עבודה זו נתמכה על ידי משרד המדע והטכנולוגיה (MOST 104-2311-B-001-034) והמכון סלולארית וביולוגיה והאורגניזמית, Academia Sinica, טייוואן.

1. בניית tsMARCM המוכן זבובי שימוש החובה Transgenes 11, 13 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור את הגרסה המקורית של זבובי tsMARCM מוכנים מן transgenes הנזקפים על ידי זבובי פרט 11 (ראה טבלה 1). לביצוע מזימות מעבר גנטיים רגילות זבוב, אשר תוארו בעבר, על ידי צבת transgenes המרובה באותו המניות לטוס 13. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באחד קו הורי, להרכיב את transgenes של FRT 40A, כטב&quot;מ- mCD8 :: GFP (הכתב הראשון, mCD8 :: GFP; ביטוי של transgene הוא תחת השליטה של אמרגן רצף הפעלה במעלה הזרם, אשר מייצרת עיתונאי קשור-קרום של העכבר מקבץ של חלבון בידול 8 התמזגו עם חלבון פלואורסצנטי ירוק), ו כטב&quot;מ-rCD2RNAi (להלן מדכא כי מעכב התבטאות הכתב השני, את RNAi נגד ביטוי o אשכול עכברושf בידול 2, rcd2) על יד שמאל של כרומוזום 2 nd. מקום רקמות ספציפיות הנהג -GAL4 על X או 3 rd כרומוזום, במידת האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשורת ההורים אחרת, להרכיב את transgenes של 40A FRT, כטב&quot;מ-rCD2 :: RFP (הכתב השני, rCD2 :: RFP; כתב הקרום קשור אחרים מורכבים של חלבון rCD2 התמזג עם חלבון פלואורסצנטי אדום), ו כטב&quot;מ-GFPRNAi (את מדכא זה מעכב את הביטוי של ה- GFP :: mCD8, את RNAi נגד הביטוי של ה- GFP) על יד שמאל של כרומוזום 2 nd. מניחים-הלם חום (hs) -FLP או FLP specific--רקמה על X או 3 rd כרומוזום, במידת האפשר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור את הגרסה החדשה של זבובי tsMARCM מוכנים מן transgenes הנזקפים על ידי זבובי פרט 14 (ראה טבלה 1). לביצוע מזימות מעבר גנטי רגילות זבוב, אשר תוארו previously, על ידי הצבת transgenes מרובים באותו מניות לטוס 13. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באחד קו הורית, להרכיב את transgenes של אתר FRT ו כטב&quot;מ-mCD8.GFP.UAS-rCD2i (א transgene בשילוב של mCD8 :: GFP ואת מדכא כי מעכב התבטאות rCD2 :: RFP) ביחד באותו זרוע 2 nd או 3 rd כרומוזום (זוגות מתאימים של transgenes של FRT ו כטב&quot;מ-mCD8.GFP.UAS-rCD2i מסומנים בטבלה 1). מניח נהג הרקמות הספציפי-GAL4 בכרומוזומים מלבד כרומוזום של אתר FRT הנבחר, אם אפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשורת ההורים אחרת, להרכיב את transgenes של אתר FRT ו כטב&quot;מ-rCD2.RFP.UAS-GFPi (את הגן המשולב אחרים של rCD2 :: RFP ואת המדכא כי מעכב התבטאות mCD8 :: GFP) באותה הזרוע של כרומוזום 2 nd או 3 rd (זוגות מתאימים של transgenes של FRT </em&gt; ו כטב&quot;מ-rCD2.RFP.UAS-GFPi מסומנים בטבלה 1). מקום hs-FLP או רקמות ספציפיות-FLP על הכרומוזומים למעט כרומוזום של האתר FRT הנבחר, אם אפשר. </li></ol></li></ol> 2. הצלב tsMARCM מוכן מתקיף צור tsMARCM המשובטים בקרב צאצאיהם&quot; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצלב tsMARCM מוכן זבובים יחד (למשל, לשים 10-15 זבובים זכרים משלב 1.1.1 או 1.2.1 ו- 20-30 הנשי בתולה זבובים משלב 1.1.2 או 1.2.2 יחד) בבקבוקון מזון-fly עם טרי להדביק שמרים -made על הקיר של הבקבוקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על זבובי tsMARCM המוכנים חצו במהירות של 25 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים כדי לשפר את הסיכוי של הזדווגות לפני איסוף ביצים מופרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעתים קרובות להעביר את הזבובים tsMARCM המוכנים חצו לתוך צלוחיות yeasted הטרי כדי למנוע צפיפות (להקיש את הזבובים או להשתמש פחמן דו חמצני כדי להרדים את הזבובים כדי להקל על ההעברה; לשמור על לא יותר מ 80-100 ביצים מופרות בתוך מזון לטוס 10 מיליליטר דרךl להימנע מדי הזחלים בקעו). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות החיות tsMARCM (כלומר, ביצים מופרות; דוגמה של הגנוטיפ של חיות tsMARCM, כפי שמוצג באיור 3, הוא hs-FLP [22], w / w; כטב&quot;מ- mCD8 :: GFP, כטב&quot;מ-rCD2RNAi, FRT 40A , GAL4-GH146 / כטב&quot;מ-rCD2 :: RFP, כטב&quot;מ-GFPRNAi, 40A FRT; +; +) אשר נקבע ב הצלוחיות הועברו הסדרה של 25 מעלות צלזיוס עד שהם מפתחים לשלבים הרצויים (למשל, עובר, הזחלים, או גלמים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את הבקבוקונים הועברו המכילים חיות tsMARCM באותו שלב התפתחותי כדי באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 10, 20, 30, 40, ו -50 דקות כדי לקבוע את הזמן האופטימלי של הלם חום שגורם ביטוי של FLP על מנת ליצור את שיבוטים של עניין tsMARCM. דלג על שלב זה אם FLP רקמות specific- נמצא בשימוש בניסוי tsMARCM (hs-FLP היא מועדפת עבור שושלת עצבית מנתח; הסיבות להעדפה זו תוארו בעבר 15). הערה: חזור על שלב 2.5 באמצעות הזמן האופטימלי של הלם חום בניסויים tsMARCM בעתיד אם יותר שיבוטים tsMARCM עניין מבוקשים; בדרך כלל, ביטוי FLP יותר מושרה hs-FLP [22] לעומת hs-FLP [1] עם הזמן חום הלם אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות החיות tsMARCM-בהלם חום של 25 מעלות צלזיוס עד שהם הגיעו לשלב ההתפתחותי המתאים, ולאחר מכן המשך לשלב 3. </li></ol> 3. כן, כתם, מוח טס הר המכיל tsMARCM המשובטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו מאכלים מלקחיים-הגנה. מערבבים חלק (30 גרם) וחלק ב &#39;(3 גרם) של ערכת אלסטומר סיליקון עם פחם פעיל (0.25 גרם). יוצקים את התערובת לתוך מנות המתאימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח זחל, גלמים או מוחות בוגרים מתוך חי tsMARCM המלוחים פוספט שנאגר 1x (PBS) באמצעות מלקחיים על צלחת מלקחיים-הגנה מוצגת באמצעות מיקרוסקופ לנתיחה. הערה: פרוטוקול לנתיחת מוח לטוס כבר יורדתribed בעבר 16. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את המוח זבוב בצלחת במקום זכוכית עם PBS 1x המכיל פורמלדהיד 4% בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. לעבד את המוח זבוב בצלחת במקום זכוכית זה לשארית המדרגות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את המוח לטוס שלוש פעמים עם 1% PBT (PBS 1x המכיל 1% Triton X-100) ולשטוף אותם שלוש פעמים במשך 30 דקות כל אחד PBT 1% (לשטוף: להסיר PBT ולהוסיף PBT חדשים במהירות; לשטוף: להסיר PBT, להוסיף חדשים PBT, דגירת מוח הזבוב בתוך PBT החדש באמצעות שייקר מסלולית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה המוח לטוס עם תערובת של נוגדנים ראשוניים לילה ב 4 מעלות צלזיוס או 4 שעות בטמפרטורת החדר. דוגמה של תערובת של נוגדנים ראשוניים הוא עכברוש נוגדן אנטי CD8 (1: 100), נוגדן אנטי DsRed ארנב (1: 800), ועכבר אנטי Bruchpilot (BRP) נוגדנים (1:50) ב 1% PBT המכיל 5% נסיוב עז נורמלי (NGS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את המוח לטוס שלוש פעמים עם 1% PBT, ולאחר מכן לשטוף אותם שלוש פעמים במשך 30 דקות כל אחד עם 1% PBT. </li><li&gt; דגירה המוח לטוס עם תערובת של נוגדנים משני לילה ב 4 מעלות צלזיוס או 4 שעות בטמפרטורת החדר. דוגמה של תערובת של נוגדנים משני הוא נוגדן IgG אנטי עכברוש עיזים מצומדות עם צבע ירוק ניאון (1: 800), נוגדן IgG נגד ארנב עז מצומדות עם צבע צהוב-ניאון (1: 800), ו עז נגד העכבר נוגדן IgG מצומדות עם צבע מרחיקות אדום-ניאון (1: 800) ב PBT 1% המכיל 5% NGS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את המוח לטוס שלוש פעמים עם 1% PBT, ולאחר מכן לשטוף אותם שלוש פעמים במשך 30 דקות כל אחד עם 1% PBT. הר אותם בשקופית מיקרו עם מגיב אנטי מרווה. שים כוס כיסוי מיקרו בשקופית מיקרו לכסות ולהגן על המוח זבוב. חותם את הקצוות של השקופית זכוכית מיקרו כיסוי מיקרו באמצעות לק ברור. אחסן רכוב אלה וחתומים לטוס דגימות מוח על 4 מעלות צלזיוס. </li></ol> 4. קחו, תהליך, ולנתח תמונות פלורסנט משובטים tsMARCM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלמו תמונות הניאון של fr שיבוטים tsMARCMאום הדגימות שנוצרו בשלב 3.8 באמצעות מערכת מיקרוסקופיה confocal של בחירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ערימות הפרויקט של תמונות ניאון confocal tsMARCM לתוך דו מימדי, שטוח התמונות באמצעות תוכנת עיבוד תמונה מסופק עם מערכת מיקרוסקופיה confocal של בחירה (ראה איור 3B - 3E, 3G - 3J, 3L - 3O, ו 3Q - 3T לדוגמאות של בברוטליות תמונות ניאון confocal). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את מספר הסלולרי של הצדדים רב תאיים-NB של שיבוטים tsMARCM באמצעות תוכנת עיבוד תמונה מתאימה (למשל, הפונקציה &quot;מונה תא&quot; ב ImageJ 17; ראה 3E איור, 3J, 3O, ו 3T לדוגמאות של התא גופות נוירונים). </li></ol>

<ol>
	<li>Ito, M., Masuda, N., Shinomiya, K., Endo, K., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+analysis+of+neural+projections+reveals+clonal+composition+of+the+Drosophila+brain.">Systematic analysis of neural projections reveals clonal composition of the Drosophila brain.</a> Curr Biol. 23 (8), 644-655 (2013).</li><li>Yu, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+development+and+organization+of+the+adult+Drosophila+central+brain.">Clonal development and organization of the adult Drosophila central brain.</a> Curr Biol. 23 (8), 633-643 (2013).</li><li>Goodman, C. S., Doe, C. Q., Bate, M., Arias, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , (1993).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).</li><li>Lee, T., Lee, A., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+Drosophila+mushroom+bodies:+sequential+generation+of+three+distinct+types+of+neurons+from+a+neuroblast.">Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast.</a> Development. 126 (18), 4065-4076 (1999).</li><li>Lee, T., Marticke, S., Sung, C., Robinow, S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-autonomous+requirement+of+the+USP/EcR-B+ecdysone+receptor+for+mushroom+body+neuronal+remodeling+in+Drosophila.">Cell-autonomous requirement of the USP/EcR-B ecdysone receptor for mushroom body neuronal remodeling in Drosophila.</a> Neuron. 28 (3), 807-818 (2000).</li><li>Chiang, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+brain-wide+wiring+networks+in+Drosophila+at+single-cell+resolution.">Three-dimensional reconstruction of brain-wide wiring networks in Drosophila at single-cell resolution.</a> Curr Biol. 21 (1), 1-11 (2011).</li><li>Jefferis, G. S., Marin, E. C., Stocker, R. F., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+neuron+prespecification+in+the+olfactory+map+of+Drosophila.">Target neuron prespecification in the olfactory map of Drosophila.</a> Nature. 414 (6860), 204-208 (2001).</li><li>Hong, W., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+control+of+wiring+specificity+in+the+fly+olfactory+system.">Genetic control of wiring specificity in the fly olfactory system.</a> Genetics. 196 (1), 17-29 (2014).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gradients+of+the+Drosophila+Chinmo+BTB-zinc+finger+protein+govern+neuronal+temporal+identity.">Gradients of the Drosophila Chinmo BTB-zinc finger protein govern neuronal temporal identity.</a> Cell. 127 (2), 409-422 (2006).</li><li>Yu, H. H., Chen, C. H., Shi, L., Huang, Y., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twin-spot+MARCM+to+reveal+the+developmental+origin+and+identity+of+neurons.">Twin-spot MARCM to reveal the developmental origin and identity of neurons.</a> Nat Neurosci. 12 (7), 947-953 (2009).</li><li>Yu, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complete+developmental+sequence+of+a+Drosophila+neuronal+lineage+as+revealed+by+twin-spot+MARCM.">A complete developmental sequence of a Drosophila neuronal lineage as revealed by twin-spot MARCM.</a> PLoS Biol. 8 (8), (2010).</li><li>Greenspan, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fly pushing : the theory and practice of Drosophila genetics. , (1997).</li><li>Awasaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+Drosophila+lineage-restricted+drivers+via+patterned+recombination+in+neuroblasts.">Making Drosophila lineage-restricted drivers via patterned recombination in neuroblasts.</a> Nat Neurosci. 17 (4), 631-637 (2014).</li><li>Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+mosaics+for+lineage+analysis+in+flies.">Generating mosaics for lineage analysis in flies.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 3 (1), 69-81 (2014).</li><li>Wu, J. S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+dissecting+Drosophila+melanogaster+brains+for+live+imaging+or+immunostaining.">A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining.</a> Nat Protoc. 1 (4), 2110-2115 (2006).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Lin, S., Kao, C. F., Yu, H. H., Huang, Y., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+analysis+of+Drosophila+lateral+antennal+lobe+neurons+reveals+notch-dependent+binary+temporal+fate+decisions.">Lineage analysis of Drosophila lateral antennal lobe neurons reveals notch-dependent binary temporal fate decisions.</a> PLoS Biol. 10 (11), e1001425 (2012).</li><li>Zhan, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Dscam+diversity+in+regulating+axon+guidance+in+Drosophila+mushroom+bodies.">Analysis of Dscam diversity in regulating axon guidance in Drosophila mushroom bodies.</a> Neuron. 43 (5), 673-686 (2004).</li><li>Griffin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+twin+spot+generator+for+differential+Drosophila+lineage+analysis.">The twin spot generator for differential Drosophila lineage analysis.</a> Nat Methods. 6 (8), 600-602 (2009).</li><li>Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Q+system:+a+repressible+binary+system+for+transgene+expression,+lineage+tracing,+and+mosaic+analysis.">The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis.</a> Cell. 141 (3), 536-548 (2010).</li><li>Lai, S. L., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+mosaic+with+dual+binary+transcriptional+systems+in+Drosophila.">Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila.</a> Nat Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).</li><li>Kao, C. F., Yu, H. H., He, Y., Kao, J. C., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+deployment+of+factors+regulating+temporal+fate+in+a+diverse+neuronal+lineage+of+the+Drosophila+central+brain.">Hierarchical deployment of factors regulating temporal fate in a diverse neuronal lineage of the Drosophila central brain.</a> Neuron. 73 (4), 677-684 (2012).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול צעדים 1.1.1, 1.2.1, 2.3, 2.5, ו -3.2 הם קריטיים להשגת תוצאות tsMARCM טובות. רקמות ספציפיות נהגי -GAL4 כי אינו מבטא GAL4 ב אבות עצביים הם העדיפו צעדים 1.1.1 1.2.1. הימנע צפיפות גדולה החיות גדלו צלוחיות-אוכל לטוס בשלב 2.3. מכיו?...

המוח, מורכב ממספר עצום וסוגים מגוונים של נוירונים, מעניק חיות עם היכולת לתפוש, תהליך, ולהגיב לאתגרים מהעולם החיצוני. נוירונים של המוח המרכזי תסיסנית המבוגר נגזרים ממספר מצומצם של תאי גזע עצביים, neuroblasts שנקרא (NBS), במהלך התפתחות 1, 2. רוב NBS המשתתפים neurogenesis המוח תסיסנית עוברים חלוקה סימטרית לייצר NBS עצמית חידוש תאים אמא גנגליון (GMCs), ואת GMCs ואז לעבור לעוד סיבוב של חלוקת לייצר שני לתאי הבת כי להתמיין נוירונים 3 (איור 1 א ). בגלל המורכבות של מורפולוגיה עצבית ואת האתגרים הקשורים בזיהוי נוירונים ספציפיים, טכנולוגית תיוג פסיפס חיובית, ניתוח פסיפס עם סמן תא repressible (MARCM), הומצא כדי לאפשר visualizatיון של נוירון בודד או קבוצה קטנה של נוירונים מתוך אוכלוסיית נוירונים שמסביב, ללא תווית 4. MARCM מנצל את flippase (FLP) / היעד הכרה FLP (FRT) מערכת לתווך רקומבינציה אתר ספציפי בין כרומוזומים הומולוגיים בתוך תא המפריד מבשר נושאת אלל הטרוזיגוטיים של גן מדכא, שביטויים בדרך כלל מעכב את הביטוי של הגן הכתב 4. לאחר חלוקת mitotic, הכרומוזומים רקומביננטי מופרדים לתאים התאום, כך תא אחד מכיל אללים הומוזיגוטים של הגן מדכא והתא השני אין גן-the מדכא ביטוי של הכתב בתא כי (וצאצאיו) הוא כבר לא חסם 4. שלושה דפוסי המשובטים נמצאים בדרך כלל ניסוי MARCM כאשר FLP מושרה stochastically ב- NBS או GMCs: תא בודד ושני תאים-GMC שיבוטים, המתארים מורפולוגיה העצבית ב resolutio תא בודדn, ומשכפל רב התאי-NB, המגלה דפוסי מורפולוגיים כולו של נוירונים נגזרו NB משותף (איור 1 ב). טכניקת MARCM הוחלה נרחבת במחקרים הנוירוביולוגי תסיסנית, לרבות זיהוי סוג עצבי לשחזור רשתות חיווט-רחב מוח, שושלת עצבית ניתוחית לחשוף את ההיסטוריה ההתפתחותית של נוירונים, אפיון פנוטיפי של פונקציות גן מעורבות מפרט גורל תא, ומורפוגנזה עצבית והבחנה לומדת 5, 6, 7, 8, 9, 10. בגלל MARCM הקונבנציונלי רק תוויות אחד משני התאים הבת (שושלות) לאחר אירוע רקומבינציה mitotic המושרה, מידע שימושי פוטנציאלי מהצד המסומן הולך לאיבוד. מגבלה זו מונעת את היישום של M הבסיסימערכת ARCM כדי ברזולוציה גבוהה מנתח של שושלות עצביות רבות לעבור גורלות תא קצב מהיר או דיוק מנתח של פונקציות גן בנוירונים זהה של בעלי חיים שונים 11, 12. Twin-spot MARCM (tsMARCM) הנו מערכת מתקדמת המאפשרים תוויות נוירונים נגזרו אב משותף עם שני צבעים שונים, אשר מאפשרת שחזור של מידע שימושי משני צידי תאי התאומים, ובכך להתגבר על המגבלה של מערכת MARCM המקורית 11 ( איור 2 א - 2C). במערכת tsMARCM, שתי התערבות RNA (RNAi) מבוססת מדכאי ממוקמים ב-אתרי טרנס של כרומוזומים הומולוגיים בתוך תא מבשר, והביטוי של מדכאים אלה באופן עצמאי לעכב את הביטוי של העיתונאים שלהם (איור 2 ב). בעקבות רקומבינציה mitotic באתר ספציפי בתיווכם של מערכת FLP / FRT, את two מדכאים מבוססים RNAi להיות הפרדה לתאים התאום להתיר את הביטוי של עיתונאים נפרדים (איור 2 ב). שני דפוסים משובטים, תא בודד הקשורים שיבוטי תא בודד ושני תאים-GMC הקשורים שיבוטים רבים תאי-NB, נתפסים בדרך כלל בניסוי tsMARCM (איור 2 ג). מידע נגזר צד אחד של תאי התאומים יכול להיות מנוצל כהפניה עבור הצד השני, מה שמאפשר שושלת עצבית ברזולוציה גבוהה מנתח, כגון לידת היכרויות הנוירונים שכותרתו, פנוטיפי מנתח של נוירונים זהים בחיות שונות לחקירה המדויקת של תפקוד גן עצבי 11, 12. כאן, אנו מציגים צעד-אחר-צעד פרוטוקול המתאר כיצד לערוך ניסוי tsMARCM, אשר ניתן להשתמש בהם על ידי מעבדות אחרות כדי להרחיב את לימודיהם של ההתפתחות העצבית (כמו גם התפתחות של רקמות אחרות, אם זה אפשרי) תסיסנית.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide (CO2)</td>
			<td>Local vendor</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Anesthetize flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 pad</td>
			<td>Local vendor</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Sort, cross and transfer flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS pH 7.4</td>
			<td>Uniregion Bio-Tech (or other vendors)</td>
			<td>PBS001</td>
			<td>Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252549</td>
			<td>Fix fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Rinse, wash and immunostain fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat</td>
			<td rowspan="2">Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td rowspan="2">005-000-121</td>
			<td rowspan="2">Immunostain fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD8 antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MCD0800</td>
			<td>Immunostain fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-DsRed antibody</td>
			<td>Clonetech</td>
			<td>632496</td>
			<td>Immunostain fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Brp antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>nc82</td>
			<td>Immunostain fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11006</td>
			<td>Immunostain fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11035</td>
			<td>Immunostain fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21236</td>
			<td>Immunostain fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlowFade gold antifade reagent</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>S36936</td>
			<td>Mount fly brains and protect quenching of fluorescence&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX 9 depression glass spot plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7220-85</td>
			<td>Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYLG184</td>
			<td>Make black Sylgard dishes to protect forceps during brain dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activated charcoal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>242276-250G</td>
			<td>Make black Sylgard dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-30</td>
			<td>Dissect and mount fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro slide</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2948-75x25</td>
			<td>Mount fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover glass No.1.5</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>48366-205</td>
			<td>Mount fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td>Local vendor</td>
			<td>not available</td>
			<td>Seal micro cover glass on micro slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Incubator&#160;</td>
			<td>Kansin Instruments</td>
			<td rowspan="2">LTI603</td>
			<td rowspan="2">culture flies at 25&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(or other vendors)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Water bath</td>
			<td>Kansin Instruments</td>
			<td rowspan="2">WB212-B2</td>
			<td rowspan="2">Induce heat-shock in flies at 37&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(or other vendors)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Orbital shaker</td>
			<td>Kansin Instruments</td>
			<td rowspan="2">OS701</td>
			<td rowspan="2">Wash and immunostain fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(or other vendors)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EZ4</td>
			<td>Sort, cross and transfer flies; Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss (or other vendors)</td>
			<td>LSM 700 (or other models)</td>
			<td>Image tsMARCM clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>image-processing software 1 
			(e.g., Zeiss LSM image browser)&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>not available</td>
			<td>Project stacks of confocal images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>image-processing software 2 
			(e.g., Image-J)&#160;</td>
			<td>not available</td>
			<td>not available</td>
			<td>Count cell number of tsMARCM clones</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell lineage analyses and gene function studies using twin-spot marcm

M osaic nalysis עם arker ג r epressible ell מ (MARCM) היא מערכת תיוג פסיפס חיובית כי כבר מיושמת באופן נרחב במחקרים הנוירוביולוגי תסיסנית לתאר מורפולוגיות מסובכות כדי לתפעל את הפונקציה של גנים תת קבוצות של נוירונים בתוך אחר לא מסומן ו שאנן אורגניזמים. פסיפסים גנטיים שנוצרו במערכת MARCM באים לידי ביטוי בתיווכם רקומבינציה אתר ספציפי בין כרומוזומים ההומולוגיים בתוך חלוקת תאים מבשרים לייצור הן (שיבוטי MARCM) מסומן לתאים בת לא מסומנים במהלך מיטוזה. הארכת תוקפה של שיטת MARCM, MARCM תאום המקום שנקרא (tsMARCM), תוויות הן של תאי התאום נגזרו אב משותף עם שני צבעים שונים. טכניקה זו פותחה כדי לאפשר שהליפה של מידע שימושי משני-השושלות החמות. על ידי מקיף וניתוח זוגות שונים של שיבוטי tsMARCM, מערכת tsMARCM מתירה mappin שושלת עצבית ברזולוציה גבוההז כדי לחשוף את הלידה-הסדר המדויק של נוירונים שכותרתו מופק ובתאים משותפים. כמו כן, מערכת tsMARCM גם מרחיבה מחקרים לתפקד גנים על ידי מתיר הניתוח פנוטיפי של נוירונים זהים של בעלי חיים שונים. כאן אנו מתארים כיצד ליישם את מערכת tsMARCM כדי להקל על מחקרים של ההתפתחות העצבית תסיסנית.

מערכת tsMARCM נעשה שימוש כדי להקל על שושלת עצבית מנתח ומחקרי תפקוד הגן באמצעות אחזור מידע חשוב על נוירונים נגזרו NBS המשותף. המערכת נעשתה שימוש כדי לזהות את רוב (אם לא כל) סוגי נוירונים, לקבוע את המספר הסלולרי של כל סוג עצבי, ותוודא הלידה מהסדר של נוירונים ...

Watch this Scientific Journal Video about Cell Lineage Analyses and Gene Function Studies Using Twin-spot MARCM at JoVE.com

Cell Lineage Analyses and Gene Function Studies Using Twin-spot MARCM

כאן, אנו מציגים פרוטוקול טכניקת תיוג פסיפס המאפשרת ההדמיה של נוירונים נגזרו תא אב משותף בשני צבעים שונים. זה מקל על ניתוחי שושלת עצביים עם היכולת של נוירונים בודדים היכרויות לידת תפקוד גן הלומדים באותו נוירונים של אנשים שונים.

ניתוח שושלת תא ולימודי תפקוד גן באמצעות Twin-spot MARCM

Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) is a positive mosaic labeling system that has been widely applied in Drosophila neurobiological ...

cell-lineage-analyses-and-gene-function-studies-using-twin-spot-marcm

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.9K Views.  Academia Sinica.  כאן, אנו מציגים פרוטוקול טכניקת תיוג פסיפס המאפשרת ההדמיה של נוירונים נגזרו תא אב משותף בשני צבעים שונים. זה מקל על ניתוחי שושלת עצביים עם היכולת של נוירונים בודדים היכרויות לידת תפקוד גן הלומדים באותו נוירונים של אנשים שונים. 

Video: Cell Lineage Analyses and Gene Function Studies Using Twin-spot MARCM

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying the biology of retinal neurons, particularly photoreceptors. The applications of this system go beyond basic research, as they can easily be adapted to high throughput technologies for drug development. However, genetic manipulation of retinal photoreceptors in these cultures has proven to be very challenging, posing an important limitation to the usefulness of the system. We have recently developed and validated an ex&#160;ovo plasmid electroporation technique that increases the rate of transfection of retinal cells in these cultures by five-fold compared to other currently available protocols1. In this method embryonic chick eyes are enucleated at stage 27, the RPE is removed, and the retinal cup is placed in a plasmid-containing solution and electroporated using easily constructed custom-made electrodes. The retinas are then dissociated and cultured using standard procedures. This technique can be applied to overexpression studies as well as to the downregulation of gene expression, for example via the use of plasmid-driven RNAi technology, commonly achieving transgene expression in 25% of the photoreceptor population. The video format of the present publication will make this technology easily accessible to researchers in the field, enabling the study of gene function in primary retinal cultures. We have also included detailed explanations of the critical steps of this procedure for a successful outcome and reproducibility.

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Embryonic chick retinal cell cultures constitute valuable tools for the study of photoreceptor biology. We have developed an efficient gene transfer technique based on ex&#160;ovo plasmid electroporation of the retinas prior to culture. This technique considerably increases transfection efficiencies over currently available protocols, making genetic manipulation feasible for this system.

העברה יעילה ג&#39;ין בצ&#39;יק הרשתיות לסלולריים יסודי לימודי תרבות:<em&gt; אקס-אוב</em&gt; גישת Electroporation

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Organotypic Slice Cultures for Studies of Postnatal Neurogenesis

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This method maintains the characteristic topographical morphology of the hippocampus while allowing direct application of pharmacological agents to the developing hippocampal dentate gyrus. Additionally, slice cultures can be maintained for up to 4 weeks and thus, allow one to study the maturation process of newborn granule neurons. Slice cultures allow for efficient pharmacological manipulation of hippocampal slices while excluding complex variables such as uncertainties related to the deep anatomic location of the hippocampus as well as the blood brain barrier. For these reasons, we sought to optimize organotypic slice cultures specifically for postnatal neurogenesis research.

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis using the organotypic slice culture technique. This method allows for in vitro manipulation of adult neurogenesis and allows for the direct application of pharmacological agents to the cultured hippocampus.

תרבויות Organotypic Slice ללימודים של אחרי לידה נוירוגנזה

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This ...

Efficient Generation of hiPSC Neural Lineage Specific Knockin Reporters Using the CRISPR/Cas9 and Cas9 Double Nickase System

Gene targeting is a critical approach for characterizing gene functions in modern biomedical research. However, the efficiency of gene targeting in human cells has been low, which prevents the generation of human cell lines at a desired rate. The past two years have witnessed a rapid progression on improving efficiency of genetic manipulation by genome editing tools such as the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) system. This manuscript describes a protocol for generating lineage specific human induced pluripotent stem cell (hiPSC) reporters using CRISPR/Cas system assisted homologous recombination. Procedures for obtaining necessary components for making neural lineage reporter lines using the CRISPR/Cas system, focusing on construction of targeting vectors and single guide RNAs, are described. This protocol can be extended to platform establishment and mutation correction in hiPSCs.

Genome editing tools such as the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) system have greatly improved gene targeting efficiency in human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). This manuscript describes a protocol for generating lineage specific hiPSC reporter using CRISPR/Cas system assisted homologous recombination.

דור יעיל של כתבים במכות ספציפיים Lineage hiPSC עצבי באמצעות CRISPR / Cas9 ומערכת Nickase זוגי Cas9

Gene targeting is a critical approach for characterizing gene functions in modern biomedical research. However, the efficiency of gene targeting in human ...

A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied for many decades, revealing seminal findings in developmental biology. More recently, it was adopted by stem cell biologists to identify and track different stem cell populations with minimal experimental intervention. The recent developments in mouse genetics, the availability of a large number of mouse strains, and the advancements in fluorescent microscopy allow the straightforward design of powerful lineage tracing systems for various tissues with basic expertise, using commercially available tools. We have recently taken advantage of this powerful methodology to explore the origin and fate of stem cells at the ocular surface using R26R-Confetti mouse. This model offers a multi-color genetic system, for the expression of 4 fluorescent genes in a random manner. Here we describe the principles of this methodology and provide an adaptable protocol for designing lineage tracing experiments; specifically for the corneal epithelium as well as for other tissues.

In this article we describe the principles for designing and performing a multi-color lineage tracing experiment using R26R-Confetti mice. We provide a specific protocol for tracking corneal epithelial cells which can be modified for other tissues of interest.

שיטה לאיתור שושלת של תאי קרנית באמצעות עכברים כתב ניאון רב-צבע

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

Co-localization of Cell Lineage Markers and the Tomato Signal

The cell lineage tracing system has been used predominantly in developmental biology studies. The use of Cre recombinase allows for the activation of the reporter in a specific cell line and all progeny. Here, we used the cell lineage tracing technique to demonstrate that chondrocytes directly transform into osteoblasts and osteocytes during long bone and mandibular condyle development using two kinds of Cre, Col10a1-Cre and Aggrecan-CreERT2 (Agg-CreERT2), crossed with Rosa26tdTomato. Both Col10 and aggrecan are well-recognized markers for chondrocytes.
On this basis, we developed a new method-cell lineage tracing in conjunction with fluorescent immunohistochemistry-to define cell fate by analyzing the expression of specific cell markers. Runx2 (a marker for early-stage osteogenic cells) and Dentin matrix protein1 (DMP1; a marker for late-stage osteogenic cells) were used to identify chondrocyte-derived bone cells and their differentiation status. This combination not only broadens the application of cell lineage tracing, but also simplifies the generation of compound mice. More importantly, the number, location, and differentiation statuses of parent cell progeny are displayed simultaneously, providing more information than cell lineage tracing alone. In conclusion, the co-application of cell lineage tracing techniques and immunofluorescence is a powerful tool for investigating cell biology in vivo.

We developed two sets of tracing combinations in Rosa26tdtomato (ubiquitously expressed in all cells)/Cre (specifically expressed in chondrocytes) mice: one with 2.3Col1a1-GFP (specific to osteoblasts) and one with immunofluorescence (specific to bone cells). The data demonstrate the direct transformation of chondrocytes into bone cells.

שיתוף לוקליזציה של סמני שושלת תא ואת האיתותים העגבניות

The cell lineage tracing system has been used predominantly in developmental biology studies. The use of Cre recombinase allows for the activation of the ...

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into the developing oocyte. Because these events rely on maternal products which typically act very soon after fertilization-that preexist inside the egg, standard approaches for expression and functional reduction involving the injection of reagents into the fertilized egg are typically ineffective. Instead, such manipulations must be performed during oogenesis, prior to or during the accumulation of maternal products. This article describes in detail a protocol for the in vitro maturation of immature zebrafish oocytes and their subsequent in vitro fertilization, yielding viable embryos that survive to adulthood. This method allows the functional manipulation of maternal products during oogenesis, such as the expression of products for phenotypic rescue and tagged construct visualization, as well as the reduction of gene function through reverse-genetics agents.

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

An optimized protocol for the in vitro maturation of zebrafish oocytes used for the manipulation of maternal gene products is presented here.

מניפולציה פונקציונלית של מוצרים אימהיים הגן באמצעות<em&gt; במבחנה</em&gt; הבשלת ביצית דג הזברה

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into ...

Structure-function Studies in Mouse Embryonic Stem Cells Using Recombinase-mediated Cassette Exchange

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of the cell and often consist of multiple functional domains, which can be influenced by posttranslational modifications. The depletion of the entire protein in conditional or constitutive knock-out (KO) mice does not take into account this functional diversity and regulation. An mESC line and a derived mouse model, in which a docking site for FLPe recombination-mediated cassette exchange (RMCE) was inserted within the ROSA26 (R26) locus, was previously reported. Here, we report on a structure-function approach that allows for molecular dissection of the different functionalities of a multidomain protein. To this end, RMCE-compatible mice must be crossed with KO mice and then RMCE-compatible KO mESCs must be isolated. Next, a panel of putative rescue constructs can be introduced into the R26 locus via RMCE targeting. The candidate rescue cDNAs can be easily inserted between RMCE sites of the targeting vector using recombination cloning. Next, KO mESCs are transfected with the targeting vector in combination with an FLPe recombinase expression plasmid. RMCE reactivates the promoter-less neomycin-resistance gene in the ROSA26 docking sites and allows for the selection of the correct targeting event. In this way, high targeting efficiencies close to 100% are obtained, allowing for insertion of multiple putative rescue constructs in a semi-high throughput manner. Finally, a multitude of R26-driven rescue constructs can be tested for their ability to rescue the phenotype that was observed in parental KO mESCs. We present a proof-of-principle structure-function study in p120 catenin (p120ctn) KO mESCs using endoderm differentiation in embryoid bodies (EBs) as the phenotypic readout. This approach enables the identification of important domains, putative downstream pathways, and disease-relevant point mutations that underlie KO phenotypes for a given protein.

Proteins often contain multiple domains that can exert different cellular functions. Gene knock-outs (KO) do not consider this functional diversity. Here, we report a recombination-mediated cassette exchange (RMCE)-based structure-function approach in KO embryonic stem cells that allows for the molecular dissection of various functional domains or variants of a protein.

מחקרי מבנה-תפקוד תאי גזע עוברי עכבר שימוש recombinase בתיווך Exchange קסטה

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of ...

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors of the diseases. To validate the contribution of a dysfunction of the mutated genes to disease development, the generation of animal models carrying the mutations is one obvious approach. While germline genetically engineered mouse models (GEMMs) are popular biological tools and exhibit reproducible results, it is restricted by time and costs. Meanwhile, non-germline GEMMs often enable exploring gene function in a more feasible manner. Since some brain diseases (e.g., brain tumors) appear to result from somatic but not germline mutations, non-germline chimeric mouse models, in which normal and abnormal cells coexist, could be helpful for disease-relevant analysis. In this study, we report a method for the induction of CRISPR-mediated somatic mutations in the cerebellum. Specifically, we utilized conditional knock-in mice, in which Cas9 and GFP are chronically activated by the CAG (CMV enhancer/chicken &#223;-actin) promoter after Cre-mediated recombination of the genome. The self-designed single-guide RNAs (sgRNAs) and the Cre recombinase sequence, both encoded in a single plasmid construct, were delivered into cerebellar stem/progenitor cells at an embryonic stage using in utero electroporation. Consequently, transfected cells and their daughter cells were labeled with green fluorescent protein (GFP), thus facilitating further phenotypic analyses. Hence, this method is not only showing electroporation-based gene delivery into embryonic cerebellar cells but also proposing a novel quantitative approach to assess CRISPR-mediated loss-of-function phenotypes.

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

Conventional loss-of-function studies of genes using knockout animals have often been costly and time-consuming. Electroporation-based CRISPR-mediated somatic mutagenesis is a powerful tool to understand gene functions in vivo. Here, we report a method to analyze knockout phenotypes in proliferating cells of the cerebellum.

בתיווך CRISPR אובדן ניתוח פונקציה גרגר אסטרוציטומה תאים באמצעות בתוך הרחם מבוסס-אלקטרופורציה את ההעברה של ג'ין

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. The classical histochemical reaction is based on the hydrolysis of the substrate X-gal in combination with ferric and ferrous ions, which produces an insoluble blue precipitate that is easy to visualize. Therefore, &#946;-galactosidase activity serves as a marker for the expression pattern of the gene of interest as the development proceeds. Here we describe the standard protocol for the detection of &#946;-galactosidase activity in early whole mouse embryos and the subsequent method for paraffin sectioning and counterstaining. Additionally, a procedure for clarifying whole embryos is provided to better visualize X-gal staining in deeper regions of the embryo. Consistent results are obtained by performing this procedure, although optimization of reaction conditions is needed to minimize background activity. Limitations in the assay should be also considered, particularly regarding the size of the embryo in whole mount staining. Our protocol provides a sensitive and a reliable method for &#946;-galactosidase detection during the mouse development that can be further applied to the cryostat sections as well as whole organs. Thus, the dynamic gene expression patterns throughout development can be easily analyzed by using this protocol in whole embryos, but also detailed expression at the cellular level can be assessed after paraffin sectioning.

Here we describe the standard protocol for the detection of &#946;-galactosidase activity in early whole mouse embryos and the method for paraffin sectioning and counterstaining. This is an easy and quick procedure to monitor gene expression during development that can also be applied to tissue sections, organs or cultured cells.

עקיבה ביטוי גנים דרך זיהוי של β-galactosidase פעילות ב עכבר כל העוברים

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, including insulin-secreting &#946; cells, are differentiated from common endocrine progenitors during the embryonic stage. Immature endocrine cells expand via cell proliferation and mature during a long postnatal developmental period. However, the mechanisms underlying these processes are not clearly defined. Single-cell RNA-sequencing is a promising approach for the characterization of distinct cell populations and tracing cell lineage differentiation pathways. Here, we describe a method for the single-cell RNA-sequencing of isolated pancreatic &#946; cells from embryonic, neonatal and postnatal pancreases.

We describe a method for the isolation of endocrine cells from embryonic, neonatal and postnatal pancreases followed by single-cell RNA sequencing. This method allows analyses of pancreatic endocrine lineage development, cell heterogeneity and transcriptomic dynamics.

Transcriptomic תא בודד ניתוחים של תאים בלבלב האנדוקרינית העכבר

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...

ניתוח שושלת תא ולימודי תפקוד גן באמצעות Twin-spot MARCM

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

העברה יעילה ג'ין בצ'יק הרשתיות לסלולריים יסודי לימודי תרבות: