This work was supported by the US National Institutes of Health grants (R01HL109102, P01HL107202, U19CA179512, F31HL131361), a Leukemia &amp; Lymphoma Society scholar award (K.M.A.), and the National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) Medical Scientist Training Program (Grant #T32GM007618) (M.M.).

Este protocolo se adhiere a las directrices de la UCSF para la ética de investigación en humanos. 1. Preparación de T cultivo celular, el aislamiento de células T CD4 + y la polarización Th17 <ol><li> En el Día 0, capa placas de cultivo tisular de 6 pocillos con 1,5 ml por pocillo de anti-CD3 humano (2 g / ml) y CD28 anti-humano (4 mg / ml) en PBS con calcio y magnesio durante al menos 2 h en 37 ° C. <ol><li> Alternativamente, revestir las placas durante la noche a 4 ° C. Envolver las placas en Parafilm. </li></ol></li><li> Preparar las células mononucleares de sangre de cordón (CBMCs) por centrifugación en gradiente de densidad de acuerdo con las instrucciones del fabricante. PRECAUCIÓN: Trabajar con cuidado y asegurar que el equipo de protección personal (EPP) se utilizar para la manipulación de la sangre humana para evitar cualquier riesgo de exposición a patógenos transmitidos por la sangre. </li><li> Una vez que se han aislado y se lavó las células mononucleares, lleve a cabo el aislamiento de células T CD4 + humano por sele negativocción utilizando un kit comercial de células T CD4 humano +. NOTA: Si hay contaminación de glóbulos rojos después del aislamiento de células mononucleares, una lisis de glóbulos rojos opcional puede llevarse a cabo antes de las etapas de aislamiento de células T CD4 +. Resuspender las células mononucleares en 1 ml de tampón de aislamiento (2% de FBS en PBS). Añadir 5 ml de solución de lisis 1x. Incubar durante 15 min a temperatura ambiente. A continuación, añadir 5 ml de tampón de aislamiento y se centrifuga a 300 xg durante 5 min a 4 ° C para sedimentar las células. <ol><li> Resuspender las células mononucleares a una densidad de 50 x 10 6 por 500! L en el tampón de aislamiento en un nuevo tubo de 5 ml. </li><li> Añadir 100 ml de FBS y 100 l de la mezcla de anticuerpo por tubo a continuación, incubar cada tubo a 4 ° C durante 20 min en un agitador orbital a mezclar bien. </li><li> Después de la incubación, añadir 34 ml de tampón de aislamiento para lavar las células. Centrifugar las células a 300 xg durante 8 minutos a 4 ° C para sedimentar las células. aspirar con cuidado la supernatant. </li><li> Durante este giro, antes de lavar las perlas magnéticas. Transferir la cantidad deseada de perlas magnéticas en un nuevo tubo (utilizado a 1: 1 con las células) y se añade un volumen igual de tampón de aislamiento para lavar las perlas. Mezclar bien usando una micropipeta ml 1 y luego colocar el tubo en el imán durante al menos 1 min. aspirar cuidadosamente el sobrenadante. Resuspender las perlas magnéticas en el mismo volumen inicialmente transferido antes de la colada. </li><li> Resuspender las células en cada tubo con 500! L del tampón de aislamiento y añadir 500 l de perlas magnéticas pre-lavado. </li><li> Se incuban las células con las perlas magnéticas durante 15 min en un agitador orbital a temperatura ambiente (18 ° C a 25 ° C) para mezclar bien. </li><li> Después de la incubación, pipetear a fondo las células utilizando una micropipeta de 1 ml, al menos 10 veces. A continuación, añadir 34 ml de tampón de aislamiento y coloque cada tubo en el imán durante 2 min. </li><li> Transferir cuidadosamente las células T CD4 + seleccionadas negativamente que se encuentran enel sobrenadante a un nuevo tubo. </li></ol></li><li> Una vez que se ha completado el aislamiento de células T CD4 +, contar las células con un hemocitómetro y mantener las células en hielo. </li><li> Lavar las placas recubiertas de anticuerpos dos veces con PBS. A continuación, añadir 1,5 ml de 2x mezcla de medios Th17-polarizar a cada pocillo: IFN anti-humano (20 g / ml), anti-IL-4 humana (20 mg / ml), TGF humano (10 ng / ml), humana IL-1β (40 ng / ml), IL-23 (40 ng / ml), IL-6 humana (50 ng / ml) todo diluyó en un medio de base libre de suero (suplementado con 2 mM L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, HEPES 10 mM, piruvato de sodio 1 mM y 100 mM 2-mercaptoetanol). NOTA: La transfección y la interferencia de ARN hace el trabajo en medios que contienen suero. El propósito de usar medios libres de suero con este protocolo es para lograr una mejor producción de IL-17A. </li><li> Centrifugar las células T CD4 + humanos a 500 xg durante 5 min a 4 ° C para sedimentar las células. Aspirar con cuidado la Supernathormiga. Entonces resuspender las células en medios de base libre de suero y la placa de las células a una densidad de 3 x 10 6 en 1,5 ml por pocillo de modo que el volumen final es de 3 ml por pocillo y las citocinas polarizantes están ahora a una concentración final de 1x. <ol><li> Colocar las placas en 5% de CO2, 37 ° C incubadora durante dos días. </li></ol></li></ol> 2. Las células Electroporación de In Vitro Polarized Th17 humana <ol><li> En el Día 2, la capa de placas de cultivo tisular de 48 pocillos con 250! L por pocillo de anti-CD3 humano (2 g / ml) y CD28 anti-humano (4 mg / ml) en PBS con calcio y magnesio durante al menos 2 h en 37 ° C. <ol><li> Alternativamente, revestir las placas durante la noche a 4 ° C. Envolver las placas en Parafilm. </li></ol></li><li> Preparar pequeños ARN para la transfección. Para cada transfección, alícuota de 1 l de una 5 M solución madre de siRNA en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Incluir pequeñas contr ARN química con ajuste apropiadool. Mantenga todos los tubos en hielo. </li><li> Lavar las placas recubiertas de anticuerpos dos veces con PBS. A continuación, añadir 500 l de 1X Th17-polarizando medios de comunicación a cada pocillo: IFN anti-humano (10 g / ml), anti-IL-4 humana (10 mg / ml), TGF humana (5 ng / ml), IL-humana 1β (20 ng / ml), IL-23 (20 ng / ml), IL-6 humana (25 ng / ml) todo diluyó en un medio de base libre de suero (suplementado con 2 mM L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, HEPES 10 mM, piruvato de sodio 1 mM y 100 mM 2-mercaptoetanol). </li><li> Después se preparan las placas de cultivo y reactivos de transfección, resuspender las células con un 1 ml micropipeta, pipeteado suave pero que garantiza que todas las células se separan del fondo de los pocillos. Reunir las células en un tubo cónico y se centrifuga a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. NOTA: Para los períodos de cultivo más largo que el protocolo de cuatro días presentado en el presente documento, las células deben transfectarse aproximadamente cada 3 días usando este mismo protocolo. Paso 20.4 debería modificarse sin embargo ya que las células tratadas con diferentes ARNs pequeños no se mezclarán. Todas las condiciones se están probando debe recogerse, contados, y se transfectaron por separado. </li><li> aspirar cuidadosamente el sobrenadante, y luego volver a suspender las células en al menos 1 ml de PBS para lavar. Contar las células Th17 en vivo (por ejemplo con un hemocitómetro usando exclusión de azul de tripano para evaluar la viabilidad) y luego transferir las células a un tubo de microcentrífuga. </li><li> Centrifugar a 500 xg durante 5 min a temperatura ambiente para sedimentar las células. </li><li> Aspirar cuidadosamente el sobrenadante, y luego resuspender las células usando el tampón de resuspensión proporcionado en el kit de sistema de transfección 10 l a una densidad de 2,5-4 x 10 7 células por ml. Mantener las células a temperatura ambiente. NOTA: Como pauta, tratar de preparar sólo como muchas células como se puede transfectadas dentro de 30 min. Varios lotes se pueden comparar. </li><li> Añadir 9 l de células a 1 l de ARN pequeño en cada MicroCtubo entrifuge. Pipetear una vez para mezclar las células y los pequeños ARN para la transfección a continuación, cargar en la punta del electrodo pipeta proporcionado. NOTA: Típicamente, añadir 9,5! L de suspensión de células para asegurar que hay suficiente de la mezcla para evitar la creación de burbujas en la punta del electrodo de pipeta antes de la transfección. </li><li> Llenar la cubeta proporcionado con 3 ml de temperatura ambiente electrolítico Buffer E. Place la cubeta dentro de la estación de pipeta y luego colocar la pipeta en posición dentro de la cubeta. </li><li> Inmediatamente electroporar cada 10? L de la mezcla de células y pequeños ARN utilizando los siguientes parámetros: voltaje de impulso 1,500-1,550 V, anchura de impulso de 10 ms, y 3 pulsos total en el dispositivo de la transfección. </li><li> Después de la electroporación es completa, añadir directamente a la mezcla de células a 500 l de medio 1X Th17 polarizante en pozos preparados de una placa de cultivo. Placas lugar en un 5% de CO2, 37 ° C incubadora durante dos días más. NOTA: Lavar la punta del electrodo pipeta pipeteandoarriba y abajo en PBS entre cada transfección. </li></ol> 3. Las células de cosecha Th17 humana <ol><li> Resuspender las células en medios de cultivo con una micropipeta, pipeteando suavemente pero asegurando que todas las células se separan del fondo de los pocillos. Preparar las células para ensayos de expresión funcionales y / o de genes. NOTA: Rutinariamente, suficientes células se produjeron a partir de un único pocillo de células Th17 transfectadas para ser utilizado para el análisis de citometría de flujo de marcador de superficie e intracelular de citoquinas y factor de transcripción tinción o para la preparación de ARN para el análisis de la expresión génica. </li></ol>

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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microRNA+upregulated+in+asthma+airway+T+cells+promotes+TH2+cytokine+production.">A microRNA upregulated in asthma airway T cells promotes TH2 cytokine production.</a> Nature Immunol. 15 (12), 1162-1170 (2014).</li><li>Pua, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+24+and+27+Suppress+Allergic+Inflammation+and+Target+a+Network+of+Regulators+of+T+Helper+2+Cell-Associated+Cytokine+Production.">MicroRNAs 24 and 27 Suppress Allergic Inflammation and Target a Network of Regulators of T Helper 2 Cell-Associated Cytokine Production.</a> Immunity. 44 (4), 821-832 (2016).</li><li>Flaherty, S., Reynolds, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Na&#239;ve+CD4++T+Cell+Isolation+and+In+vitro+Differentiation+into+T+Cell+Subsets.">Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets.</a> J Vis Exp. (98), (2015).</li><li>Schumann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+knock-in+primary+human+T+cells+using+Cas9+ribonucleoproteins.">Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 112 (33), 10437-10442 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Este protocolo proporciona un método mejorado para el suministro de pequeños ARN en células Th17 humanos. Aunque se utilizaron células Th17 humanos aquí, este método de electroporación con pequeños ARN se puede utilizar con otros subconjuntos helper humano primario T, tales como Th1, Th2, y Tregs. No ha funcionado bien para las células T CD4 + vírgenes por lo que las células deben ser activadas en cultivo antes de la transfección. Para este protocolo, primero optimizado el sistema de cult...

Células T CD4 + son orchestrators cruciales de la respuesta inmune adaptativa. Células T CD4 + vírgenes son capaces de desarrollar en varias células T efectoras diferentes (por ejemplo, Th1, Th2, Th17, etc.), cada uno con su propio conjunto de citocinas características y factores de transcripción, dependiendo de la microentorno local 1. Las decisiones del linaje que las células T hacen son críticos tanto para la inmunidad protectora y la tolerancia a la libre. Células Th17 son un subconjunto de células T conocidos para combatir bacterias y hongos extracelulares, pero sus respuestas incorrectas también están implicados en la patogénesis de múltiples enfermedades autoinmunes e inflamatorias tales como esclerosis múltiple y psoriasis 2, 3. Células Th17 humanos pueden ser generados a partir de células T CD4 + vírgenes in vitro, proporcionándoles un ambiente de polarización apropiado 4. Vario<html> nos combinaciones de las citoquinas IL-1β, IL-23, TGF, y IL-6 se han utilizado para el desarrollo de las células Th17 humanos. Células Th17 humanos expresan CCR6, un receptor de quimioquinas que se utiliza comúnmente para identificar esta población de células y se define por la expresión de su director factor de transcripción, RORγt (codificada por RORC) 5, 6. células Th17 tienen la capacidad de expresar múltiples citocinas, pero IL-17A es la citoquina efectora linaje-definir producido por estas células. Se examinó la expresión de los tres marcadores Th17-asociado (CCR6, RORγt, IL-17A) para evaluar la solidez de nuestro ensayo de diferenciación humana Th17 in vitro. Además, se cultivaron células T CD4 + humanas en condiciones no polarización, donde no se añadieron citoquinas o anticuerpos de bloqueo a los medios de cultivo para su uso como un control negativo ya que la expresión de estos marcadores Th17 debe ser muy baja o ausente. ve_content &quot;&gt; Una manera de estudiar el desarrollo humano normal T biología celular y es manipular la expresión génica durante su desarrollo.-ARN corto de interferencia (ARNsi) son pequeñas moléculas de ARN sintéticos que se dirigen a ARNm codificantes de proteínas y pueden ser utilizados para reducir la expresión de genes específicos . microARNs (miARN) son endógenos no codificantes ARN pequeños conocidos para modular la expresión del gen post-transcripcionalmente. miRNAs han sido demostrado que desempeñan un papel importante tanto en murino y la biología de células T humanas, incluso en las células Th17 7, 8, 9. se es crucial tener métodos fiables de manipulación de la actividad de ARN pequeño en las células T humanas para estudiar sus efectos sobre la expresión de genes y en última instancia, sobre la biología de células T humanas. a continuación, describimos un protocolo fácil de uso, consistente y fiable que hemos desarrollado para introducir pequeños RNAs sintéticos y ácidos nucleicos bloqueados (LNA, modificar químicamente los ácidos nucleicos con una mayor estabilidad)en células inmunes, y específicamente en células Th17 humanos. Hay varios métodos alternativos de introducción de pequeños ARN en células de mamífero, que generalmente se dividen en categorías químicas, biológicas o físicas 10. métodos químicos normalmente usados, incluyendo transfecciones basadas en lípidos y transfecciones de calcio-fosfato, se basan en la creación de complejos de ADN-químico que se toman más eficientemente por las células. En general, los métodos químicos no son tan eficientes para la transfección de células T primarias. El método biológico más común es usar un vector viral (por ejemplo, retrovirus o lentivirus), que inserta directamente ARN extraño en un huésped como parte de su ciclo de replicación natural. transducción viral típicamente tarda más tiempo en completar, especialmente cuando se toma en cuenta el tiempo para la clonación molecular de los plásmidos proviral. Además, los vectores virales de transducción pueden ser potencialmente dañinos para los investigadores humanos. La electroporación es un m físicaétodo de inducir permeabilización de la membrana sometiendo las células a pulsos de alto voltaje, permitiendo que los ácidos nucleicos para introducir transitoriamente en la célula donde pueden actuar en su objetivo. instrumentos de electroporación tradicionales no eran eficaces para transfectar linfocitos primarios. Sin embargo, optimizado siguiente electroporación generación ha demostrado ser capaz de transfectar las células T a muy alta eficiencia, especialmente cuando el material a transfectar es pequeño ARN. El término próxima generación se utiliza libremente para diferenciar las dos plataformas más recientes (por ejemplo, neón, Amaxa) de máquinas de electroporación tradicionales. Además, este método es fácilmente escalable para pantallas de rendimiento moderados con hasta aproximadamente 120 pequeños RNAs en un solo experimento, a menudo utilizando reactivos sintéticos validados. Es importante destacar que las transfecciones con éxito se puede lograr en tan poco como 16 h después de la activación de células T. La desventaja de este método, sin embargo, es que no da como resultado de plástic genómico establesucesivamente, y es por lo tanto transitoria. Por lo tanto, vale la pena el esfuerzo extra para crear una construcción de expresión estable que puede ser empaquetado en un vector viral y se expresó con éxito en las células T en los casos en que se requiere la expresión a largo plazo de un pequeño ARN. Hemos utilizado una próxima generación de transfección (por ejemplo, neón) para ofrecer diversas herramientas sintéticos individuales o de doble hebra de ARN o de oligonucleótidos LNA para diferentes propósitos 11, 12, 13. la interferencia de ARN eficiente puede ser inducida en el ratón primario y las células T humanas utilizando ARN-interferencia corto de doble hebra (siRNA). Este protocolo describe condiciones optimizadas para el uso de esta técnica en las células Th17 humanos. Además de siRNAs, disponibles comercialmente imita e inhibidores de miARN sintéticos pueden ser utilizados para estudiar el aumento de miARN y pérdida de función. imita miARN son moléculas de ARN de doble cadena muy similares a siRNAs, pero designed con la secuencia de miRNAs maduros endógenos. inhibidores de miARN están químicamente modificados de ARN y / o LNA basado oligonucleótidos monocatenarios que se unen a miRNAs nativas y antagonizan su función. Hemos encontrado que todas estas herramientas se pueden utilizar de manera efectiva en los linfocitos T primarias cultivadas, incluyendo pero no limitado a las células Th17 humanos.

<table><tbody><tr><td>anti-human IL-17A PE</td><td>ebioscience</td><td>12-7179-42&amp;nbsp;</td><td>Clone: eBio64DEC17</td></tr><tr><td>anti-human IFNg FITC</td><td>ebioscience</td><td>11-7319-82</td><td>Clone: 4S.B3</td></tr><tr><td>anti-human CD4 eVolve605</td><td>ebioscience</td><td>83-0047-42</td><td>Clone: SK3</td></tr><tr><td>mouse anti-human CD196 (CCR6) BV421</td><td>BD biosciences</td><td>562515</td><td>Clone: 11A9</td></tr><tr><td>anti-human RORgt AF647</td><td>BD biosciences</td><td>563620</td><td>Clone: Q21-559</td></tr><tr><td>anti-human CD45 eFluor450</td><td>ebioscience</td><td>48-9459-42</td><td>Clone: 2D1</td></tr><tr><td>Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set</td><td>ebioscience</td><td>00-5523-00</td><td>For intracellular transcription factor flow cytometry staining</td></tr><tr><td>Hu FcR Binding Inhibitor Purified</td><td>ebioscience</td><td>14-9161-71</td><td></td></tr><tr><td>ImmunoCult-XF T Cell Expansion Medium</td><td>Stemcell Technologies</td><td>10981</td><td>&quot;Serum-Free Base Media&quot;</td></tr><tr><td>MACS CD28 pure functional grade, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-375</td><td>Clone: 15E8</td></tr><tr><td>anti-human CD3 Purified</td><td>UCSF monoclonal antibody core</td><td>N/A</td><td>Clone: OKT-3</td></tr><tr><td>LEAF purified anti-human IL-4</td><td>Biolegend</td><td>500815</td><td>Clone: MP4-25D2</td></tr><tr><td>anti-human IFNg, functional grade purified</td><td>ebioscience</td><td>16-7318-85</td><td>Clone: NIB42</td></tr><tr><td>Recombinant human IL-23</td><td>Peprotech&amp;nbsp;</td><td>200-23</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human IL-1&amp;beta;</td><td>Peprotech&amp;nbsp;</td><td>200-01B</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human TGF-&amp;beta;1</td><td>Peprotech&amp;nbsp;</td><td>100-21C</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human IL-6</td><td>Peprotech&amp;nbsp;</td><td>200-06</td><td></td></tr><tr><td>siGENOME Control Pool, Non-targeting #2</td><td>Dharmacon</td><td>D-001206-14-05</td><td></td></tr><tr><td>siGENOME SMARTpool Human RORC</td><td>Dharmacon</td><td>M-003442-00</td><td></td></tr><tr><td>siGENOME SMARTpool Human PTPRC</td><td>Dharmacon</td><td>M-008067-01</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11346D</td><td>Human CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; T cell Isolation Kit</td></tr><tr><td>Neon Tranfection System</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK5000</td><td>Next generation electroporation instrument</td></tr><tr><td>Neon Tranfection System 10 &amp;mu;L Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK1096</td><td></td></tr><tr><td>Resuspension Buffer T</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Provided in kit (MPK1096)</td><td>&quot;Transfection Resuspension Buffer&quot;</td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Stemcell Technologies</td><td>#07801</td><td>Density Gradient Medium</td></tr><tr><td>costar 6-well tissue culture treated plates</td><td>Corning</td><td>3516</td><td>flat bottom plates</td></tr><tr><td>costar 48-well tissue culture treated plates</td><td>Corning</td><td>3548</td><td>flat bottom plates</td></tr><tr><td>BD Pharm Lyse lysing buffer, 10x</td><td>BD biosciences</td><td>555899</td><td>Must make 1x solution with distilled water prior to use</td></tr></tbody></table>

small rna transfection in primary human th17 cells by next generation electroporation

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro by activating them in the presence of the polarizing cytokines IL-1&#946;, IL-6, IL-23, and TGF&#946;. Th17 cells orchestrate immunity against extracellular bacteria and fungi, but their aberrant activity has also been associated with several autoimmune and inflammatory diseases. Th17 cells are identified by the chemokine receptor CCR6 and defined by their master transcription factor, ROR&#947;t, and characteristic effector cytokine, IL-17A. Optimized culture conditions for Th17 cell differentiation facilitate mechanistic studies of human T cell biology in a controlled environment. They also provide a setting for studying the importance of specific genes and gene expression programs through RNA interference or the introduction of microRNA (miRNA) mimics or inhibitors. This protocol provides an easy to use, reproducible, and highly efficient method for transient transfection of differentiating primary human Th17 cells with small RNAs using a next generation electroporation device.

El primer paso para desarrollar un sistema fiable de electroporación con éxito células Th17 humanos era generar robusto en cultivos de células Th17 humanos in vitro diferenciados. Las células T cultivadas en condiciones Th17-polarizantes expresan el receptor de quimiocinas CCR6 y el factor de transcripción RORγt (Figura 1A, izquierda). Estos marcadores no se expresaron cuando se cultivaron las células T en condiciones no polarizante (THN) <stron...

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Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

Next generation electroporation is an efficient method for transfecting human Th17 cells with small RNAs to alter gene expression and cell behavior.

Small RNA Transfección en células primarias Th17 humano por Next Generation electroporación

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

small-rna-transfection-primary-human-th17-cells-next-generation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.8K vistas.  University of California, San Francisco. Next generation electroporation is an efficient method for transfecting human Th17 cells with small RNAs to alter gene expression and cell behavior.

Video: Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection of pathogenic antigen by na&iuml;ve DCs is through pattern recognition receptors (PRRs) which are able to recognize specific conserved structures referred to as pathogen-associated molecular patterns (PAMPS). Detection of PAMPs by DCs triggers an intracellular signaling cascade resulting in their activation and transformation to mature DCs. This process is typically characterized by production of type 1 interferon along with other proinflammatory cytokines, upregulation of cell surface markers such as MHCII and CD86 and migration of the mature DC to draining lymph nodes, where interaction with T cells initiates the adaptive immune response2,3. Thus, DCs link the innate and adaptive immune systems. 
The ability to dissect the molecular networks underlying DC response to various pathogens is crucial to a better understanding of the regulation of these signaling pathways and their induced genes. It should also help facilitate the development of DC-based vaccines against infectious diseases and tumors. However, this line of research has been severely impeded by the difficulty of transfecting primary DCs4.
Virus transduction methods, such as the lentiviral system, are typically used, but carry many limitations such as complexity and bio-hazardous risk (with the associated costs)5,6,7,8. Additionally, the delivery of viral gene products increases the immunogenicity of those transduced DCs9,10,11,12. Electroporation has been used with mixed results13,14,15, but we are the first to report the use of a high-throughput transfection protocol and conclusively demonstrate its utility.
In this report we summarize an optimized commercial protocol for high-throughput transfection of human primary DCs, with limited cell toxicity and an absence of DC maturation16. Transfection efficiency (of GFP plasmid) and cell viability were more than 50% and 70% respectively. FACS analysis established the absence of increase in expression of the maturation markers CD86 and MHCII in transfected cells, while qRT-PCR demonstrated no upregulation of IFN&beta;. Using this electroporation protocol, we provide evidence for successful transfection of DCs with siRNA and effective knock down of targeted gene RIG-I, a key viral recognition receptor16,17, at both the mRNA and protein levels.

We present our optimized high-throughput nucleofection protocol as an efficient way of transfecting primary human monocyte-derived dendritic cells with either plasmid DNA or siRNA without causing cell maturation. We further provide evidence for successful siRNA silencing of targeted gene RIG-I at both the mRNA and protein levels.

Protocolo optimizado para la transfección eficiente de células dendríticas, sin maduración de las células

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Investigación

Inmunología e Infección

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA)

The discovery of RNAi pathway in eukaryotes and the subsequent development of RNAi agents, such as siRNA and shRNA, have achieved a potent method for silencing specific genes1-8 for functional genomics and therapeutics. A major challenge involved in RNAi based studies is the delivery of RNAi agents to targeted cells. Traditional non-viral delivery techniques, such as bulk electroporation and chemical transfection methods often lack the necessary spatial control over delivery and afford poor transfection efficiencies9-12. Recent advances in chemical transfection methods such as cationic lipids, cationic polymers and nanoparticles have resulted in highly enhanced transfection efficiencies13. However, these techniques still fail to offer precise spatial control over delivery that can immensely benefit miniaturized high-throughput technologies, single cell studies and investigation of cell-cell interactions. 
Recent technological advances in gene delivery have enabled high-throughput transfection of adherent cells14-23, a majority of which use microscale electroporation. Microscale electroporation offers precise spatio-temporal control over delivery (up to single cells) and has been shown to achieve high efficiencies19, 24-26. Additionally, electroporation based approaches do not require a prolonged period of incubation (typically 4 hours) with siRNA and DNA complexes as necessary in chemical based transfection methods and lead to direct entry of naked siRNA and DNA molecules into the cell cytoplasm. As a consequence gene expression can be achieved as early as six hours after transfection27. Our lab has previously demonstrated the use of microelectrode arrays (MEA) for site-specific transfection in adherent mammalian cell cultures17-19. In the MEA based approach, delivery of genetic payload is achieved via localized micro-scale electroporation of cells. An application of electric pulse to selected electrodes generates local electric field that leads to electroporation of cells present in the region of the stimulated electrodes. The independent control of the micro-electrodes provides spatial and temporal control over transfection and also enables multiple transfection based experiments to be performed on the same culture increasing the experimental throughput and reducing culture-to-culture variability. 
Here we describe the experimental setup and the protocol for targeted transfection of adherent HeLa cells with a fluorescently tagged scrambled sequence siRNA using electroporation. The same protocol can also be used for transfection of plasmid vectors. Additionally, the protocol described here can be easily extended to a variety of mammalian cell lines with minor modifications. Commercial availability of MEAs with both pre-defined and custom electrode patterns make this technique accessible to most research labs with basic cell culture equipment.

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays MEA

The article details the protocol for site-specific transfection of scrambled sequence of siRNA in an adherent mammalian cell culture using a microelectrode array (MEA).

Alta eficiencia, específica del sitio La transfección de células adherentes con siRNA uso de arrays de microelectrodos (MEA)

The discovery of RNAi pathway in eukaryotes and the subsequent development of RNAi agents, such as siRNA and shRNA, have achieved a potent method for ...

Bioingeniería

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La preparación de cultivos primarios de células hematopoyéticas de la médula ósea murina por electroporación

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Biología

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. Transfection with siRNA and plasmid DNA is an efficient tool for studying their function, but transfection of macrophages is not a trivial matter. Although many different approaches for transfection of eukaryotic cells are available, only few allow reliable and efficient transfection of macrophages, but reduced cell vitality and severely altered cell behavior like diminished capability for differentiation or polarization are frequently observed. Therefore a transfection protocol is required that is capable of transferring siRNA and plasmid DNA into macrophages without causing serious side-effects thus allowing the investigation of the effect of the siRNA or plasmid in the context of normal cell behavior. The protocol presented here provides a method for reliably and efficiently transfecting human THP-1 macrophages and monocytes with high cell vitality, high transfection efficiency, and minimal effects on cell behavior. This approach is based on Nucleofection and the protocol has been optimized to maintain maximum capability for cell activation after transfection. The protocol is adequate for adherent cells after detachment as well as cells in suspension, and can be used for small to medium sample numbers. Thus, the method presented is useful for investigating gene regulatory effects during macrophage differentiation and polarization. Apart from presenting results characterizing macrophages transfected according to this protocol in comparison to an alternative chemical method, the impact of cell culture medium selection after transfection on cell behavior is also discussed. The presented data indicate the importance of validating the selection for different experimental settings.

This protocol presents an efficient and reliable method to transfect human THP-1 macrophages with siRNA or plasmid DNA by electroporation with high transfection efficiency while maintaining high cell vitality and full macrophage capacity for differentiation and polarization.

La transfección altamente eficiente de humanos THP-1 macrófagos por Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Generation of Knock-out Primary and Expanded Human NK Cells Using Cas9 Ribonucleoproteins

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging in primary NK cells. For example, transgene delivery using lentiviral or retroviral transduction resulted in a limited yield of genetically-engineered NK cells due to substantial procedure-associated NK cell apoptosis. We describe here a DNA-free method for genome editing of human primary and expanded NK cells using Cas9 ribonucleoprotein complexes (Cas9/RNPs). This method allowed efficient knockout of the TGFBR2 and HPRT1 genes in NK cells. RT-PCR data showed a significant decrease in gene expression level, and a cytotoxicity assay of a representative cell product suggested that the RNP-modified NK cells became less sensitive to TGF&#946;. Genetically modified cells could be expanded post-electroporation by stimulation with irradiated mbIL21-expressing feeder cells.

Here, we present a protocol to genetically modify primary or expanded human natural killer (NK) cells using Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs). By using this protocol, we generated human NK cells deficient for transforming growth factor&#8211;b receptor 2 (TGFBR2) and hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1).

Generación de células NK humano primario y ampliado de Knock-out utilizando ribonucleoproteínas Cas9

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging ...

Electroporation-Based Genetic Modification of Primary Human Pigment Epithelial Cells Using the Sleeping Beauty Transposon System

Our increasingly aging society leads to a growing incidence of neurodegenerative diseases. So far, the pathological mechanisms are inadequately understood, thus impeding the establishment of defined treatments. Cell-based additive gene therapies for the increased expression of a protective factor are considered as a promising option to medicate neurodegenerative diseases, such as age-related macular degeneration (AMD). We have developed a method for the stable expression of the gene encoding pigment epithelium-derived factor (PEDF), which is characterized as a neuroprotective and anti-angiogenic protein in the nervous system, into the genome of primary human pigment epithelial (PE) cells using the Sleeping Beauty (SB) transposon system. Primary PE cells were isolated from human donor eyes and maintained in culture. After reaching confluence, 1 x 104 cells were suspended in 11 &#181;L of resuspension buffer and combined with 2 &#181;L of a purified solution containing 30 ng of hyperactive SB (SB100X) transposase plasmid and 470 ng of PEDF transposon plasmid. Genetic modification was carried out with a capillary electroporation system using the following parameters: two pulses with a voltage of 1,100 V and a width of 20 ms. Transfected cells were transferred into culture plates containing medium supplemented with fetal bovine serum; antibiotics and antimycotics were added with the first medium exchange. Successful transfection was demonstrated in independently performed experiments. Quantitative polymerase chain reaction (qPCR) showed the increased expression of the PEDF transgene. PEDF secretion was significantly elevated and remained stable, as evaluated by immunoblotting, and quantified by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). SB100X-mediated transfer allowed for a stable PEDF gene integration into the genome of PE cells and ensured the continuous secretion of PEDF, which is critical for the development of a cell-based gene addition therapy to treat AMD or other retinal degenerative diseases. Moreover, analysis of the integration profile of the PEDF transposon into human PE cells indicated an almost random genomic distribution.

We have developed a protocol to transfect primary human pigment epithelial cells by electroporation with the gene encoding pigment epithelium-derived factor (PEDF) using the Sleeping Beauty (SB) transposon system. Successful transfection was demonstrated by quantitative polymerase chain reaction (qPCR), immunoblotting, and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

Modificación genética basada en electroporación de células epiteliales pigmentarias humanas primarias utilizando el sistema de transposones de la Bella Durmiente

Our increasingly aging society leads to a growing incidence of neurodegenerative diseases. So far, the pathological mechanisms are inadequately ...

Medicina

<meta charset="utf8"></head><body>Diferenciación de células Th17 a partir de células T CD4+ ingenuas mediante citometría de flujo

In Vitro Differentiation of Naive CD4+ T Cells into Pathogenic Th17 Cells in Mouse

In vitro T cell differentiation techniques are essential for both functional and mechanistic investigations of CD4+ T cells. Pathogenic Th17 cells have been linked to a wide range of diseases in recent times, including multiple sclerosis (MS), rheumatoid arthritis, acute respiratory distress syndrome (ARDS), sepsis, and other autoimmune disorders. However, the currently known in vitro differentiation protocols have difficulty achieving high purity of pathogenic Th17 cells, with the induction efficiency often below 50%, which is a key challenge in in vitro experiments. In this protocol, we propose an enhanced in vitro culture and differentiation protocol for pathogenic Th17 cells, which is used to directly differentiate naive CD4+ T cells isolated from mouse spleens into pathogenic Th17 cells. This protocol provides detailed instructions on splenocyte isolation, purification of naive CD4+ T cells, and differentiation of pathogenic Th17 cells. Through this protocol, we can achieve a differentiation purity of approximately 90% for pathogenic Th17 cells, which meets the basic needs of many cellular experiments.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor destacado: Lograr la diferenciación in vitro de alta pureza de las células Th17 mediante la modulación de la concentración de citocinas

This protocol describes the differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells into pathogenic Th17 cells in vitro. Specifically, when combined with a multi-parameter flow cytometry-based approach, 90% purity of pathogenic Th17 cells can be obtained from na&#239;ve CD4+ T cells using this differentiation method.

Diferenciación in vitro de linfocitos T CD4+ naive en linfocitos Th17 patógenos en ratón

In vitro T cell differentiation techniques are essential for both functional and mechanistic investigations of CD4+ T cells. Pathogenic Th17 cells have ...

<meta charset="utf8"></head><body>Transducción retroviral de ARN guía para la edición génica en la diferenciación Th17

Retroviral CRISPR/Cas9-Mediated Gene Targeting for the Study of Th17 Differentiation in Vitro

T helper cells that produce IL-17A, known as Th17 cells, play a critical role in immune defense and are implicated in autoimmune disorders. CD4 T cells can be stimulated with antigens and well-defined cytokine cocktails in vitro to mimic Th17 cell differentiation in vivo. Research has been conducted extensively on the Th17 differentiation regulation mechanisms using the in vitro Th17 polarization assay.
Conventional Th17 polarization methods typically involve obtaining na&#239;ve CD4 T cells from genetically modified mice to study the effects of specific genes on Th17 differentiation and function. These methods can be time-consuming and costly and may be influenced by cell-extrinsic factors from the knockout animals. Thus, a protocol using retroviral transduction of guide RNA to introduce gene knockout in CRISPR/Cas9 knockin primary mouse T cells serves as a very useful alternative approach. This paper presents a protocol to differentiate na&#239;ve primary T cells into Th17 cells following retroviral-mediated gene targeting, as well as the subsequent flow cytometry analysis methods for assaying infection and differentiation efficiency.

<meta charset="utf8"></head><body>Segmentación génica retroviral mediada por CRISPR/Cas9 para el estudio de la diferenciación de Th17 in vitro

We present a protocol for retroviral transduction of guide RNA into primary T cells from Cas9 transgenic mice, providing an efficient alternative for gene editing in studying Th17 differentiation.

Segmentación génica retroviral mediada por CRISPR/Cas9 para el estudio de la diferenciación de Th17 in vitro

T helper cells that produce IL-17A, known as Th17 cells, play a critical role in immune defense and are implicated in autoimmune disorders. CD4 T cells ...

Small RNA Transfección en células primarias Th17 humano por Next Generation electroporación

Resumen

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Protocolo optimizado para la transfección eficiente de células dendríticas, sin maduración de las células

Alta eficiencia, específica del sitio La transfección de células adherentes con siRNA uso de arrays de microelectrodos (MEA)

La preparación de cultivos primarios de células hematopoyéticas de la médula ósea murina por electroporación

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Diferenciación in vitro de linfocitos T CD4⁺ naive en linfocitos Th17 patógenos en ratón

Diferenciación in vitro de linfocitos T CD4⁺ naive en linfocitos Th17 patógenos en ratón

Diferenciación in vitro de linfocitos T CD4⁺ naive en linfocitos Th17 patógenos en ratón

Segmentación génica retroviral mediada por CRISPR/Cas9 para el estudio de la diferenciación de Th17 in vitro