הפרדת תאים זקיקים וביצים בזקיקי השחלות של זברהפיש

המטרה הכוללת של הליך זה היא להפריד תאים זקיקיים ו Oocytes בזקיק השחלות של זברה. הזקיקים הם היחידה הבסיסית של השחלה, המורכבת מהאוציטים ומהתאים הזקיקיים שמסביב. זהו הכלי הרחב להפריד הן את התא הזקיקי והן את התאים החיצוניים למדיניות מחקרית היטב, כולל לכידה ראשונית של תאים זקיקיים ועולה על ביטוי גנים, כל הרוויה והפריה חוץ גופית.

לאחרונה, הזברהפיש הפך למודל רב עוצמה של ניסאן, שחוקרת שליטה בהתפתחות כבר. כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה, כך מפריד תאים זקיקיים וביציתות של זברהפיש זקיק אשר יאפשר חקירות של התפתחות כבר זברה המסחרי, אין מסה או שני נפרדים על תאים זקיקיים וכל הצדדים של ספינים משתמשים פוסט אשר יש מבוך, זמן רב היה נזק גבוה מבחוץ. כאן, הקמנו שיטה פשוטה לשני תאים נפרדים באמצעות משקפיים או חלק שיעור טמלה תחת שונית טהורה.

היקף המטרו שלנו, הן בחוץ והן בתאים הזקיקיים ניתן לפברק בקלות על ידי הקלדת נימי זכוכית משך. ראשית, להכין נימי זכוכית משורר. הכה את ראשו של נימי זכוכית על מבער האלכוהול.

השתמש בארבעה צדדים כדי למתוח את נימי הזכוכית לקוטר כרטיס הרייב. שנית, לדכא את זה overate מן הדגים נקבה בוגרת, לבודד זקיקי השחלות מן השחלה. לבסוף להשתמש נימי זכוכית נשאל כדי להפריד תא זקיקים ו Oocyte מזקיקי השחלות.

מכינים את נימי הזכוכית, מיכל חדות, חותך בשפע, מבער אלכוהול ומלקחיים. שקר מבער אלכוהול, לקחת הביתה נימי לחמם קצה אחד של נימי זכוכית על האש של מבער אלכוהול. השתמש מלקחיים להחזיק קצה נוסף של נימי זכוכית, להדגיש את נימי זכוכית במהירות ובעדינות.

שים את פסולת הזכוכית למיכל החדים. השתמש חותך בשפע Gretch על הבריכה עם זכוכית. ואז לשבור על ידי מלקחיים בעדינות כדי להפוך פתיחה חלקה של מבט הנמל במהירות לשרוף את קצה נימי הזכוכית על מבער אלכוהול מספר פעמים ולשפשף את הקצה הפתוח על ידי חותך בשפע בזהירות.

קח איך מיכל הדגים ממערכת המים המעובדים. ועכשיו הנקבות הבוגרות קושרות על ידי הנחת דגים על מי הקרח לפחות שתיים עד חמש דקות עד שהדגים עוצרים את תנועת גיל. מוציאים את הדגים מקופסת הקרח ומסירים את גוף דגי המים הנותר במגבת, מניחים דג על צלחת החלק D עם ארבעה סטים.

דגים נערפו על ידי הגשת אקורד Spang באמצעות המספריים החדים שלהם כדי להבטיח את המוות. השתמש בניתוח מספריים כדי לחתוך כדלקמן. לנתח מחיתוך קלואי לזימים לאורך קו האמצע של הבטן, לחתוך מגדת קלואי, לחתוך מהקצה הצדדי לצד הגבי.

הסיר בעדינות את העור והשרירים בצד אחד של הגוף, לחשוף את האיברים הפנימיים ולקחת שחלה שלמה בריאה עם ארבעה שלבים. השחלות הונחו בעדינות מיד בתרבות 100 מילימטר, מיכל צלחת 60%L 50 חציון. שלח מיקרוסקופ מנתח עם אופטיקת אור משודרת המבוססת על הגודל והמורפולוגיה של זקיקי השחלות בשלבים שונים.

לבודד זקיקי השחלות האלה באופן ידני באמצעות בירה של מתחרה ארבעה סטים. לאסוף את זקיקי השחלות המבודדים ולשים אותם בצלחת תרבותית אחרת המכילה 60%L 50 בינוני, זקיקי השחלות מבודדים נחמד ישמש להפרדת תאים זקיקים ו Oocytes. לאחר מכן הגדר התקן להפרדה.

השתמש בצינור פלסטיק 30 ס"מ. קצה אחד מחובר עם קצה פיפטה מיליליטר אחד עם אלמנט מסנן. קצה נוסף מחובר עם קצה פיפטה 200 מיקרוליטר.

תחת מיקרוסקופ מנתח, להשתמש בפה כדי לשלוט על זרימת האוויר כדי לאפשר את הפגום הולך לעבור לבריכה עם נימי זכוכית ואז לפוצץ את האיוולת יוצא נימי זכוכית. במהלך תהליך זה, תא זקיקים ו Oocytes של זקיקי השחלות ניתן להפריד. זהו תהליך פרידה לזקיק שלב בוגר.

במהלך תהליך השאיפה, שכבת התא הזקיקי מנותקת מן Oocyte, עושה לאחר נושבת את התא הזקיקי ו Oocyte ניתן להפריד. זהו זקיק שלב קרקע מלא. אנחנו יכולים לראות את שכבת התא הזקיקי מנותקת מהאוציטה.

שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם בשלב מוקדם זקיקי השחלות. זהו זקיק בשלב הלייטלה ג'נסיס האמצעי. זהו זקיק בשלב מוקדם של ואטלה בראשית.

זהו זקיק בשלב טרום ואטלה בראשית. מתמונה זו, באפשרותך לראות את תהליך ההפרדה. פאנל אחד מציג זקיק שלם בלוח במה בוגר מלא.

פאנל 2 מראה את הזווית של זקיק זה לתוך נימי זכוכית משוך. פאנל 3 מראה שהזקיקי פוצץ מתוך נימי הזכוכית שנמשכו. פאנל 4 מציין את ההפרדה המוצלחת F denuded Oocyte ותא זקיק.

אפילו שיטה זו, הפרדת תא זקיק ב Oocyte יכול להתבצע בשלבים שונים זקיקים. לחקור אם התאים הזקיקיים הופרדו מן הזקיקים שלמים. שלם זקיק והוא מופרד Oocyte משלבים שונים של זקיקים משלב BV לשלב FG היו מוכתמים DAPI.

הגרעין של תאים זקיקיים יכול להיות מוכתם על ידי DAPI. האות הכחול של DAPI נצפה בזקיקים שלמים אך לא באוציטים מנוכרים בזקיקי השלב השונים האלה. כדי לאשר עוד יותר את ההפרדה הברורה, הזקיקים השלמים והאוציטים המופרדים היו הרוסים לחלקים ההיסטולוגיים.

DAPI המציין תוצאות הראו כי תאים זקיקיים הוסרו בבירור ו denuded Oocytes. בשיטה זו, אוציטים מנודים מופרדים מזקיקי במה בוגרים נמצאו לעבור את התבגרות Oocyte ספונטנית. ללא כל טיפול לאחר ארבע שעות דגירה.

לאחר הפעלה על ידי מים, אלה Oocytes התבגר יכול לעבור את הרחבת chorion מלא. תוצאה זו מציינת את הנזק הנמוך ל- Oocyte בשיטה זו. לכן, חרדל זה יכול לשמש כדי לקבל את Oocyte denuded ללימוד Oocyte התבגר מנה של דגי זברה.

ניתן להסיר את שכבת החומר הזקיקית לזקיקים על ידי צינור זכוכית נימי. אלה יכולים להיות מופרים ולהתפתח לשלב הבקיעה. התוצאות מראות כי שיטה זו יכולה לשמש הפריה חוץ גופית בדגי זברה.

אנו מתארים כאן שיטה חדשנית להפרדה מהירה וקלה של תא זקיקים וביצית מזקיקי השחלות של דגי זברה. לשיטה זו מספר יתרונות משמעותיים, מתודולוגיות הפוכות. העיקרי ביניהם הוא להגדיל מאוד את קלות ההפרדה כמו רק מניפולציה אחת וחיצונית נדרשת.

הקלות המוגברת של ההפרדה מגדילה את הזמינות של שיטה זו לאותם חוקרים שאינם מיומנים במיקרו-דיסקציה. שנית, שיטה זו יכולה לשמש כדי להפריד תא זקיקי ו Oocyte של זקיקי השחלות ושלבים התפתחותיים מוקדמים, כולל PV, שלב MV EBV, הפרדה כזו לא ניתן לבצע בשלב מוקדם זקיק באמצעות מתודולוגיות הנוכחי. שלישית, שיטה חדשה זו מובילה לפחות נזק לאוציטים.

הביציות המופרדות בשיטה זו יכולות לעבור את התבגרות הביצית וניתן להפרותן. בנוסף, שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם דגים אחרים.