Name: cell lineage analyses and gene function studies using twin-spot marcm
Uploaded: 2017-03-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
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Diese Arbeit wurde durch das Ministerium für Wissenschaft und Technologie (MOST 104-2311-B-001-034) und dem Institut für Zelluläre und Organismische Biologie, Academia Sinica, Taiwan unterstützt wurde.

1. Erstellen Sie tsMARCM-ready Flies Anwendung des erforderlichen Transgene 11, 13 <ol><li> Generieren Sie die ursprüngliche Version von tsMARCM-ready fliegt von Transgenen, die von einzelnen Fliegen getragen werden 11 (siehe Tabelle 1). Zuführen Standard fly genetische Kreuzungsschemata, die zuvor beschrieben wurden, um 13 mehrere Transgene in den gleichen fly Aktien setzen. <ol><li> In einer Elternlinie, montieren die Transgene von FRT 40A, UAS-mCD8 :: GFP (der erste Reporter, mCD8 :: GFP; Expression des Transgens unter der Kontrolle des Upstream - Aktivierungssequenz Promotor ist, die eine Membran-gebundenen Reporter erzeugt von Maus - Cluster von Proteindifferenzierung 8 mit grün fluoreszierenden Protein fusioniert) und UAS-rCD2RNAi (Suppressor, die die Expression des zweiten Reporter hemmt, die RNAi gegen die Expression von Ratten - Cluster of Differenzierung 2, RCD2) auf dem linken Arm des Chromosoms 2 nd. Ort gewebespezifische -GAL4 Treiber auf dem X oder 3. Chromosom, falls möglich. </li><li> In der anderen Elternlinie, montieren die Transgene von FRT 40A, UAS-RCD2 :: RFP (der zweite Reporter, RCD2 :: RFP, die andere Membran-gebundenen Reporter aus RCD2 Protein mit rot fluoreszierendes Protein fusioniert) und UAS-GFPRNAi (der Suppressor, der die Expression mCD8 :: GFP hemmt, die RNAi gegen die Expression von gfp) auf dem linken Arm des Chromosoms 2 nd. Platzieren Hitzeschock (hs) -FLP oder Gewebe-Spezifität FLP auf das X oder 3. Chromosom, wenn möglich. </li></ol></li><li> Generieren Sie die neue Version von tsMARCM-ready fliegt von Transgenen, die von einzelnen Fliegen getragen werden 14 (siehe Tabelle 1). Führen Sie Standard-fly genetischen Kreuzungsschemata, die p beschrieben wurdenreviously, durch mehrere Transgene in den gleichen Flug Aktien 13 setzen. <ol><li> In einer Elternlinie, montieren die Transgene einer FRT - Stelle und UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i (ein kombiniertes Transgen mCD8 :: GFP und den Suppressor, die die Expression von RCD2 :: RFP hemmt) zusammen im selben Arm der 2. oder 3. Chromosom (entsprechende Paare von Transgenen von FRT und UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i sind in Tabelle 1 angegeben). Platzieren gewebsspezifische-GAL4 - Treiber auf den Chromosomen anderen als dem Chromosom des gewählten FRT - Stelle, falls möglich. </li><li> In der anderen Elternlinie, montieren die Transgene einer FRT - Stelle und UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPI (den anderen verbundenen Transgen RCD2 :: RFP und den Suppressor, die die Expression von mCD8 :: GFP hemmt) im selben Arm der 2. oder 3. Chromosom (geeignete Paare von Transgenen von FRT </em&gt; und UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPI sind in Tabelle 1) angegeben. Ort hs-FLP oder gewebespezifische FLP-on Chromosome anderen als dem Chromosom des Standortes gewählt FRT, falls möglich. </li></ol></li></ol> 2. Quer tsMARCM-ready Fliegen zu tsMARCM Klone in ihren Nachkommen generieren <ol><li> Kreuz tsMARCM-ready Fliegen zusammen (zB setzen 10-15 männlichen Fliegen aus Schritt 1.1.1 oder 1.2.1 und 20-30 jungfräulichen Weibchen aus Schritt fliegt 1.1.2 oder 1.2.2 zusammen) in einem Fly-Essen Fläschchen mit frischem -Aus Hefe-Paste an der Wand des Gefäßes. </li><li> Pflegen Sie die gekreuzten tsMARCM-ready Fliegen bei 25 ° C für 2 Tage, um die Chance der Paarung zu verbessern, bevor befruchteten Eier zu sammeln. </li><li> Häufig übertragen die gekreuzten tsMARCM-ready Fliegen in frisch yeasted Fläschchen Verdrängung zu vermeiden (tippen Sie die Fliegen oder Kohlendioxid verwenden, um die Fliegen zu betäuben den Transfer zu erleichtern, halten nicht mehr als 80 bis 100 befruchtete Eier in einen 10-ml Fliegen-Food überl zu vermeiden, dass zu viele geschlüpften Larven). </li><li> Kultur die tsMARCM Tiere (dh befruchtete Eier, ein Beispiel des Genotyps tsMARCM Tiere, wie verwendet in Abbildung 3 ist hs-FLP [22], w / w; UAS-mCD8 :: GFP, UAS-rCD2RNAi, FRT 40A , GAL4-GH146 / UAS-RCD2 :: RFP, UAS-GFPRNAi, FRT 40A; +; +), die in den seriell übertragen Fläschchen bei 25 ° C gelegt wurden , bis sie auf die gewünschten Stufen (zB Embryonen, Larven entwickeln, oder Puppen). </li><li> Legen Sie die übertragenen Fläschchen, die tsMARCM Tiere in der gleichen Entwicklungsstufe zu einem 37 ° C Wasserbad enthalten für 10, 20, 30, 40 und 50 Minuten, um die optimale Zeit der Hitzeschock, um zu bestimmen, welche die Expression von FLP induziert zu erzeugen, die tsMARCM Klone von Interesse. Überspringen Sie diesen Schritt , wenn Gewebe-Spezifität FLP ist in der tsMARCM Experiment verwendet wird (hs-FLP ist für neuronale Linie bevorzugt analysiert; die Gründe für diese Einstellung zuvor 15 beschrieben worden ist). HINWEIS: Wiederholen Sie Schritt 2.5 die optimale Zeit des Hitzeschock in Zukunft tsMARCM Experimente, wenn mehr tsMARCM Klone von Interesse verwendet werden wollte; Im Allgemeinen wird in hs-FLP mehr FLP Expression induziert [22] im Vergleich zu hs-FLP [1] mit der gleichen Hitzeschock - Zeit. </li><li> Kultur, die einem Hitzeschock tsMARCM Tiere bei 25 ° C, bis sie die entsprechende Entwicklungsstufe erreicht, und dann gehen Sie zu Schritt 3. </li></ol> 3. Bereiten Sie, Beize und Mount Fly Gehirne mit einem Gehalt tsMARCM Clones <ol><li> Bereiten Sie zangen Schutz Gerichte. Mischen Sie Teil A (30 g) und Teil B (3 g) des Silikon-Elastomer-Kit mit Aktivkohle (0,25 g). Gießen Sie die Mischung in die entsprechenden Gerichte. </li><li> Präparieren Larven-, pupal oder Erwachsenen-Gehirn aus der tsMARCM Tiere in 1x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) Zange auf einem zangenSchutzSchale betrachtet durch eine Dissektion Mikroskop. HINWEIS: Ein Protokoll für das Fliegen Gehirnsezierung wurde abribed 16 zuvor. </li><li> Fix the fly Gehirn in einem Glas Tüpfelplatte mit 1x PBS für 20 min 4% Formaldehyd bei Raumtemperatur enthält. Verarbeiten Sie die Fliege Gehirne in diesem Glas Tüpfelplatte für den Rest der Schritte. </li><li> Spülen Sie die Fliege Gehirne dreimal mit 1% PBT (1x PBS mit 1% Triton X-100) und waschen Sie sie dreimal für je 30 min in 1% PBT (rinse: entfernen PBT und fügen Sie neue PBT schnell; waschen: entfernen PBT, fügen Sie neue PBT, und brüten die Fliege Gehirne in der neuen PBT einen Orbitalschüttler verwenden). </li><li> Inkubieren Sie die Fliege Gehirne mit der Mischung aus primären Antikörper über Nacht bei 4 ° C oder für 4 Stunden bei Raumtemperatur. Ein Beispiel der Mischung aus primärem Antikörper ist Ratte anti-CD8-Antikörper (1: 100), Kaninchen-Anti-DsRed-Antikörper (1: 800) und Maus-Anti-Bruchpilot (BRP) Antikörper (1:50) in 1% PBT, enthaltend 5% normalem Ziegenserum (NGS). </li><li> Spülen Sie die Fliege Gehirne dreimal mit 1% PBT, und dann waschen Sie sie dreimal für jeweils 30 min mit 1% PBT. </li><li&gt; Inkubieren Sie die Fliege Gehirne mit der Mischung aus sekundären Antikörper über Nacht bei 4 ° C oder für 4 Stunden bei Raumtemperatur. Ein Beispiel für die Mischung von Sekundärantikörper ist Ziege-anti-Ratte-IgG-Antikörper mit grün-fluoreszierenden Farbstoff konjugiert ist (1: 800), Ziege-anti-Kaninchen-IgG-Antikörper, konjugiert mit gelb-fluoreszierenden Farbstoff (1: 800) und Ziege-anti-Maus konjugierte IgG-Antikörper mit weit rot-fluoreszierenden Farbstoff (1: 800) in 1% PBT mit 5% NGS. </li><li> Spülen Sie die Fliege Gehirne dreimal mit 1% PBT, und dann waschen Sie sie dreimal für jeweils 30 min mit 1% PBT. Montieren sie auf einem Mikroobjektträger mit einem Anti-Quenching-Reagenz. Setzen Sie ein Mikrodeckglas auf der Mikro Dia-the-fly Gehirne zu bedecken und zu schützen. Seal die Ränder des Mikrodeckglas und Mikro-Schlitten mit klarem Nagellack. Bewahren Sie diese montiert und versiegelt Gehirn Proben bei 4 ° C fliegen. </li></ol> Nehmen 4., Prozess- und Analysieren Fluoreszenzbilder von tsMARCM Clones <ol><li> Erfassen Fluoreszenzbilder von tsMARCM Klone from die Proben in Schritt 3.8 mit der konfokalen Mikroskopie System der Wahl erstellt. </li><li> Projektstapel tsMARCM konfokalen Fluoreszenzbildern in zweidimensionalen, abgeflachten Bilder die Bildverarbeitungs - Software mit dem konfokalen Mikroskopiesystem der Wahl zugeführt (siehe Figur 3B - 3E, 3G - 3J, 3L - 3O und 3Q - 3T für Beispiele von abgeflachten konfokale Fluoreszenzbilder). </li><li> Zählen der Zellanzahl der mehrzelligen-NB Seiten der tsMARCM Klone eine geeignete Bildverarbeitungssoftware (beispielsweise die &quot;Zellzähler&quot; -Funktion in ImageJ 17; siehe Figur 3E, 3J, 3O und 3T für die Beispiele der Zelle Leichen von Neuronen). </li></ol>

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	<li>Ito, M., Masuda, N., Shinomiya, K., Endo, K., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+analysis+of+neural+projections+reveals+clonal+composition+of+the+Drosophila+brain.">Systematic analysis of neural projections reveals clonal composition of the Drosophila brain.</a> Curr Biol. 23 (8), 644-655 (2013).</li><li>Yu, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+development+and+organization+of+the+adult+Drosophila+central+brain.">Clonal development and organization of the adult Drosophila central brain.</a> Curr Biol. 23 (8), 633-643 (2013).</li><li>Goodman, C. S., Doe, C. Q., Bate, M., Arias, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , (1993).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).</li><li>Lee, T., Lee, A., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+Drosophila+mushroom+bodies:+sequential+generation+of+three+distinct+types+of+neurons+from+a+neuroblast.">Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast.</a> Development. 126 (18), 4065-4076 (1999).</li><li>Lee, T., Marticke, S., Sung, C., Robinow, S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-autonomous+requirement+of+the+USP/EcR-B+ecdysone+receptor+for+mushroom+body+neuronal+remodeling+in+Drosophila.">Cell-autonomous requirement of the USP/EcR-B ecdysone receptor for mushroom body neuronal remodeling in Drosophila.</a> Neuron. 28 (3), 807-818 (2000).</li><li>Chiang, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+brain-wide+wiring+networks+in+Drosophila+at+single-cell+resolution.">Three-dimensional reconstruction of brain-wide wiring networks in Drosophila at single-cell resolution.</a> Curr Biol. 21 (1), 1-11 (2011).</li><li>Jefferis, G. S., Marin, E. C., Stocker, R. F., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+neuron+prespecification+in+the+olfactory+map+of+Drosophila.">Target neuron prespecification in the olfactory map of Drosophila.</a> Nature. 414 (6860), 204-208 (2001).</li><li>Hong, W., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+control+of+wiring+specificity+in+the+fly+olfactory+system.">Genetic control of wiring specificity in the fly olfactory system.</a> Genetics. 196 (1), 17-29 (2014).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gradients+of+the+Drosophila+Chinmo+BTB-zinc+finger+protein+govern+neuronal+temporal+identity.">Gradients of the Drosophila Chinmo BTB-zinc finger protein govern neuronal temporal identity.</a> Cell. 127 (2), 409-422 (2006).</li><li>Yu, H. H., Chen, C. H., Shi, L., Huang, Y., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twin-spot+MARCM+to+reveal+the+developmental+origin+and+identity+of+neurons.">Twin-spot MARCM to reveal the developmental origin and identity of neurons.</a> Nat Neurosci. 12 (7), 947-953 (2009).</li><li>Yu, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complete+developmental+sequence+of+a+Drosophila+neuronal+lineage+as+revealed+by+twin-spot+MARCM.">A complete developmental sequence of a Drosophila neuronal lineage as revealed by twin-spot MARCM.</a> PLoS Biol. 8 (8), (2010).</li><li>Greenspan, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fly pushing : the theory and practice of Drosophila genetics. , (1997).</li><li>Awasaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+Drosophila+lineage-restricted+drivers+via+patterned+recombination+in+neuroblasts.">Making Drosophila lineage-restricted drivers via patterned recombination in neuroblasts.</a> Nat Neurosci. 17 (4), 631-637 (2014).</li><li>Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+mosaics+for+lineage+analysis+in+flies.">Generating mosaics for lineage analysis in flies.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 3 (1), 69-81 (2014).</li><li>Wu, J. S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+dissecting+Drosophila+melanogaster+brains+for+live+imaging+or+immunostaining.">A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining.</a> Nat Protoc. 1 (4), 2110-2115 (2006).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Lin, S., Kao, C. F., Yu, H. H., Huang, Y., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+analysis+of+Drosophila+lateral+antennal+lobe+neurons+reveals+notch-dependent+binary+temporal+fate+decisions.">Lineage analysis of Drosophila lateral antennal lobe neurons reveals notch-dependent binary temporal fate decisions.</a> PLoS Biol. 10 (11), e1001425 (2012).</li><li>Zhan, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Dscam+diversity+in+regulating+axon+guidance+in+Drosophila+mushroom+bodies.">Analysis of Dscam diversity in regulating axon guidance in Drosophila mushroom bodies.</a> Neuron. 43 (5), 673-686 (2004).</li><li>Griffin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+twin+spot+generator+for+differential+Drosophila+lineage+analysis.">The twin spot generator for differential Drosophila lineage analysis.</a> Nat Methods. 6 (8), 600-602 (2009).</li><li>Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Q+system:+a+repressible+binary+system+for+transgene+expression,+lineage+tracing,+and+mosaic+analysis.">The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis.</a> Cell. 141 (3), 536-548 (2010).</li><li>Lai, S. L., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+mosaic+with+dual+binary+transcriptional+systems+in+Drosophila.">Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila.</a> Nat Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).</li><li>Kao, C. F., Yu, H. H., He, Y., Kao, J. C., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+deployment+of+factors+regulating+temporal+fate+in+a+diverse+neuronal+lineage+of+the+Drosophila+central+brain.">Hierarchical deployment of factors regulating temporal fate in a diverse neuronal lineage of the Drosophila central brain.</a> Neuron. 73 (4), 677-684 (2012).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Kritische Schritte im Rahmen des Protokolls Die Schritte 1.1.1, 1.2.1, 2.3, 2.5 und 3.2 sind von entscheidender Bedeutung für eine gute tsMARCM Ergebnisse zu erhalten. Gewebespezifische -GAL4 Treiber , die 1.1.1 und 1.2.1 für Schritte nicht GAL4 in neuralen Vorläuferzellen exprimieren , werden bevorzugt. Vermeiden Sie die Tiere über Anziehens in den Fly-Lebensmittel Fläschchen in Schritt 2,3 gezüchtet. Da die Induktion Latenz, das Expressionsniveau von FLP auf Hitzeschock, und di...

Das Gehirn, die aus einer großen Anzahl und vielfältige Arten von Neuronen, ausstattet Tiere mit der Fähigkeit, Verfahren zu erkennen und zu Herausforderungen von der Außenwelt zu antworten. Neurone des adulten Drosophila zentralen Gehirn aus einer begrenzten Anzahl von neuralen Stammzellen, die so genannte Neuroblasten (NBS) abgeleitet wird , während der Entwicklung 1, 2. Die meisten der NBS in Gehirn Neurogenese in Drosophila beteiligt laufen asymmetrische Teilung selbst erneuernden NBs und Ganglion Mutterzellen (GMCs) zu erzeugen, und die GMCs dann durch eine weitere Runde der Abteilung gehen zu zwei Tochterzellen zu produzieren, die in Neuronen 3 (Abbildung 1A unterscheiden ). Wegen der Kompliziertheit der neuronalen Morphologie und die Herausforderungen im Zusammenhang mit spezifischen Neuronen identifiziert, eine positive Mosaik Etikettiertechnik, Mosaik-Analyse mit einer repressible Zellmarker (MARCM) wurde erfunden, die visualizat zu ermöglichenIon eines einzelnen Neurons oder einer kleinen Untergruppe von Neuronen aus der Bevölkerung der Umgebung, nicht markierten Neuronen 4. MARCM nutzt die Flippase (FLP) / FLP Erkennungsziel (FRT) System 4 ortsspezifische Rekombination zwischen homologen Chromosomen in einer Teilungsvorläuferzelle Durchführung eines heterozygoten Allel eines Repressor - Gen, dessen Expression normalerweise hemmt die Expression eines Reportergens zu vermitteln. Nach der mitotischen Teilung werden die rekombinanten Chromosomen in zwei Einzelzellen getrennt ist, so dass eine Zelle homozygot Allele des Repressor-Gen enthält, und die andere Zelle hat kein Repressorgen-die Expression des Reporter in dieser Zelle (und ihre Nachkommen) nicht mehr 4 blockiert. Drei klonalen Muster sind in der Regel in einem Experiment gefunden MARCM wenn FLP stochastisch in NBs oder GMCs induziert wird: single-cell und zweizelligen-GMC-Klone, die neuronale Morphologie auf Einzelzell resolutio darstellenn und mehrzelligen-NB - Klone, die aus einer gemeinsamen NB (1B) abgeleitet gesamten morphologischen Muster von Neuronen offenbaren. Die MARCM Technik wurde in Drosophila Neurobiologie Studien weit angewendet worden, einschließlich der neuronalen Typerkennung für die Rekonstruktion des Gehirns weiten Kabelnetze, neuronale Abstammungslinie Analysen in Zellschicksal Spezifikation und neuronalen Morphogenese die Entwicklungsgeschichte von Neuronen, phänotypischen Charakterisierung von Gen - Funktionen beteiligt für die Offenlegung von und Differenzierungsstudien 5, 6, 7, 8, 9, 10. Denn nur herkömmliche MARCM eine der beiden Tochterzellen-Etiketten (und Linien) nach der mitotischen Rekombinationsereignis induziert, möglicherweise nützliche Informationen aus der unmarkierten Seite verloren. Diese Einschränkung schließt die Anwendung der Grund MARCM System hochauflösende Analysen vieler neuronaler Linien, die Zellschicksalen in schnellem Tempo oder Präzision umschalten Analysen von Genfunktionen in identischen Neuronen verschiedener Tiere 11, 12. Twin-Spot MARCM (tsMARCM) ist ein fortschrittliches System , das von einem gemeinsamen Vorläufer mit zwei verschiedenen Farben abgeleitet Neuronen - Etiketten, die die Rückgewinnung von nützlichen Informationen von beiden Seiten der Doppelzellen ermöglicht, so dass die Begrenzung des ursprünglichen MARCM System zu überwinden 11 ( 2A - 2C). Im tsMARCM System werden zwei RNA - Interferenz (RNAi) -basierte Suppressoren an trans-Stellen von homologen Chromosomen in einer Vorläuferzelle angeordnet sind, und die Expression dieser Suppressoren unabhängig die Expression ihrer jeweiligen Reporter (2B) hemmen. Im Anschluss an die ortsspezifische mitotische Rekombination vermittelt durch das FLP / FRT-System, das two RNAi-basierte Suppressoren getrennt werden in zwei Einzelzellen , die Expression von verschiedenen Reportern (2B) zu ermöglichen. Zwei klonalen Muster, single-Zelle , die mit Single-Zell - Klonen und zwei-cell-GMC zugeordnet mehrzelligen-NB - Klone, werden typischerweise in einem tsMARCM experiment (2C) zu sehen. Information von einer Seite der Doppelzellen abgeleitet sind, können als die Referenz für die andere Seite verwendet werden, wodurch hochauflösende neuralen lineage wie Geburten Datieren des markierten Neuronen Analysen und phänotypische Analyse von identischen Neuronen in verschiedenen Tieren, die für die genaue Untersuchung neuronaler Genfunktion 11, 12. Hier präsentieren wir eine Schritt- für -Schritt - Protokoll beschreibt , wie ein tsMARCM Experiment durchzuführen, die von anderen Laboratorien verwendet werden , können ihr Studium der neuronalen Entwicklung (sowie die Entwicklung von anderen Geweben, wo zutreffend) in Drosophila zu erweitern.

<table><tbody><tr><td>Carbon dioxide (CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Local vendor</td><td>n.a.</td><td>Anesthetize flies</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; pad</td><td>Local vendor</td><td>n.a.</td><td>Sort, cross and transfer flies</td></tr><tr><td>10x PBS pH 7.4</td><td>Uniregion Bio-Tech (or other vendors)</td><td>PBS001</td><td>Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains</td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549</td><td>Fix fly brains</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Rinse, wash and immunostain fly brains</td></tr><tr><td>Normal goat</td><td>Jackson ImmunoResearch&amp;nbsp;</td><td>005-000-121</td><td>Immunostain fly brains</td></tr><tr><td>serum</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD8 antibody</td><td>Invitrogen</td><td>MCD0800</td><td>Immunostain fly brains</td></tr><tr><td>Rabbit anti-DsRed antibody</td><td>Clonetech</td><td>632496</td><td>Immunostain fly brains</td></tr><tr><td>Mouse anti-Brp antibody</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>nc82</td><td>Immunostain fly brains</td></tr><tr><td>Goat anti-rat IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11006</td><td>Immunostain fly brains</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 546</td><td>Invitrogen</td><td>A11035</td><td>Immunostain fly brains</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A21236</td><td>Immunostain fly brains</td></tr><tr><td>SlowFade gold antifade reagent</td><td>Molecular Probes</td><td>S36936</td><td>Mount fly brains and protect quenching of fluorescence&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PYREX 9 depression glass spot plate</td><td>Corning</td><td>7220-85</td><td>Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains</td></tr><tr><td>Sylgard 184 silicone elastomer kit</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYLG184</td><td>Make black Sylgard dishes to protect forceps during brain dissection</td></tr><tr><td>Activated charcoal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>242276-250G</td><td>Make black Sylgard dishes</td></tr><tr><td>Dumont #5 forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td>Dissect and mount fly brains</td></tr><tr><td>Micro slide</td><td>Corning</td><td>2948-75x25</td><td>Mount fly brains</td></tr><tr><td>Micro cover glass No. 1.5</td><td>VWR International</td><td>48366-205</td><td>Mount fly brains</td></tr><tr><td>Nail polish</td><td>Local vendor</td><td>not available</td><td>Seal micro cover glass on micro slides</td></tr><tr><td>Incubator&amp;nbsp;</td><td>Kansin Instruments</td><td>LTI603</td><td>culture flies at 25 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>(or other vendors)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td>Kansin Instruments</td><td>WB212-B2</td><td>Induce heat-shock in flies at 37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>(or other vendors)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td>Kansin Instruments</td><td>OS701</td><td>Wash and immunostain fly brains</td></tr><tr><td>(or other vendors)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>Leica</td><td>EZ4</td><td>Sort, cross and transfer flies; Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains</td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Zeiss (or other vendors)</td><td>LSM 700 (or other models)</td><td>Image tsMARCM clones</td></tr><tr><td>image-processing software 1&lt;br/&gt; (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, Zeiss LSM image browser)&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>not available</td><td>Project stacks of confocal images</td></tr><tr><td>image-processing software 2&lt;br/&gt; (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, ImageJ)&amp;nbsp;</td><td>not available</td><td>not available</td><td>Count cell number of tsMARCM clones</td></tr></tbody></table>

cell lineage analyses and gene function studies using twin-spot marcm

M osaic eine nalyse mit einem r epressible c ell m Arker (MARCM) ist ein positives Kennzeichnungssystem Mosaik , das in Drosophila Neurobiologie Studien weithin angewandt wurde komplizierte Morphologien darzustellen und die Funktion von Genen in Teilmengen von Neuronen innerhalb ansonsten unmarkierten und unbeirrt zu manipulieren Organismen. Genetische Mosaiken im MARCM System erzeugt werden durch ortsspezifische Rekombination zwischen homologen Chromosomen vermittelten Vorläuferzellen innerhalb Dividieren beide markiert (MARCM Klone) und unmarkierten Tochterzellen während der Mitose zu erzeugen. Eine Erweiterung des MARCM Methode, die so genannte Twin-Spot MARCM (tsMARCM), Etiketten sowohl der Zwillings von einem gemeinsamen Vorläufer mit zwei verschiedenen Farben abgeleiteten Zellen. Diese Technik wurde entwickelt, um das Abrufen nützlicher Informationen aus beiden Hemi-Abstammungslinien zu ermöglichen. Durch umfassend verschiedene Paare von tsMARCM Klone Analyse erlaubt die tsMARCM System mappin neuronale Abstammungslinie hochauflösenderg die genaue Geburtsfolge der markierten Neuronen aus gemeinsamen Vorläuferzellen produziert zu offenbaren. Ferner erstreckt sich die tsMARCM System auch Studien der Genfunktion durch die phänotypische Analyse von identischen Neuronen verschiedener Tiere ermöglicht. Hier beschreiben wir , wie die tsMARCM System anzuwenden Studien der neuronalen Entwicklung in Drosophila zu erleichtern.

Das tsMARCM System verwendet worden neuronale Abstammungslinie zu erleichtern Analysen und Genfunktion Studien durch Abrufen wichtiger Informationen zu Neuronen aus gemeinsamen NBs abgeleitet. Das System verwendet worden ist am meisten zu identifizieren (wenn nicht alle) neuronalen Typen, bestimmen die Zellzahl jeder neuronalen Typ, und ermitteln die Geburt Ordnung dieser Neuronen 11, 12, 18 (si...

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Cell Lineage Analyses and Gene Function Studies Using Twin-spot MARCM

Hier stellen wir ein Protokoll für ein Mosaik Markierungstechnik, die die Visualisierung von Neuronen aus einer gemeinsamen Vorläuferzelle in zwei verschiedenen Farben abgeleitet ermöglicht. Dies erleichtert die neuronale Abstammungslinie Analyse mit der Fähigkeit, Geburts Datierung einzelner Neuronen und das Studium der Genfunktion in den gleichen Neuronen verschiedener Individuen.

Zell Lineage Analysen und Genfunktion Studien mit Twin-Spot MARCM

Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) is a positive mosaic labeling system that has been widely applied in Drosophila neurobiological ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.9K Aufrufe.  Academia Sinica.  Hier stellen wir ein Protokoll für ein Mosaik Markierungstechnik, die die Visualisierung von Neuronen aus einer gemeinsamen Vorläuferzelle in zwei verschiedenen Farben abgeleitet ermöglicht. Dies erleichtert die neuronale Abstammungslinie Analyse mit der Fähigkeit, Geburts Datierung einzelner Neuronen und das Studium der Genfunktion in den gleichen Neuronen verschiedener Individuen. 

Serie: Cell Lineage Analyses and Gene Function Studies Using Twin-spot MARCM

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the context of a whole organism. Sophisticated techniques to generate genetic mosaics facilitate induction of visually marked, genetically defined clones surrounded by normal tissue. The clones can be analyzed through diverse molecular, cellular and omics approaches. This study describes how to generate fluorescently labeled clonal tumors of varying malignancy in the eye/antennal imaginal discs (EAD) of Drosophila larvae using the Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. It describes procedures how to recover the mosaic EAD and brain from the larvae and how to process them for simultaneous imaging of fluorescent transgenic reporters and antibody staining. To facilitate molecular characterization of the mosaic tissue, we describe a protocol for isolation of total RNA from the EAD. The dissection procedure is suitable to recover EAD and brains from any larval stage. The fixation and staining protocol for imaginal discs works with a number of transgenic reporters and antibodies that recognize Drosophila proteins. The protocol for RNA isolation can be applied to various larval organs, whole larvae, and adult flies. Total RNA can be used for profiling of gene expression changes using candidate or genome-wide approaches. Finally, we detail a method for quantifying invasiveness of the clonal tumors. Although this method has limited use, its underlying concept is broadly applicable to other quantitative studies where cognitive bias must be avoided.

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

This protocol demonstrates how to generate fluorescently marked, genetically defined clonal tumors in the Drosophila eye/antennal imaginal discs (EAD). It describes how to dissect the EAD and brain from the third instar larvae and how to process them to visualize and quantify gene expression changes and tumor invasiveness.

Das<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginalscheibe Tumormodell: Visualisierung und Quantifizierung von Genexpression und Tumorinvasivität mit Genetischen Mosaiken

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Forschung

Krebsforschung

A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied for many decades, revealing seminal findings in developmental biology. More recently, it was adopted by stem cell biologists to identify and track different stem cell populations with minimal experimental intervention. The recent developments in mouse genetics, the availability of a large number of mouse strains, and the advancements in fluorescent microscopy allow the straightforward design of powerful lineage tracing systems for various tissues with basic expertise, using commercially available tools. We have recently taken advantage of this powerful methodology to explore the origin and fate of stem cells at the ocular surface using R26R-Confetti mouse. This model offers a multi-color genetic system, for the expression of 4 fluorescent genes in a random manner. Here we describe the principles of this methodology and provide an adaptable protocol for designing lineage tracing experiments; specifically for the corneal epithelium as well as for other tissues.

In this article we describe the principles for designing and performing a multi-color lineage tracing experiment using R26R-Confetti mice. We provide a specific protocol for tracking corneal epithelial cells which can be modified for other tissues of interest.

Eine Methode zur Lineage Tracing von Hornhautzellen mit Multi-Farben-Fluoreszenz-Reporter-Mäuse

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

Entwicklungsbiologie

Co-localization of Cell Lineage Markers and the Tomato Signal

The cell lineage tracing system has been used predominantly in developmental biology studies. The use of Cre recombinase allows for the activation of the reporter in a specific cell line and all progeny. Here, we used the cell lineage tracing technique to demonstrate that chondrocytes directly transform into osteoblasts and osteocytes during long bone and mandibular condyle development using two kinds of Cre, Col10a1-Cre and Aggrecan-CreERT2 (Agg-CreERT2), crossed with Rosa26tdTomato. Both Col10 and aggrecan are well-recognized markers for chondrocytes.
On this basis, we developed a new method-cell lineage tracing in conjunction with fluorescent immunohistochemistry-to define cell fate by analyzing the expression of specific cell markers. Runx2 (a marker for early-stage osteogenic cells) and Dentin matrix protein1 (DMP1; a marker for late-stage osteogenic cells) were used to identify chondrocyte-derived bone cells and their differentiation status. This combination not only broadens the application of cell lineage tracing, but also simplifies the generation of compound mice. More importantly, the number, location, and differentiation statuses of parent cell progeny are displayed simultaneously, providing more information than cell lineage tracing alone. In conclusion, the co-application of cell lineage tracing techniques and immunofluorescence is a powerful tool for investigating cell biology in vivo.

We developed two sets of tracing combinations in Rosa26tdtomato (ubiquitously expressed in all cells)/Cre (specifically expressed in chondrocytes) mice: one with 2.3Col1a1-GFP (specific to osteoblasts) and one with immunofluorescence (specific to bone cells). The data demonstrate the direct transformation of chondrocytes into bone cells.

Co-Lokalisierung von Zell Lineage Marker und die Tomate Signal

The cell lineage tracing system has been used predominantly in developmental biology studies. The use of Cre recombinase allows for the activation of the ...

HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries

CCCTC-binding factor (CTCF)-mediated stable topologically associating domains (TADs) play a critical role in constraining interactions of DNA elements that are located in neighboring TADs. CTCF plays an important role in regulating the spatial and temporal expression of HOX genes that control embryonic development, body patterning, hematopoiesis, and leukemogenesis. However, it remains largely unknown whether and how HOX loci associated CTCF boundaries regulate chromatin organization and HOX gene expression. In the current protocol, a specific sgRNA pooled library targeting all CTCF binding sites in the HOXA/B/C/D loci has been generated to examine the effects of disrupting CTCF-associated chromatin boundaries on TAD formation and HOX gene expression. Through CRISPR-Cas9 genetic screening, the CTCF binding site located between HOXA7/HOXA9 genes (CBS7/9) has been identified as a critical regulator of oncogenic chromatin domain, as well as being important for maintaining ectopic HOX gene expression patterns in MLL-rearranged acute myeloid leukemia (AML). Thus, this sgRNA library screening approach provides novel insights into CTCF mediated genome organization in specific gene loci and also provides a basis for the functional characterization of the annotated genetic regulatory elements, both coding and noncoding, during normal biological processes in the post-human genome project era.

HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries

A CRISPR/sgRNA library has been applied to interrogating protein-coding genes.However, the feasibility of a sgRNA library to uncover the function of a CTCF boundary in gene regulation remains unexplored. Here, we describe a HOX loci specific sgRNA library to elucidate the function of CTCF boundaries in HOX loci.

HOX Loci Focused CRISPR/SgRNA Bibliothek Screening identifizieren kritische CTCF Grenzen

CCCTC-binding factor (CTCF)-mediated stable topologically associating domains (TADs) play a critical role in constraining interactions of DNA elements ...

Genetik

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk population methods (Northern blot, PCR, and RNAseq) that measure mRNA levels lack the ability to provide information on cell-to-cell variation in responses. Precise single cell and allelic visualization and quantification is possible via single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH). RNA-FISH is performed by hybridizing target RNAs with labeled oligonucleotide probes. These can be imaged in medium/high throughput modalities, and, through image analysis pipelines, provide quantitative data on both mature and nascent RNAs, all at the single cell level. The fixation, permeabilization, hybridization and imaging steps have been optimized in the lab over many years using the model system described herein, which results in successful and robust single cell analysis of smFISH labeling. The main goal with sample preparation and processing is to produce high quality images characterized by a high signal-to-noise ratio to reduce false positives and provide data that are more accurate. Here, we present a protocol describing the pipeline from sample preparation to data analysis in conjunction with suggestions and optimization steps to tailor to specific samples.&#160;

Single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a method to accurately quantify levels and localization of specific RNAs at the single cell level. Here, we report our validated lab protocols for wet-bench processing, imaging and image analysis for single cell quantification of specific RNAs.

Einzelzellanalyse transkriptionell aktiver Allele mittels Einzelmolekül FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Biochemie

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell fate determining and maturing factors. We previously set out to define the minimal set of factors necessary for instructing red blood cell development using direct lineage reprogramming of fibroblasts into induced erythroid progenitors/precursors (iEPs). We showed that overexpression of Gata1, Tal1, Lmo2, and c-Myc (GTLM) can rapidly convert murine and human fibroblasts directly to iEPs that resemble bona fide erythroid cells in terms of morphology, phenotype, and gene expression. We intend that iEPs will provide an invaluable tool to study erythropoiesis and cell fate regulation. Here we describe the stepwise process of converting murine tail tip fibroblasts into iEPs via transcription factor-driven direct lineage reprogramming (DLR). In this example, we perform the reprogramming in fibroblasts from erythroid lineage-tracing mice that express the yellow fluorescent protein (YFP) under the control of the erythropoietin receptor gene (EpoR) promoter, enabling visualization of erythroid cell fate induction upon reprogramming. Following this protocol, fibroblasts can be reprogrammed into iEPs within five to eight days. 
While improvements can still be made to the process, we show that GTLM-mediated reprogramming is a rapid and direct process, yielding cells with properties of bona fide erythroid progenitor and precursor cells.

Here we present our protocol for producing induced erythroid progenitors (iEPs) from mouse adult fibroblasts using transcription factor-driven direct lineage reprogramming (DLR).

Direkte Linie Reprogrammierung von adulten Maus-Fibroblasten zu erythroiden Vorläuferzellen

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental biology. It has been successfully used to identify rare cell populations, discover novel marker genes, and decode spatial and temporal developmental information. The single cell method has also evolved from the microfluidic based Fluidigm C1 technology to the droplet-based solutions in the last two to three years. Here we used the heart as an example to demonstrate how to profile the mouse embryonic tissue cells using the droplet based scRNA-Seq method. In addition, we have integrated two strategies into the workflow to profile multiple samples in a single experiment. Using one of the integrated methods, we have simultaneously profiled more than 9,000 cells from eight heart samples. These methods will be valuable to the developmental biology field by providing a cost-effective way to simultaneously profile single cells from different genetic backgrounds, developmental stages, or anatomical locations.

Here we presented a multiplexed single cell mRNA sequencing method to profile gene expression in mouse embryonic tissues. The droplet-based single cell mRNA sequencing (scRNA-Seq) method in combination with multiplexing strategies can profile single cells from multiple samples simultaneously, which significantly reduces reagent costs and minimizes experimental batch effects.

Multiplexed Single Cell mRNA Sequenzierungsanalyse von Mausembryonalzellen

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental ...

Isolierung und Genotypisierung von gastrulierenden Mausembryonen für die Einzelzellsequenzierung

Single-Cell RNA Sequencing of Mutant Whole Mouse Embryos: From the Epiblast to the End of Gastrulation

Over the last decade, single-cell approaches have become the gold standard for studying gene expression dynamics, cell heterogeneity, and cell states within samples. Before single-cell advances, the feasibility of capturing the dynamic cellular landscape and rapid cell transitions during early development was limited. In this paper, a robust pipeline was designed to perform single-cell and nuclei analysis on mouse embryos from embryonic day E6.5 to E8, corresponding to the onset and completion of gastrulation. Gastrulation is a fundamental process during development that establishes the three germinal layers: mesoderm, ectoderm, and endoderm, which are essential for organogenesis. Extensive literature is available on single-cell omics applied to wild-type perigastrulating embryos. However, single-cell analysis of mutant embryos is still scarce and often limited to FACS-sorted populations. This is partially due to the technical constraints associated with the need for genotyping, timed pregnancies, the count of embryos with desired genotypes per pregnancy, and the number of cells per embryo at these stages. Here, a methodology is presented designed to overcome these limitations. This method establishes breeding and timed pregnancy guidelines to achieve a higher chance of synchronized pregnancies with desired genotypes. Optimization steps in the embryo isolation process coupled with a same-day genotyping protocol (3 h) allow for microdroplet-based single-cell to be performed on the same day, ensuring the high viability of cells and robust results. This method further includes guidelines for optimal nuclei isolations from embryos. Thus, these approaches increase the feasibility of single-cell approaches of mutant embryos at the gastrulation stage. We anticipate that this method will facilitate the analysis of how mutations shape the cellular landscape of the gastrula.

Autor im Rampenlicht: Eine Pipeline zur Analyse linienspezifischer mutierter Embryonen mit Einzelzellauflösung

This paper establishes a pipeline for high-quality single-cell and nuclei suspensions of gastrulating mouse embryos for sequencing of single cells and nuclei.

Einzelzell-RNA-Sequenzierung von mutierten ganzen Mausembryonen: Vom Epiblasten bis zum Ende der Gastrulation

Over the last decade, single-cell approaches have become the gold standard for studying gene expression dynamics, cell heterogeneity, and cell states ...

Zell Lineage Analysen und Genfunktion Studien mit Twin-Spot MARCM

Zusammenfassung

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Das

Eine Methode zur Lineage Tracing von Hornhautzellen mit Multi-Farben-Fluoreszenz-Reporter-Mäuse

Co-Lokalisierung von Zell Lineage Marker und die Tomate Signal

HOX Loci Focused CRISPR/SgRNA Bibliothek Screening identifizieren kritische CTCF Grenzen

Einzelzellanalyse transkriptionell aktiver Allele mittels Einzelmolekül FISH

Direkte Linie Reprogrammierung von adulten Maus-Fibroblasten zu erythroiden Vorläuferzellen

Multiplexed Single Cell mRNA Sequenzierungsanalyse von Mausembryonalzellen

Einzelzell-RNA-Sequenzierung von mutierten ganzen Mausembryonen: Vom Epiblasten bis zum Ende der Gastrulation

Einzelzell-RNA-Sequenzierung von mutierten ganzen Mausembryonen: Vom Epiblasten bis zum Ende der Gastrulation

Einzelzell-RNA-Sequenzierung von mutierten ganzen Mausembryonen: Vom Epiblasten bis zum Ende der Gastrulation