Diese Arbeit wurde durch das Ministerium für Wissenschaft und Technologie (MOST 104-2311-B-001-034) und dem Institut für Zelluläre und Organismische Biologie, Academia Sinica, Taiwan unterstützt wurde.

1. Erstellen Sie tsMARCM-ready Flies Anwendung des erforderlichen Transgene 11, 13 <ol><li> Generieren Sie die ursprüngliche Version von tsMARCM-ready fliegt von Transgenen, die von einzelnen Fliegen getragen werden 11 (siehe Tabelle 1). Zuführen Standard fly genetische Kreuzungsschemata, die zuvor beschrieben wurden, um 13 mehrere Transgene in den gleichen fly Aktien setzen. <ol><li> In einer Elternlinie, montieren die Transgene von FRT 40A, UAS-mCD8 :: GFP (der erste Reporter, mCD8 :: GFP; Expression des Transgens unter der Kontrolle des Upstream - Aktivierungssequenz Promotor ist, die eine Membran-gebundenen Reporter erzeugt von Maus - Cluster von Proteindifferenzierung 8 mit grün fluoreszierenden Protein fusioniert) und UAS-rCD2RNAi (Suppressor, die die Expression des zweiten Reporter hemmt, die RNAi gegen die Expression von Ratten - Cluster of Differenzierung 2, RCD2) auf dem linken Arm des Chromosoms 2 nd. Ort gewebespezifische -GAL4 Treiber auf dem X oder 3. Chromosom, falls möglich. </li><li> In der anderen Elternlinie, montieren die Transgene von FRT 40A, UAS-RCD2 :: RFP (der zweite Reporter, RCD2 :: RFP, die andere Membran-gebundenen Reporter aus RCD2 Protein mit rot fluoreszierendes Protein fusioniert) und UAS-GFPRNAi (der Suppressor, der die Expression mCD8 :: GFP hemmt, die RNAi gegen die Expression von gfp) auf dem linken Arm des Chromosoms 2 nd. Platzieren Hitzeschock (hs) -FLP oder Gewebe-Spezifität FLP auf das X oder 3. Chromosom, wenn möglich. </li></ol></li><li> Generieren Sie die neue Version von tsMARCM-ready fliegt von Transgenen, die von einzelnen Fliegen getragen werden 14 (siehe Tabelle 1). Führen Sie Standard-fly genetischen Kreuzungsschemata, die p beschrieben wurdenreviously, durch mehrere Transgene in den gleichen Flug Aktien 13 setzen. <ol><li> In einer Elternlinie, montieren die Transgene einer FRT - Stelle und UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i (ein kombiniertes Transgen mCD8 :: GFP und den Suppressor, die die Expression von RCD2 :: RFP hemmt) zusammen im selben Arm der 2. oder 3. Chromosom (entsprechende Paare von Transgenen von FRT und UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i sind in Tabelle 1 angegeben). Platzieren gewebsspezifische-GAL4 - Treiber auf den Chromosomen anderen als dem Chromosom des gewählten FRT - Stelle, falls möglich. </li><li> In der anderen Elternlinie, montieren die Transgene einer FRT - Stelle und UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPI (den anderen verbundenen Transgen RCD2 :: RFP und den Suppressor, die die Expression von mCD8 :: GFP hemmt) im selben Arm der 2. oder 3. Chromosom (geeignete Paare von Transgenen von FRT </em&gt; und UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPI sind in Tabelle 1) angegeben. Ort hs-FLP oder gewebespezifische FLP-on Chromosome anderen als dem Chromosom des Standortes gewählt FRT, falls möglich. </li></ol></li></ol> 2. Quer tsMARCM-ready Fliegen zu tsMARCM Klone in ihren Nachkommen generieren <ol><li> Kreuz tsMARCM-ready Fliegen zusammen (zB setzen 10-15 männlichen Fliegen aus Schritt 1.1.1 oder 1.2.1 und 20-30 jungfräulichen Weibchen aus Schritt fliegt 1.1.2 oder 1.2.2 zusammen) in einem Fly-Essen Fläschchen mit frischem -Aus Hefe-Paste an der Wand des Gefäßes. </li><li> Pflegen Sie die gekreuzten tsMARCM-ready Fliegen bei 25 ° C für 2 Tage, um die Chance der Paarung zu verbessern, bevor befruchteten Eier zu sammeln. </li><li> Häufig übertragen die gekreuzten tsMARCM-ready Fliegen in frisch yeasted Fläschchen Verdrängung zu vermeiden (tippen Sie die Fliegen oder Kohlendioxid verwenden, um die Fliegen zu betäuben den Transfer zu erleichtern, halten nicht mehr als 80 bis 100 befruchtete Eier in einen 10-ml Fliegen-Food überl zu vermeiden, dass zu viele geschlüpften Larven). </li><li> Kultur die tsMARCM Tiere (dh befruchtete Eier, ein Beispiel des Genotyps tsMARCM Tiere, wie verwendet in Abbildung 3 ist hs-FLP [22], w / w; UAS-mCD8 :: GFP, UAS-rCD2RNAi, FRT 40A , GAL4-GH146 / UAS-RCD2 :: RFP, UAS-GFPRNAi, FRT 40A; +; +), die in den seriell übertragen Fläschchen bei 25 ° C gelegt wurden , bis sie auf die gewünschten Stufen (zB Embryonen, Larven entwickeln, oder Puppen). </li><li> Legen Sie die übertragenen Fläschchen, die tsMARCM Tiere in der gleichen Entwicklungsstufe zu einem 37 ° C Wasserbad enthalten für 10, 20, 30, 40 und 50 Minuten, um die optimale Zeit der Hitzeschock, um zu bestimmen, welche die Expression von FLP induziert zu erzeugen, die tsMARCM Klone von Interesse. Überspringen Sie diesen Schritt , wenn Gewebe-Spezifität FLP ist in der tsMARCM Experiment verwendet wird (hs-FLP ist für neuronale Linie bevorzugt analysiert; die Gründe für diese Einstellung zuvor 15 beschrieben worden ist). HINWEIS: Wiederholen Sie Schritt 2.5 die optimale Zeit des Hitzeschock in Zukunft tsMARCM Experimente, wenn mehr tsMARCM Klone von Interesse verwendet werden wollte; Im Allgemeinen wird in hs-FLP mehr FLP Expression induziert [22] im Vergleich zu hs-FLP [1] mit der gleichen Hitzeschock - Zeit. </li><li> Kultur, die einem Hitzeschock tsMARCM Tiere bei 25 ° C, bis sie die entsprechende Entwicklungsstufe erreicht, und dann gehen Sie zu Schritt 3. </li></ol> 3. Bereiten Sie, Beize und Mount Fly Gehirne mit einem Gehalt tsMARCM Clones <ol><li> Bereiten Sie zangen Schutz Gerichte. Mischen Sie Teil A (30 g) und Teil B (3 g) des Silikon-Elastomer-Kit mit Aktivkohle (0,25 g). Gießen Sie die Mischung in die entsprechenden Gerichte. </li><li> Präparieren Larven-, pupal oder Erwachsenen-Gehirn aus der tsMARCM Tiere in 1x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) Zange auf einem zangenSchutzSchale betrachtet durch eine Dissektion Mikroskop. HINWEIS: Ein Protokoll für das Fliegen Gehirnsezierung wurde abribed 16 zuvor. </li><li> Fix the fly Gehirn in einem Glas Tüpfelplatte mit 1x PBS für 20 min 4% Formaldehyd bei Raumtemperatur enthält. Verarbeiten Sie die Fliege Gehirne in diesem Glas Tüpfelplatte für den Rest der Schritte. </li><li> Spülen Sie die Fliege Gehirne dreimal mit 1% PBT (1x PBS mit 1% Triton X-100) und waschen Sie sie dreimal für je 30 min in 1% PBT (rinse: entfernen PBT und fügen Sie neue PBT schnell; waschen: entfernen PBT, fügen Sie neue PBT, und brüten die Fliege Gehirne in der neuen PBT einen Orbitalschüttler verwenden). </li><li> Inkubieren Sie die Fliege Gehirne mit der Mischung aus primären Antikörper über Nacht bei 4 ° C oder für 4 Stunden bei Raumtemperatur. Ein Beispiel der Mischung aus primärem Antikörper ist Ratte anti-CD8-Antikörper (1: 100), Kaninchen-Anti-DsRed-Antikörper (1: 800) und Maus-Anti-Bruchpilot (BRP) Antikörper (1:50) in 1% PBT, enthaltend 5% normalem Ziegenserum (NGS). </li><li> Spülen Sie die Fliege Gehirne dreimal mit 1% PBT, und dann waschen Sie sie dreimal für jeweils 30 min mit 1% PBT. </li><li&gt; Inkubieren Sie die Fliege Gehirne mit der Mischung aus sekundären Antikörper über Nacht bei 4 ° C oder für 4 Stunden bei Raumtemperatur. Ein Beispiel für die Mischung von Sekundärantikörper ist Ziege-anti-Ratte-IgG-Antikörper mit grün-fluoreszierenden Farbstoff konjugiert ist (1: 800), Ziege-anti-Kaninchen-IgG-Antikörper, konjugiert mit gelb-fluoreszierenden Farbstoff (1: 800) und Ziege-anti-Maus konjugierte IgG-Antikörper mit weit rot-fluoreszierenden Farbstoff (1: 800) in 1% PBT mit 5% NGS. </li><li> Spülen Sie die Fliege Gehirne dreimal mit 1% PBT, und dann waschen Sie sie dreimal für jeweils 30 min mit 1% PBT. Montieren sie auf einem Mikroobjektträger mit einem Anti-Quenching-Reagenz. Setzen Sie ein Mikrodeckglas auf der Mikro Dia-the-fly Gehirne zu bedecken und zu schützen. Seal die Ränder des Mikrodeckglas und Mikro-Schlitten mit klarem Nagellack. Bewahren Sie diese montiert und versiegelt Gehirn Proben bei 4 ° C fliegen. </li></ol> Nehmen 4., Prozess- und Analysieren Fluoreszenzbilder von tsMARCM Clones <ol><li> Erfassen Fluoreszenzbilder von tsMARCM Klone from die Proben in Schritt 3.8 mit der konfokalen Mikroskopie System der Wahl erstellt. </li><li> Projektstapel tsMARCM konfokalen Fluoreszenzbildern in zweidimensionalen, abgeflachten Bilder die Bildverarbeitungs - Software mit dem konfokalen Mikroskopiesystem der Wahl zugeführt (siehe Figur 3B - 3E, 3G - 3J, 3L - 3O und 3Q - 3T für Beispiele von abgeflachten konfokale Fluoreszenzbilder). </li><li> Zählen der Zellanzahl der mehrzelligen-NB Seiten der tsMARCM Klone eine geeignete Bildverarbeitungssoftware (beispielsweise die &quot;Zellzähler&quot; -Funktion in ImageJ 17; siehe Figur 3E, 3J, 3O und 3T für die Beispiele der Zelle Leichen von Neuronen). </li></ol>

<ol>
	<li>Ito, M., Masuda, N., Shinomiya, K., Endo, K., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+analysis+of+neural+projections+reveals+clonal+composition+of+the+Drosophila+brain.">Systematic analysis of neural projections reveals clonal composition of the Drosophila brain.</a> Curr Biol. 23 (8), 644-655 (2013).</li><li>Yu, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+development+and+organization+of+the+adult+Drosophila+central+brain.">Clonal development and organization of the adult Drosophila central brain.</a> Curr Biol. 23 (8), 633-643 (2013).</li><li>Goodman, C. S., Doe, C. Q., Bate, M., Arias, A. 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H., Chen, C. H., Shi, L., Huang, Y., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twin-spot+MARCM+to+reveal+the+developmental+origin+and+identity+of+neurons.">Twin-spot MARCM to reveal the developmental origin and identity of neurons.</a> Nat Neurosci. 12 (7), 947-953 (2009).</li><li>Yu, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complete+developmental+sequence+of+a+Drosophila+neuronal+lineage+as+revealed+by+twin-spot+MARCM.">A complete developmental sequence of a Drosophila neuronal lineage as revealed by twin-spot MARCM.</a> PLoS Biol. 8 (8), (2010).</li><li>Greenspan, R. 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V., Liang, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Q+system:+a+repressible+binary+system+for+transgene+expression,+lineage+tracing,+and+mosaic+analysis.">The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis.</a> Cell. 141 (3), 536-548 (2010).</li><li>Lai, S. L., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+mosaic+with+dual+binary+transcriptional+systems+in+Drosophila.">Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila.</a> Nat Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).</li><li>Kao, C. F., Yu, H. H., He, Y., Kao, J. C., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+deployment+of+factors+regulating+temporal+fate+in+a+diverse+neuronal+lineage+of+the+Drosophila+central+brain.">Hierarchical deployment of factors regulating temporal fate in a diverse neuronal lineage of the Drosophila central brain.</a> Neuron. 73 (4), 677-684 (2012).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Kritische Schritte im Rahmen des Protokolls Die Schritte 1.1.1, 1.2.1, 2.3, 2.5 und 3.2 sind von entscheidender Bedeutung für eine gute tsMARCM Ergebnisse zu erhalten. Gewebespezifische -GAL4 Treiber , die 1.1.1 und 1.2.1 für Schritte nicht GAL4 in neuralen Vorläuferzellen exprimieren , werden bevorzugt. Vermeiden Sie die Tiere über Anziehens in den Fly-Lebensmittel Fläschchen in Schritt 2,3 gezüchtet. Da die Induktion Latenz, das Expressionsniveau von FLP auf Hitzeschock, und di...

Das Gehirn, die aus einer großen Anzahl und vielfältige Arten von Neuronen, ausstattet Tiere mit der Fähigkeit, Verfahren zu erkennen und zu Herausforderungen von der Außenwelt zu antworten. Neurone des adulten Drosophila zentralen Gehirn aus einer begrenzten Anzahl von neuralen Stammzellen, die so genannte Neuroblasten (NBS) abgeleitet wird , während der Entwicklung 1, 2. Die meisten der NBS in Gehirn Neurogenese in Drosophila beteiligt laufen asymmetrische Teilung selbst erneuernden NBs und Ganglion Mutterzellen (GMCs) zu erzeugen, und die GMCs dann durch eine weitere Runde der Abteilung gehen zu zwei Tochterzellen zu produzieren, die in Neuronen 3 (Abbildung 1A unterscheiden ). Wegen der Kompliziertheit der neuronalen Morphologie und die Herausforderungen im Zusammenhang mit spezifischen Neuronen identifiziert, eine positive Mosaik Etikettiertechnik, Mosaik-Analyse mit einer repressible Zellmarker (MARCM) wurde erfunden, die visualizat zu ermöglichenIon eines einzelnen Neurons oder einer kleinen Untergruppe von Neuronen aus der Bevölkerung der Umgebung, nicht markierten Neuronen 4. MARCM nutzt die Flippase (FLP) / FLP Erkennungsziel (FRT) System 4 ortsspezifische Rekombination zwischen homologen Chromosomen in einer Teilungsvorläuferzelle Durchführung eines heterozygoten Allel eines Repressor - Gen, dessen Expression normalerweise hemmt die Expression eines Reportergens zu vermitteln. Nach der mitotischen Teilung werden die rekombinanten Chromosomen in zwei Einzelzellen getrennt ist, so dass eine Zelle homozygot Allele des Repressor-Gen enthält, und die andere Zelle hat kein Repressorgen-die Expression des Reporter in dieser Zelle (und ihre Nachkommen) nicht mehr 4 blockiert. Drei klonalen Muster sind in der Regel in einem Experiment gefunden MARCM wenn FLP stochastisch in NBs oder GMCs induziert wird: single-cell und zweizelligen-GMC-Klone, die neuronale Morphologie auf Einzelzell resolutio darstellenn und mehrzelligen-NB - Klone, die aus einer gemeinsamen NB (1B) abgeleitet gesamten morphologischen Muster von Neuronen offenbaren. Die MARCM Technik wurde in Drosophila Neurobiologie Studien weit angewendet worden, einschließlich der neuronalen Typerkennung für die Rekonstruktion des Gehirns weiten Kabelnetze, neuronale Abstammungslinie Analysen in Zellschicksal Spezifikation und neuronalen Morphogenese die Entwicklungsgeschichte von Neuronen, phänotypischen Charakterisierung von Gen - Funktionen beteiligt für die Offenlegung von und Differenzierungsstudien 5, 6, 7, 8, 9, 10. Denn nur herkömmliche MARCM eine der beiden Tochterzellen-Etiketten (und Linien) nach der mitotischen Rekombinationsereignis induziert, möglicherweise nützliche Informationen aus der unmarkierten Seite verloren. Diese Einschränkung schließt die Anwendung der Grund MARCM System hochauflösende Analysen vieler neuronaler Linien, die Zellschicksalen in schnellem Tempo oder Präzision umschalten Analysen von Genfunktionen in identischen Neuronen verschiedener Tiere 11, 12. Twin-Spot MARCM (tsMARCM) ist ein fortschrittliches System , das von einem gemeinsamen Vorläufer mit zwei verschiedenen Farben abgeleitet Neuronen - Etiketten, die die Rückgewinnung von nützlichen Informationen von beiden Seiten der Doppelzellen ermöglicht, so dass die Begrenzung des ursprünglichen MARCM System zu überwinden 11 ( 2A - 2C). Im tsMARCM System werden zwei RNA - Interferenz (RNAi) -basierte Suppressoren an trans-Stellen von homologen Chromosomen in einer Vorläuferzelle angeordnet sind, und die Expression dieser Suppressoren unabhängig die Expression ihrer jeweiligen Reporter (2B) hemmen. Im Anschluss an die ortsspezifische mitotische Rekombination vermittelt durch das FLP / FRT-System, das two RNAi-basierte Suppressoren getrennt werden in zwei Einzelzellen , die Expression von verschiedenen Reportern (2B) zu ermöglichen. Zwei klonalen Muster, single-Zelle , die mit Single-Zell - Klonen und zwei-cell-GMC zugeordnet mehrzelligen-NB - Klone, werden typischerweise in einem tsMARCM experiment (2C) zu sehen. Information von einer Seite der Doppelzellen abgeleitet sind, können als die Referenz für die andere Seite verwendet werden, wodurch hochauflösende neuralen lineage wie Geburten Datieren des markierten Neuronen Analysen und phänotypische Analyse von identischen Neuronen in verschiedenen Tieren, die für die genaue Untersuchung neuronaler Genfunktion 11, 12. Hier präsentieren wir eine Schritt- für -Schritt - Protokoll beschreibt , wie ein tsMARCM Experiment durchzuführen, die von anderen Laboratorien verwendet werden , können ihr Studium der neuronalen Entwicklung (sowie die Entwicklung von anderen Geweben, wo zutreffend) in Drosophila zu erweitern.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide (CO2)</td>
			<td>Local vendor</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Anesthetize flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 pad</td>
			<td>Local vendor</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Sort, cross and transfer flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS pH 7.4</td>
			<td>Uniregion Bio-Tech (or other vendors)</td>
			<td>PBS001</td>
			<td>Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252549</td>
			<td>Fix fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Rinse, wash and immunostain fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat</td>
			<td rowspan="2">Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td rowspan="2">005-000-121</td>
			<td rowspan="2">Immunostain fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD8 antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MCD0800</td>
			<td>Immunostain fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-DsRed antibody</td>
			<td>Clonetech</td>
			<td>632496</td>
			<td>Immunostain fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Brp antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>nc82</td>
			<td>Immunostain fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11006</td>
			<td>Immunostain fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11035</td>
			<td>Immunostain fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21236</td>
			<td>Immunostain fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlowFade gold antifade reagent</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>S36936</td>
			<td>Mount fly brains and protect quenching of fluorescence&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX 9 depression glass spot plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7220-85</td>
			<td>Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYLG184</td>
			<td>Make black Sylgard dishes to protect forceps during brain dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activated charcoal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>242276-250G</td>
			<td>Make black Sylgard dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-30</td>
			<td>Dissect and mount fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro slide</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2948-75x25</td>
			<td>Mount fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover glass No.1.5</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>48366-205</td>
			<td>Mount fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td>Local vendor</td>
			<td>not available</td>
			<td>Seal micro cover glass on micro slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Incubator&#160;</td>
			<td>Kansin Instruments</td>
			<td rowspan="2">LTI603</td>
			<td rowspan="2">culture flies at 25&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(or other vendors)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Water bath</td>
			<td>Kansin Instruments</td>
			<td rowspan="2">WB212-B2</td>
			<td rowspan="2">Induce heat-shock in flies at 37&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(or other vendors)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Orbital shaker</td>
			<td>Kansin Instruments</td>
			<td rowspan="2">OS701</td>
			<td rowspan="2">Wash and immunostain fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(or other vendors)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EZ4</td>
			<td>Sort, cross and transfer flies; Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss (or other vendors)</td>
			<td>LSM 700 (or other models)</td>
			<td>Image tsMARCM clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>image-processing software 1 
			(e.g., Zeiss LSM image browser)&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>not available</td>
			<td>Project stacks of confocal images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>image-processing software 2 
			(e.g., Image-J)&#160;</td>
			<td>not available</td>
			<td>not available</td>
			<td>Count cell number of tsMARCM clones</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell lineage analyses and gene function studies using twin-spot marcm

M osaic eine nalyse mit einem r epressible c ell m Arker (MARCM) ist ein positives Kennzeichnungssystem Mosaik , das in Drosophila Neurobiologie Studien weithin angewandt wurde komplizierte Morphologien darzustellen und die Funktion von Genen in Teilmengen von Neuronen innerhalb ansonsten unmarkierten und unbeirrt zu manipulieren Organismen. Genetische Mosaiken im MARCM System erzeugt werden durch ortsspezifische Rekombination zwischen homologen Chromosomen vermittelten Vorläuferzellen innerhalb Dividieren beide markiert (MARCM Klone) und unmarkierten Tochterzellen während der Mitose zu erzeugen. Eine Erweiterung des MARCM Methode, die so genannte Twin-Spot MARCM (tsMARCM), Etiketten sowohl der Zwillings von einem gemeinsamen Vorläufer mit zwei verschiedenen Farben abgeleiteten Zellen. Diese Technik wurde entwickelt, um das Abrufen nützlicher Informationen aus beiden Hemi-Abstammungslinien zu ermöglichen. Durch umfassend verschiedene Paare von tsMARCM Klone Analyse erlaubt die tsMARCM System mappin neuronale Abstammungslinie hochauflösenderg die genaue Geburtsfolge der markierten Neuronen aus gemeinsamen Vorläuferzellen produziert zu offenbaren. Ferner erstreckt sich die tsMARCM System auch Studien der Genfunktion durch die phänotypische Analyse von identischen Neuronen verschiedener Tiere ermöglicht. Hier beschreiben wir , wie die tsMARCM System anzuwenden Studien der neuronalen Entwicklung in Drosophila zu erleichtern.

Das tsMARCM System verwendet worden neuronale Abstammungslinie zu erleichtern Analysen und Genfunktion Studien durch Abrufen wichtiger Informationen zu Neuronen aus gemeinsamen NBs abgeleitet. Das System verwendet worden ist am meisten zu identifizieren (wenn nicht alle) neuronalen Typen, bestimmen die Zellzahl jeder neuronalen Typ, und ermitteln die Geburt Ordnung dieser Neuronen 11, 12, 18 (si...

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Cell Lineage Analyses and Gene Function Studies Using Twin-spot MARCM

Hier stellen wir ein Protokoll für ein Mosaik Markierungstechnik, die die Visualisierung von Neuronen aus einer gemeinsamen Vorläuferzelle in zwei verschiedenen Farben abgeleitet ermöglicht. Dies erleichtert die neuronale Abstammungslinie Analyse mit der Fähigkeit, Geburts Datierung einzelner Neuronen und das Studium der Genfunktion in den gleichen Neuronen verschiedener Individuen.

Zell Lineage Analysen und Genfunktion Studien mit Twin-Spot MARCM

Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) is a positive mosaic labeling system that has been widely applied in Drosophila neurobiological ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.9K Aufrufe.  Academia Sinica.  Hier stellen wir ein Protokoll für ein Mosaik Markierungstechnik, die die Visualisierung von Neuronen aus einer gemeinsamen Vorläuferzelle in zwei verschiedenen Farben abgeleitet ermöglicht. Dies erleichtert die neuronale Abstammungslinie Analyse mit der Fähigkeit, Geburts Datierung einzelner Neuronen und das Studium der Genfunktion in den gleichen Neuronen verschiedener Individuen. 

Serie: Cell Lineage Analyses and Gene Function Studies Using Twin-spot MARCM

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying the biology of retinal neurons, particularly photoreceptors. The applications of this system go beyond basic research, as they can easily be adapted to high throughput technologies for drug development. However, genetic manipulation of retinal photoreceptors in these cultures has proven to be very challenging, posing an important limitation to the usefulness of the system. We have recently developed and validated an ex&#160;ovo plasmid electroporation technique that increases the rate of transfection of retinal cells in these cultures by five-fold compared to other currently available protocols1. In this method embryonic chick eyes are enucleated at stage 27, the RPE is removed, and the retinal cup is placed in a plasmid-containing solution and electroporated using easily constructed custom-made electrodes. The retinas are then dissociated and cultured using standard procedures. This technique can be applied to overexpression studies as well as to the downregulation of gene expression, for example via the use of plasmid-driven RNAi technology, commonly achieving transgene expression in 25% of the photoreceptor population. The video format of the present publication will make this technology easily accessible to researchers in the field, enabling the study of gene function in primary retinal cultures. We have also included detailed explanations of the critical steps of this procedure for a successful outcome and reproducibility.

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Embryonic chick retinal cell cultures constitute valuable tools for the study of photoreceptor biology. We have developed an efficient gene transfer technique based on ex&#160;ovo plasmid electroporation of the retinas prior to culture. This technique considerably increases transfection efficiencies over currently available protocols, making genetic manipulation feasible for this system.

Effizienten Gentransfer in Küken Netzhäute für primäre Zellkulturstudien: Eine<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Elektroporation Ansatz

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Organotypic Slice Cultures for Studies of Postnatal Neurogenesis

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This method maintains the characteristic topographical morphology of the hippocampus while allowing direct application of pharmacological agents to the developing hippocampal dentate gyrus. Additionally, slice cultures can be maintained for up to 4 weeks and thus, allow one to study the maturation process of newborn granule neurons. Slice cultures allow for efficient pharmacological manipulation of hippocampal slices while excluding complex variables such as uncertainties related to the deep anatomic location of the hippocampus as well as the blood brain barrier. For these reasons, we sought to optimize organotypic slice cultures specifically for postnatal neurogenesis research.

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis using the organotypic slice culture technique. This method allows for in vitro manipulation of adult neurogenesis and allows for the direct application of pharmacological agents to the cultured hippocampus.

Organotypischen Kulturen für Studien der postnatale Neurogenese

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This ...

Efficient Generation of hiPSC Neural Lineage Specific Knockin Reporters Using the CRISPR/Cas9 and Cas9 Double Nickase System

Gene targeting is a critical approach for characterizing gene functions in modern biomedical research. However, the efficiency of gene targeting in human cells has been low, which prevents the generation of human cell lines at a desired rate. The past two years have witnessed a rapid progression on improving efficiency of genetic manipulation by genome editing tools such as the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) system. This manuscript describes a protocol for generating lineage specific human induced pluripotent stem cell (hiPSC) reporters using CRISPR/Cas system assisted homologous recombination. Procedures for obtaining necessary components for making neural lineage reporter lines using the CRISPR/Cas system, focusing on construction of targeting vectors and single guide RNAs, are described. This protocol can be extended to platform establishment and mutation correction in hiPSCs.

Genome editing tools such as the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) system have greatly improved gene targeting efficiency in human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). This manuscript describes a protocol for generating lineage specific hiPSC reporter using CRISPR/Cas system assisted homologous recombination.

Effiziente Erzeugung von hiPSC Neural Lineage Spezifische Knockin Reporter Mit den CRISPR / Cas9 und Cas9 Doppel Nickase-System

Gene targeting is a critical approach for characterizing gene functions in modern biomedical research. However, the efficiency of gene targeting in human ...

A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied for many decades, revealing seminal findings in developmental biology. More recently, it was adopted by stem cell biologists to identify and track different stem cell populations with minimal experimental intervention. The recent developments in mouse genetics, the availability of a large number of mouse strains, and the advancements in fluorescent microscopy allow the straightforward design of powerful lineage tracing systems for various tissues with basic expertise, using commercially available tools. We have recently taken advantage of this powerful methodology to explore the origin and fate of stem cells at the ocular surface using R26R-Confetti mouse. This model offers a multi-color genetic system, for the expression of 4 fluorescent genes in a random manner. Here we describe the principles of this methodology and provide an adaptable protocol for designing lineage tracing experiments; specifically for the corneal epithelium as well as for other tissues.

In this article we describe the principles for designing and performing a multi-color lineage tracing experiment using R26R-Confetti mice. We provide a specific protocol for tracking corneal epithelial cells which can be modified for other tissues of interest.

Eine Methode zur Lineage Tracing von Hornhautzellen mit Multi-Farben-Fluoreszenz-Reporter-Mäuse

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

Co-localization of Cell Lineage Markers and the Tomato Signal

The cell lineage tracing system has been used predominantly in developmental biology studies. The use of Cre recombinase allows for the activation of the reporter in a specific cell line and all progeny. Here, we used the cell lineage tracing technique to demonstrate that chondrocytes directly transform into osteoblasts and osteocytes during long bone and mandibular condyle development using two kinds of Cre, Col10a1-Cre and Aggrecan-CreERT2 (Agg-CreERT2), crossed with Rosa26tdTomato. Both Col10 and aggrecan are well-recognized markers for chondrocytes.
On this basis, we developed a new method-cell lineage tracing in conjunction with fluorescent immunohistochemistry-to define cell fate by analyzing the expression of specific cell markers. Runx2 (a marker for early-stage osteogenic cells) and Dentin matrix protein1 (DMP1; a marker for late-stage osteogenic cells) were used to identify chondrocyte-derived bone cells and their differentiation status. This combination not only broadens the application of cell lineage tracing, but also simplifies the generation of compound mice. More importantly, the number, location, and differentiation statuses of parent cell progeny are displayed simultaneously, providing more information than cell lineage tracing alone. In conclusion, the co-application of cell lineage tracing techniques and immunofluorescence is a powerful tool for investigating cell biology in vivo.

We developed two sets of tracing combinations in Rosa26tdtomato (ubiquitously expressed in all cells)/Cre (specifically expressed in chondrocytes) mice: one with 2.3Col1a1-GFP (specific to osteoblasts) and one with immunofluorescence (specific to bone cells). The data demonstrate the direct transformation of chondrocytes into bone cells.

Co-Lokalisierung von Zell Lineage Marker und die Tomate Signal

The cell lineage tracing system has been used predominantly in developmental biology studies. The use of Cre recombinase allows for the activation of the ...

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into the developing oocyte. Because these events rely on maternal products which typically act very soon after fertilization-that preexist inside the egg, standard approaches for expression and functional reduction involving the injection of reagents into the fertilized egg are typically ineffective. Instead, such manipulations must be performed during oogenesis, prior to or during the accumulation of maternal products. This article describes in detail a protocol for the in vitro maturation of immature zebrafish oocytes and their subsequent in vitro fertilization, yielding viable embryos that survive to adulthood. This method allows the functional manipulation of maternal products during oogenesis, such as the expression of products for phenotypic rescue and tagged construct visualization, as well as the reduction of gene function through reverse-genetics agents.

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

An optimized protocol for the in vitro maturation of zebrafish oocytes used for the manipulation of maternal gene products is presented here.

Funktionelle Manipulation der mütterlichen Gene Produkte verwenden<em&gt; In Vitro</em&gt; Oozytenreifung in Zebrabärbling

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into ...

Structure-function Studies in Mouse Embryonic Stem Cells Using Recombinase-mediated Cassette Exchange

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of the cell and often consist of multiple functional domains, which can be influenced by posttranslational modifications. The depletion of the entire protein in conditional or constitutive knock-out (KO) mice does not take into account this functional diversity and regulation. An mESC line and a derived mouse model, in which a docking site for FLPe recombination-mediated cassette exchange (RMCE) was inserted within the ROSA26 (R26) locus, was previously reported. Here, we report on a structure-function approach that allows for molecular dissection of the different functionalities of a multidomain protein. To this end, RMCE-compatible mice must be crossed with KO mice and then RMCE-compatible KO mESCs must be isolated. Next, a panel of putative rescue constructs can be introduced into the R26 locus via RMCE targeting. The candidate rescue cDNAs can be easily inserted between RMCE sites of the targeting vector using recombination cloning. Next, KO mESCs are transfected with the targeting vector in combination with an FLPe recombinase expression plasmid. RMCE reactivates the promoter-less neomycin-resistance gene in the ROSA26 docking sites and allows for the selection of the correct targeting event. In this way, high targeting efficiencies close to 100% are obtained, allowing for insertion of multiple putative rescue constructs in a semi-high throughput manner. Finally, a multitude of R26-driven rescue constructs can be tested for their ability to rescue the phenotype that was observed in parental KO mESCs. We present a proof-of-principle structure-function study in p120 catenin (p120ctn) KO mESCs using endoderm differentiation in embryoid bodies (EBs) as the phenotypic readout. This approach enables the identification of important domains, putative downstream pathways, and disease-relevant point mutations that underlie KO phenotypes for a given protein.

Proteins often contain multiple domains that can exert different cellular functions. Gene knock-outs (KO) do not consider this functional diversity. Here, we report a recombination-mediated cassette exchange (RMCE)-based structure-function approach in KO embryonic stem cells that allows for the molecular dissection of various functional domains or variants of a protein.

Struktur-Funktions-Studien in embryonalen Maus-Stammzellen Rekombinase-vermittelten Kassettenaustausch

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of ...

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors of the diseases. To validate the contribution of a dysfunction of the mutated genes to disease development, the generation of animal models carrying the mutations is one obvious approach. While germline genetically engineered mouse models (GEMMs) are popular biological tools and exhibit reproducible results, it is restricted by time and costs. Meanwhile, non-germline GEMMs often enable exploring gene function in a more feasible manner. Since some brain diseases (e.g., brain tumors) appear to result from somatic but not germline mutations, non-germline chimeric mouse models, in which normal and abnormal cells coexist, could be helpful for disease-relevant analysis. In this study, we report a method for the induction of CRISPR-mediated somatic mutations in the cerebellum. Specifically, we utilized conditional knock-in mice, in which Cas9 and GFP are chronically activated by the CAG (CMV enhancer/chicken &#223;-actin) promoter after Cre-mediated recombination of the genome. The self-designed single-guide RNAs (sgRNAs) and the Cre recombinase sequence, both encoded in a single plasmid construct, were delivered into cerebellar stem/progenitor cells at an embryonic stage using in utero electroporation. Consequently, transfected cells and their daughter cells were labeled with green fluorescent protein (GFP), thus facilitating further phenotypic analyses. Hence, this method is not only showing electroporation-based gene delivery into embryonic cerebellar cells but also proposing a novel quantitative approach to assess CRISPR-mediated loss-of-function phenotypes.

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

Conventional loss-of-function studies of genes using knockout animals have often been costly and time-consuming. Electroporation-based CRISPR-mediated somatic mutagenesis is a powerful tool to understand gene functions in vivo. Here, we report a method to analyze knockout phenotypes in proliferating cells of the cerebellum.

CRISPR-vermittelten Verlust der Funktionsanalyse in zerebelläre Untermodul Zellen mit In Utero Elektroporation-basierte Gentransfer

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. The classical histochemical reaction is based on the hydrolysis of the substrate X-gal in combination with ferric and ferrous ions, which produces an insoluble blue precipitate that is easy to visualize. Therefore, &#946;-galactosidase activity serves as a marker for the expression pattern of the gene of interest as the development proceeds. Here we describe the standard protocol for the detection of &#946;-galactosidase activity in early whole mouse embryos and the subsequent method for paraffin sectioning and counterstaining. Additionally, a procedure for clarifying whole embryos is provided to better visualize X-gal staining in deeper regions of the embryo. Consistent results are obtained by performing this procedure, although optimization of reaction conditions is needed to minimize background activity. Limitations in the assay should be also considered, particularly regarding the size of the embryo in whole mount staining. Our protocol provides a sensitive and a reliable method for &#946;-galactosidase detection during the mouse development that can be further applied to the cryostat sections as well as whole organs. Thus, the dynamic gene expression patterns throughout development can be easily analyzed by using this protocol in whole embryos, but also detailed expression at the cellular level can be assessed after paraffin sectioning.

Here we describe the standard protocol for the detection of &#946;-galactosidase activity in early whole mouse embryos and the method for paraffin sectioning and counterstaining. This is an easy and quick procedure to monitor gene expression during development that can also be applied to tissue sections, organs or cultured cells.

Tracing Genexpression durch Nachweis der Aktivität der β-Galaktosidase in ganze Mausembryonen

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, including insulin-secreting &#946; cells, are differentiated from common endocrine progenitors during the embryonic stage. Immature endocrine cells expand via cell proliferation and mature during a long postnatal developmental period. However, the mechanisms underlying these processes are not clearly defined. Single-cell RNA-sequencing is a promising approach for the characterization of distinct cell populations and tracing cell lineage differentiation pathways. Here, we describe a method for the single-cell RNA-sequencing of isolated pancreatic &#946; cells from embryonic, neonatal and postnatal pancreases.

We describe a method for the isolation of endocrine cells from embryonic, neonatal and postnatal pancreases followed by single-cell RNA sequencing. This method allows analyses of pancreatic endocrine lineage development, cell heterogeneity and transcriptomic dynamics.

Einzellige Transkriptomischen Analysen der Maus endokrinen Zellen der Bauchspeicheldrüse

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...