ברצוננו להודות על המתקן הליבה Cytometry זרימה ב- פנסילבניה המדינה אוניברסיטת המילניום מדע מורכבים.

<ol><li>Davies, L. C., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+macrophages%3A+Then+and+Now%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident macrophages: Then and Now.</a> Immunology. 144 (4), 541-548 (2015).</li>
<li>Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+linking+obesity+to+insulin+resistance+and+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes.</a> Nature. 444 (12), 840-846 (2006).</li>
<li>Van Gaal, L. F., Mertens, I. L., De Block, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+linking+obesity+with+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanisms linking obesity with cardiovascular disease.</a> Nature. 444 (12), 875-880 (2006).</li>
<li>Jung, U., Choi, M. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+and+Its+Metabolic+Complications%3A+The+Role+of+Adipokines+and+the+Relationship+between+Obesity%2C+Inflammation%2C+Insulin+Resistance%2C+Dyslipidemia+and+Nonalcoholic+Fatty+Liver+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Obesity and Its Metabolic Complications: The Role of Adipokines and the Relationship between Obesity, Inflammation, Insulin Resistance, Dyslipidemia and Nonalcoholic Fatty Liver Disease.</a> Int J Mol Sci. 15 (4), 6184-6223 (2014).</li>
<li>Emanuela, F., Grazia, M., Marco, D. R., Maria Paola, L., Giorgio, F., Marco, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+as+a+link+between+obesity+and+metabolic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nutr+Metab%22%5BJournal%5D)">Inflammation as a link between obesity and metabolic syndrome.</a> Nutr Metab. 2012, 1-7 (2012).</li>
<li>Vieira-Potter, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+macrophage+modulation+in+adipose+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Inflammation and macrophage modulation in adipose tissues.</a> Cell Microbiol. 16 (10), 1484-1492 (2014).</li>
<li>Chawla, A., Nguyen, K. D., Goh, Y. P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage-mediated+inflammation+in+metabolic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage-mediated inflammation in metabolic disease.</a> Nat Rev Immunol. 11 (11), 738-749 (2011).</li>
<li>Dey, A., Allen, J., Hankey-giblin, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+and+polarization+of+macrophages+in+inflammation+%3A+blood+monocytes+versus+tissue+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ontogeny and polarization of macrophages in inflammation : blood monocytes versus tissue macrophages.</a> Front Immunol. 5 (1), 1-15 (2015).</li>
<li>Mills, C. D., Lenz, L. L., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+at+the+fork+in+the+road+to+health+or+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophages at the fork in the road to health or disease.</a> Front Immunol. 6 (2), 1-6 (2015).</li>
<li>Italiani, P., Boraschi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+monocytes+to+M1%2FM2+macrophages%3A+Phenotypical+vs.+functional+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">From monocytes to M1/M2 macrophages: Phenotypical vs. functional differentiation.</a> Front Immunol. 5 (8), 1-22 (2014).</li>
<li>Guilherme, A., Virbasius, J. V., Vishwajeet, P., Czech, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte+dysfunctions+linking+obesity+to+insulin+resistance+and+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Adipocyte dysfunctions linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (5), 367-377 (2008).</li>
<li>Cummins, T. D., Holden, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+remodeling+of+white+adipose+tissue+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Metabolic remodeling of white adipose tissue in obesity.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 307 (3), 262-277 (2014).</li>
<li>Fujisaka, S., Usui, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+Mechanisms+for+Adipose+Tissue+M1+and+M2+Macrophages+in+Diet+Induced+Obese+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Regulatory Mechanisms for Adipose Tissue M1 and M2 Macrophages in Diet Induced Obese Mice.</a> Diabetes. 58 (9), 2574-2582 (2009).</li>
<li>Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+induces+a+phenotipic+switch+in+adipose+tissue+macrophage+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Obesity induces a phenotipic switch in adipose tissue macrophage polarization.</a> J Clin Invest. 117 (1), 175-184 (2007).</li>
<li>Qureshi, K., Abrams, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+liver+disease+of+obesity+and+role+of+adipose+tissue+in+the+pathogenesis+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Metabolic liver disease of obesity and role of adipose tissue in the pathogenesis of nonalcoholic fatty liver disease.</a> World J Gastroenterol. 13 (26), 3540-3553 (2007).</li>
<li>Bedossa, P., Paradis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+extracellular+matrix+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Liver extracellular matrix in health and disease.</a> J Pathol. 200 (4), 504-515 (2003).</li>
<li>Tilg, H., Moschen, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+inflammation+in+nonalcoholic+fatty+liver+disease%3A+The+multiple+parallel+hits+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Evolution of inflammation in nonalcoholic fatty liver disease: The multiple parallel hits hypothesis.</a> Hepatology. 52 (5), 1836-1846 (2010).</li>
<li>Milic, S., Lulic, D., Stimac, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-alcoholic+fatty+liver+disease+and+obesity%3A+Biochemical%2C+metabolic+and+clinical+presentations%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Non-alcoholic fatty liver disease and obesity: Biochemical, metabolic and clinical presentations.</a> World J Gastroenterol. 20 (28), 9330-9337 (2014).</li>
<li>Williams, I. L., Wheatcroft, S. B., Shah, A. M., Kearney, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity%2C+atherosclerosis+and+the+vascular+endothelium%3A+mechanisms+of+reduced+nitric+oxide+bioavailability+in+obese+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Obesity%22%5BJournal%5D)">Obesity, atherosclerosis and the vascular endothelium: mechanisms of reduced nitric oxide bioavailability in obese humans.</a> Int J Obesity. 26 (12), 754-764 (2002).</li>
<li>Mestas, J., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte-Endothelial+Cell+Interactions+in+the+Development+of+Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cardiovasc+Med%22%5BJournal%5D)">Monocyte-Endothelial Cell Interactions in the Development of Atherosclerosis.</a> Trends Cardiovasc Med. 18 (6), 228-232 (2008).</li>
<li>Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+biology+in+development%2C+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Macrophage biology in development, homeostasis and disease.</a> Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).</li>
<li>Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/ni/journal/v14/n10/full/ni.2705.html">Tissue-resident macrophages.</a> Nat Rev Immunol. 14 (10), 986-995 (2013).</li>
<li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> J Vis Exp. (41), e1546(2010).</li>
<li>Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization%2C+Identification%2C+and+Excision+of+Murine+Adipose+Depots%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Localization, Identification, and Excision of Murine Adipose Depots.</a> J Vis Exp. (94), e52174(2014).</li>
<li>Smedsrød, B. Protocol for preparation of mouse liver Kupffer cells and liver sinusoidal endothelial cells. 1, Available from: 
 <a target="_blank" href="http://munin.uit.no/handle/10037/4575">http://munin.uit.no/handle/10037/4575</a> 1-10 (2012).</li>
<li>Butcher, M. J., Herre, M., Ley, K., Galkina, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+analysis+of+immune+cells+within+murine+aortas%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas.</a> J Vis Exp. (53), e2848(2011).</li>
<li>Salamone, M., Saladino, S., Pampalone, M. <a target="_blank" href="http://www.aidic.it/cet/14/38/042.pdf">Tissue Dissociation and Primary Cells Isolation Using Recombinant Collagenases Class I and II.</a> Chemical Engineering Transactions. 38, Matsushita 1994 247-252 (2014).</li>
<li>Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+matrix+stiffness+in+regulating+cell+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The role of matrix stiffness in regulating cell behavior.</a> Hepatology. 47 (4), 1394-1400 (2008).</li>
<li>Fain, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Free+Brown+and+White+Fat+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Isolation of Free Brown and White Fat Cells.</a> Diabetologia. 375 (1964), 555-561 (1968).</li>
<li>Seglen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+isolated+rat+liver+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Method Cell Biol. 13, 29-83 (1976).</li>
<li>Yu, S., Allen, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ron+Receptor+Tyrosine+Kinase+Regulates+Macrophage+Heterogeneity+and+Plays+a+Protective+Role+in+Diet-Induced+Obesity%2C+Atherosclerosis%2C+and+Hepatosteatosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The Ron Receptor Tyrosine Kinase Regulates Macrophage Heterogeneity and Plays a Protective Role in Diet-Induced Obesity, Atherosclerosis, and Hepatosteatosis.</a> J Immunol. 197 (1), 256-265 (2016).</li>
<li>Yu, Y. R. A., O'Koren, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+the+comprehensive+flow+cytometric+analysis+of+immune+cells+in+normal+and+inflamed+murine+non-lymphoid+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues.</a> PLoS ONE. 11 (3), 1-23 (2016).</li>
<li>Zizzo, G., Hilliard, B. A., Monestier, M., Cohen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+clearance+of+early+apoptotic+cells+by+human+macrophages+requires+%26%2334%3BM2c%26%2334%3B+polarization+and+MerTK+induction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Efficient clearance of early apoptotic cells by human macrophages requires &#34;M2c&#34; polarization and MerTK induction.</a> J Immunol. 100 (2), 130-134 (2012).</li>
<li>Jablonski, K. A., Amici, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+markers+to+delineate+murine+M1+and+M2+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Novel markers to delineate murine M1 and M2 macrophages.</a> PLoS ONE. 10 (12), 5-11 (2015).</li>
<li>Rőszer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+Mysterious+M2+Macrophage+through+Activation+Markers+and+Effector+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+of+Inflamm%22%5BJournal%5D)">Understanding the Mysterious M2 Macrophage through Activation Markers and Effector Mechanisms.</a> Mediators of Inflamm. 2015, 1-16 (2015).</li>
<li>Cho, K. W., Morris, D. L., Lumeng, C. N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24480353">Flow Cytometry Analysis of Adipose Tissue Macrophages.</a> Methods Enzymol. 4 (164), 297-314 (2011).</li>
<li>Kim, Y. -J., Brox, T., Feiden, W., Weickert, J. Technical Note: Flow Cytometry Controls, Instrument Setup, and the Determination of Positivity. Cytometry A. 71 (1), 8-15 (2007).</li>
<li>Tung, J. W., Heydari, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+Flow+Cytometry%3A+A+Practical+Approach%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">Modern Flow Cytometry: A Practical Approach.</a> Clin Lab Med. 27 (3), 453-468 (2007).</li>
<li>Martinez, F. O., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+M1+and+M2+paradigm+of+macrophage+activation%3A+time+for+reassessment%5BTitle%5D)+AND+%22F1000%22%5BJournal%5D)">The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment.</a> F1000. 6 (3), 13(2014).</li>
<li>Porcheray, F., Viaud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+switching%3A+An+asset+for+the+resolution+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation switching: An asset for the resolution of inflammation.</a> Clin Exp Immunol. 142 (3), 481-489 (2005).</li>
<li>Plouffe, B. D., Murthy, S. K., Lewis, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+and+Application+of+Magnetic+Particles+in+Cell+Isolation+and+Enrichment%5BTitle%5D)+AND+%22Rep+Prog+Phys%22%5BJournal%5D)">Fundamentals and Application of Magnetic Particles in Cell Isolation and Enrichment.</a> Rep Prog Phys. 1 (78), 1-6 (2010).</li>
</ol>

לעורכים יש אינטרסים לא לחשוף.

דיאטה-induced הפרעות מטבוליות בדגמי לחקות morbidities שיתוף כגון טרשת עורקים, steatosis פשוטה, steatohepatitis ואף סוכרת מסוג 2 נמצאים בשימוש נרחב כדי להבין טוב יותר את המנגנונים המולקולריים שבבסיס של התקדמות המחלה. עיכול תלויים collagenase משמש לעתים קרובות מביצועם רקמות לשחרר תאים16,מטריצה חוץ-...

העכבר מודלים היו בשימוש נרחב ללמוד את הדינמיקה של מחלות אנושיות. בידוד תקין של רקמות תאים תושב עכברים בתוך מדינה חולה יכול לספק פלטפורמה להבנת מולקולרית, תאית התרומות בפתוגנזה של המחלה1. הפרעה אחת זה חשיבות קריטית היא השמנת יתר. שכיחות ההשמנה ממשיכה לעלות בכל העולם במקביל לאינסולין סוג 2 סוכרת מחלות לב וכלי דם, מחלת כבד שומני2,3. צריכת מזון נוסף מוטה על ידי ירידה פעילות גופנית מפעילה שינו אותות שמקורם רקמת שומן, אשר יכול לשנות את חצרו הסלולר של רקמות היקפיים אחרים כגון אב העורקים ואת הכבד4. כזה שיבוש הומאוסטזיס המטבולית גורמת לדלקת מערכתית כרונית נמוך בכיתה5.
הפעלה קלאסית של מקרופאגים תושב העורקים ואת הכבד, כמו גם את הגיוס שומן לבן (וואט) הוכח ליזום dysregulation של אותות מטבולי אלא גם לקיים דלקת6,7. הטרוגניות פנוטיפי ופונקציונליים של מקרופאגים קשורה חזק בפתוגנזה של השמנת יתר הקשורים לעבודה morbidities7. הפלסטיות דינמי ב מקרופאג קיטוב מאפשר תאים אלה שהפגינו מגוון פנוטיפים מופעל זה לתאם את התקדמות והרזולוציה של דלקת8. בעוד בסגנון קלאסי מופעל מקרופאגים (M1) הם מעורבים על התפשטות של דלקת, לחלופין מופעל מקרופאגים (M2) קושרו עם רזולוציה ורקמות תיקון9,10.
כפי הגוף עובר מתח מטבולית, שומן לבן מצטבר באופן חריג. רקמת שומן המורחב מושך, שומר על תאים דלקתיים שמשנות עמוקות adipocyte רגילה פונקציה כדי לקדם את תנגודת לאינסולין, היפרגליקמיה, בסופו של דבר סוכרת סוג 2, תנגודת לאינסולין או היפרגליקמיה11, 12. במקביל, remodels שומן לבן בתגובה אותות דלקתיים שפורסמו על ידי הסתננו מופעל באופן קלאסי (M1) רקמת שומן מקרופאגים (כספומטים)13,14. איבר זה רב תאית מפעילה מפל של אותות זה תוקע את התיפקוד הרגיל של איברים אחרים בגוף כגון אבי העורקים, כבד4.
הכבד הוא עוצמתי מטבולית המסתגל בתגובה לגירויים שמקורם dysregulated הסמוך וואט15. מקרופאגים כבדית או תאים Kupffer, כתגובה לשינויים מטבוליים, מפרישים ציטוקינים דלקתיים שהופכים שניהם parenchymal ו תא הלא-parenchymal פנוטיפ ולקדם רקמות. הצטברות שומנים בדם הכבד, דלקת, פיקדונות מופרז מטריצה חוץ-תאית, נמק, הפונקציה בסופו של דבר אובדן כדלקמן העלבונות דלקתיות לתרום ספקטרום רחב של פגיעה בכבד הקשורים אלכוהוליים מחלת כבד שומני 1617,,18.
במקביל וואט פרוץ, תפקודי כבד, עורקים גדולים לצבור שומנים בתוך קיר עורקים כפי הגוף עובר מתח מטבולית כרונית19. הצטברות שומנים בדם עורקי מפעיל את הפרשת נוגדנים על ידי תאי אנדותל מופעל והגיוס עוקבות של monocytes20. ברגע גייס, ומונוציטים להתרבות, להבדיל, להבלע lipoproteins, להפוך לתאי קצף. Atherogenesis יזם, נגרם על ידי פעילות הפרו דלקתיים גייס ו רקמות לאדן השומנים תושב מקרופאגים. להיכנע האותות חוץ-תאית, תאיים סטרס נמסר ב- microenvironment atherogenic הזה, מקרופאגים האלה ואז לעסוק מוות איתות בהתאם להיררכית הקשרים. כאשר תאים אלה קצף מתים, הם תורמים את תוכנם השומנים מלא אל ליבה נמק של הנגע, מה שמוביל ואז קרע פלאק, אוטם שריר הלב ושבץ.
באופן קולקטיבי, הטרוגניות של פנוטיפים מקרופאג האחראית בחלקו השמנת יתר הנגרמת על ידי שינויים דלקתיים שנצפתה dysregulated רקמות כגון וואט, הכבד, אבי העורקים8,21. אפיון גייס, מקרופאגים תושב רקמות יכול לספק תובנות פוטנציאליים מטרות מולקולריות שמטפלות מקרופאג פנוטיפ1. לאפיין ביעילות מקרופאגים רקמות מודלק השמנת יתר-induced, ניתן לקבל השעיה תא בודד באמצעות עיכול אנזימטי. פרוטוקולים דיסוציאציה כזה חייב להיות יעיל דיו משפילים רקמת חיבור תוך מזעור מוות של תאים חיסוניים, מתן תשואה אופטימלית בתא. התערובת אנזים הוא תלוי בסוג הרקמה איפור המבני שלה. רקמות גמיש כמו אבי העורקים דורש פעילות אנזימטי חזק יותר, לעומת הכבד ו וואט, כדי להשיג רקמה דיסוציאציה. מן התליה תא בודד, מקרופאגים תושב רקמות ניתן חד משמעית מאופיין או מבודדים עבור נוסף במורד הזרם ניתוחים כגון יצירת פרופיל תעתיק.
כאן פרוטוקול רקמות ספציפיות מתואר המשתמשת תלויי-collagenase רקמות לעיכול, cytometry זרימה צבעוני לבודד ביעילות לאפיין את רקמת תושב מקרופאגים המתקבל השמנה דיאטה מסורתי המושרה, טרשת עורקים, פשוט steatosis ומודלים steatohepatitis העכבר. סימולטני מכתים של סמני פני שטח התא עם נוגדנים נגד ליקוציט-(CD45 או CD11b) וגם מקרופאג - אנטיגנים ספציפיים (F4/80) משמשת לעתים קרובות כדי לזהות אוכלוסיות מקרופאג22. תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) היא אסטרטגיה רב עוצמה המשמש למיון אוכלוסיות אלה שזוהו על טוהר גבוהה. אז ניתן להעריך האוכלוסייה ממוינים לפרופילי גנים ספציפיים פנוטיפ באמצעות אנליזה מולקולרית במורד הזרם (כגון תגובת שרשרת של פולימראז בזמן אמת כמותית)23. למרות cytometry זרימה רגילה ומיון תא מבוססי cytometry זרימה כלים רבי-עוצמה בהבחנה מקרופאגים בתוך השעיה תא הטרוגנית מאוד, הפרוטוקולים לשעבר חייב להיות מוטבת כדי להבטיח פלט מוצלחת. במחקר זה, פרוטוקולים של ביעילות לבודד, לאפיין את רקמת קיימא מקרופאגים ספציפיים מתוארים; חשוב יותר, מחקר זה מספק תובנה מכריע בנושאים טכניים הנובעים לעתים קרובות, כמו גם אסטרטגיות פרואקטיבית וגישה לפתרון בעיות כדי למנוע ו/או לפתור אותן.

<table><tbody><tr><td>26 G x 5/8 in Needles</td><td>BD</td><td>305115</td><td></td></tr><tr><td>23 G x 0.75 in needle x 12 in. tubing Blood Collection Set</td><td>BD</td><td>367297</td><td>Used for cannulation of subhepatic IVC during liver perfusion</td></tr><tr><td>21 G 1 1/2 in. Needles</td><td>BD</td><td>305156</td><td></td></tr><tr><td>1 mL syringe with rubber stops</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Syringes</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Syringe</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>F4/80 PE</td><td>Biolegend</td><td>123110</td><td></td></tr><tr><td>CD11c PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>117318</td><td></td></tr><tr><td>CD11b PE/Cy5</td><td>eBioscience</td><td>15-0112-81</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD16/32 Fc Block&amp;nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>101320</td><td></td></tr><tr><td>CD45 Pacific Blue</td><td>Biolegend</td><td>103126</td><td></td></tr><tr><td>PE Rat IgG2a</td><td>Biolegend</td><td>400508</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 Armenian Hamster IgG</td><td>Biolegend</td><td>400922</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy5 Rat IgG2b</td><td>Biolegend</td><td>400610</td><td></td></tr><tr><td>Pacific Blue Rat IgG2c</td><td>Biolegend</td><td>400717</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle Medium (DMEM)&amp;nbsp;</td><td>Cellgro</td><td>15-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>1x Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m cell strainers</td><td>Corning, Inc.</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL microcentrifuge tube&amp;nbsp;</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde Aqueous Solution -16x</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>CAS #30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>Micro Dissecting Scissors, 3.5 inch, Straight, 23 mm, Sharp&amp;nbsp;</td><td>Stoelting</td><td>52132-10P</td><td>Used for general dissecting purposes</td></tr><tr><td>Micro Forceps, 4 inches, full curve, 0.8 mm</td><td>Stoelting</td><td>52102-37P&amp;nbsp;</td><td>Used for general dissecting purposes</td></tr><tr><td>Spring dissection scissors &amp;ndash; 3 mm Cutting edge&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tool</td><td>15000-10</td><td>Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28</td></tr><tr><td>Curved 0.07 mm x 0.04&amp;nbsp;mm Tip Forceps</td><td>Fine Science Tool</td><td>11297-10</td><td>Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28</td></tr><tr><td>Hemostatic Forceps (Curved)</td><td>Fine Science Tool</td><td>13021-12</td><td></td></tr><tr><td>Heparin Sodium Salt</td><td>Fischer Scientific</td><td>9041-08-1</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Cell Culture/Petri Dishes</td><td>Fischer Scientific</td><td>12-565-90</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene Petri Dishes (10 cm) w/lid</td><td>Fischer Scientific</td><td>08-757-100D</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene)</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Conical Centrifuge Tubes&amp;nbsp;(Polypropylene)</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Round-Bottom Polystyrene Tubes&amp;nbsp;</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-959-5</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (Stock Ethyl Alcohol Denatured, Anyhydrous)</td><td>Millipore</td><td>EX0285-1</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Rockland</td><td>BSA-50</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6885</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasse Type XI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7657</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase Type I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0130</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1310-73-2&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>449709-10G</td><td></td></tr><tr><td>500 mL beaker&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>02-540M</td><td></td></tr><tr><td>4 cm Hemostatic clamp</td><td>Stoelting</td><td>52120-40</td><td></td></tr><tr><td>Toothed forceps</td><td>Stoelting</td><td>52104-33P</td><td></td></tr><tr><td>50 &amp;mu;m Disposable filters</td><td>Systemex</td><td>04-0042-2317</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type IV</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Chloride Potassium (ACK)</td><td>ThermoFischer Scientific&amp;nbsp;</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>Razors (0.22 mm (0.009&quot;))</td><td>VWR International</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red Live/Dead stain</td><td></td><td></td><td>Red viability stain (in &lt;strong&gt;Figure 1A&lt;/strong&gt;)</td></tr></tbody></table>

isolation, characterization, and purification of macrophages from tissues affected by obesity-related inflammation

השמנת יתר מקדמת מדינה דלקתית כרונית בעיקר מתווך על ידי רקמת תושב מקרופאגים, כמו גם נגזר מונוציט מקרופאגים. דיאטה-induced השמנת יתר (דיו) הוא מודל ערך לומד את התפקיד של הטרוגניות מקרופאג; עם זאת, ומשום מקרופאג נאותה קשים לרכוש רקמות מודלק. ב פרוטוקול זה, אנו מכינים את הצעדים בידוד ואת ההנחיות הדרושות לפתרון בעיות נגזר מן המחקרים שלנו להשגת אוכלוסייה מתאימים של מקרופאגים רקמות תושב של עכברים לאחר 18 שבועות עתירת שומן (HFD) או שומן/תיכון-כולסטרול ( התערבות תזונה HFHCD). פרוטוקול זה מתמקד שלוש רקמות הולמרק למד ב השמנת יתר, טרשת עורקים, כולל הכבד, רקמות adipose לבן (וואט) של העורקים. אנחנו להדגיש השימוש איך דואלית של זרימה cytometry ניתן להשיג מימד חדש של בידוד ואפיון של רקמות תושב מקרופאגים. מקטע יסוד של פרוטוקול זה מטפל המורכבות הבסיסית digestions אנזימטי רקמות ספציפיות מקרופאג בידוד, ואת הבאים נוגדן תא-פני מכתים לניתוח cytometric זרימה. פרוטוקול זה מטפל המורכבות הקיימת בבסיס תא לפעיל על-פלורסנט מיון (FACS) ומציגה הבהרות על המורכבות כדי להשיג אפיון במגוון רחב של אוכלוסיות תאים ממוינים כראוי. שיטות חלופיות העשרה הינם כלולים למיון תאים, כגון הכבד צפופה, ומאפשר גמישות וניהול זמן בעת עבודה עם FACS. בקצרה, פרוטוקול זה מסייע החוקר להעריך מקרופאג הטרוגניות של שפע של רקמות מודלק במחקר נתון, ומספק עצות לפתרון בעיות תובנה כי כבר מוצלח עבור בידוד תאית חיובית ואפיון של תאים חיסוניים בדלקת בתיווך דיו.

בעת שימוש לקוי אפוליפופרוטאין E עכברים (ספקיות KO) C57BL/6 (BL6) שמרו על דיאטה גבוה כולסטרול גבוה שמן (HCHFD או HCD) 18 שבועות, עונה 1 פרק 10-4 - 2 x 104 CD45+F4/80+ מקרופאגים אבי העורקים ניתן לבודד בעת ששתי הדגימות במאגר. כבדי גזור מן HFHCD-fed ספקיות KO עכברים, הפיק גדול מ- 5 x 10...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation at JoVE.com

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

פרוטוקול זה מאפשר חוקר לבודד ולאפיין רקמות תושב מקרופאגים שונות הולמרק רקמות מודלק שחולצו מן הדיאטה-induced מודלים של הפרעות מטבוליות.

בידוד, אפיון, טיהור של מקרופאגים רקמות מושפעות על ידי דלקת הקשורות להשמנת יתר

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

isolation-characterization-purification-macrophages-from-tissues

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

25.2K Views.  The Pennsylvania State University. פרוטוקול זה מאפשר חוקר לבודד ולאפיין רקמות תושב מקרופאגים שונות הולמרק רקמות מודלק שחולצו מן הדיאטה-induced מודלים של הפרעות מטבוליות.

Video: Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although the isolation methods of liver macrophages have been well-described4-6, most of these methods require sophisticated equipment, such as a centrifugal elutriator and technical skills. Here, we provide a novel method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity from mixed primary cultures of adult rat liver cells, as schematically illustrated in Figure 1.
After dissociation of the liver cells by two-step perfusion method7,8,a fraction mostly composed of parenchymal hepatocytes is prepared and seeded into T75 tissue culture flasks with culture medium composed of DMEM and 10% FCS.Parenchymal hepatocytes lose the epithelial cell morphology within a few days in culture, degenerate or transform into fibroblast-like cells (Figure 2). As the culture proceeds, around day 6, phase contrast-bright, round macrophage-like cells start to proliferate on the fibroblastic cell sheet (Figure 2). The growth of the macrophage-like cells continue and reach to maximum levels around day 12, covering the cell sheet on the flask surface. By shaking of the culture flasks, macrophages are readily suspended into the culture medium. Subsequent transfer and short incubation in plastic dishes result in selective adhesion of macrophages(Figure 3), where as other contaminating cells remain suspended. After several rinses with PBS, attached macrophages are harvested. More than 106 cells can be harvested repeatedly from the same T75 tissue culture flask at two to three day intervals for more than two weeks(Figure 3).The purities of the isolated macrophages were 95 to 99%, as evaluated by flow cytometry or immunocytochemistry with rat macrophage-specific antibodies (Figure 4).The isolated cells show active phagocytosis of polystylene beads (Figure 5), proliferative response to recombinant GM-CSF, secretion of inflammatory/anti-inflammatory cytokines upon stimulation with LPS, and formation of multinucleated giant cells9.
In conclusion, we provide a simple and efficient method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity without complex equipment and skills.This method might be applicable to other mammalian species.

A novel method to obtain macrophages from primary culture of rat liver cells is described. This method utilizes the proliferation of macrophages in the culture, followed by shaking of culture flasks and purification by selective attachment to plastic dishes. This technique efficiently provides liver macrophages without complex equipment and skills.

שיטה פשוטה ויעילה על מנת לבודד המקרופאגים מתרבויות ראשי מעורבות של תאים בכבד למבוגרים

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. The various functions of these cells are related to their activation states, which is also called polarization. The precise molecular description of these various polarizations is a priority in the field of macrophage biology. It is currently acknowledged that a multidimensional approach is necessary to describe how polarization is controlled by environmental signals. In this report, we describe a protocol designed to obtain the proteomic signature of various polarizations in human macrophages. This protocol is based on a label-free quantification of macrophage protein expression obtained from in-gel fractionated and Lys C/trypsin-digested cellular lysis content. We also provide a protocol based on in-solution digestion and isoelectric focusing fractionation to use as an alternative. Because oxygen concentration is a relevant environmental parameter in tissues, we use this protocol to explore how atmospheric composition or a low oxygen environment affects the classification of macrophage polarization.

We present a protocol to obtain proteomic signatures of human macrophages and apply this to determination of the impact of a low oxygen environment on macrophage polarization.

ניתוח פרוטיאומיה מבנית של קיטוב מקרופאג האנושי תחת סביבה חמצן נמוך

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Biochemistry

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

חקירה של קיטוב Macrophage שימוש המקרופאגים נגזרים מח עצם

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

<em&gt; במבחנה</em&gt; מודל ללמוד ההטרוגניות של בידול Macrophage אדם וקיטוב

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

The discovery of increased macrophage infiltration in the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an intensification of interest in immune cell contribution to local and systemic insulin resistance. Isolation and quantification of different immune cell populations in lean and obese AT is now a commonly utilized technique in immunometabolism laboratories; yet extreme care must be taken both in stromal vascular cell isolation and in the flow cytometry analysis so that the data obtained is reliable and interpretable. In this video we demonstrate how to mince, digest, and isolate the immune cell-enriched stromal vascular fraction. Subsequently, we show how to antibody label macrophages and T lymphocytes and how to properly gate on them in flow cytometry experiments. Representative flow cytometry plots from low fat-fed lean and high fat-fed obese mice are provided. A critical element of this analysis is the use of antibodies that do not fluoresce in channels where AT macrophages are naturally autofluorescent, as well as the use of proper compensation controls.

Adipose tissue (AT) is a site of intense immune cell activation and interaction. Almost all cells of the immune system are present in AT and their ratios are altered by obesity. Proper isolation, quantification, and characterization of AT immune cell populations are critical for understanding their role in immunometabolic disease.

בידוד של תאים חיסוני רקמת שומן

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to understand the underlying mechanisms of these diseases. We therefore present a straightforward protocol for the isolation of human monocytes from buffy coats, followed by a differentiation procedure which results in high macrophage yields. The technique relies mostly on commonly available lab equipment and thus provides a cost and time effective way to obtain large quantities of human macrophages. Briefly, buffy coats from healthy blood donors are subjected to a double density gradient centrifugation to harvest monocytes from the peripheral blood. These monocytes are then cultured in fluorinated ethylene propylene (FEP) Teflon-coated cell culture bags in the presence of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF). The differentiated macrophages can be easily harvested and used for subsequent studies and functional assays. Important methods for quality control and validation of the isolation and differentiation steps will be highlighted within the protocol. In summary, the protocol described here enables scientists to routinely and reproducibly isolate human macrophages without the need for cost intensive tools. Furthermore, disease models can be studied in a syngeneic human system circumventing the use of murine macrophages.

We present a simple and efficient protocol for the generation of human macrophages. Buffy coats are processed by double density gradient centrifugation and isolated monocytes are then differentiated to macrophages in Teflon-coated cell culture bags. This maximizes macrophage yields and facilitates cell harvesting for subsequent experiments.

בידוד של אדם מונוציטים ידי זוגי Gradient צנטריפוגה והבידול שלהם להמקרופאגים בתיקי תרבית תאים מצופים טפלון

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Isolation of Murine Peritoneal Macrophages to Carry Out Gene Expression Analysis Upon Toll-like Receptors Stimulation

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. Macrophages express surface Toll-like receptors (TLRs), which recognize molecular patterns conserved through evolution in a wide range of microorganisms. TLRs play a central role in macrophage activation which is usually associated with gene expression alteration. Macrophages are critical in many diseases and have emerged as attractive targets for therapy. In the following protocol, we describe a procedure to isolate murine peritoneal macrophages using Brewer&#8217;s thioglycollate medium. The latter will boost monocyte migration into the peritoneum, accordingly this will raise macrophage yield by 10-fold. Several studies have been carried out using bone marrow, spleen or peritoneal derived macrophages. However, peritoneal macrophages were shown to be more mature upon isolation and are more stable in their functionality and phenotype. Thus, macrophages isolated from murine peritoneal cavity present an important cell population that can serve in different immunological and metabolic studies. Once isolated, macrophages were stimulated with different TLR ligands and consequently&#160;gene expression was evaluated.

We describe here a simple protocol to isolate murine peritoneal macrophages. This procedure is followed by RNA extraction to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation.

בידוד של הצפק Murine המקרופאגים לבצע ניתוח ביטוי גנים בעת ביצוע כמו אגרה רצפטורים הגירוי

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. ...

In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages

Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) are mature leukocytes that serve a critical physiological role as professional phagocytes capable of clearing a variety of particles. Normally, BMDMs are restricted from the central nervous system (CNS), but following an injury, they can readily infiltrate. Once within the injured CNS tissue, BMDMs are the primary cell type responsible for the clearance of injury-derived cellular debris, including large quantities of lipid rich myelin debris. The neuropathological ramifications of BMDM infiltration and myelin debris phagocytosis within the CNS are complex and not well understood. The protocols described here, allow for the direct in vitro study of BMDMs in the context of CNS injury. We cover murine BMDM isolation and culture, myelin debris preparation, and assays to assess BMDM myelin debris phagocytosis. These techniques produce robust quantifiable results without the need for significant specialized equipment or materials, yet can be easily customized to meet the needs of researchers.

In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages

We present methods to assess the phagocytic capacity of primary murine bone marrow-derived macrophages using fluorescently labeled myelin debris and intracellular lipid droplet staining.

במבחנה Phagocytosis של המיאלין פסולת על ידי מקרופאגים הנגזרות מח עצם

Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) are mature leukocytes that serve a critical physiological role as professional phagocytes capable of clearing a ...

Neuroscience

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the development of obesity-associated complications such as type 2 diabetes. To quantitatively and qualitatively investigate the immune cell subsets in human AT deposits, we have developed a flow cytometry approach. The stromal vascular fraction (SVF), containing the immune cells, is isolated from subcutaneous and visceral AT biopsies by collagenase digestion. Adipocytes are removed after centrifugation. The SVF cells are stained for multiple membrane-bound markers selected to differentiate between immune cell subsets and analyzed using flow cytometry. As a result of this approach, pro- and anti-inflammatory macrophage subsets, dendritic cells (DCs), B-cells, CD4+ and CD8+ T-cells, and NK cells can be detected and quantified. This method gives detailed information about immune cells in AT and the amount of each specific subset. Since there are numerous fluorescent antibodies available, our flow cytometry approach can be adjusted to measure various other cellular and intracellular markers of interest.

This article describes a method to analyze immune cell content of adipose tissue by isolation of immune cells from adipose tissue and subsequent analysis using flow cytometry.

אפיון של תאים חיסוניים בתוך רקמת שומן אנושי באמצעות Cytometry זרימה

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

Medicine

Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping

Visceral adipose tissue (VAT) is an active metabolic organ composed mainly of mature adipocytes and stromal vascular fraction (SVF) cells, which release different bioactive molecules that control metabolic, hormonal, and immune processes; currently, it is unclear how these processes are regulated within the adipose tissue. Therefore, the development of methods evaluating the contribution of each cell population to the pathophysiology of adipose tissue is crucial. This protocol describes the isolation steps and provides the necessary troubleshooting guidelines for efficient isolation of viable mature adipocytes and SVF from human VAT biopsies in a single process, using a collagenase enzymatic digestion technique. Moreover, the protocol is also optimized to identify macrophage subsets and perform mature adipocyte RNA isolation for gene expression studies, which allows performing studies dissecting the interaction between these cell populations. Briefly, VAT biopsies are washed, minced mechanically, and digested to generate a single-cell suspension. After centrifugation, mature adipocytes are isolated by flotation from the SVF pellet. The RNA extraction protocol ensures a high yield of total RNA (including miRNAs) from adipocytes for downstream expression assays. Simultaneously, SVF cells are used to characterize macrophage subsets (pro- and anti-inflammatory phenotype) through flow cytometry analysis.

This protocol provides an efficient collagenase digestion method for isolation of viable adipocytes and stromal vascular fraction-SVF cells from human visceral fat in a single process, including methodology to obtain high-quality RNA from adipocytes and phenotypification of SVF-macrophages through staining of multiple membrane-bound markers for analysis by flow cytometry.

בידוד אדיפוציטים בני קיימא ומקטע כלי דם סטרומלי מרקמת השומן הקרבית האנושית המתאימה לניתוח RNA ופנוטיפ מקרופאגים

Visceral adipose tissue (VAT) is an active metabolic organ composed mainly of mature adipocytes and stromal vascular fraction (SVF) cells, which release ...