שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום כלורופלסט, למשל, הרכב מכונות ייבוא החלבון chloroplast. זה חיוני לירוק ופוטוסינתזה ומכאן לייצור מזון על פני כדור הארץ. המכונה המולקולרית מורכבת משני מתחמים נפרדים בחבר החיצוני והפנימי של הכלורופלסט הנקרא TOC ו- TIC, אך ההרכב אינו ידוע במלואו.
היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי טיהור של Arabidopsis TOC / טיק מורכבים ניתן להשיג בשיטת טיהור צעד אחד, TAP-TOC טיהור. זוהי שיטה ספציפית ויעילה. בדרך כלל, חוקרים חדשים בשיטה זו עשויים להיאבק כי הם לא מכירים את הבידוד של שברי קרום כלורופלסט, חומר ניקוי, מנוכרות, או טיהור זיקה.
לאחר הכנת הצמחים Arabidopsis, לטחון 10 גרם של שתילים בני שלושה שבועות בחנקן נוזלי, באמצעות מרגמה קרה ועלי עם חול. מוסיפים 20 מיליליטר של חיץ שחיקה קרה לרקמות הקרקע. מערבבים היטב ולתת את התערובת להפשיר על קרח.
לאחר מכן, להשרות שתי שכבות של חומר סינון מהיר עם חיץ שחיקה. סנן את ההומוג'ונט דרך שתי השכבות של חומר הסינון לתוך צינור צנטריפוגה חרוטי 50 מיליליטר. צנטריפוגה לסינון ב 1, 500 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ולהעביר את supernatant לצינור טרי, מקורר מראש 50 מיליליטר חרוט צנטריפוגה.
חזור על הצנטריפוגה פעם נוספת באותם תנאים. מעבירים את העל-טבעי לצינור אולטרהצנטריפוג קר של 38.50 מיליליטר ומעבירים אותו ל-35 מיליליטר עם חיץ שחיקה קר. השתמש אולטרהצנטריפוגה כדי צנטריפוגה המדגם ב 100, 000 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.
באמצעות homogenizer טפלון זכוכית, תן שימוש חוזר את גלולה ירוקה חיץ שחיקה. צנטריפוגה ב 100, 000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס במשך שעה אחת ולהשליך את העל טבעי. השתמש homogenizer טפלון זכוכית כדי לנצל מחדש את גלולה ירוקה ב 18.75 מיליליטר של חיץ אחד x שחיקה.
לאחר מכן הוסיפו עוד 9.375 מיליליטר של מאגר שחיקה x אחד. הוסף 9.375 מיליליטר של פתרון פיוזביליזציה x ארבע כדי להביא את הנפח הסופי ל 37.5 מיליליטר דגירה על שייקר מסתובב בארבע מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לאחר מכן, השתמש אולטרהצנטריפוגה כדי צנטריפוגה המדגם ב 100, 000 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.
מעבירים את העל-טבעי המכיל את הממברנות המבודדות לצינור צנטריפוגה חרוטי טרי של 50 מיליליטר. לאחר הכנת שרף אגרוז IGG, להעביר את שרף IGG agarose שנשטף בעבר לצינור חרוט 50 מיליליטר המכיל את 37.5 מיליליטר של ממברנות מנוכרות. דגירה במשך הלילה על שייקר מסתובב בארבע מעלות צלזיוס.
למחרת, מעים IGG agarose שן ב 100 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. השתמש בפיגט כדי להסיר את העל-טבעי. האם שן האגה של IGG היה ב-37.5 מיליליטר של חיץ A ודגירה על שייקר מסתובב בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
המשך להססן שטיפת שהף כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, להעביר את שף Agarose IGG לעמודת ספין 500 microliter עם מסנן 35 מיקרון. לשטוף את חרוזים פעמיים עם 300 microliters של מאגר אלוטיון TEV לשיווי משקל.
לאחר מכן, להוסיף 300 microliters של מאגר אלוטיון TEV מכילים 10 microliters של פרוטאז TEV. הדגירה את עמוד ספין עם חרוזים תרמומיקסר ב 16 מעלות צלזיוס ו 350 סל"ד במשך שעתיים. לאחר מכן, פתח את עמוד הסיבוב והצב אותו בצינור חדש, נקי, 1.5 מיליליטר.
לסובב את הצינור הזה ב 100 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות כדי לאסוף את eluate. במחקר זה TAP מתויג כלורופלסט מעטפת חלבון קומפלקס מצמחים מהו מהודרים A.thaliana מטוהרים. ניתוח Immunoblot מאשר כי לבודד TAP-TOC159 אינטראקציה עם TOC75 ו TOC33 של קומפלקס TOC.
קינאז הממברנה החיצוני כלורופלסט, KOC1, אשר ידוע phosphorylate TOC159 הוא גם מבודד במשותף. נוכחותו של TIC110 מגלה כי מתחם TAP-TOC159 המבודד מכיל גם את מרכיבי מתחם TIC. הנוגדן FBN1A לא זיהה את קומפלקס TAP-TOC159, מה שמצביע על היעדר זיהומים.
בשליטה השלילית, חלבון NTAP immunoprecipitated לא לבודד במשותף עם כל TOC, טיק חלבונים ומאשר את הספציפיות של הטיהור TAP-TOC159. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי ייבוא חלבון כלורופלסט, ניתן ליישם אותה על כל קומפלקס אחר במערכת בקבוקי התאליאנה Arabidopsis. בעקבות הליך זה, ניתן ליישם שיטות אחרות כגון סופג מערבי או ספקטרומטריית מסה כדי להדגים את נוכחותם של רכיבים ידועים או כדי לזהות רכיבים חדשים של מתחמי TOC ו- TIC.
טכניקה זו סללה את הדרך למחקר בתחום ייבוא החלבון כלורופלסט כדי לחקור את הפונקציה של רכיבים חדשים של מתחמי TOC ו- TIC.
