This work was supported by the US National Institutes of Health grants (R01HL109102, P01HL107202, U19CA179512, F31HL131361), a Leukemia &amp; Lymphoma Society scholar award (K.M.A.), and the National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) Medical Scientist Training Program (Grant #T32GM007618) (M.M.).

פרוטוקול זה פועל לפי ההנחיות של UCSF לאתיקת מחקר אנושי. 1. הכנת תרבית תאי T, הבידוד של תאים מסוג CD4 + T, ואת קיטוב TH17 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 0, צלחות תרבות מעיל רקמה 6-היטב עם 1.5 מ&quot;ל לכל טוב של CD3 אנטי אנושי (2 מיקרוגרם / מ&quot;ל) ו CD28 אנטי-אנושיים (4 מיקרוגרם / מ&quot;ל) ב PBS עם סידן ומגנזיום לפחות 2 שעות ב 37 ° C. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, מעיל הצלחות לילה בשעה 4 ° C. גלישת צלחות ב parafilm. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את התאים mononuclear דם טבורי (CBMCs) על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות לפי הוראות היצרן. זהירות: עבוד בזהירות ולוודא ציוד מגן אישי מתאים (PPE) הוא משוחק בעת טיפול דם אנושי כדי למנוע כל סיכון של חשיפה לפתוגנים שמקורן בדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שתאי mononuclear בודדו ורחץ, לבצע בידוד תא אנושי CD4 + T על ידי Sele גודל שליליction באמצעות ערכת תא מסחרית האנוש CD4 + T. הערה: אם יש זיהום תא דם אדום לאחר בידוד תא mononuclear, הגידול ימס כדוריות דם אדום אופציונאלי עשויות להתבצע לפני צעדי בידוד תא CD4 + T. Resuspend התאים mononuclear ב 1 מ&quot;ל של חיץ בידוד (2% FBS ב PBS). מוסיפים 5 מ&quot;ל של תמיסת lysing 1x. דגירה של 15 דקות בטמפרטורת החדר. ואז להוסיף 5 מ&quot;ל של חיץ צנטריפוגות בידוד XG 300 5 דקות ב 4 ° C עד גלולה התאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים mononuclear בצפיפות של 50 x 10 6 לכל 500 μL במאגר הבידוד בצינור 5 מ&quot;ל חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μL של FBS ו 100 μL של מיקס נוגדן לכל צינור דגירה אז כל צינור בבית 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות על שייקר מסלולית לערבב היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, להוסיף 3-4 מ&quot;ל של חיץ בידוד לשטוף את התאים. צנטריפוגה התאים XG 300 8 דקות ב 4 ° C עד גלולה התאים. בזהירות לשאוב Supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך ספין זו, טרום לשטוף את החרוזים המגנטיים. מעביר את הכמות הרצויה של חרוזים מגנטיים לתוך צינור חדש (בשימוש ב- 1: 1 עם התאים) ולהוסיף נפח שווה של חיץ בידוד כדי לשטוף את החרוזים. מערבבים היטב באמצעות micropipette מ&quot;ל 1 ולאחר מכן למקם את הצינורית שואבת דק 1 לפחות. בזהירות לשאוב supernatant. Resuspend החרוזים המגנטיים בהיקף הזהה הועבר בתחילה לפני הכביסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים בצינור אחד עם 500 μL של חיץ בידוד ולהוסיף 500 μL של חרוזים מגנטיים מראש שטף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים עם חרוזים מגנטיים עבור 15 דקות על שייקר מסלולית בטמפרטורת החדר (18 ° C עד 25 ° C) לערבב היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, ביסודיות pipet התאים באמצעות micropipette 1 מ&quot;ל לפחות 10 פעמים. ואז להוסיף 3-4 מיליליטר של חיץ בידוד ומקום כל צינורית השואבת 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר בזהירות את התאים באופן שלילי שנבחרו CD4 + T הנמצאיםאת supernatant לצינור חדש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר CD4 + T בידוד תא יושלם, לספור את התאים עם hemocytometer ולשמור תאים על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פעמים שתי צלחות מצופים נוגדן עם PBS. ואז להוסיף 1.5 מ&quot;ל של 2x תערובת של TH17-מקטב התקשורת היטב כל: אנטי-אנושי IFNγ (20 מיקרוגרם / מ&quot;ל), אנטי אנושי IL-4 (20 מיקרוגרם / מ&quot;ל), TGFβ אדם (10 ng / mL), אדם IL-1β (40 ng / mL), אדם IL-23 (40 ng / mL), IL-6 אדם (50 ng / mL) כל מדולל תקשורת בסיס סרום ללא (בתוספת 2 מ&quot;מ L- גלוטמין, 100 U / פניצילין מ&quot;ל, 100 מיקרוגרם / סטרפטומיצין מ&quot;ל, 10 HEPES מ&quot;מ, 1 מ&quot;מ פירובט נתרן ו 100 מיקרומטר 2-mercaptoethanol). הערה: Transfection והפרעה RNA עושה עבודה בתקשורת סרום המכיל. מטרת השימוש בסרום ללא מדיה עם פרוטוקול זה היא להשיג ייצור IL-17A טוב יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה תאי CD4 + T האנושיים XG ב 500 במשך 5 דקות ב 4 ° C עד גלולת תאים. בזהירות לשאוב supernatנְמָלָה. ואז resuspend התאים בתקשורת בסיס סרום ללא צלחת התאים בצפיפות של 3 x 10 6 ב 1.5 מ&quot;ל לכל היטב כך נפח הסופי הוא 3 מ&quot;ל לכל טוב וציטוקינים מקטב כיום בריכוז סופי 1x. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחות ב 5% 2 CO, 37 ° C חממה במשך יומיים. </li></ol></li></ol> 2. Electroporation של במבחנת תאי TH17 אנוש Polarized <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 2, צלחות תרבות 48-היטב רקמות מעיל עם 250 μL לכל טוב של אנטי אנושי CD3 (2 מיקרוגרם / מ&quot;ל) ו CD28 אנטי-אנושיים (4 מיקרוגרם / מ&quot;ל) ב PBS עם סידן ומגנזיום לפחות 2 שעות ב 37 ° C. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, מעיל הצלחות לילה בשעה 4 ° C. גלישת צלחות ב parafilm. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן RNA הקטן עבור transfection. במשך כל transfection, aliquot 1 μL של פתרון המניות 5 מיקרומטר של siRNA לתוך צינור 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge. כלול contr RNA קטן כימית בהתאמה המתאימהol. שמור את כל הצינורות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פעמים שתי צלחות מצופים נוגדן עם PBS. ואז להוסיף 500 μL של 1X TH17-מקטב התקשורת היטב כל: IFNγ האנטי-אנושית (10 מיקרוגרם / מ&quot;ל), אנטי אנושי IL-4 (10 מיקרוגרם / מ&quot;ל), אדם TGFβ (5 ng / mL), אדם אִי- 1β (20 ng / mL), אדם IL-23 (20 ng / mL), IL-6 אדם (25 ng / mL) כל מדולל תקשורת בסיס סרום ללא (בתוספת 2 מ&quot;מ L- גלוטמין, 100 U / מ&quot;ל פניצילין, 100 מיקרוגרם / סטרפטומיצין מ&quot;ל, 10 HEPES מ&quot;מ, 1 מ&quot;מ פירובט נתרן ו 100 מיקרומטר 2-mercaptoethanol). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הצלחות תרבות ריאגנטים transfection מוכנים, להשעות את התאים עם pipetting 1 מ&quot;ל micropipette, בעדינות אך להבטיח כי כל התאים מנותקים מהחלק התחתון של בארות. פינת התאים לתוך צינור צנטריפוגות חרוטים ב XG 500 עבור 5 דקות ב 4 °. הערה: עבור תקופות תרבות יותר מאשר פרוטוקול ארבעה ימים המוצגת כאן, התאים צריכים להיות טרנספקציה בערך כל 3 ימים באמצעות בפרוטוקול הזה. שלב 20.4 מן ראוי לשנות זאת מאז התאים שטופלו RNA הקטן שונה לא צריכים להיות ונקווה. כל התנאים הנבדקים יש לאסוף, נספר בנפרד טרנספקציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב supernatant, ולאחר מכן מחדש להשעות את התאים לפחות 1 מ&quot;ל של PBS לשטוף. ספירת תאי TH17 החיים (למשל עם hemocytometer באמצעות הרחקה הכחולה Trypan להעריך כדאיות) ולאחר מכן להעביר את התאים לצינור microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה XG ב 500 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי גלולה התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב supernatant, ולאחר מכן מחדש להשעות את התאים באמצעות חיץ resuspension סיפק מן ערכת מערכת transfection 10 μL בצפיפות של 2.5-4 x 10 7 תאים לכל מ&quot;ל. שמור תאים בטמפרטורת החדר. הערה: ככלל מנחה, ולנסות להכין רק כמו תאים רבים ככל שניתן טרנספקציה בתוך 30 דקות. ניתן להשוות קבוצות מרובות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 9 μL של תאים 1 μL של RNA קטנים בכל microcצינור entrifuge. Pipet פעם לערבב את התאים RNA קטנים עבור transfection מכן לטעון לתוך קצה האלקטרודה פיפטה המסופקים. הערה: בדרך כלל, להוסיף 9.5 μL של ההשעיה התא כדי להבטיח שיש מספיק מהתערובת על מנת למנוע יצירת בועות קצה האלקטרודה pipet לפני transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו קובט מסופק עם 3 מ&quot;ל של E. חוצץ אלקטרוליטי בטמפרטורת החדר מקום קובט בתוך תחנת פיפטה ואז למקם את פיפטה לתוך העמדה בתוך קובט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד electroporate כל תמהיל 10 μL של תאים ו- RNA הקטן באמצעות הפרמטרים הבאים: מתח דופק 1,500-1,550 V, רוחב דופק 10 ms, ו 3 פולסים הכוללים במכשיר transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר electroporation יושלם, ישירות מוסיף את תערובת תא 500 μL של 1X TH17-מקטב תקשורת בארות מוכנות של צלחת תרבות. צלחות מקום בתוך CO 5% 2, 37 ° C חממה במשך יומיים נוספים. הערה: לשטוף את קצה האלקטרודה פיפטה ידי pipettingמעלה ומטה PBS בין כל transfection. </li></ol> 3. תאי קציר האנוש TH17 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים התקשורת והתרבות עם micropipette, pipetting בעדינות אך להבטיח כי כל התאים מנותקים מהחלק התחתון של בארות. הכן את התאים עבור מבחני ביטוי תפקודיים ו / או גן. הערה: שגרה, מספיק תאי ניב מבאר אחת של תאי TH17 טרנספקציה לשמש לניתוח הזרימה cytometric של סמן משטח גורם ציטוקינים ותמלול תאיים מכתים או להכנה של RNA עבור ניתוח ביטוי גנים. </li></ol>

<ol>
	<li>Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Effector+CD4+T+Cell+Populations*.">Differentiation of Effector CD4 T Cell Populations*.</a> Ann Rev Immunol. 28 (1), 445-489 (2010).</li><li>Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-17+and+Th17+Cells.">IL-17 and Th17 Cells.</a> Ann Rev Immunol. 27 (1), 485-517 (2009).</li><li>Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., Cua, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IL-23-IL-17+immune+axis:+from+mechanisms+to+therapeutic+testing.">The IL-23-IL-17 immune axis: from mechanisms to therapeutic testing.</a> Nature. 14 (9), 585-600 (2014).</li><li>Romagnani, S., Maggi, E., Liotta, F., Cosmi, L., Annunziato, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+and+origin+of+human+Th17+cells.">Properties and origin of human Th17 cells.</a> Mol Immunol. 47 (1), 3-7 (2009).</li><li>Acosta-Rodriguez, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+phenotype+and+antigenic+specificity+of+human+interleukin+17-producing+T+helper+memory+cells.">Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells.</a> Nature Immunol. 8 (6), 639-646 (2007).</li><li>Annunziato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+functional+features+of+human+Th17+cells.">Phenotypic and functional features of human Th17 cells.</a> J Exp Med. 204 (8), 1849-1861 (2007).</li><li>Du, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+miR-326+regulates+TH-17+differentiation+and+is+associated+with+the+pathogenesis+of+multiple+sclerosis.">MicroRNA miR-326 regulates TH-17 differentiation and is associated with the pathogenesis of multiple sclerosis.</a> Nature Immunol. 10 (12), 1252-1259 (2009).</li><li>Escobar, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-155+Activates+Cytokine+Gene+Expression+in+Th17+Cells+by+Regulating+the+DNA-Binding+Protein+Jarid2+to+Relieve+Polycomb-Mediated+Repression.">miR-155 Activates Cytokine Gene Expression in Th17 Cells by Regulating the DNA-Binding Protein Jarid2 to Relieve Polycomb-Mediated Repression.</a> Immunity. 40 (6), 865-879 (2014).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+regulation+of+Hif1a+expression+and+TH17+differentiation+by+the+hypoxia-regulated+microRNA+miR-210.">Negative regulation of Hif1a expression and TH17 differentiation by the hypoxia-regulated microRNA miR-210.</a> Nature Immunol. 15 (4), 393-401 (2014).</li><li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cell+transfection:+the+present+and+the+future.">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Anal bioanal chem. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li><li>Steiner, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-29+Regulates+T-Box+Transcription+Factors+and+Interferon-&amp;gamma;+Production+in+Helper+T+Cells.">MicroRNA-29 Regulates T-Box Transcription Factors and Interferon-&amp;gamma; Production in Helper T Cells.</a> Immunity. 35 (2), 169-181 (2011).</li><li>Simpson, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microRNA+upregulated+in+asthma+airway+T+cells+promotes+TH2+cytokine+production.">A microRNA upregulated in asthma airway T cells promotes TH2 cytokine production.</a> Nature Immunol. 15 (12), 1162-1170 (2014).</li><li>Pua, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+24+and+27+Suppress+Allergic+Inflammation+and+Target+a+Network+of+Regulators+of+T+Helper+2+Cell-Associated+Cytokine+Production.">MicroRNAs 24 and 27 Suppress Allergic Inflammation and Target a Network of Regulators of T Helper 2 Cell-Associated Cytokine Production.</a> Immunity. 44 (4), 821-832 (2016).</li><li>Flaherty, S., Reynolds, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Na&#239;ve+CD4++T+Cell+Isolation+and+In+vitro+Differentiation+into+T+Cell+Subsets.">Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets.</a> J Vis Exp. (98), (2015).</li><li>Schumann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+knock-in+primary+human+T+cells+using+Cas9+ribonucleoproteins.">Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 112 (33), 10437-10442 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

פרוטוקול זה מספק שיטה משופרת עבור המשלוח של RNA הקטן לתוך תאי TH17 אנושיים. למרות תאים אנושיים TH17 שימשו כאן, שיטה זו של electroporation עם RNA קטנים יכולים לשמש עם תת T מסייעים האנושי העיקרי אחרים, כגון Th1, Th2, ו Tregs. זה לא עבד היטב עבור תאים נאיביים CD4 + T כך התאים חייב להיות מופעל ...

תאי CD4 + T הם Orchestrators חיוני של התגובה החיסונית אדפטיבית. תאים נאיבי CD4 + T המסוגלים להתפתח לתאי T מפעיל שונים (למשל Th1, Th2, TH17, וכו &#39;), כל אחד עם סט משלו של ציטוקינים מאפיין גורמי שעתוק, תלוי במיקרו-סביבה מקומיים 1. החלטות השושלת תאי T להפוך הן קריטיות עבור שני החסינויות וסובלנות עצמיות. תאי TH17 הם תת-קבוצה אחת של תאי T הידועים להילחם חיידקים ופטריות תאיים, אבל התגובות הפסולות שלהם הן מעורבות גם בפתוגנזה של מחלות מרובות אוטואימוניות ודלקתיות כגון טרשת נפוצה ופסוריאזיס 2, 3. ניתן להפיק תאי TH17 אדם מתאי נאיבית CD4 + T במבחנה על ידי מתן אותם עם סביבת מקטב מתאימה 4. Vario<html> לנו שילובים של ציטוקינים IL-1β, IL-23, TGFβ, ו- IL-6 שימשו לפיתוח תאי TH17 האנושי. תאי האדם TH17 להביע CCR6, קולטן chemokine כי הוא נפוץ לזהות אוכלוסיית התא הזה ומוגדרים על ידי הביטוי של גורם השעתוק העיקרי שלהם, RORγt (המקודדים על ידי RORC) 5, 6. יש TH17 התאים את היכולת להביע ציטוקינים מרובים, אך IL-17A הוא ציטוקין מפעיל-המגדיר בשושלת מיוצר על ידי תאים אלה. בחנו את הביטוי של כל שלושת הסמנים הקשורים TH17 (CCR6, RORγt, IL-17A) כדי להעריך את החוסן של assay בידול במבחנה ב TH17 האנושי שלנו. בנוסף, אנו בתרבית תאים מסוג CD4 + T אנושיים בתנאים בלתי-מקטב, שבו אין ציטוקינים או נוגדנים חוסמים נוספו התקשורת והתרבות להשתמש כביקורת שלילית מאז הביטוי של סמנים TH17 אלה צריכים להיות מאוד נמוך או נעדר. ve_content &quot;&gt; דרך אחת ללמוד פיתוח T תא אנושי נורמלי ביולוגיה היא לתפעל ביטוי גנים במהלך ההתפתחות שלהם. קצר מפריעים RNA (siRNA) הם מולקולות רנ&quot;א קטנות כי למקד תעתיקי המקודדים חלבונים והוא יכול להיות מנוצל כדי להפחית ביטוי גנים ספציפיים . מיקרו RNA (miRNAs) הוא אנדוגניים ללא קידוד RNA הקטן הידוע לווסת ביטוי גנים לאחר תעתיק. miRNAs הוכח לשחק תפקיד חשוב הן בעכברי ביולוגיה של תא T אנושי, לרבות TH17 תא 7, 8, 9. זה חשוב לי שיטות אמינות של מניפולצית פעילות RNA קטנה תא T אנושי ללמוד והשפיע על ביטוי גנים, ובסופו של דבר על הביולוגיה של תאי T אנושי. כאן, אנו מתארים פרוטוקול קל לשימוש, עקבי ואמין שפתחנו עבור החדרה RNAs סינטטי קטן וחומצות גרעין נעול (LNAs, שינוי כימי חומצות גרעין עם יציבות מוגברת)לתוך תאי מערכת חיסון, ובאופן ספציפי לתאי TH17 אנושיים. ישנן מספר שיטות חלופיות של החדרת RNA הקטן לתוך תאי יונקים, אשר בדרך כלל מתחלקים לקטגוריות כימיות, ביולוגיות, או פיסיות 10. בשימוש נפוץ שיטות כימיות, כולל transfections שומנים מבוססי transfections וסידן-פוספט, להסתמך על יצירת מתחמים הכימי-DNA, כי הם יותר נלקחים ביעילות על ידי תאים. באופן כללי, שיטות כימיות אינן יעילות כמו עבור transfection של תאי T העיקריים. השיטה הביולוגית הנפוצה ביותר היא להשתמש וקטור ויראלי (רטרו-וירוס למשל או lentivirus), אשר מוסיף RNA זרות ישירות לתוך שורה כחלק מחזור השכפול הטבעי שלה. תמרת ויראלי בדרך כלל לוקחת יותר זמן כדי להשלים, במיוחד כאשר אחד גורמים בזמן שיבוט מולקולרי של פלסמידים proviral. בנוסף, וקטורי תמרת ויראלי יכולים להיות מזיקים חוקרים אנושי. Electroporation הוא מ פיזיתethod של גרימת הקרום permeabilization ידי העמדה לתאים פולסי מתח גבוה, המאפשרת חומצות גרעין להיכנס לתוך התא זמני שבו הם יכולים לפעול על היעד שלהם. מכשירי electroporation מסורתיים היו לא יעילים עבור transfecting לימפוציטים העיקרי. עם זאת, electroporation הדור הבא אופטימיזציה הוכיח להיות מסוגל transfecting תאי T ביעילות גבוהה מאוד, במיוחד כאשר החומר להיות transfected הוא RNA הקטן. הדור הבא המונח משמש באופן רופף להבדיל שני הפלטפורמות החדשות יותר (למשל, הניאון, Amaxa) ממכונות electroporation מסורתיות. בנוסף, שיטה זו היא להרחבה בקלות עבור מסכי תפוקה מתונים עם עד כ 120 RNA הקטנים בניסוי אחד, לעתים קרובות באמצעות ריאגנטים סינטטיים תוקף. חשוב לציין, ניתן להשיג transfections מוצלח קטן כמו 16 שעות לאחר הפעלת תא T. החסרון של שיטה זו, לעומת זאת, הוא שזה לא לגרום incorporati גנומי יציבעל, ולכן הוא חולף. לפיכך, זה שווה את המאמץ הנוסף כדי ליצור מבנה ביטוי יציב שיכול להיות ארוז לתוך וקטור ויראלי והביע בהצלחה בתאי T במקרים בם ביטוי לטווח הארוך של RNA קטנה נדרש. השתמשנו transfection הדור הבא (למשל, ניאון) כדי לספק כלי RNA או LNA oligonucleotide יחידים או פעמים התקועות סינטטיים מגוונים למטרות שונות 11, 12, 13. התערבות RNA יעילה יכולה להיגרם עכבר עיקרי ותא T אנושי באמצעות RNA דו-גדילים קצרי מפריעים (siRNA). פרוטוקול זה מתאר מצבים מותאמים לשימוש בטכניקה זו בתאי TH17 אנושיים. בנוסף siRNAs, מחק מירנה סינטתית זמינה מסחרי מעכבים יכולים לשמש כדי ללמוד רווח מירנה ואובדן התפקוד. מחקה מירנה הן מולקולות RNA דו-גדילים דומות מאוד siRNAs, אבל designeד עם רצף של miRNAs בוגרת אנדוגניים. מעכבי מירנה הם כימית-modified RNA ו / או LNA מבוסס oligonucleotides תקועים אחד אשר נקלטות על ידי miRNAs יליד להרגיז את תפקידם. מצאנו כי כל הכלים האלה יכולים לשמש ביעילות לימפוציטים מסוג T העיקרי מתורבתים, לרבות אך לא רק תאי TH17 אנושיים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>anti-human IL-17A PE</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>12-7179-42&#160;</td>
			<td>Clone: eBio64DEC17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human IFNg FITC</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>11-7319-82</td>
			<td>Clone: 4S.B3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human CD4 eVolve605</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>83-0047-42</td>
			<td>Clone: SK3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-human CD196 (CCR6) BV421</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>562515</td>
			<td>Clone: 11A9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human RORgt AF647</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>563620</td>
			<td>Clone: Q21-559</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human CD45 eFluor450</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>48-9459-42</td>
			<td>Clone: 2D1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foxp3/Trascription Factor Staining Buffer Set</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>00-5523-00</td>
			<td>For intracellular transcription factor flow cytometry staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hu FcR Binding Inhibitor Purified</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>14-9161-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmunoCult-XF T Cell Expansion Medium</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>10981</td>
			<td>&#34;Serum-Free Base Media&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS CD28 pure functional grade, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-375</td>
			<td>Clone: 15E8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human CD3 Purified</td>
			<td>UCSF monoclonal antibody core</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Clone: OKT-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEAF purified anti-human IL-4</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>500815</td>
			<td>Clone: MP4-25D2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human IFNg, functional grade purified</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>16-7318-85</td>
			<td>Clone: NIB42</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-23</td>
			<td>Peprotech&#160;</td>
			<td>200-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-1&#946;</td>
			<td>Peprotech&#160;</td>
			<td>200-01B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human TGF-&#946;1</td>
			<td>Peprotech&#160;</td>
			<td>100-21C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-6</td>
			<td>Peprotech&#160;</td>
			<td>200-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siGENOME Control Pool, Non-targeting #2</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>D-001206-14-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siGENOME SMARTpool Human RORC</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>M-003442-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siGENOME SMARTpool Human PTPRC</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>M-008067-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11346D</td>
			<td>Human CD4+ T cell Isolation Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Tranfection System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td>Next generation electroporation instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Tranfection System 10 &#956;l Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resuspension Buffer T</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Provided in kit (MPK1096)</td>
			<td>&#34;Transfection Resuspension Buffer&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>#07801</td>
			<td>Density Gradient Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>costar 6-well tissue culture treated plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td>flat bottom plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>costar 48-well tissue culture treated plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3548</td>
			<td>flat bottom plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharm Lyse lysing buffer, 10 X</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>555899</td>
			<td>Must make 1X solution with distilled water prior to use</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

small rna transfection in primary human th17 cells by next generation electroporation

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro by activating them in the presence of the polarizing cytokines IL-1&#946;, IL-6, IL-23, and TGF&#946;. Th17 cells orchestrate immunity against extracellular bacteria and fungi, but their aberrant activity has also been associated with several autoimmune and inflammatory diseases. Th17 cells are identified by the chemokine receptor CCR6 and defined by their master transcription factor, ROR&#947;t, and characteristic effector cytokine, IL-17A. Optimized culture conditions for Th17 cell differentiation facilitate mechanistic studies of human T cell biology in a controlled environment. They also provide a setting for studying the importance of specific genes and gene expression programs through RNA interference or the introduction of microRNA (miRNA) mimics or inhibitors. This protocol provides an easy to use, reproducible, and highly efficient method for transient transfection of differentiating primary human Th17 cells with small RNAs using a next generation electroporation device.

הצעד הראשון כדי לפתח מערכת אמינה של electroporating בהצלחת תאים אנושיים TH17 היה לייצר חזק בתרביות תאי TH17 אנושיות המובחן במבחנה. תאי T בתרבית בתנאים-מקטב TH17 הביע את הקולטן chemokine CCR6 ואת גורם שעתוק RORγt (איור 1A, שמאל). סמנים אלה לא באו לידי ביטוי ...

Watch this Scientific Journal Video about Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation at JoVE.com

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

Next generation electroporation is an efficient method for transfecting human Th17 cells with small RNAs to alter gene expression and cell behavior.

RNA הקטן Transfection ב ראשוני האדם TH17 תאים על ידי הדור הבא Electroporation

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

small-rna-transfection-primary-human-th17-cells-next-generation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.8K Views.  University of California, San Francisco. Next generation electroporation is an efficient method for transfecting human Th17 cells with small RNAs to alter gene expression and cell behavior.

Video: Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

Transfection and Mutagenesis of Target Genes in Mosquito Cells by Locked Nucleic Acid-modified Oligonucleotides

Plasmodium parasites, the causative agent of malaria, are transmitted through the bites of infected Anopheles mosquitoes resulting in over 250 million new infections each year. Despite decades of research, there is still no vaccine against malaria, highlighting the need for novel control strategies. One innovative approach is the use of genetically modified mosquitoes to effectively control malaria parasite transmission. Deliberate alterations of cell signaling pathways in the mosquito, via targeted mutagenesis, have been found to regulate parasite development 1. From these studies, we can begin to identify potential gene targets for transformation. Targeted mutagenesis has traditionally relied upon the homologous recombination between a target gene and a large DNA molecule. However, the construction and use of such complex DNA molecules for generation of stably transformed cell lines is costly, time consuming and often inefficient. Therefore, a strategy using locked nucleic acid-modified oligonucleotides (LNA-ONs) provides a useful alternative for introducing artificial single nucleotide substitutions into episomal and chromosomal DNA gene targets (reviewed in 2). LNA-ON-mediated targeted mutagenesis has been used to introduce point mutations into genes of interest in cultured cells of both yeast and mice 3,4. We show here that LNA-ONs can be used to introduce a single nucleotide change in a transfected episomal target that results in a switch from blue fluorescent protein (BFP) expression to green fluorescent protein (GFP) expression in both Anopheles gambiae and Anopheles stephensi cells. This conversion demonstrates for the first time that effective mutagenesis of target genes in mosquito cells can be mediated by LNA-ONs and suggests that this technique may be applicable to mutagenesis of chromosomal targets in vitro and in vivo.

Oligonucleotides can be used to site specifically substitute a single nucleotide of transfected target genes in both Anopheles gambiae and Anopheles stephensi cells.

Transfection ו mutagenesis של גני מטרה של תאים על ידי יתוש נעול חומצה שונה oligonucleotides גרעין

Plasmodium parasites, the causative agent of malaria, are transmitted through the bites of infected Anopheles mosquitoes resulting in over 250 million new ...

Generation of Organotypic Raft Cultures from Primary Human Keratinocytes

The development of organotypic epithelial raft cultures has provided researchers with an efficient in vitro system that faithfully recapitulates epithelial differentiation. There are many uses for this system. For instance, the ability to grow three-dimensional organotypic raft cultures of keratinocytes has been an important milestone in the study of human papillomavirus (HPV)1. The life cycle of HPV is tightly linked to the differentiation of squamous epithelium2. Organotypic epithelial raft cultures as demonstrated here reproduce the entire papillomavirus life cycle, including virus production3,4,5. In addition, these raft cultures exhibit dysplastic lesions similar to those observed upon in vivo infection with HPV. Hence this system can also be used to study epithelial cell cancers, as well as the effect of drugs on epithelial cell differentiation in general. Originally developed by Asselineau and Prunieras6 and modified by Kopan et al.7, the organotypic epithelial raft culture system has matured into a general, relatively easy culture model, which involves the growth of cells on collagen plugs maintained at an air-liquid interface (Figure 1A). Over the course of 10-14 days, the cells stratify and differentiate, forming a full thickness epithelium that produces differentiation-specific cytokeratins. Harvested rafts can be examined histologically, as well as by standard molecular and biochemical techniques. In this article, we describe a method for the generation of raft cultures from primary human keratinocytes. The same technique can be used with established epithelial cell lines, and can easily be adapted for use with epithelial tissue from normal or diseased biopsies8. Many viruses target either the cutaneous or mucosal epithelium as part of their replicative life cycle. Over the past several years, the feasibility of using organotypic raft cultures as a method of studying virus-host cell interactions has been shown for several herpesviruses, as well as adenoviruses, parvoviruses, and poxviruses9. Organotypic raft cultures can thus be adapted to examine viral pathogenesis, and are the only means to test novel antiviral agents for those viruses that are not cultivable in permanent cell lines.

An in vitro method to mimic in vivo epithelial differentiation is described. Many viruses target epithelial cells as part of their viral life cycle, and this method provides a means of examining virus:host interactions that more closely resembles that which occurs in vivo. This technique can be used with primary keratinocytes, established cell lines, as well as normal or diseased biopsy tissue.

הדור של תרבויות רפסודות Organotypic של קרטינוציטים אדם מן המעלה הראשונה

The development of organotypic epithelial raft cultures has provided researchers with an efficient in vitro system that faithfully recapitulates ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in immunologic homeostasis with the vast amount of self and commensal antigens in and on the human body. Perturbations in the balance between Tregs and inflammatory conventional T cells can result in immunopathology or cancer. Although therapeutic injection of Tregs has been shown to be efficacious in murine models of colitis1 , type I diabetes2 , rheumatoid arthritis and graft versus host disease,4 several fundamental differences in human versus mouse Treg biology5 has thus far precluded clinical use. The lack of sufficient number, purity, stability and homing specificity of therapeutic Tregs necessitated a dynamic platform of human Treg development on which to optimize conditions for their ex vivo expansion6.
Here we describe a method for the differentiation of induced Tregs (iTregs) from a single human peripheral blood donor which can be broken down into four stages: isolation of peripheral blood mononuclear cells, magnetic selection of CD4+ T cells, in vitro cell culture and fluorescence activated cell sorting (FACS) of T cell subsets. Since the Treg signature transcription factor forkhead box P3 (FoxP3) is an activation-induced transcription factor in humans7 and no other unique marker exists, a combinatorial panel of markers must be used to identify T cells with suppressor activity. After six days in culture, cells in our system can be demarcated into na&iuml;ve T cells, memory T cells or iTregs based on their relative expression of CD25 and CD45RA. As memory and na&iuml;ve T cells have different reported polarization requirements and plasticities8 , pre-sorting of the initial T cell population into CD45RA+ and CD45RO+ subsets can be used to examine these discrepancies. Consistent with others, our CD25HiCD45RA- iTregs express high levels of FoxP39 , GITR and CTLA-411 and low levels of CD12712 . Following FACS of each population, resultant cells can be used in a suppressor assay which evaluates the relative ability to retard the proliferation of carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeled autologous T cells.

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&#239;ve and Memory T Cells

We describe a method for generating regulatory, memory and na&#239;ve T cells from a single human blood donor. Polarized Tregs can be then compared to other subsets in a variety of genetic and functional applications with genetic homogeneity, including a suppression assay also detailed here.

דור של מושרה תאים T רגולטוריים של האדם תאים ראשוניים טי נאיביות וזיכרון

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

שינוי מערכת Transposon piggyBac של תאי T אנושיים ראשוניים

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

כמותי<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay כדי למדוד הידבקות נויטרופילים לתאים מופעלים עיקריים אדם אנדותל כלי הדם בתנאים סטטיים

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. Transfection with siRNA and plasmid DNA is an efficient tool for studying their function, but transfection of macrophages is not a trivial matter. Although many different approaches for transfection of eukaryotic cells are available, only few allow reliable and efficient transfection of macrophages, but reduced cell vitality and severely altered cell behavior like diminished capability for differentiation or polarization are frequently observed. Therefore a transfection protocol is required that is capable of transferring siRNA and plasmid DNA into macrophages without causing serious side-effects thus allowing the investigation of the effect of the siRNA or plasmid in the context of normal cell behavior. The protocol presented here provides a method for reliably and efficiently transfecting human THP-1 macrophages and monocytes with high cell vitality, high transfection efficiency, and minimal effects on cell behavior. This approach is based on Nucleofection and the protocol has been optimized to maintain maximum capability for cell activation after transfection. The protocol is adequate for adherent cells after detachment as well as cells in suspension, and can be used for small to medium sample numbers. Thus, the method presented is useful for investigating gene regulatory effects during macrophage differentiation and polarization. Apart from presenting results characterizing macrophages transfected according to this protocol in comparison to an alternative chemical method, the impact of cell culture medium selection after transfection on cell behavior is also discussed. The presented data indicate the importance of validating the selection for different experimental settings.

This protocol presents an efficient and reliable method to transfect human THP-1 macrophages with siRNA or plasmid DNA by electroporation with high transfection efficiency while maintaining high cell vitality and full macrophage capacity for differentiation and polarization.

Transfection יעיל ביותר של של אדם המקרופאגים THP-1 על ידי nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Generation of Knock-out Primary and Expanded Human NK Cells Using Cas9 Ribonucleoproteins

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging in primary NK cells. For example, transgene delivery using lentiviral or retroviral transduction resulted in a limited yield of genetically-engineered NK cells due to substantial procedure-associated NK cell apoptosis. We describe here a DNA-free method for genome editing of human primary and expanded NK cells using Cas9 ribonucleoprotein complexes (Cas9/RNPs). This method allowed efficient knockout of the TGFBR2 and HPRT1 genes in NK cells. RT-PCR data showed a significant decrease in gene expression level, and a cytotoxicity assay of a representative cell product suggested that the RNP-modified NK cells became less sensitive to TGF&#946;. Genetically modified cells could be expanded post-electroporation by stimulation with irradiated mbIL21-expressing feeder cells.

Here, we present a protocol to genetically modify primary or expanded human natural killer (NK) cells using Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs). By using this protocol, we generated human NK cells deficient for transforming growth factor&#8211;b receptor 2 (TGFBR2) and hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1).

דור של תאים מעלף העיקרי ומורחבת NK האנושי באמצעות Cas9 Ribonucleoproteins

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging ...

Identification of Mouse and Human Antibody Repertoires by Next-Generation Sequencing

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular mechanisms underlying the production of the vast repertoire of antibodies by the acquired immune systems, it has not yet been possible to arrive at a global view of a complete antibody repertoire. In particular, B cell repertoires have been regarded as a black box because of their astronomical number of antibody clones. However, next-generation sequencing technologies are enabling breakthroughs to increase our understanding of the B cell repertoire. In this report, we describe a simple and efficient method to visualize and analyze whole individual mouse and human antibody repertoires. From the immune organs, representatively from spleen in mice and peripheral blood mononuclear cells in humans, total RNA was prepared, reverse transcribed, and amplified using the 5&#39;-RACE method. Using a universal forward primer and antisense primers for the antibody class-specific constant domains, antibody mRNAs were uniformly amplified in proportions reflecting their frequencies in the antibody populations. The amplicons were sequenced by next-generation sequencing (NGS), yielding more than 105 antibody sequences per immunological sample. We describe the protocols for antibody sequence analyses including V(D)J-gene-segment annotation, a bird&#39;s-eye view of the antibody repertoire, and our computational methods.

Here, we describe protocols for the analysis and visualization of the structure and constitution of whole antibody repertoires. This involves the acquisition of vast sequences of antibody RNA using next-generation sequencing.

זיהוי של נוגדנים אנושיים Repertoires על ידי הדור הבא רצפי של עכבר

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular ...

Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors (PRRs) such as the retinoic acid (RIG-I) like receptors (RLRs) RIG-I and melanoma differentiation-associated protein 5 (MDA-5) leads to the induction of the innate immune response. The formation and intracellular distribution of dsRNA in positive-sense RNA virus infection has been well characterized by microscopy. Many negative-sense RNA viruses, including some arenaviruses, trigger the innate immune response during infection. However, negative-sense RNA viruses were thought to produce low levels of dsRNA, which hinders the imaging study of PRR recognition of viral dsRNA. Additionally, infection experiments with highly pathogenic arenaviruses must be performed in high containment biosafety level facilities (BSL-4). The interaction between viral RNA and PRRs for highly pathogenic RNA virus is largely unknown due to the additional technical challenges that researchers need to face in the BSL-4 facilities. Recently, a monoclonal antibody (Mab) (clone 9D5) originally used for pan-enterovirus detection has been found to specifically detect dsRNA with a higher sensitivity than the traditional J2 or K1 anti-dsRNA antibodies. Herein, by utilizing the 9D5 antibody, we describe a confocal microscopy protocol that has been used successfully to visualize dsRNA, viral protein and PRR simultaneously in individual cells infected by arenavirus. The protocol is also suitable for imaging studies of dsRNA and PRR distribution in pathogenic arenavirus infected cells in BSL4 facilities.

Double-stranded RNA produced during RNA virus replication can be recognized by pattern recognition receptors to induce an innate immune response. For negative-sense RNA viruses, the interaction between the low-level dsRNA and PRRs remains unclear. We have developed a confocal microscopy method to visualize arenavirus dsRNA and PRR in individual cells.

הדמיה קונאפוקלית של זוגיות גדילי RNA ודפוס זיהוי רצפטורים להדבקת וירוס RNA שלילי-סנס

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors ...

Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. While antiretroviral therapy efficiently lowers systemic viral load and restores normal CD4+ T cell counts, it does not reconstitute a completely functional immune system. A dysfunctional immune system in HIV-infected individuals undergoing cART may be characterized by immune activation, early aging of immune cells, or persistent inflammation. These conditions, along with comorbid factors associated with HIV infection, add complexity to the disease, which cannot be easily reproduced in cellular and animal models. To investigate the molecular events underlying immune dysfunction in these patients, a system to culture and manipulate human primary monocytes in vitro is presented here. Specifically, the protocol allows for the culture and transfection of primary CD14+ monocytes obtained from HIV-infected individuals undergoing cART as well as from HIV-negative controls. The method involves isolation, culture, and transfection of monocytes and monocyte-derived macrophages. While commercially available kits and reagents are employed, the protocol provides important tips and optimized conditions for successful adherence and transfection of monocytes with miRNA mimics and inhibitors as well as with siRNAs.

Presented here is an optimized protocol for isolating, culturing, transfecting, and differentiating human primary monocytes from HIV-infected individuals and healthy controls.

בידוד, העברה ותרבות של האדם הראשי המונולוציטים

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. ...