך למקום החתך, אז ממוקם בעדינות לתוך אתר החתך שנעשה על ידי מחט טונגסטן באמצעות הזיף / כלי השוט. ברגע שmicrobead הוא תמרן באתר החתך, זה צריך להיות תחוב לתוך הרקמה (מהחתך) למצב ביציבות microbead ולמנוע התנועה הבאה מהעובר כפיתוח ממשיך. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig2large.jpg" target="_blank">P</a>לחכור לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig3.jpg" /> יכול להיות מושתל microbeads 3. איור לעוברי בשלבי התפתחות שונה. () עוברי דג הזברה הושתלו עם microbead (קוטר של כ -50 מיקרומטר) לתא המטען בשלב ניצן זנב. כשבדק בשתל 24 שעות שלאחר חרוז (hpbi), העוברים שהתפתחו בצורה נורמלית וmicrobead הראה תנועה מינימאלית בחלוף זמן התפתחותי. עוברי דג הזברה (ב) מושתלים עם microbeads (בקוטר של כ 50 מיקרומטר) לתוך שק החלמון בשלב 3 somite (SS) מוצגים התפתחות תקינה עם תנועת חרוז קטנה יחסית לאורך זמן. (ג) microbeads גדול יותר (בקוטר של כ 70 מיקרומטר) הושתלו לתוך עובר 7 ss דומה הראה התפתחות תקינה שלאחר מכן, כמו גם מיניmal אם תנועה כלשהי מהאתר של השתלה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig4.jpg" /> איור 4. פיתוח ברוטו של עובר דג הזברה הוא מוטרד מהנוכחות של microbead דרך 72 hpbi. עוברי דג הזברה הושתלו עם microbeads הספוג בתמיסת רינגר (בקוטר של כ 50 מיקרומטר) בשלב 7 somite (SS). כל microbead הוכנס בניתוח לתא המטען, בין somites 3 ​​ו -4 הנוכחות של חרוז לא הייתה קשורה לפגמים גלויים התפתחותית בשתל לאחר חרוז 24 שעות (hpbi), 48 hpbi, או 72 hpbi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo at JoVE.com

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Microbead השרשה בעובר דג הזברה

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

microbead-implantation-in-the-zebrafish-embryo

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.2K Views.  University of Notre Dame. The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Video: Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions 1. The major cell types of the innate immune system, macrophages and neutrophils, develop during the first days of embryogenesis prior to the maturation of lymphocytes that are required for adaptive immune responses. The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, the optical transparency of embryonic and larval stages, a wide range of genetic tools, extensive mutant resources and collections of transgenic reporter lines, all add to the versatility of the zebrafish model. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium) and Mycobacterium marinum can reside intracellularly in macrophages and are frequently used to study host-pathogen interactions in zebrafish embryos. The infection processes of these two bacterial pathogens are interesting to compare because S. typhimurium infection is acute and lethal within one day, whereas M. marinum infection is chronic and can be imaged up to the larval stage 2, 3. The site of micro-injection of bacteria into the embryo (Figure 1) determines whether the infection will rapidly become systemic or will initially remain localized. A rapid systemic infection can be established by micro-injecting bacteria directly into the blood circulation via the caudal vein at the posterior blood island or via the Duct of Cuvier, a wide circulation channel on the yolk sac connecting the heart to the trunk vasculature. At 1 dpf, when embryos at this stage have phagocytically active macrophages but neutrophils have not yet matured, injecting into the blood island is preferred. For injections at 2-3 dpf, when embryos also have developed functional (myeloperoxidase-producing) neutrophils, the Duct of Cuvier is preferred as the injection site. To study directed migration of myeloid cells towards local infections, bacteria can be injected into the tail muscle, otic vesicle, or hindbrain ventricle 4-6. In addition, the notochord, a structure that appears to be normally inaccessible to myeloid cells, is highly susceptible to local infection 7. A useful alternative for high-throughput applications is the injection of bacteria into the yolk of embryos within the first hours after fertilization 8. Combining fluorescent bacteria and transgenic zebrafish lines with fluorescent macrophages or neutrophils creates ideal circumstances for multi-color imaging of host-pathogen interactions. This video article will describe detailed protocols for intravenous and local infection of zebrafish embryos with S. typhimurium or M. marinum bacteria and for subsequent fluorescence imaging of the interaction with cells of the innate immune system.

Transparent zebrafish embryos have proved useful model hosts to visualize and functionally study interactions between innate immune cells and intracellular bacterial pathogens, such as Salmonella typhimurium and Mycobacterium marinum. Micro-injection of bacteria and multi-color fluorescence imaging are essential techniques involved in the application of zebrafish embryo infection models.

זיהום של עוברים דג הזברה עם פתוגנים חיידקיים תאיים

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Immunology and Infection

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microinjection של mRNA ו oligonucleotides Morpholino antisense עוברי דג הזברה.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Biology

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

חיים הדמיה של המוח על ידי עוברי דג הזברה מיקרוסקופיה confocal

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex developmental processes. Zebrafish embryos are ideally suited for these manipulations since they are easily accessible, relatively large in size, and transparent. However, previously developed devices for cell removal and transplantation are cumbersome to use or expensive to purchase. In contrast, the transplantation device presented here is economical, easy to assemble, and simple to use. In this protocol, we first introduce the handling of the transplantation device as well as its assembly from commercially and widely available parts. We then present three applications for its use: generation of ectopic clones to study signal dispersal from localized sources, extirpation of cells to produce size-reduced embryos, and germline transplantation to generate maternal-zygotic mutants. Finally, we show that the tool can also be used for embryological manipulations in other species such as the Japanese rice fish medaka.

Embryological manipulations such as extirpation and transplantation of cells are important tools to study early development. This protocol describes a simple and effective transplantation device to perform these manipulations in zebrafish embryos.

מכשיר השתלה פשוט ויעיל לעוברי דגי זברה

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex ...

Direct Force Measurements of Subcellular Mechanics in Confinement using Optical Tweezers

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue morphogenesis goes in hand with molecular and structural changes at the single cell level that result in variations of subcellular mechanical properties. As a consequence, even within the same cell, different organelles and compartments resist differently to mechanical stresses; and mechanotransduction pathways can actively regulate their mechanical properties. The ability of a cell to adapt to the microenvironment of the tissue niche thus is in part due to the ability to sense and respond to mechanical stresses. We recently proposed a new mechanosensation paradigm in which nuclear deformation and positioning enables a cell to gauge the physical 3D environment and endows the cell with a sense of proprioception to decode changes in cell shape. In this article, we describe a new method to measure the forces and material properties that shape the cell nucleus inside living cells, exemplified on adherent cells and mechanically confined cells. The measurements can be performed non-invasively with optical traps inside cells, and the forces are directly accessible through calibration-free detection of light momentum. This allows measuring the mechanics of the nucleus independently from cell surface deformations and allowing dissection of exteroceptive and interoceptive mechanotransduction pathways. Importantly, the trapping experiment can be combined with optical microscopy to investigate the cellular response and subcellular dynamics using fluorescence imaging of the cytoskeleton, calcium ions, or nuclear morphology. The presented method is straightforward to apply, compatible with commercial solutions for force measurements, and can easily be extended to investigate the mechanics of other subcellular compartments, e.g., mitochondria, stress-fibers, and endosomes.

Here, we present a protocol to investigate the intracellular mechanical properties of isolated embryonic zebrafish cells in three-dimensional confinement with direct force measurement by an optical trap.

מדידות כוח ישירות של מכניקה תת-תאית בכליאה באמצעות פינצטה אופטית

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue ...

A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection

Biomaterial-associated infection (BAI) is a major cause of the failure of biomaterials/medical devices. Staphylococcus aureus is one of the major pathogens in BAI. Current experimental BAI mammalian animal models such as mouse models are costly and time-consuming, and therefore not suitable for high throughput analysis. Thus, novel animal models as complementary systems for investigating BAI in vivo are desired. In the present study, we aimed to develop a zebrafish embryo model for in vivo visualization and intravital analysis of bacterial infection in the presence of biomaterials based on fluorescence microscopy. In addition, the provoked macrophage response was studied. To this end, we used fluorescent protein-expressing S. aureus and transgenic zebrafish embryos expressing fluorescent proteins in their macrophages and developed a procedure to inject bacteria alone or together with microspheres into the muscle tissue of embryos. To monitor bacterial infection progression in live embryos over time, we devised a simple but reliable method of microscopic scoring of fluorescent bacteria. The results from microscopic scoring showed that all embryos with more than 20 colony-forming units (CFU) of bacteria yielded a positive fluorescent signal of bacteria. To study the potential effects of biomaterials on infection, we determined the CFU numbers of S. aureus with and without 10 &#181;m polystyrene microspheres (PS10) as model biomaterials in the embryos. Moreover, we used the ObjectJ project file &#34;Zebrafish-Immunotest&#34; operating in ImageJ to quantify the fluorescence intensity of S. aureus infection with and without PS10 over time. Results from both methods showed higher numbers of S. aureus in infected embryos with microspheres than in embryos without microspheres, indicating an increased infection susceptibility in the presence of the biomaterial. Thus, the present study shows the potential of the zebrafish embryo model to study BAI with the methods developed here.

A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection

The present study describes a zebrafish embryo model for in vivo visualization and intravital analysis of biomaterial-associated infection over time based on fluorescence microscopy. This model is a promising system complementing mammalian animal models such as mouse models for studying biomaterial-associated infections in vivo.

מודל העובר דג זברה, ויזואליזציה Vivo, ניתוח Intravital של Biomaterial-הקשורים Staphylococcus aureus זיהום

Biomaterial-associated infection (BAI) is a major cause of the failure of biomaterials/medical devices. Staphylococcus aureus is one of the major ...

Bioengineering

<meta charset="utf8"></head><body>הבהרת התנהגות תאי מיקרוגליה בהתפתחות טקטום אופטי של דגי זברה

Live Imaging and Characterization of Microglia Dynamics in the Zebrafish Embryo

Microglia are highly dynamic cells and their migration and colonization of the brain parenchyma is a crucial step for proper brain development and function. Externally developing zebrafish embryos possess optical transparency, which along with well-characterized transgenic reporter lines that fluorescently label microglia, make zebrafish an ideal vertebrate model for such studies. In this paper, we take advantage of the unique features of the zebrafish model to visualize the dynamics of microglia cells in vivo and under physiological conditions. We use confocal microscopy to record a timelapse of microglia cells in the optic tectum of the zebrafish embryo and then, extract tracking data using the IMARIS 10.0 software to obtain the cells' migration path, mean speed, and distribution in the optic tectum at different developmental stages. This protocol can be a useful tool to elucidate the physiological significance of microglia behavior in various contexts, contributing to a deeper characterization of these highly motile cells.

<meta charset="utf8"></head><body>מחבר זרקור: שימוש בדגי זברה לחקר נדידת תאי מיקרוגליה במהלך התפתחות המוח

We demonstrate a method that takes advantage of fast scanning confocal microscopy to perform live imaging of microglia cells in the developing zebrafish optic tectum, allowing for the analysis of the dynamics of these cells in vivo.

הדמיה חיה ואפיון דינמיקה של תאי מיקרוגליה בעובר דג הזברה

Microglia are highly dynamic cells and their migration and colonization of the brain parenchyma is a crucial step for proper brain development and ...

Brain Ventricular Microinjections of Lipopolysaccharide into Larval Zebrafish to Assess Neuroinflammation and Neurotoxicity

Neuroinflammation is a key player in various neurological disorders, including neurodegenerative diseases. Therefore, it is of great interest to research and develop alternative in vivo neuroinflammation models to understand the role of neuroinflammation in neurodegeneration. In this study, a larval zebrafish model of neuroinflammation mediated by ventricular microinjection of lipopolysaccharide (LPS) to induce an immune response and neurotoxicity was developed and validated. The transgenic zebrafish lines elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP, and mpo:EGFP were used for real-time quantification of brain neuron viability by fluorescence live imaging integrated with fluorescence intensity analysis. The locomotor behavior of zebrafish larvae was recorded automatically using a video-tracking recorder. The content of nitric oxide (NO), and the mRNA expression levels of inflammatory cytokines including interleukin-6 (IL-6), interleukin-1&#946; (IL-1&#946;), and human tumor necrosis factor &#945; (TNF-&#945;) were investigated to assess the LPS-induced immune response in the larval zebrafish head. At 24 h after the brain ventricular injection of LPS, loss of neurons and locomotion deficiency were observed in zebrafish larvae. In addition, LPS-induced neuroinflammation increased NO release and the mRNA expression of IL-6, IL-1&#946;, and TNF-&#945; in the head of 6 days post fertilization (dpf) zebrafish larvae, and resulted in the recruitment of neutrophils in the zebrafish brain. In this study, injection of zebrafish with LPS at a concentration of 2.5-5 mg/mL at 5 dpf was determined as the optimum condition for this pharmacological neuroinflammation assay. This protocol presents a new, quick, and efficient methodology for brain ventricle microinjection of LPS to induce LPS-mediated neuroinflammation and neurotoxicity in a zebrafish larva, which is useful for studying neuroinflammation and could also be used as a high-throughput in vivo drug screening assay.

This protocol demonstrates the microinjection of lipopolysaccharide into the brain ventricular region in a zebrafish larval model to study the resulting neuroinflammatory response and neurotoxicity.

מיקרו-הזרקות חדריות למוח של ליפופוליסכריד לדגי זברה זחליים להערכת דלקת עצבית ורעילות עצבית

Neuroinflammation is a key player in various neurological disorders, including neurodegenerative diseases. Therefore, it is of great interest to research ...

Microbead השרשה בעובר דג הזברה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

זיהום של עוברים דג הזברה עם פתוגנים חיידקיים תאיים

Microinjection של mRNA ו oligonucleotides Morpholino antisense עוברי דג הזברה.

חיים הדמיה של המוח על ידי עוברי דג הזברה מיקרוסקופיה confocal

מכשיר השתלה פשוט ויעיל לעוברי דגי זברה

מדידות כוח ישירות של מכניקה תת-תאית בכליאה באמצעות פינצטה אופטית

מודל העובר דג זברה, ויזואליזציה Vivo, ניתוח Intravital של Biomaterial-הקשורים Staphylococcus aureus זיהום

הדמיה חיה ואפיון דינמיקה של תאי מיקרוגליה בעובר דג הזברה

הדמיה חיה ואפיון דינמיקה של תאי מיקרוגליה בעובר דג הזברה

הדמיה חיה ואפיון דינמיקה של תאי מיקרוגליה בעובר דג הזברה

מיקרו-הזרקות חדריות למוח של ליפופוליסכריד לדגי זברה זחליים להערכת דלקת עצבית ורעילות עצבית