이 작품은 과학 기술부에 의해 지원되었다 (MOST 104-2311-B-001-034)과 세포 연구소 유기체 생물학, 중앙 연구원, 대만.

1. 필수 유전자 (11), (13)를 사용하여 tsMARCM 준비 파리 구축 <ol><li> 개별 플라이 (11)에 의해 수행되는 유전자로부터 tsMARCM 준비 파리의 원래 버전을 생성 (표 1 참조). 같은 비행 주식 13에서 여러 유전자를 넣어, 이전에 설명 된 표준 비행 유전자 교차 제도를 실시한다. <ol><li> 한 부모의 라인에서, FRT 40A, UAS-mCD8 :: GFP (첫 번째 기자, mCD8 :: GFP의 유전자를 조립, 형질 전환 유전자의 발현이 막 닿는 기자를 생산하는 업스트림 활성화 시퀀스 프로모터의 제어하에 쥐 클러스터 (O)의 발현에 대하여 RNAi에, 녹색 형광 단백질을 융합 단백질의 분화 8 마우스 클러스터)와 UAS-rCD2RNAi (제 리포터의 발현을 억제 레서의F 차별화 2, rcd2) 2 차 염색체의 왼쪽 팔에. 장소 조직 특이 가능한 경우 X 또는 3 번째 염색체에 -GAL4 드라이버. </li><li> 다른 부모의 라인에서, FRT 40A, UAS-rCD2 :: RFP의 유전자 조립 (제 기자, rCD2 :: RFP를, 다른 막 닿는 기자가 적색 형광 단백질 융합 rCD2 단백질로 구성)와 UAS-GFPRNAi (mCD8 :: GFP의 발현을 억제 억압, GFP의 발현에 대한 RNAi의) 2 차 염색체의 왼쪽 팔에. 는 X 또는 제 3 염색체 가능한 경우에 열 충격 (HS) -FLP 또는 조직 특정 - FLP를 놓습니다. </li></ol></li><li> 개별 파리 (14)에 의해 수행되는 유전자에서 tsMARCM 준비 파리의 새 버전을 생성 (표 1 참조). P는 설명 된 표준 비행 유전자 교차 제도를 실시reviously, 동일한 플라이 주식 13에서 여러 유전자를 넣어. <ol><li> 한 부모 행에서 같은 팔에 함께 FRT 사이트와 UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i (mCD8 :: GFP 및 rCD2의 발현 :: RFP를 억제하는 서프 레서의 결합 된 유전자)의 유전자를 조립 2 차 또는 3 차 염색체 (FRT와 UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i의 유전자들의 적절한 쌍이 표 1에 나타내었다). 가능하면, 선택한 FRT 사이트의 염색체 이외의 다른 염색체에 조직 특이-GAL4 드라이버를 놓습니다. </li><li> 다른 부모의 라인에서, FRT 사이트와 UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi (다른 결합 rCD2의 유전자 :: RFP 및 mCD8 :: GFP의 발현 억제 서프 레서) 같은 팔을의 유전자를 조립 FRT의 도입 유전자의 2 차 또는 3 차 염색체 (적절한 쌍 </EM&gt;와 UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi)은 표 1에 표시됩니다. 장소 HS-FLP 또는 가능하면, 선택한 FRT 사이트의 염색체 이외의 다른 염색체에 조직 특이-FLP. </li></ol></li></ol> 2. 크로스 tsMARCM 준비는 그들의 자손에 tsMARCM 클론을 생성 (으)로 운항하는 항공사 <ol><li> 함께 간 tsMARCM 준비 파리 신선한와 플라이 식품 유리 병에 (예를 들어, 함께 단계 1.1.2 또는 1.2.2에서 날아 단계 1.1.1 또는 1.2.1 및 20 ~ 30 버진 여성에서 10 ~ 15 남성 파리를 넣어) 유리 병의 벽에 - 만든 효모 붙여 넣기. </li><li> 수정 된 알을 수집하기 전에 상대의 기회를 향상시키기 위해 2 일 동안 25 ° C에서 넘어 tsMARCM 준비 파리를 유지한다. </li><li> 자주 전송을 용이하게하기 위해 (군집 피 파리를 누르거나 파리를 마취하는 이산화탄소를 사용하는 갓 yeasted 유리 병에 넘어 tsMARCM 준비 파리를 전송;를 통해 10 mL의 플라이 식품에 80-100 수정란보다 더 이상 유지하지난) 너무 많은 부화 유충을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 문화 tsMARCM 동물 (즉, 수정란, tsMARCM 동물의 유전자형의 예를 들어, 그림 3에서 사용이며, HS-FLP [22], w / w, UAS-mCD8 :: GFP, UAS-rCD2RNAi, FRT (40A) , GAL4-GH146 / UAS-rCD2 :: RFP, UAS-GFPRNAi, FRT 40A, + 그들은 원하는 단계 (예를 들어, 배아, 유충에 개발 될 때까지 25 ° C에서 직렬로 전송 유리 병에 배치 된 +), 또는 번데기). </li><li> 를 생성 FLP의 발현을 유도하는 열 충격을 최적의 시간을 결정하기 위해 전송 (10) 37 °의 C 수조, 20, 30, 40와 동일한 발달 단계에서 tsMARCM 동물을 포함 바이알에서 50 분간 배치 관심 tsMARCM 클론. 조직 특정 - FLP는 tsMARCM 실험에 사용하는 경우이 단계를 건너 뜁니다 (HS-FLP는 신경 계통에 대한 선호 분석,이 설정에 대한 이유는 이전에 15 설명 하였다). 참고 : 관심이 더 tsMARCM 클론이 원하는 경우 향후 tsMARCM 실험에서 열 충격의 최적의 시간을 사용하여 단계를 반복 2.5; 일반적으로, 더 FLP 표현이 비교에서 HS-FLP [22] 유도 HS-FLP [1] 같은 열 충격 시간. </li><li> 문화는 25 ° C에서 열 충격 tsMARCM 동물을 적절한 발달 단계에 도달 한 다음 3 단계로 진행 될 때까지. </li></ol> 3. 얼룩을 준비하고 마운트 플라이 두뇌는 tsMARCM 클론을 포함하는 <ol><li> 집게 보호 요리를 준비합니다. 파트 A (30g) 및 활성탄 (0.25 g)와 실리콘 엘라스토머 키트의 부품 B (3 g)을 섞는다. 해당 요리에 혼합물을 부어. </li><li> 해부 현미경을 통해 볼 집게 보호 접시에 집게를 사용 1X 인산 완충 식염수에 tsMARCM 동물 (PBS) 중 애벌레, 번데기, 또는 성인의 뇌를 해부하다. 참고 : 플라이 뇌 해부를위한 프로토콜은 내림차순하고있다이전 16 ribed. </li><li> 1X PBS을 실온에서 20 분간 4 % 포름 알데히드를 함유하는 유리 스폿 접시 플라이 머리를 고정한다. 단계의 나머지 부분이 유리 자리 접시에 플라이 뇌를 처리합니다. </li><li> 제거 PBT :; 세척 PBT를 제거하고 신속하게 새로운 PBT를 추가 플라이 뇌를 1 % PBT (1X PBS 1 % 트리톤 X-100 포함) 및 1 % PBT (씻어 30 분 동안 그들에게 각각 세 번 씻어로 3 회 씻어 새로운 PBT를 추가하고, 궤도 쉐이커를 사용하여 새 PBT에서 플라이 두뇌)를 품어. </li><li> 밤새 4 ℃ 또는 실온에서 4 시간 동안 일차 항체의 혼합물 플라이 뇌 인큐베이션. 포함하고, 마우스 항 Bruchpilot (BRP) 항체 (1시 50분) 1 % PBT에서 : 토끼 항을 DsRed 항체 (800 1) 일차 항체의 혼합물의 예는 쥐 항 CD8 항체 (1 : 100) 인 5 % 정상 염소 혈청 (NGS). </li><li> 플라이 두뇌 1 %의 PBT로 3 회 씻어, 다음 1 % PBT와 30 분마다 그들에게 세 번 씻는다. </li><l난&gt; 밤새 4 ℃ 또는 실온에서 4 시간 동안 2 차 항체의 혼합물로 즉시 뇌를 부화. 및 염소 항 - 마우스 - 황색 형광 염료 (800 1)와 접합 염소 항 - 토끼 IgG 항체 : 이차 항체의 혼합물의 예는 녹색 형광 염료 (800 1)와 접합 된 염소 항 - 래트 IgG 항체 인 5 % NGS를 포함하는 1 % PBT에서 : IgG 항체는 멀리 붉은 형광 염료 (800 일)와 결합. </li><li> 플라이 두뇌 1 %의 PBT로 3 회 씻어, 다음 1 % PBT와 30 분마다 그들에게 세 번 씻는다. 반 담금질 시약 마이크로 슬라이드를 탑재합니다. 플라이 머리를 커버하고 보호하기 위해 마이크로 슬라이드에 마이크로 커버 유리를 넣습니다. 투명한 매니큐어를 사용하여 마이크로 커버 유리 마이크로 슬라이드의 가장자리를 밀봉. 이러한 장착하고 4 ℃에서 뇌 표본을 비행 밀봉 보관하십시오. </li></ol> 4. 프로세스를 가지고, 그리고 tsMARCM 클론의 형광 이미지 분석 <ol><li> tsMARCM 클론의 FR의 형광 이미지를 캡처OM 샘플을 원하는 초점 현미경 시스템을 이용하여 단계 380에서 생성. </li><li> 두 차원에 tsMARCM 공 초점 형광 이미지의 프로젝트 스택은, 선택의 공 초점 현미경 시스템과 함께 제공되는 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 이미지를 평평 (그림 3B 참조 - 평평의 예 3T - 3E, 3G - 3J, 3L - 3O, 3 분기를 공 초점 형광 이미지). </li><li> 적절한 화상 처리 소프트웨어 (ImageJ에 17 예, &quot;셀 카운터&quot;기능을 이용하여 tsMARCM 클론의 다세포-NB 측의 세포 수를 세어 상기 셀의 예는도 3e, 3J, 3O 및 3T 참조 신경 세포의 시체). </li></ol>

<ol>
	<li>Ito, M., Masuda, N., Shinomiya, K., Endo, K., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+analysis+of+neural+projections+reveals+clonal+composition+of+the+Drosophila+brain.">Systematic analysis of neural projections reveals clonal composition of the Drosophila brain.</a> Curr Biol. 23 (8), 644-655 (2013).</li><li>Yu, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+development+and+organization+of+the+adult+Drosophila+central+brain.">Clonal development and organization of the adult Drosophila central brain.</a> Curr Biol. 23 (8), 633-643 (2013).</li><li>Goodman, C. S., Doe, C. Q., Bate, M., Arias, A. 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H., Chen, C. H., Shi, L., Huang, Y., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twin-spot+MARCM+to+reveal+the+developmental+origin+and+identity+of+neurons.">Twin-spot MARCM to reveal the developmental origin and identity of neurons.</a> Nat Neurosci. 12 (7), 947-953 (2009).</li><li>Yu, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complete+developmental+sequence+of+a+Drosophila+neuronal+lineage+as+revealed+by+twin-spot+MARCM.">A complete developmental sequence of a Drosophila neuronal lineage as revealed by twin-spot MARCM.</a> PLoS Biol. 8 (8), (2010).</li><li>Greenspan, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fly pushing : the theory and practice of Drosophila genetics. , (1997).</li><li>Awasaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+Drosophila+lineage-restricted+drivers+via+patterned+recombination+in+neuroblasts.">Making Drosophila lineage-restricted drivers via patterned recombination in neuroblasts.</a> Nat Neurosci. 17 (4), 631-637 (2014).</li><li>Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+mosaics+for+lineage+analysis+in+flies.">Generating mosaics for lineage analysis in flies.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 3 (1), 69-81 (2014).</li><li>Wu, J. S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+dissecting+Drosophila+melanogaster+brains+for+live+imaging+or+immunostaining.">A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining.</a> Nat Protoc. 1 (4), 2110-2115 (2006).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Lin, S., Kao, C. F., Yu, H. H., Huang, Y., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+analysis+of+Drosophila+lateral+antennal+lobe+neurons+reveals+notch-dependent+binary+temporal+fate+decisions.">Lineage analysis of Drosophila lateral antennal lobe neurons reveals notch-dependent binary temporal fate decisions.</a> PLoS Biol. 10 (11), e1001425 (2012).</li><li>Zhan, X. 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V., Liang, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Q+system:+a+repressible+binary+system+for+transgene+expression,+lineage+tracing,+and+mosaic+analysis.">The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis.</a> Cell. 141 (3), 536-548 (2010).</li><li>Lai, S. L., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+mosaic+with+dual+binary+transcriptional+systems+in+Drosophila.">Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila.</a> Nat Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).</li><li>Kao, C. F., Yu, H. H., He, Y., Kao, J. C., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+deployment+of+factors+regulating+temporal+fate+in+a+diverse+neuronal+lineage+of+the+Drosophila+central+brain.">Hierarchical deployment of factors regulating temporal fate in a diverse neuronal lineage of the Drosophila central brain.</a> Neuron. 73 (4), 677-684 (2012).</li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

프로토콜 내에서 중요한 단계 2.5, 2.3, 1.2.1, 1.1.1 단계, 3.2 좋은 tsMARCM 결과를 얻기위한 중요합니다. 신경 전구 세포에서 GAL4을 표현하지 않는 조직 별 -GAL4 드라이버 단계 1.1.1과 1.2.1 바람직하다. 단계 2.3에서 플라이 식품 유리 병에서 자란 동물을 과도하게 몰려 마십시오. 유도 지연, 열충격시 FLP의 발현 수준 및 신경 전구 세포 (즉, 새로운 기지국과 GMCs)의 평균 분할...

방대한 수의 뉴런 다양한 형태로 구성 뇌가, 지각 처리와 외부 세계로부터의 도전에 대응하는 능력을 동물 부여한다. 성인 초파리 중앙 뇌의 신경 세포는 신경 줄기 세포의 수가 제한으로부터 유도되는 현상 (1, 2) 동안 호출 neuroblasts (NBS). 새로운 기지국이 초파리의 뇌 신경에 참여하는 대부분의 자기 갱신 NBS 및 신경절 어머니 세포 (GMCs)를 생성하는 비대칭 분열을 받아야하고, GMCs는 (그림 1A를 신경 세포 3로 분화 두 개의 딸 세포를 생산하는 부문의 또 다른 라운드 통과 ). 때문에 신경 형태의 복잡함과 특정 신경 세포, 긍정적 인 모자이크 레이블 기술하는 repressible 세포 마커 (MARCM) 모자이크 분석을 식별과 관련된 문제의의 visualizat 수 있도록 발명되었다하나의 신경 세포 또는 주변, 레이블이없는 뉴런 (4)의 인구 중 신경 세포의 작은 부분 집합의 이온. MARCM는 flippase (FLP) 식 일반적으로 리포터 유전자 4의 발현을 억제하는 리프레 서 유전자의 이형 접합 대립 유전자를 운반하는 분할 전구 세포 내에서 상동 염색체 사이의 부위 특이 적 재조합을 중재하기 / FLP 인식 대상 (FRT) 시스템을 사용합니다. 유사 분열 분할 한 후, 재조합 염색체가 더 이상없는 하나의 셀은 동형 접합 리프레 유전자의 대립 유전자와 다른 세포가 더 리프레 서 유전자 - 더 그 셀 (및 그 자손)에 기자의 발현이 없습니다를 포함하도록, 트윈 세포로 분리된다 (4)를 차단했습니다. FLP가 확률 적 NBS 또는 GMCs 유도 할 때 세 가지 클론 패턴은 일반적으로 MARCM 실험에서 발견된다 : 단일 셀 resolutio에서 신경 세포의 형태를 묘사 단일 셀 및 2 셀 - GMC 클론을,일반적인 NB (그림 1B)에서 파생 된 신경 세포의 전체 형태 학적 패턴을 보여 n 및 다세포-NB 클론. MARCM 기술이 널리 뇌 전체의 배선 네트워크를 재구성 신경 유형 식별을 포함하여, 초파리 신경 생물학적 연구에 적용되어, 신경 계통은 신경 세포 운명 사양에 관여하는 유전자의 기능 표현형 특성의 개발 역사를 공개에 대해 분석하고, 신경 세포의 형태 형성 분화는 5, 6, 7, 8, 9, 10 연구. 종래 MARCM 만 유도 분열 재조합 이벤트 이후 개의 딸세포 (및 계통) 중 한 라벨 때문에, 표시되지 않은 측면에서 잠재적으로 유용한 정보가 손실된다. 이 제한은 기본 M의 적용을 배제고해상도로 ARCM 시스템은 빠른 템포 세포 운명 전환 많은 신경 계통 분석 또는 다른 동물 정밀도 11, 12의 동일한 뉴런 유전자 기능 분석한다. 트윈 스폿 MARCM (tsMARCM)는 이렇게 원래 MARCM 시스템 (11)의 한계 (극복 트윈 셀의 양측에서 유용한 정보의 회복을 가능하게 두 개의 별개의 색상이 공통 조상으로부터 유래 신경 라벨 고급 시스템이다 그림 2A - 2C). tsMARCM 시스템에서, 두 개의 RNA 간섭 (RNAi) 억제제는 전구 세포 내에서 상동 염색체의 트랜스 위치에 놓인다 기반, 이러한 억제제의 발현이 독립적으로 각각의 기자 (도 2B)의 발현을 억제한다. FLP / FRT 시스템을 통해 매개되는 부위 특이 적 분열 재결합 후, TWO가 RNAi를 기반 억제 별개 기자 (도 2B)의 발현을 허용하는 트윈 세포로 분리. 두 클론 패턴 다세포-NB 클론과 연관된 단일 세포 클론과 두 셀 GMC와 연관된 단일 셀은 전형적 tsMARCM 실험 (도 2c)에서 볼 수있다. 정보는 출생 데이트 표지 뉴런 신경 혈통 분석 고해상도를 가능 타측에 대한 기준으로서 이용 될 수있는 트윈 셀의 한쪽에서 유래하고, 표현형은 정확한 조사 다른 동물에서 동일 뉴런 분석 신경 유전자 기능 (11), (12). 여기서, 우리는 (가능한 경우뿐만 아니라, 다른 조직의 발달) 초파리 신경 발달 공부 범위를 확장하기 위해 다른 실험실에서 사용될 수있는 tsMARCM 실험을 수행하는 방법을 설명하는 단계별 프로토콜을 제시한다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide (CO2)</td>
			<td>Local vendor</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Anesthetize flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 pad</td>
			<td>Local vendor</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Sort, cross and transfer flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS pH 7.4</td>
			<td>Uniregion Bio-Tech (or other vendors)</td>
			<td>PBS001</td>
			<td>Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252549</td>
			<td>Fix fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Rinse, wash and immunostain fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat</td>
			<td rowspan="2">Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td rowspan="2">005-000-121</td>
			<td rowspan="2">Immunostain fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD8 antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MCD0800</td>
			<td>Immunostain fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-DsRed antibody</td>
			<td>Clonetech</td>
			<td>632496</td>
			<td>Immunostain fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Brp antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>nc82</td>
			<td>Immunostain fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11006</td>
			<td>Immunostain fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11035</td>
			<td>Immunostain fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21236</td>
			<td>Immunostain fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlowFade gold antifade reagent</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>S36936</td>
			<td>Mount fly brains and protect quenching of fluorescence&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX 9 depression glass spot plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7220-85</td>
			<td>Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYLG184</td>
			<td>Make black Sylgard dishes to protect forceps during brain dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activated charcoal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>242276-250G</td>
			<td>Make black Sylgard dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-30</td>
			<td>Dissect and mount fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro slide</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2948-75x25</td>
			<td>Mount fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover glass No.1.5</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>48366-205</td>
			<td>Mount fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td>Local vendor</td>
			<td>not available</td>
			<td>Seal micro cover glass on micro slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Incubator&#160;</td>
			<td>Kansin Instruments</td>
			<td rowspan="2">LTI603</td>
			<td rowspan="2">culture flies at 25&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(or other vendors)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Water bath</td>
			<td>Kansin Instruments</td>
			<td rowspan="2">WB212-B2</td>
			<td rowspan="2">Induce heat-shock in flies at 37&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(or other vendors)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Orbital shaker</td>
			<td>Kansin Instruments</td>
			<td rowspan="2">OS701</td>
			<td rowspan="2">Wash and immunostain fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(or other vendors)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EZ4</td>
			<td>Sort, cross and transfer flies; Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss (or other vendors)</td>
			<td>LSM 700 (or other models)</td>
			<td>Image tsMARCM clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>image-processing software 1 
			(e.g., Zeiss LSM image browser)&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>not available</td>
			<td>Project stacks of confocal images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>image-processing software 2 
			(e.g., Image-J)&#160;</td>
			<td>not available</td>
			<td>not available</td>
			<td>Count cell number of tsMARCM clones</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell lineage analyses and gene function studies using twin-spot marcm

M은 R의 epressible C의 엘 m 개의 arker와 nalysis (MARCM) 널리 복잡 모폴로지를 도시하고, 그렇지 않으면 표시되지 않은 및 교란 내 뉴런의 서브 세트에서 유전자의 기능을 조작하는 초파리 신경 생물학적 연구에 적용되어 포지티브 모자이크 표시 시스템이다 osaic 생물. MARCM 시스템에서 발생하는 유전 모자이크는 유사 분열하는 동안 모두 표시 (MARCM 클론) 및 표시되지 않은 딸 세포를 생성하는 전구 세포를 분할 내에서 상동 염색체 사이의 부위 특이 적 재조합을 통해 매개된다. MARCM 방법의 확장이라는 쌍둥이 자리 MARCM (tsMARCM)는, 두 가지 색상으로 공통 조상에서 유래 쌍둥이 세포의 두 레이블. 이 기술은 모두 헤미 계통에서 유용한 정보의 검색을 가능하게하기 위해 개발되었다. 종합적 tsMARCM 클론의 다른 쌍을 분석함으로써, tsMARCM 시스템은 고해상도 신경 계통 mappin 허용g는 일반 전구 세포에서 생성 된 레이블 뉴런의 정확한 출생 순서를 공개합니다. 또한, tsMARCM 시스템은 또한 다른 동물 동일한 뉴런 표현형 분석을 허용하여 유전자 기능 연구를 확장한다. 여기, 우리는 초파리에서 신경 발달의 연구를 용이하게하기 위해 tsMARCM 시스템을 적용하는 방법에 대해 설명합니다.

tsMARCM 시스템은 공통 NBS 유래의 신경 세포에 대한 중요한 정보를 입수하여 신경 혈통 분석하여 유전자 기능 연구를 용이하게하기 위해 사용되어왔다. 이 시스템은 신경 세포의 종류 (모든 경우) 대부분을 식별 각각의 신경 세포 유형의 세포 수를 결정하고,에 tsMARCM를 사용하여 이러한 신경 세포의 출생 순서 11, 12, <sup cla...

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Cell Lineage Analyses and Gene Function Studies Using Twin-spot MARCM

여기서 우리는 두 가지 색상으로 일반 전구 세포에서 파생 된 신경 세포의 시각화를 허용하는 모자이크 라벨 기술에 대한 프로토콜을 제시한다. 이것은 다른 사람의 동일한 뉴런에서 출생 데이트 개별 뉴런의 기능과 공부 유전자 기능과 신경 계통 분석을 용이하게한다.

쌍둥이 자리 MARCM를 사용하여 세포 계보 분석 및 유전자 기능 연구

Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) is a positive mosaic labeling system that has been widely applied in Drosophila neurobiological ...

cell-lineage-analyses-and-gene-function-studies-using-twin-spot-marcm

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.9K 조회수.  Academia Sinica.  여기서 우리는 두 가지 색상으로 일반 전구 세포에서 파생 된 신경 세포의 시각화를 허용하는 모자이크 라벨 기술에 대한 프로토콜을 제시한다. 이것은 다른 사람의 동일한 뉴런에서 출생 데이트 개별 뉴런의 기능과 공부 유전자 기능과 신경 계통 분석을 용이하게한다. 

비디오: Cell Lineage Analyses and Gene Function Studies Using Twin-spot MARCM

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying the biology of retinal neurons, particularly photoreceptors. The applications of this system go beyond basic research, as they can easily be adapted to high throughput technologies for drug development. However, genetic manipulation of retinal photoreceptors in these cultures has proven to be very challenging, posing an important limitation to the usefulness of the system. We have recently developed and validated an ex&#160;ovo plasmid electroporation technique that increases the rate of transfection of retinal cells in these cultures by five-fold compared to other currently available protocols1. In this method embryonic chick eyes are enucleated at stage 27, the RPE is removed, and the retinal cup is placed in a plasmid-containing solution and electroporated using easily constructed custom-made electrodes. The retinas are then dissociated and cultured using standard procedures. This technique can be applied to overexpression studies as well as to the downregulation of gene expression, for example via the use of plasmid-driven RNAi technology, commonly achieving transgene expression in 25% of the photoreceptor population. The video format of the present publication will make this technology easily accessible to researchers in the field, enabling the study of gene function in primary retinal cultures. We have also included detailed explanations of the critical steps of this procedure for a successful outcome and reproducibility.

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Embryonic chick retinal cell cultures constitute valuable tools for the study of photoreceptor biology. We have developed an efficient gene transfer technique based on ex&#160;ovo plasmid electroporation of the retinas prior to culture. This technique considerably increases transfection efficiencies over currently available protocols, making genetic manipulation feasible for this system.

차 세포 배양 연구 병아리 망막에 효율적인 유전자 전송 :<em&gt; 전 비켜</em&gt; Electroporation에 접근

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

연구

발생학

Organotypic Slice Cultures for Studies of Postnatal Neurogenesis

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This method maintains the characteristic topographical morphology of the hippocampus while allowing direct application of pharmacological agents to the developing hippocampal dentate gyrus. Additionally, slice cultures can be maintained for up to 4 weeks and thus, allow one to study the maturation process of newborn granule neurons. Slice cultures allow for efficient pharmacological manipulation of hippocampal slices while excluding complex variables such as uncertainties related to the deep anatomic location of the hippocampus as well as the blood brain barrier. For these reasons, we sought to optimize organotypic slice cultures specifically for postnatal neurogenesis research.

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis using the organotypic slice culture technique. This method allows for in vitro manipulation of adult neurogenesis and allows for the direct application of pharmacological agents to the cultured hippocampus.

출생 후 신경 발생의 연구 Organotypic 슬라이스 문화

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This ...

Efficient Generation of hiPSC Neural Lineage Specific Knockin Reporters Using the CRISPR/Cas9 and Cas9 Double Nickase System

Gene targeting is a critical approach for characterizing gene functions in modern biomedical research. However, the efficiency of gene targeting in human cells has been low, which prevents the generation of human cell lines at a desired rate. The past two years have witnessed a rapid progression on improving efficiency of genetic manipulation by genome editing tools such as the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) system. This manuscript describes a protocol for generating lineage specific human induced pluripotent stem cell (hiPSC) reporters using CRISPR/Cas system assisted homologous recombination. Procedures for obtaining necessary components for making neural lineage reporter lines using the CRISPR/Cas system, focusing on construction of targeting vectors and single guide RNAs, are described. This protocol can be extended to platform establishment and mutation correction in hiPSCs.

Genome editing tools such as the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) system have greatly improved gene targeting efficiency in human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). This manuscript describes a protocol for generating lineage specific hiPSC reporter using CRISPR/Cas system assisted homologous recombination.

hiPSC 신경 리니지 특정 올림피아 기자의 효율적인 생성 사용 CRISPR / Cas9 및 Cas9 더블 Nickase 시스템

Gene targeting is a critical approach for characterizing gene functions in modern biomedical research. However, the efficiency of gene targeting in human ...

A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied for many decades, revealing seminal findings in developmental biology. More recently, it was adopted by stem cell biologists to identify and track different stem cell populations with minimal experimental intervention. The recent developments in mouse genetics, the availability of a large number of mouse strains, and the advancements in fluorescent microscopy allow the straightforward design of powerful lineage tracing systems for various tissues with basic expertise, using commercially available tools. We have recently taken advantage of this powerful methodology to explore the origin and fate of stem cells at the ocular surface using R26R-Confetti mouse. This model offers a multi-color genetic system, for the expression of 4 fluorescent genes in a random manner. Here we describe the principles of this methodology and provide an adaptable protocol for designing lineage tracing experiments; specifically for the corneal epithelium as well as for other tissues.

In this article we describe the principles for designing and performing a multi-color lineage tracing experiment using R26R-Confetti mice. We provide a specific protocol for tracking corneal epithelial cells which can be modified for other tissues of interest.

멀티 컬러 형광 기자 마우스를 사용하여 각막 세포의 리니지 추적하는 방법

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

Co-localization of Cell Lineage Markers and the Tomato Signal

The cell lineage tracing system has been used predominantly in developmental biology studies. The use of Cre recombinase allows for the activation of the reporter in a specific cell line and all progeny. Here, we used the cell lineage tracing technique to demonstrate that chondrocytes directly transform into osteoblasts and osteocytes during long bone and mandibular condyle development using two kinds of Cre, Col10a1-Cre and Aggrecan-CreERT2 (Agg-CreERT2), crossed with Rosa26tdTomato. Both Col10 and aggrecan are well-recognized markers for chondrocytes.
On this basis, we developed a new method-cell lineage tracing in conjunction with fluorescent immunohistochemistry-to define cell fate by analyzing the expression of specific cell markers. Runx2 (a marker for early-stage osteogenic cells) and Dentin matrix protein1 (DMP1; a marker for late-stage osteogenic cells) were used to identify chondrocyte-derived bone cells and their differentiation status. This combination not only broadens the application of cell lineage tracing, but also simplifies the generation of compound mice. More importantly, the number, location, and differentiation statuses of parent cell progeny are displayed simultaneously, providing more information than cell lineage tracing alone. In conclusion, the co-application of cell lineage tracing techniques and immunofluorescence is a powerful tool for investigating cell biology in vivo.

We developed two sets of tracing combinations in Rosa26tdtomato (ubiquitously expressed in all cells)/Cre (specifically expressed in chondrocytes) mice: one with 2.3Col1a1-GFP (specific to osteoblasts) and one with immunofluorescence (specific to bone cells). The data demonstrate the direct transformation of chondrocytes into bone cells.

셀 리니지 마커의 공동 현지화와 토마토 신호

The cell lineage tracing system has been used predominantly in developmental biology studies. The use of Cre recombinase allows for the activation of the ...

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into the developing oocyte. Because these events rely on maternal products which typically act very soon after fertilization-that preexist inside the egg, standard approaches for expression and functional reduction involving the injection of reagents into the fertilized egg are typically ineffective. Instead, such manipulations must be performed during oogenesis, prior to or during the accumulation of maternal products. This article describes in detail a protocol for the in vitro maturation of immature zebrafish oocytes and their subsequent in vitro fertilization, yielding viable embryos that survive to adulthood. This method allows the functional manipulation of maternal products during oogenesis, such as the expression of products for phenotypic rescue and tagged construct visualization, as well as the reduction of gene function through reverse-genetics agents.

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

An optimized protocol for the in vitro maturation of zebrafish oocytes used for the manipulation of maternal gene products is presented here.

사용 모성 유전자 제품의 기능 조작<em&gt; 체외</em제브라 피쉬&gt; 난자의 성숙

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into ...

Structure-function Studies in Mouse Embryonic Stem Cells Using Recombinase-mediated Cassette Exchange

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of the cell and often consist of multiple functional domains, which can be influenced by posttranslational modifications. The depletion of the entire protein in conditional or constitutive knock-out (KO) mice does not take into account this functional diversity and regulation. An mESC line and a derived mouse model, in which a docking site for FLPe recombination-mediated cassette exchange (RMCE) was inserted within the ROSA26 (R26) locus, was previously reported. Here, we report on a structure-function approach that allows for molecular dissection of the different functionalities of a multidomain protein. To this end, RMCE-compatible mice must be crossed with KO mice and then RMCE-compatible KO mESCs must be isolated. Next, a panel of putative rescue constructs can be introduced into the R26 locus via RMCE targeting. The candidate rescue cDNAs can be easily inserted between RMCE sites of the targeting vector using recombination cloning. Next, KO mESCs are transfected with the targeting vector in combination with an FLPe recombinase expression plasmid. RMCE reactivates the promoter-less neomycin-resistance gene in the ROSA26 docking sites and allows for the selection of the correct targeting event. In this way, high targeting efficiencies close to 100% are obtained, allowing for insertion of multiple putative rescue constructs in a semi-high throughput manner. Finally, a multitude of R26-driven rescue constructs can be tested for their ability to rescue the phenotype that was observed in parental KO mESCs. We present a proof-of-principle structure-function study in p120 catenin (p120ctn) KO mESCs using endoderm differentiation in embryoid bodies (EBs) as the phenotypic readout. This approach enables the identification of important domains, putative downstream pathways, and disease-relevant point mutations that underlie KO phenotypes for a given protein.

Proteins often contain multiple domains that can exert different cellular functions. Gene knock-outs (KO) do not consider this functional diversity. Here, we report a recombination-mediated cassette exchange (RMCE)-based structure-function approach in KO embryonic stem cells that allows for the molecular dissection of various functional domains or variants of a protein.

재조합 효소 매개 카세트 교환을 사용하여 마우스 배아 줄기 세포의 구조 - 기능 연구

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of ...

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors of the diseases. To validate the contribution of a dysfunction of the mutated genes to disease development, the generation of animal models carrying the mutations is one obvious approach. While germline genetically engineered mouse models (GEMMs) are popular biological tools and exhibit reproducible results, it is restricted by time and costs. Meanwhile, non-germline GEMMs often enable exploring gene function in a more feasible manner. Since some brain diseases (e.g., brain tumors) appear to result from somatic but not germline mutations, non-germline chimeric mouse models, in which normal and abnormal cells coexist, could be helpful for disease-relevant analysis. In this study, we report a method for the induction of CRISPR-mediated somatic mutations in the cerebellum. Specifically, we utilized conditional knock-in mice, in which Cas9 and GFP are chronically activated by the CAG (CMV enhancer/chicken &#223;-actin) promoter after Cre-mediated recombination of the genome. The self-designed single-guide RNAs (sgRNAs) and the Cre recombinase sequence, both encoded in a single plasmid construct, were delivered into cerebellar stem/progenitor cells at an embryonic stage using in utero electroporation. Consequently, transfected cells and their daughter cells were labeled with green fluorescent protein (GFP), thus facilitating further phenotypic analyses. Hence, this method is not only showing electroporation-based gene delivery into embryonic cerebellar cells but also proposing a novel quantitative approach to assess CRISPR-mediated loss-of-function phenotypes.

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

Conventional loss-of-function studies of genes using knockout animals have often been costly and time-consuming. Electroporation-based CRISPR-mediated somatic mutagenesis is a powerful tool to understand gene functions in vivo. Here, we report a method to analyze knockout phenotypes in proliferating cells of the cerebellum.

CRISPR 중재 손실 함수 분석 소 뇌과 립 세포를 사용 하 여 Utero에서 Electroporation 기반 유전자 이동

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. The classical histochemical reaction is based on the hydrolysis of the substrate X-gal in combination with ferric and ferrous ions, which produces an insoluble blue precipitate that is easy to visualize. Therefore, &#946;-galactosidase activity serves as a marker for the expression pattern of the gene of interest as the development proceeds. Here we describe the standard protocol for the detection of &#946;-galactosidase activity in early whole mouse embryos and the subsequent method for paraffin sectioning and counterstaining. Additionally, a procedure for clarifying whole embryos is provided to better visualize X-gal staining in deeper regions of the embryo. Consistent results are obtained by performing this procedure, although optimization of reaction conditions is needed to minimize background activity. Limitations in the assay should be also considered, particularly regarding the size of the embryo in whole mount staining. Our protocol provides a sensitive and a reliable method for &#946;-galactosidase detection during the mouse development that can be further applied to the cryostat sections as well as whole organs. Thus, the dynamic gene expression patterns throughout development can be easily analyzed by using this protocol in whole embryos, but also detailed expression at the cellular level can be assessed after paraffin sectioning.

Here we describe the standard protocol for the detection of &#946;-galactosidase activity in early whole mouse embryos and the method for paraffin sectioning and counterstaining. This is an easy and quick procedure to monitor gene expression during development that can also be applied to tissue sections, organs or cultured cells.

전체 마우스 배아에서 β-galactosidase 활동의 감지를 통해 유전자 발현 추적

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, including insulin-secreting &#946; cells, are differentiated from common endocrine progenitors during the embryonic stage. Immature endocrine cells expand via cell proliferation and mature during a long postnatal developmental period. However, the mechanisms underlying these processes are not clearly defined. Single-cell RNA-sequencing is a promising approach for the characterization of distinct cell populations and tracing cell lineage differentiation pathways. Here, we describe a method for the single-cell RNA-sequencing of isolated pancreatic &#946; cells from embryonic, neonatal and postnatal pancreases.

We describe a method for the isolation of endocrine cells from embryonic, neonatal and postnatal pancreases followed by single-cell RNA sequencing. This method allows analyses of pancreatic endocrine lineage development, cell heterogeneity and transcriptomic dynamics.

마우스 췌 장 내 분 비 세포의 단일 셀 Transcriptomic 분석

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...