אנו מכירים אנשי המעבדה Mably ו Narie סטורר לקבלת סיוע טכני שלהם, איגוד הלב האמריקני (NCRP המדען פיתוח גרנט 0635363N) לבין הלאומי ללב, ריאות, ודם המכון (גרנט SCCOR HL02 RFA-027) למימון.

חלק 1: ייצור ביצה אוסף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלילה לפני זריקה, להגדיר את הדגים רבייה טנקים עם חוצצים במקום. כדי להגדיל את הייצור הכולל ביצה, דגים ניתן להגדיר יחס של שתי נקבות על זכר אחד אם תרצה בכך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר, אחרי האורות בחדר נדלק, למשוך את חוצצים מטנקים מספר ולאפשר כ 20 דקות של זמן הזיווג באין מפריע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מסננת, לאסוף את הביצים מן הכלובים לגידול ולשטוף אותם במים ביצה. יוצקים את הביצים לתוך צלחת פטרי עם מים ביצה מופרית להסיר ביצים ופסולת עם פיפטה העברה. דגים יכולים להיות נערכו מחדש במיכלים גדולים כדי לייצר סיבובים נוספים של ביצים להזרקה. התאם את העיתוי של איסוף ביצים כדי לאפשר מספרים המרבי של ביצים להיות מיוצר מבלי לאפשר להם לעבור את השלב תא בודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום שקופיות מיקרוסקופ במכסה הפוכה של צלחת פטרי 100mm. השתמש פיפטה להעביר בשורה את הביצים על הצד של המגלשה להרכיב עמודה בודדת. הסרה של עודפי מים ביצה משקופית על ידי לחיצה Kimwipe נגד הצד הנגדי הביצים. (איור 1A) </li></ol> חלק 2: משיכת המחט, טעינה, והכנת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם חולץ micropipette, למשוך כוס 1.0mm OD נימי לשתי מחטים חנות בצלחת פטרי 150mm ידי הנחת מעל רמפות מרק טיפשי. מחטים יכול להיות משך מראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחט Backload עם μL 3 של חומר ההזרקה באמצעות פיפטה microloader. נער את בולוס לעבר קצה המחט עד כמה יש בועות או לא הנותרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מקור האוויר microinjector. הכנס את המחט לתוך microinjector ולהבטיח חותם חזק בתוך הדיור. בדוק micromanipulator נמצא במצב תקין כדי לאפשר מגוון רחב של תנועה והסתגלות. תביאו את קצה מחט לתוך מטוס המבט של מיקרוסקופ, גבוה מעל הבמה, להתמקד באזור הדק של קצה. השתמש זוג מלקחיים חדה לצבוט את מחט בנקודה אשר משאיר המחט צר מספיק כדי לחדור את סיסית וחלמון אבל עדיין מסוגל לספק גודל חרוז עקבי. טיפה של שמן מינרלי על מיקרומטר ניתן להשתמש כדי לחשב את עוצמת הקול של כל הזרקה. כאשר מוזרק לתוך השמן, חרוז בקוטר של 0.1 מ&quot;מ מכיל 500 PL של חומר ההזרקה (1B דמות); כרכים הזרקה של 500 PL או 1nL משמשים בדרך כלל. לדכא את דוושת רגל ולנטר את גודל חרוז בעוד זמירה את המחט והתאמת לחץ ההזרקה לפי הצורך. כרכים הזרקת אידיאלי תמלא כ 10% מנפח הביצה. איכות קצה מחט הוא חיוני כדי להקל על שניהם הזרקת ואת איכות ועקביות של התוצאות. </li></ol> חלק 3: הזרקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא העוברים לא התפתחו מעבר לשלב ארבע התא. באופן אידיאלי, עוברים צריך להיות בשלב אחד התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנמיכים את המחט לכיוון הטור של ביצים, מחזיק את המנה במקום עם היד מול שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פירס את פני השטח של סיסית והזן את החלמון במכה אחת חלקה תוך כדי צפייה לכל ריסוק או קריעה של שק החלמון. להזריק את חומר הזרקה לתוך החלמון (דמות 1C). הימנע הזרקת בועות אוויר או מתיחת חלמון כמו גם יכול להיות קטלני לעובר. עבודה לאורך הקו, להתאים את הלחץ הדרוש כדי לשמור על גודל חרוז עקבית, באמצעות קצה פיפטה, להסיר ביצים שנראים מופרית או נהרסים בתהליך הזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השלמת עמודה של ביצים, להשתמש בזרם עדין של מים ביצה להעביר את הביצים מוזרק לתוך צלחת פטרי נקי. חזור על פי הצורך. שמור עוברים uninjected מספר כביקורת. בסוף של יום אחד, להסיר עוברים מתים להקליט את מספר העוברים מוזרק. החלף את המים ביצה בצלחת מעת לעת כדי להקטין את הסיכוי לזיהום. </li></ol> חלק 4: תוצאות נציג תלוי מה זה להיות מוזרק, העוברים עשויים לשרוד בקצב נמוך יותר מאשר אחים uninjected שלהם. למרבה המזל, קל להזריק מספרים עצומים של אותם, אז זה רק לעתים נדירות בעיה. זה נורמלי morphants להציג הפיתוח מתעכב מעט. כדי להמחיש את התוצאות של microinjection, השתמשנו בפרוטוקול זה כדי לתפעל את רמות החלבון הלב של זכוכית (Heg). Heg הוא חלבון הטרנסממברני הדרושים לפיתוח לב נורמלי. בהעדר שלה, עוברים לפתח לבבות עם קטעי יבוא ענק ותאי 1. אנו מזריקים two morpholinos מתואר בעבר נגד heg, heg_e3i3_egfr1 ו heg_e4i4_egfr2, בריכוז של 500 מיקרומטר. בשלב ההפריה 2 ימים הודעה, שולט אח uninjected נראים תקינים, כצפוי (2A דמות ו-B). עוברים הזריקו heg_e3i3_egfr1 יש בצקת במוח (דמות 2C). למרות ליבם של רוב morphants אלה שינו את המורפולוגיה, חדרי שלהם הם בגודל רגיל (דמות 2D). עוברים מוזרקעם heg_e4i4_egfr2 מומים בלב התערוכה משתנה. חלקם נראים תקינים, בעוד אחרים יש שטחים גדולים יבוא אטריה מוגדל בינוני (2E דמות ו-F). מוטציה heg, כפי שדווח בעבר 1, יש דרכי יבוא מוגדל עצומה ו אטריום (דמות 2G ו-H). אנחנו גם עוברים wildtype מוזרק עם mRNA 400 ng / μL עיבד מ heg באורך מלא cDNA. אמנם שולטת uninjected להתפתח בצורה תקינה (איור 3A ו-B), עוברים הזריקו heg mRNA בתערוכה מגוון של פנוטיפים החל המראה wildtype כדי cyclopia חמור, קיצור של ציר הגוף העיקרי, נמק של הראש והגוף, ועל ליקויים קו האמצע (דמות 3C ו-D). <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%201%20FINAL.png" alt="" /> באיור 1. לעוברים להיות מוזרק הם נעמדו מול המיקרוסקופ שקופית בצלחת פטרי (A). נפח הזרקה נקבעת על ידי הזרקה לתוך שמן מינרלי דגש על מיקרומטר. נפח הזרקה של 500 PL, אשר נמצא בשימוש נפוץ, בעל קוטר של 0.1 מ&quot;מ (B). מיד לאחר ההזרקה, morpholino או mRNA נראה כמו מקום להדגיש את החלמון (C). <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%202%20FINAL.png" alt="" /> איור 2. בשלב ההפריה 2 ימים הודעה, עוברים uninjected אין פגמים ברוטו (א) או הפנוטיפ לב (B). עוברים מוזרק עם heg_e3i3_egfr1 morpholino יש בצקת במוח (C, חץ) אבל חדרי הלב בגודל רגיל (D). כמה עוברי מוזרק עם heg_e4i4_egfr2 morpholino יש קטעי זרימה מוגדלים אטריה (E, F). מוטנטים heg יש קטעי יבוא מוגדל קשה אטריה (G, H). (א), (ג), (E), ו - (G) הם תמונות DIC 4x, (ב), (ד), (F) (H) הם 20x תמונות DIC. אטריום = זה = בדרכי יבוא. <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%203%20FINAL.png" alt="" /> איור 3. הפריה בגיל 24 שעות לכתוב, uninjected עוברי יש גוף ארוך, ישר, ללא פגמים או נמק קו האמצע (א) ושתי עיניים מוגדרים בבירור עם צינור עצביים ביניהם (B). כמה עוברי הזריקו mRNA heg, לעומת זאת, התערוכה ציר הגוף מקוצר, נמק, somites מעוותות (ג), ו cyclopia (ד &#39;). (א) ו - (ג) הם תמונות DIC 4x, (ב) ו - (ד) הם 20x תמונות DIC.

<ol>
	<li>Mably, J. D., Mohideen, M. P. K., Burns, C. G., Chen, J., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=heart+of+glass+regulates+the+concentric+growth+of+the+heart+in+zebrafish.">heart of glass regulates the concentric growth of the heart in zebrafish.</a> Curr. Biol. 13, 2138-2147 (2003).</li></ol>

אחד היתרונות של מערכת מודל דג הזברה הוא הקלות בה מוצרי גן מסוים ניתן להוסיף או לבטל מן העובר על ידי microinjection. כדי בכל מקום בגוף overexpress חלבון מסוים, קידוד ה-mRNA הוא מוזרק לתוך החלמון בשלב 1-התא. במהלך הפיתוח הבאים של העובר, RNA מופץ ברחבי האורגניזם ותורגם. לעומת זאת, כדי למנוע חלבון מסוים, morpholinos משמשים. Morpholinos הם oligonucleotides סינתטי נועד עם ההשלמה antisense כדי RNAs ספציפיים. כמו mRNAs, morpholinos מוזרקים לתוך החלמון בשלב 1-התא. בתוך העובר הם נקשרים RNAs היעד שלהם, למנוע תרגום. השינוי העיקרי צריך להיעשות עבור כל morpholino או mRNA הוא הריכוז של החומר המוזרק. גבוה מדי ריכוז או morpholino או mRNA עלול לגרום אי - רעילות ספציפיים, בעוד כל morpholino חייבים להיבדק אמפירית כדי לקבוע ריכוז אופטימלי שלה, בדרך כלל ריכוזי morpholino בין 200 מיקרומטר ו 500 מיקרומטר להפיל פעילות הגן ביעילות מבלי לגרום אי - פגמים ספציפיים. גודלו המדויק של פתיחת מחט זה לא קריטי. בתוך במגוון גדלים מחט, בלחץ הזרקה וזמן הזרקה ניתן להתאים לייצר בולוס נפח הנכון. Morpholinos יש יישומים רבים, כולל לנתיחה התפקודית של תחומים בתוך החלבון. כאשר תוכנן יעד ספציפי, אקסון אינטרון צמתים, morpholinos תמנע שחבור התרחשות שם. בדקנו את ההשפעה של שתי morpholinos אשר נקלטות אקסון אינטרון צמתים ב-mRNA מראש של heg. Heg_e3i3_egfr1 morpholino נקשר הצומת בין אקסון אינטרון 3 ו 3, מניעת מכונות שחבור מתוך שילוב של אקסון 3 לתוך תמלילי בוגרת. Heg_e4i4_egfr2 morpholino דומה מסיר אקסון 4. שני אקסונים 3 ו -4 לקודד תחומים המכיל EGF כמו חוזר. עוברים כמה הזריקו heg_e4i4_egfr2 בינוני phenocopy מוטציה; ניסויים נוספים יידרשו להבין את התפקיד של Heg אקסון 4 בהתפתחות הלב. באופן מפתיע, עוברים הזריקו heg_e3i3_egfr1 יש בצקת במוח, תכונה לא ראיתי מוטציות heg. זה יכול להיות בגלל היכולת של morpholinos להיקשר תמלילי אימהית זה יהיה מעושה מוטנטים zygotic.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Microinjector</td>
<td>Tool</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>PLI 100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micromanipulator</td>
<td>Tool</td>
<td>Narishige</td>
<td>MN 153</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Needle Puller</td>
<td>Tool</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>P 97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Capillaries</td>
<td>Tool</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>TW100 F6</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microloader Pipettes</td>
<td>Tool</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5242956.003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Needle Holder</td>
<td>Tool</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>MPH310</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function

אחד היתרונות של דג הזברה לומד הוא הקלות והמהירות של מניפולציה רמות החלבון בעובר. Morpholinos, אשר oligonucleotides סינתטי עם ההשלמה antisense כדי RNAs היעד, ניתן להוסיף את העובר כדי לצמצם את הביטוי של גן מסוים המוצר. לעומת זאת, ה-mRNA מעובד ניתן להוסיף העובר להגדיל את רמות של המוצר גן. הרכב להוספת או mRNA או morpholino לעובר הוא microinjection. Microinjection יעילה ומהירה, המאפשרת הזרקה של מאות עוברים לשעה. וידאו זה מציג את כל השלבים הכרוכים microinjection. בקצרה, ביצים נאספים מיד אחרי שהרימו אותו בשורה נגד המיקרוסקופ שקופית בצלחת פטרי. בשלב הבא, מחט קנס שקצהו עמוסה חומר הזרקה מחובר microinjector ומקור אוויר, שולט microinjector מותאמים לייצר נפח הזרקה רצוי. לבסוף, המחט הוא צלל לתוך החלמון של העובר ואת morpholino או mRNA הוא גורש.

Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function at JoVE.com

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

וידאו זה מראה כיצד morpholino או mRNA יהיה ניתן להזריק לתוך עוברי דג הזברה בשלב אחד התא כדי להגדיל או להקטין את רמת המוצרים גן מסוים במהלך ההתפתחות הבאים.

Microinjection של עוברי דג הזברה לנתח פונקציה ג&#39;ין

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

microinjection-of-zebrafish-embryos-to-analyze-gene-function

Research

JoVE Journal

Biology

77.2K Views.  Harvard Medical School. וידאו זה מראה כיצד morpholino או mRNA יהיה ניתן להזריק לתוך עוברי דג הזברה בשלב אחד התא כדי להגדיל או להקטין את רמת המוצרים גן מסוים במהלך ההתפתחות הבאים.

Video: Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

Microinjection עוברים א aegypti לקבל יתושים טראנסגנטי

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microinjection של mRNA ו oligonucleotides Morpholino antisense עוברי דג הזברה.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

יצירת עוברים דג הזברה chimeric על ידי השתלה

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

שימוש בתגובה optokinetic ללמוד לתפקד החזותי של דג הזברה

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

שני הפוטונים מבוסס Photoactivation עוברי דג הזברה לחיות

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1, as in zebrafish and the mouse. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions.
To take advantage of medaka fish whose embryos are transparent and develop externally, microinjection is an essential technique to inject cell-tracers for labeling cells, mRNAs or anti-sense oligonucleotides for over-expressing and knocking-down genes of interest, and DNAs for making transgenic lines.

Medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions. This protocol highlights the key points for successful microinjection into medaka embryos, an important technique for embryological and genetic analysis using medaka and zebrafish in a laboratory.

Microinjection עוברים Medaka לשימוש כמודל אורגניזם גנטי

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

ניתוח פרופיל המטבולי של עוברי דג זברה

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional mutagenesis using fluorescent reporters to tag expression of mutated genes. Several laboratories have constructed and tested enhancer- and gene-trap vectors in zebrafish, using fluorescent proteins, Gal4- and lexA- based transcriptional activators as reporters 1-7. These vectors had two potential drawbacks: suboptimal stringency (e.g. lack of ability to differentiate between enhancer- and gene-trap events) and low mutagenicity (e.g. integrations into genes rarely produced null alleles). Gene Breaking Transposon (GBTs) were developed to address these drawbacks 8-10. We have modified one of the first GBT vectors, GBT-R15, for use with Gal4-VP16 as the primary gene trap reporter and added UAS:eGFP as the secondary reporter for direct detection of gene trap events. Application of Gal4-VP16 as the primary gene trap reporter provides two main advantages. First, it increases sensitivity for genes expressed at low expression levels. Second, it enables researchers to use gene trap lines as Gal4 drivers to direct expression of other transgenes in very specific tissues. This is especially pertinent for genes with non-essential or redundant functions, where gene trap integration may not result in overt phenotypes. The disadvantage of using Gal4-VP16 as the primary gene trap reporter is that genes coding for proteins with N-terminal signal sequences are not amenable to trapping, as the resulting Gal4-VP16 fusion proteins are unlikely to be able to enter the nucleus and activate transcription. Importantly, the use of Gal4-VP16 does not pre-select for nuclear proteins: we recovered gene trap mutations in genes encoding proteins which function in the nucleus, the cytoplasm and the plasma membrane.

This protocol describes the method of gene trap insertional mutagenesis using Gal4-VP16 as the primary reporter and GFP/RFP as secondary reporters in zebrafish. Approximately one in ten high-expressing F0 fish yield gene trap progeny co-expressing GFP and RFP. The screening procedure can be readily scaled to adapt to the size of the laboratory performing the insertional mutagenesis screen.

גן השמנה באמצעות Gal4 בדג הזברה

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional measures of muscle health. In this video article, we demonstrate a method to measure force generation during contraction of zebrafish larval trunk muscle. Force measurements are accomplished by placing an anesthetized larva into a chamber filled with a salt solution. The anterior end of the larva is tied to a force transducer and the posterior end of the larva is tied to a length controller. An isometric twitch contraction is elicited by electric field stimulation and the force response is recorded for analysis. Force generation during contraction provides a measure of overall muscle health and specifically provides a measure of muscle function. Although we describe this technique for use with wild-type larvae, this method can be used with genetically modified larvae or with larvae treated with drugs or toxicants, to characterize muscle disease models and evaluate treatments, or to study muscle development, injury, or chemical toxicity.

Force measurements can be used to demonstrate changes in muscle function due to development, injury, disease, treatment or chemical toxicity. In this video, we demonstrate a method to measure force during a maximal contraction of zebrafish larval trunk muscle.

מדידת כוח במהלך התכווצות כדי להעריך את תפקוד שריר בזחלי דג הזברה

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

הר שלם ברזולוציה גבוהה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה בתוך עוברי דג הזברה לחקר ביטוי גנים ותפקוד

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...