ברצוננו להודות ד&quot;ר איין Drummond וד&quot;ר ולדימיר Korzh לשיתוף כליה GFP כליה מהונדס. כמו כן, ברצוננו להודות ל- NYITCOM על אספקת המשאבים הדרושים לביצוע עבודה זו. מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מענקים: K08DK082782, R03DK097443 (NIH), ומענק פיילוט HSCI (AV).

מחקר זה בוצע בהתאם להמלצות במדריך לטיפול ולשימוש בחיות מעבדה של המכונים הלאומיים לבריאות. הפרוטוקול אושר על ידי המכללה NYIT של אוסטאופתיה רפואה מוסדית טיפול בבעלי חיים ועדת השתמש (NYITCOM IACUC). כל הניתוחים ובניסויים ב- vivo בוצעו תחת הרדמה טריקאין, וכל המאמצים נעשו כדי למזער את הסבל. 1. קבלה ושמירה על עוברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השגת עוברי ידי מעבר הכליה GFP ניאון דג הזברה. הערה: דוגמאות של קווי דג הזברה שכותרתו fluorescently שכותרתו המפורטים בטבלה 1 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את העוברים ב 28.5 מעלות צלזיוס פתרון E3 במהלך 24 שעות לאחר ההפריה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות, להחליף את המדיום עם פתרון E3 המכיל 0.003% 1-phenyl-2-thiourea (PTU). הערה: PTU משמש מכיוון שהוא חוסם את השלבים התלויים בטירוזינאז במלנוגנזהולכן מונע פיגמנטציה. הנה, פתרון זה נקרא E3-PTU. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעלות את עוברי מופרות ב 28.5 מעלות צלזיוס עד שהם&gt; 6 dpf, באיזו נקודה הכליות התבגרו. הערה: מומלץ להשתמש בזחלים בחלון 7-7 dpf. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי לנתח בהגדלה 40X ומסננים פליטת הקרינה הירוקה, בחר את הזחלים עם הקרינה GFP הקרינה בכליה. </li></ol> 2. הרכבה דג הזברה עבור הדמיה חיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם photoablating העוברים לפני dpf 3, להסיר את הסיסית מכל דג הזברה שלא נגזר לפני הרכבה דג הזברה עבור הדמיה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן ידני dechorinate עם מלקחיים (המועדפת) או להשתמש בטיפול כימי עם תערובת פרוטאז. הערה: Dechorination מאפשרת את תוצאות ההדמיה הטובות ביותר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את פסולת סיסית בצלחת פטרי באמצעות פתרון E3-PTU ולמלא את המנה עם E3-PTU. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Prepaמחדש 1-2% נמוכה נקודת התכה (LMP) agarose עם 0.2 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​פתרון tricaine לעלות את דג הזברה עבור photablation הכליות והדמיה חיה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם agarose LMP כבר מוכן מראש, לחמם אותו במיקרוגל כדי להמיס אותו. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר agarose LMP מוכן, במקום צלחת פטרי 35 מ&quot;מ פלסטיק על מיקרוסקופ לנתח. מניחים זכוכית משכו בדיקה בקרבת מקום כדי לכוון כראוי את הזחלים הרדים. הערה: חשוב לעשות את זה צעד בזמן ו יש הכל במקום, כי העוברים חייבים להיות מכוונים לפני agarose מתקשה על 1-3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני העברת העובר כדי agarose, ודא agarose הוא מגניב ( כלומר על טמפרטורת הגוף). השתמש פלסטיק או פיפטה העברת זכוכית למקם את העובר לתוך מתקתק מותך agarose-tricaine פתרון. הערה: זה נעשה בגלל agarose כי הוא חם מדי יכול להיות מזיק לעובר, המוביל דום לבאו מוות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות פיפטה העברת, לצייר מחדש את העובר בפתרון agarose ומיקום העובר / זחל באמצע צלחת 35 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפיץ במהירות agarose המכיל את העובר / זחל כדי לכסות באופן שווה את החלק התחתון של צלחת 35 מ&quot;מ; את עוצמת הקול הטובה ביותר של agarose להשתמש ~ ~ 1-1.1 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בחלון זכוכית כדי לכוון את העובר במצב הטוב ביותר האפשרי עבור photablation והדמיה. הערה: סרט 1 מציג את הכיוון הטוב ביותר של העובר / זחל עבור photablation חד צדדית. שלב זה הוא הזמן הרגיש ביותר צריך להתבצע במהירות לפני agarose מתחיל ג &#39;ל, כמו כל ניסיון reorient דגים לאחר gelling מתחיל מזיק. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוריינט הזחל כך קטע כליה של עניין הוא בניצב לנתיב קרן בעוד קטע הנגדי הוא הרחק קרן הלייזר (ראה סרט 1 ). הערה: זה יכול להיות מושגת על ידי הפיכת הזחל כפי שמוצג בסרט 1 . </lI </ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר כ 15 דקות עבור agarose כדי לחזק. מכסים את צלחת פטרי כדי למזער אידוי. לאחר agarose יש solidified, העובר או הזחל מוכן photablation. </li></ol> 3. לייזר אבלציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מערכת הדמיה confocal. הערה: בעת שימוש בפלטפורמת ההדמיה הפניה (ראה טבלת החומרים), ההגדרות המומלצות כוללות הגדלה של 40X, עדשה לטבילה במים של 0.8 NA, והמראה הדיכרואי הראשון מוגדר על מנת לאפשר הן 488 &amp; 405 ננומטר תאורה של המדגם. האיתור צריך להתבצע על הערוץ הירוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המנה המכילה את דג הזברה משותקת על הבמה confocal. הערה: הליך זה מותאם במיוחד לתצורה זקופה באמצעות עדשת טבילה במים 40-60X. עם זאת, זה צריך להיות אפשרי לשנות את ההליך עבור מיקרוסקופ הפוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתצורה זקוף, למקם את צלחת פטרי המכיל את העובר על גבי מיקרוסקופשקופית ope ולשמור אותו במקום באמצעות חימר דוגמנות ( למשל, plasticine). מקמו את שקופית הזכוכית עם צלחת פטרי על הבמה של המיקרוסקופ confocal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 מ&quot;ל של פתרון הדמיה E3-PTU (ראה שלב 1.3) עם 0.2 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​tricaine. הערה: פתרון הדמיה יכול גם להוסיף מיד לפני הנחת השקופית על הבמה. תוספת של פתרון הדמיה צריך להיעשות בזהירות רבה כדי למנוע agarose מרחף את התחתית של המנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור לעדשת הטבילה במים (40 או 60X). לאט לאט להעלות את הבמה, ולוודא כי העדשה זווית מעט כדי למנוע את האוויר מלהיות לכודים בנתיב הקורה. כאשר העדשה נוגעת בפתרון בזווית, מרכז אותו כך שהוא נמצא בשדה הראייה של העוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא את הקטע של עניין באמצעות מקור אור פלואורסצנטי. מיקום שטחי של הענף המיועד לפגיעה כדי למזער את פיזור האור (ראה סרט 1 ). הערה: לאחר מכןT לעשות שימוש בתוכנות הפניה (ראה טבלה של חומרים), אבל הנוהל יכול להיות מותאם בקלות פלטפורמות אחרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את התוכנה. נווט אל &quot;הצג&quot; | &quot;בקרת רכש&quot; | &quot;C2plus קומפקט GUI&quot; ולהגדיר &quot;לשכון זמן פיקסל&quot; ל &quot;1.9 μs&quot;, &quot;גודל מסגרת&quot; ל &quot;512 x 512 פיקסלים&quot;, ו &quot;גודל חריר&quot; ל &quot;90 מיקרומטר&quot;. הגדר &quot;405 ננומטר (או 408 ננומטר במערכות מסוימות) עוצמת לייזר&quot; לאפס ו &quot;488 עוצמת לייזר&quot; ל &quot;נמוך&quot; (רצוי &lt;1%). להתאים את &quot;רווח&quot; כדי להשיג טווח דינמי טוב אבל לא להרוות את האות. הערה: ערכים אלה אינם קריטיים והם משמשים לעקביות. כאשר לייזר 405 ננומטר משמש, זה יגרום לעלייה הקרינה GFP. כדי למנוע את הרוויה של האות במהלך photobleaching (שלב 3.11), ערך רווח האות צריך להיות scaled למטה על הערוץ הירוק. הערוץ כחול הערוץ יכול להיות נשאר באפס, כפי שהוא אינו משמש עבור saדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;סרוק&quot; בממשק התוכנה כדי לסרוק את הכליה באמצעות לייזר 488 ננומטר. מצא את הקטע של עניין כי הוא מאונך לנתיב קרן וזה היטב visualized, עם הקרינה טוב GFP. לאחר אזור זה זוהה, לצייר אזור של עניין באמצעות אזור אליפטי של ריבית (ROI). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נווט אל &quot;החזר ROI&quot; &quot;צייר ROI אליפטית.&quot; הערה: זה ישמש ברציפות למדוד את עוצמת ה- GFP הממוצע בזמן photobleaching מתרחש, המאפשר ניהול של מנה מדויקת של טיפול בלייזר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נווט אל &quot;הצג&quot; | &quot;בקרות רכישה&quot; | &quot;C2plus Scan Area&quot; ובחר &quot;Band Scan Area&quot;. המסכה המלבנית תופיע בתוך ממשק זה. באופן ידני להגדיר חלון סריקה מלבני באמצעות הסמן ( כלומר גרור, לשנות גודל, ולהפוך את המסכה) כדי לכסות את הפלח ממוקד לייזר אבלציה. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני בתוךאזור המסכה כדי לקבל את הבחירה. הערה: רק האזור הנבחר יסרוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל את המדידה בזמן ניטור הערוץ הירוק באמצעות רק 488 ננומטר לייזר להפעיל GFP. ודא כי עוצמת הלייזר 488 הוא נמוך יחסית (~ 1%). למדוד את עוצמת הממוצע של ה- GFP באזור של עניין על ידי בחירת &quot;מדוד&quot; | &quot;מדידת זמן&quot;. השתמש בכרטיסיות &quot;גרף&quot; או &quot;נתונים&quot; כדי לעקוב אחר ערכי העוצמה הממוצעת בתוך החזר ה- ROI. הערה: שיעור הרכישה מוגדר על ידי זמן לשכון פיקסל וגודל החלון המלבני שנקבע בשלב 3.9, אבל באופן כללי, זה מאפשר ניטור מהיר של האות (~ 2-10 מסגרות / ים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרום נזק לתאי הכליה עם לייזר סגול (405 ננומטר) על ידי הגדלת עוצמת 100% על ידי הזזה של &quot;כוח לייזר&quot; שליטה כל הדרך ימינה. לייזר 488 ננומטר יכול להישאר פעיל אם עוצמת נמוכה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב לקו gRaph באמצעות הכרטיסייה &quot;גרף&quot; או את הערכים המספריים של עוצמת ה- GFP באמצעות הכרטיסייה &quot;נתונים&quot; ולחכות עד טיפות לרמה הרצויה, למשל 50% של הבסיס (כפי שמוצג בתרשים 1 ). הערה: נעשה שימוש בלייזר 20 מגה-וולט כחלק מיחידת הלייזר שאליה מתייחסת (ראה טבלת החומרים ); העוצמה המקסימלית עשויה להשתנות בין מערכות. בעצימות נמוכה ניתן לפצות על ידי חשיפה ארוכה יותר ( כלומר באמצעות הלבנת GFP אחוזים כאמצעי החשיפה הכוללת). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר עוצמת ה- GFP בתוך ההחזר על ההשקעה אליפטי (שלב 3.8) ירד לרמה הרצויה, מיד להפחית את עוצמת הסגול (405 ננומטר) לייזר ל &quot;0&quot; על ידי הזזת המחוון &quot;לייזר כוח&quot; כל הדרך שמאלה ב לוח הבקרה של התוכנה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השגת בסיס חדש של הקרינה GFP. לאשר את אבלציה על ידי קבלת יחס של X / Y. הערה: ראה איור1B; Y = האינטנסיביות הממוצעת לפני האבלציה ו- X = האינטנסיביות הממוצעת לאחר האבלציה, תוך שימוש בממוצע של 4 דגימות עוקבות בתוך החזר ה- ROI. יחס היעד המדויק (50%, 60% וכו &#39; ) תלוי בכמות הפגיעה הרצויה לניסוי נתון. </li></ol></li></ol> 4. זמן לשגות מיקרוסקופית עם מכתים יודיד Propidium <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל שיקולים כללי זמן לשגות (שתוארו במחקר קודם 15 ) כדי לדמיין מכתים propidium יודיד כקורלציה של פגיעה בתאי כליות לאחר photoablation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום לדגור את הזחלים ב 30 מיקרומטר propidium iodide פתרון (1% DMSO ב E3-PTU) במשך 3 שעות לפני הטבעה ו photoablation, כמתואר בשלבים 2 ו 3.7, בהתאמה. הערה: אין propidium יודיד נוסף נדרש agarose או פתרון הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעורר פגיעה בכליות קטועי, כפי שמתואר בשלבים 3.1-3.12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג זמן לשגות ערימות תמונה, כמו descriבמיטה במחקר קודם 14 , באמצעות לייזר 488 ננומטר (GFP) ו 461 ננומטר לייזר (Propidium יודיד, PI). הערה: שני הצבעים הם על גבי ערימות confocal לקשר את היעלמותו של ה- GFP ואת המראה של מכתים יודיד propidium. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת הפרמטרים להשגת ערימת זמן לשגות התמונה כדלקמן: עובי פרוסה וירטואלית = 4 מיקרומטר, z- מחסנית מרווח = 2 מיקרומטר, פיקסל לשכון זמן = 1.9 μs, ממדי תמונה = 512 x 512, ו ממוצעים = 2. הערה: פרמטרים אלה מאפשרים רציף, 10-15 דקות הקלטה של ​​עד 4 הזחלים ולוודא שיש photobleaching מינימלי של המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנת הדמיה תואם עם פורמט קובץ ההקלטה כדי לדמיין ולנתח את הנתונים. </li></ol>

<ol>
	<li>Chertow, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Kidney+Injury,+Mortality,+Length+of+Stay,+And+Costs+In+Hospitalized+Patients.">Acute Kidney Injury, Mortality, Length of Stay, And Costs In Hospitalized Patients.</a> J Am Soc Nephrol. 16 (11), 3365-3370 (2005).</li><li>Yasuda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+And+Clinical+Outcomes+of+Acute+Kidney+Injury+Requiring+Renal+Replacement+Therapy+In+Japan.">Incidence And Clinical Outcomes of Acute Kidney Injury Requiring Renal Replacement Therapy In Japan.</a> Ther Apher Dial. 14 (6), 541-546 (2010).</li><li>Waikar, S. S., Liu, K. D., Chertow, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis,+Epidemiology+And+Outcomes+of+Acute+Kidney+Injury.">Diagnosis, Epidemiology And Outcomes of Acute Kidney Injury.</a> Clin J Am Soc Nephrol. 3 (3), 844-861 (2008).</li><li>Lameire, N., Van Biesen, W., Vanholder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Kidney+Injury.">Acute Kidney Injury.</a> The Lancet. 372 (9653), 1863-1865 (2008).</li><li>Esson, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+And+Treatment+of+Acute+Tubular+Necrosis.">Diagnosis And Treatment of Acute Tubular Necrosis.</a> Ann Intern Med. 137 (9), 744 (2002).</li><li>Vaidya, V. S., Ferguson, M. A., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarkers+of+Acute+Kidney+Injury.">Biomarkers of Acute Kidney Injury.</a> Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 48 (1), 463-493 (2008).</li><li>Hentschel, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Renal+Failure+In+Zebrafish:+A+Novel+System+To+Study+A+Complex+Disease.">Acute Renal Failure In Zebrafish: A Novel System To Study A Complex Disease.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 288 (5), F923-F929 (2005).</li><li>Cianciolo Cosentino, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+Microinjections+of+Zebrafish+Larvae+To+Study+Acute+Kidney+Injury.">Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae To Study Acute Kidney Injury.</a> J Vis Exp. (42), (2010).</li><li>Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Ablation+of+The+Zebrafish+Pronephros+To+Study+Renal+Epithelial+Regeneration.">Laser Ablation of The Zebrafish Pronephros To Study Renal Epithelial Regeneration.</a> J Vis Exp. (54), (2011).</li><li>Drummond, I. A., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Kidney+Development.">Zebrafish Kidney Development.</a> Methods Cell Biol. , 233-260 (2010).</li><li>Toback, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+After+Acute+Tubular+Necrosis.">Regeneration After Acute Tubular Necrosis.</a> Kidney Int. 41 (1), 226-246 (1992).</li><li>Witzgall, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+Proliferating+Cell+Nuclear+Antigen,+Vimentin,+C-Fos,+And+Clusterin+In+The+Postischemic+Kidney.+Evidence+For+A+Heterogenous+Genetic+Response+Among+Nephron+Segments,+And+A+Large+Pool+of+Mitotically+Active+And+Dedifferentiated+Cells.">Localization of Proliferating Cell Nuclear Antigen, Vimentin, C-Fos, And Clusterin In The Postischemic Kidney. Evidence For A Heterogenous Genetic Response Among Nephron Segments, And A Large Pool of Mitotically Active And Dedifferentiated Cells.</a> J Clin Invest. 93 (5), 2175-2188 (1994).</li><li>Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedifferentiation+And+Proliferation+of+Surviving+Epithelial+Cells+In+Acute+Renal+Failure.">Dedifferentiation And Proliferation of Surviving Epithelial Cells In Acute Renal Failure.</a> J Am Soc Nephrol. 14 (90001), (2003).</li><li>Palmyre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+Epithelial+Migration+Drives+Kidney+Repair+After+Acute+Injury.">Collective Epithelial Migration Drives Kidney Repair After Acute Injury.</a> PLoS ONE. 9 (7), e101304 (2014).</li><li>Vasilyev, A., Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+Kidney+Development+In+Zebrafish.">Live Imaging Kidney Development In Zebrafish.</a> Methods Mol Biol. , 55-70 (2012).</li><li>Korzh, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Compound+Transgenic+Zebrafish+In+Development:+A+Tale+of+Green+Fluorescent+Protein+And+Killerred+.">Visualizing Compound Transgenic Zebrafish In Development: A Tale of Green Fluorescent Protein And Killerred .</a> Zebrafish. 8 (1), 23-29 (2011).</li><li>Bollig, F., Mehringer, R., Perner, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+comparative+expression+analysis+of+a+second+wt1+gene+in+zebrafish.">Identification and comparative expression analysis of a second wt1 gene in zebrafish.</a> Dev Dyn. 235 (2), 554-561 (2006).</li><li>Liu, Y., Pathak, N., Kramer-Zucker, A., Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+controls+the+differentiation+of+transporting+epithelia+and+multiciliated+cells+in+the+zebrafish+pronephros.">Notch signaling controls the differentiation of transporting epithelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros.</a> Development. 134 (6), 1111-1122 (2007).</li><li>Diep, C. Q., Ma, D., Deo, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+adult+nephron+progenitors+capable+of+kidney+regeneration+in+zebrafish.">Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish.</a> Nature. 470 (7332), 95-100 (2011).</li><li>Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mesonephric+development+and+regeneration+using+transgenic+zebra+fish.">Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebra fish.</a> Am J Physiol. 299 (5), F1040-F1047 (2010).</li><li>Fisher, S., Grice, E. A., Vinton, R. M., Bessling, S. L., McCallion, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+RET+regulatory+function+from+human+to+zebrafish+without+sequence+similarity.">Conservation of RET regulatory function from human to zebrafish without sequence similarity.</a> Science. 312 (5771), 276-279 (2006).</li><li>Seiler, C., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+labeling+of+the+zebrafish+pronephric+duct+and+tubules+using+a+promoter+from+the+enpep+gene.">Transgenic labeling of the zebrafish pronephric duct and tubules using a promoter from the enpep gene.</a> Gene Expr Patterns. 11, 118-121 (2011).</li><li>Lin, H. F., Traver, D., Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+thrombocyte+development+in+CD41-GFP+transgenic+zebrafish.">Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish.</a> Blood. 106 (12), 3803-3810 (2005).</li><li>Choo, B. G., Kondrichin, I., Parinov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+transgenic+Enhancer+TRAP+line+database+(ZETRAP).">Zebrafish transgenic Enhancer TRAP line database (ZETRAP).</a> BMC Dev Biol. 6 (1), 5 (2006).</li><li>Parinov, S., Kondrichin, I., Korzh, V., Emelyanov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tol2+transposon-mediated+enhancer+trap+to+identify+developmentally+regulated+zebrafish+genes+in+vivo.">Tol2 transposon-mediated enhancer trap to identify developmentally regulated zebrafish genes in vivo.</a> Dev Dyn. 231 (2), 449-459 (2004).</li></ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

יש לציין כי כוח הלייזר הכולל משתנה בין מערכות. עם זאת, באמצעות אחוזים gob photobleaching מאפשר readout של האנרגיה הכוללת נמסר כליה ניאון, עצמאית של וריאציה לייזר כוח פיצוי על ידי אורך החשיפה. יש לזכור, עם זאת, כי התגובה של רקמות שונות בשיטה זו של photoablation משתנה. גם במהלך התבגרות הכלי?...

פגיעה חריפה בכליות (AKI) , 1 , 2 , אשר גם יכול להיקרא אי ספיקת כליות חריפה, מוגדר באופן כללי כמו ליקוי פתאומי בתפקוד הכליות 3 . בעוד שרמת ההבנה של מצב זה שופרה במידה ניכרת לאורך השנים, שיעורי התחלואה והתמותה נותרו גבוהים , 1 , 2 . הטיפול הנוכחי במצב זה הוא בעיקר תומך, כמו תוצאות של ניסויים קליניים מרובים של טיפול תרופתי כבר שלילי 4 , 5 . הכליה היא ייחודית בכך שיש לה את היכולת לתקן את עצמה. לכן, טיפול תומך לאחר אבחון מוקדם של AKI הוא הדרך הטובה ביותר להגביל את התחלואה 6 . עם זאת, קשה לזהות AKI מוקדם, ושיעור התמותה הוא מדהים 50-80% עבור אלה הזקוקים לדיאליזה 5. עם היכולת של הכליות לתקן את עצמם ואת חוסר אפשרויות הטיפול עבור מצב זה, חשוב לפתח שיטות כדי לשפר את תהליך התחדשות נפרון. היו הרבה מודלים שונים המשמשים במחקר AKI הכולל סוכנים שונים של פגיעה ומודלים של בעלי חיים. במונחים של סוכנים של נזק לכליות, aminoglycoside גנטמיצין אנטיביוטי שימש כסוכן nephrotoxic שמוביל AKI 7 , 8 . עם זאת, מספר קבוצות מצאו כי טיפול גנטמיצין הוא קטלני העובר דג הזברה 9 . זה גורם נזק צינורי כי הוא רציני מדי עבור התאוששות העובר, מה שהופך את המחקר של התחדשות קשה ללא סוג כלשהו של התערבות. מודלים יונקים, כמו העכבר חולדה, נחשבים גם בעלי ערך, אבל הם עומדים בפני מגבלות רבות במהלך המחקר של AKI. אולי החיסרון העיקרי של מודלים מכרסמים הוא הקושי visuaLizing את הכליה מכרסם ובכך לקבוע את התהליכים spatiotemporal מדויק המוביל מוות ותיקון אפיתל. Johnson et al. דיווחו לייזר לייזר טכניקה מבוססת כדי לגרום פגיעה בכליות חריפה של דג הזברה עובריים 9 הזחל. הם השתמשו אבלציה לייזר פעמו לפגוע בכליה לאחר הזרקת שריר עם הצמד דקסטרן. הקרינה מן מצמידים dextran מאפשר הדמיה של נזק התחדשות אפיתל 9 אבובית. מודל זה מתגבר על שתי המגבלות שהוזכרו לעיל, אך הוא אינו מאפשר רמות מוגדרות של פגיעה וקשה לבצע על קבוצות תאים שרירותיות גדולות. החדש לייזר אבלציה מבוסס מודל דג הזברה של AKI המתואר כאן כתובות כל המגבלות לעיל. הכליה pronephric בזברה דג הזחל הוא איבר מבוגר, מתפקד המכיל קטעים דומים יונקים nePhron, כולל גלומרולוס, tubules פרוקסימלי ודיסטלי, וכן צינור איסוף 10 . הזחלים דג הזברה הם גם שקופים אופטית, מה שהופך אותו ריאלי לצפות בכליות באמצעות טכניקות הקרינה. לכן, דג הזברה הם בעלי ערך במודל vivo של AKI, ואת הכליה pronephric הזחל (5-12 ימים לאחר הפריה (dpf)) ניתן להשתמש כדי ללמוד את התהליכים הסלולר המולקולרי מעורב פגיעה בכליות ותיקון. מאמר זה מציג שיטה שבאמצעותה חלבונים ספציפיים של חלבונים ירוקים (GFP) של נפרון יכולים להיות מצולמים באמצעות מערכת אנרגיית אור נמוכה (בהשוואה למערכת לייזר פולס), אור לייזר סגול (405 ננומטר). הקרינה GFP מאפשר מיקוד של קבוצה של תאים, מה שהופך את השינויים המתרחשים גלוי דרך תצפית של photobleaching GFP. בנוסף, GFP (על ידי קליטת אור סגול) משמש כיור אנרגיה כדי potentiate הפציעה GFP- להביע תאים כליות. זמן לשגות microsעותק ואז ניתן להשתמש כדי ללמוד את תהליך התיקון. מחקרים מצאו התפשטות תאים, הגירה תא, metaplasia התא 11 , 12 , 13 להיות כל התהליכים הפוטנציאליים שעשויים לשחק תפקיד חשוב לתיקון הכליות. עם זאת, את החשיבות היחסית של תהליכים אלה ואת הפרטים של גומלין שלהם היה קשה לחשוף בשל מגבלות של מודלים קיימים של AKI. באמצעות גישה חדשה זו, ניתן היה להראות כי הגירה תא ממלא תפקיד מרכזי לתיקון כליות לאחר פגיעה חריפה 14 .

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Petri Dishes, 35 x 10mm</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-103</td>
			<td>Procedural Usage: Step 2.4,2.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes, 100 x 15mm</td>
			<td>Midwest Scientific</td>
			<td>910</td>
			<td>Procedural Usage: Step 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>De-chorination forceps- Electron Microscopy Sciences Dumont Tweezers 5 Dumostar</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>50-241-57</td>
			<td>Procedural Usage: Step 2.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Transfer Pipet</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>135030</td>
			<td>Procedural Usage: Step 2.5, 3.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5040-25G</td>
			<td>Procedural Usage: Step 2.3, 3.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP165-25</td>
			<td>Procedural Usage: Step 2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulled glass probe (manufactured manually from glass capillary tubes)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>21-1640-2C</td>
			<td>Procedural Usage: Step 2.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ1270</td>
			<td>Procedural Usage: Step 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOLA Light Engine</td>
			<td>Lumencor</td>
			<td>SOLA SM-5-LCR-SB</td>
			<td>Procedural Usage: Step 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse C2 Plus Confocal Microscope System</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Procedural Usage: Step 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x E3 Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe used to generate: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl 2 , 0.33 mM MgSO 4 Procedural Step Usage: 1.2, 1.3, 2.2, 2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTU</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7629-10G</td>
			<td>Procedural Step Usage: 1.3, 2.2, 3.4, and 4.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements Software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>C2+</td>
			<td>Procedural Usage: Step 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Unit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>MLC 400</td>
			<td>Procedural Step 3.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4170-100MG</td>
			<td>Procedural Step Usage: 4.2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

precise cellular ablation approach for modeling acute kidney injury in developing zebrafish

פגיעה חריפה בכליות (AKI) היא מצב רפואי נפוץ עם שיעור תמותה גבוה. עם יכולות התיקון של הכליה, ניתן לשחזר תפקוד כליות נאות לאחר טיפול תומך. עם זאת, הבנה טובה יותר של איך המוות נפרון התא והתיקון מתרחשים ברמה התאית נדרש כדי למזער את המוות התא כדי לשפר את תהליך התחדשות. דג הזברה pronephros היא מערכת מודל טוב כדי להשיג מטרה זו משום שהיא מכילה קטעים אנטומיים הדומים נפרון יונקים. בעבר, המודל הנפוץ ביותר המשמש לחקר פגיעה בכליות בדגים היה מודל גנטמיצין פרמקולוגי. עם זאת, מודל זה אינו מאפשר שליטה מדויקת spatiotemporal של פגיעה, ולכן קשה ללמוד תהליכים תאיים ומולקולריים המעורבים תיקון כליות. כדי להתגבר על מגבלה זו, עבודה זו מציגה שיטה שבאמצעותה, בניגוד לגישה של ג&#39;נטמיצין, חלבונים מסוימים של פרוטאינים ירוקים (GFP)לחיצה על קטע נפרון יכול להיות photablated באמצעות אור לייזר סגול (405 ננומטר). זה מודל חדשני של AKI מספק יתרונות רבים כי שיטות אחרות של פציעה אפיתל חסר. היתרונות העיקריים שלו הם היכולת &quot;לחייג&quot; את רמת הפציעה ואת השליטה המדויקת spatiotemporal חזקים מודל חיות vivo . שיטה חדשה זו יש פוטנציאל לקדם באופן משמעותי את רמת ההבנה של פגיעה בכליות מנגנוני תיקון.

שים לב כי פרוטוקול זה שימש בהצלחה עם מספר קווי Ghen כליה מהונדסים, כולל ET (krt8: EGFP) sqet11-9, ET (krt8: EGFP) sqet33-d10, ו Tg (atp1a1a.4: GFP). תוצאות הדוגמה המוצגות כאן התקבלו באמצעות ET (krt8: EGFP) sqet11-9 שורה. איור 1</str...

Watch this Scientific Journal Video about Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish at JoVE.com

Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish

עבודה זו מציגה מודל חדש של vivo של פגיעה בכליות קטועי באמצעות דג הזברה הכליה GFP כליה. המודל מאפשר אינדוקציה של אבלציה ממוקד של תאים כלית אפיתל להראות את המנגנונים הסלולר של פגיעה נפרון ותיקון.

גישה אבולרית מדויק עבור דוגמנות פגיעה בכליות חריפה בפיתוח דג הזברה

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore ...

precise-cellular-ablation-approach-for-modeling-acute-kidney-injury

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.6K Views.  NYITCOM.  עבודה זו מציגה מודל חדש של vivo של פגיעה בכליות קטועי באמצעות דג הזברה הכליה GFP כליה. המודל מאפשר אינדוקציה של אבלציה ממוקד של תאים כלית אפיתל להראות את המנגנונים הסלולר של פגיעה נפרון ותיקון. 

Video: Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

התחדשות בכליות למבוגרי דג הזברה על ידי גנטמיצין מושרה פגיעה

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes. External development and optical transparency make these embryos especially amenable to microscopy, and numerous transgenic lines that label specific cell types with fluorescent proteins are available, making the zebrafish embryo an ideal system for visualizing the interaction of vascular, hematopoietic, and other cell types during injury and repair in vivo. Forward and reverse genetics in zebrafish are well developed, and pharmacological manipulation is possible. We describe a mechanical vascular injury model using micromanipulation techniques that exploits several of these features to study responses to vascular injury including hemostasis and blood vessel repair. Using a combination of video and timelapse microscopy, we demonstrate that this method of vascular injury results in measurable and reproducible responses during hemostasis and wound repair. This method provides a system for studying vascular injury and repair in detail in a whole animal model.

This article describes a method for creating a mechanical vessel injury in zebrafish embryos. This injury model provides a platform for studying hemostasis, injury-related inflammation, and wound healing in an organism ideally suited for real-time microscopy.

פגיעה כלי מכאנית בעוברי דג הזברה

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or biliary-driven liver regeneration. In hepatocyte-driven liver regeneration, regenerating hepatocytes are derived from preexisting hepatocytes, whereas, in biliary-driven regeneration, regenerating hepatocytes are derived from biliary epithelial cells (BECs). For hepatocyte-driven liver regeneration, there are excellent rodent models that have significantly contributed to the current understanding of liver regeneration. However, no such rodent model exists for biliary-driven liver regeneration. We recently reported on a zebrafish liver injury model in which BECs extensively give rise to hepatocytes upon severe hepatocyte loss. In this model, hepatocytes are specifically ablated by a pharmacogenetic means. Here we present in detail the methods to ablate hepatocytes and to analyze the BEC-driven liver regeneration process. This hepatocyte-specific ablation model can be further used to discover the underlying molecular and cellular mechanisms of biliary-driven liver regeneration. Moreover, these methods can be applied to chemical screens to identify small molecules that augment or suppress liver regeneration.

To help assess the molecular mechanisms underlying zebrafish biliary-driven liver regeneration, we established a liver injury model in which the nitroreductase-expressing hepatocytes are genetically ablated upon metronidazole treatment. In this protocol, we describe how to adeptly manipulate, monitor and analyze hepatocyte ablation and biliary-driven liver regeneration.

אבלציה Hepatocyte הספציפי בדג הזברה לחקר התחדשות כבד מונע מרה

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

טכניקה לכוון Microinjection אל פיתוח<em&gt; Xenopus</em&gt; כליה

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their abundant pluripotent stem cell population and ability to regenerate all cell and tissue types after injuries that would be catastrophic for most animals. Recently, planarians have gained popularity as a model for eye regeneration. Their ability to regenerate the entire eye (comprised of two tissue types: pigment cells and photoreceptors) allows for the dissection of the mechanisms regulating visual system regeneration. Eye ablation has several advantages over other techniques (such as decapitation or hole punch) for examining eye-specific pathways and mechanisms, the most important of which is that regeneration is largely restricted to eye tissues alone. The purpose of this video article is to demonstrate how to reliably remove the planarian optic cup without disturbing the brain or surrounding tissues. The handling of worms and maintenance of an established colony is also described. This technique uses a 31 G, 5/16-inch insulin needle to surgically scoop out the optic cup of planarians immobilized on a cold plate. This method encompasses both single and double eye ablation, with eyes regenerating within 1-2 weeks, allowing for a wide range of applications. In particular, this ablation technique can be easily combined with pharmacological and genetic (RNA interference) screens for a better understanding of regenerative mechanisms and their evolution, eye stem cells and their maintenance, and phototaxic behavioral responses and their neurological basis.

This protocol shows how to consistently excise planarian eyes (optic cups) without disturbing surrounding tissues. Using an insulin needle and syringe, either one or both eyes can be ablated to facilitate investigations into the mechanisms regulating eye regeneration, the evolution of visual regeneration, and the neural basis of light-induced behavior.

אבלציה כירורגית Assay עבור לימוד Regeneration Eye ב Planarians

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their ...

Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related morbidity and mortality and affects more than 2 million people in the United States. A better understanding of the cellular and molecular mechanisms underlying alcohol-induced liver injury is crucial for developing effective treatment for ALD. Zebrafish larvae exhibit hepatic steatosis and fibrogenesis after just 24 h of exposure to 2% ethanol, making them useful for the study of acute alcoholic liver injury. This work describes the procedure for acute ethanol treatment in zebrafish larvae and shows that it causes steatosis and swelling of the hepatic blood vessels. A detailed protocol for Hematoxylin and Eosin (H&#38;E) staining that is optimized for the histological analysis of the zebrafish larval liver, is also described. H&#38;E staining has several unique advantages over immunofluorescence, as it marks all liver cells and extracellular components simultaneously and can readily detect hepatic injury, such as steatosis and fibrosis. Given the increasing usage of zebrafish in modeling toxin and virus-induced liver injury, as well as inherited liver diseases, this protocol serves as a reference for the histological analyses performed in all these studies.

This protocol describes histological analyses of the livers from zebrafish larvae that have been treated with 2% ethanol for 24 h. Such acute ethanol treatment results in hepatic steatosis and swelling of the hepatic vasculature.

ניתוח היסטולוגית של פגיעה חריפה בכבד אלכוהול דג הזברה

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and pathological processes, such as cancer and ageing. Recently, senescence has also been implicated in tissue repair and regeneration. Therefore, it has become increasingly critical to identify senescent cells in vivo. Senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-Gal) assay is the most widely used assay to detect senescent cells both in culture and in vivo. This assay is based on the increased lysosomal contents in the senescent cells, which allows the histochemical detection of lysosomal &#946;-galactosidase activity at suboptimum pH (6 or 5.5). In comparison with other assays, such as flow cytometry, this allows the identification of senescent cells in their resident environment, which offers valuable information such as the location relating to the tissue architecture, the morphology, and the possibility of coupling with other markers via immunohistochemistry&#160;(IHC). The major limitation of the SA-&#946;-Gal assay is the requirement of fresh or frozen samples.
Here, we present a detailed protocol to understand how cellular senescence promotes cellular plasticity and tissue regeneration in vivo. We use SA-&#946;-Gal to detect senescent cells in the skeletal muscle upon injury, which is a well-established system to study tissue regeneration. Moreover, we use&#160;IHC to detect Nanog, a marker of pluripotent stem cells, in a transgenic mouse model. This protocol enables us to examine and quantify cellular senescence in the context of induced cellular plasticity and in vivo reprogramming.

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Here we present a detailed protocol to detect both senescent and pluripotent stem cells in the skeletal muscle upon injury while inducing in vivo reprogramming. This method is suitable for evaluating the role of cellular senescence during tissue regeneration and reprogramming in vivo.

הערכה של פציעה-induced הזדקנות ביולוגית, In Vivo התכנות בשריר השלד

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling processes of excitable neuronal and muscular cells and many other biological processes, such as embryonic developmental patterning. However, there is a need for in vivo electrical activity monitoring in vertebrate embryogenesis. The advances of genetically encoded fluorescent voltage indicators (GEVIs) have made it possible to provide a solution for this challenge. Here, we describe how to create a transgenic voltage indicator zebrafish using the established voltage indicator, ASAP1 (Accelerated Sensor of Action Potentials 1), as an example. The Tol2 kit and a ubiquitous zebrafish promoter, ubi, were chosen in this study. We also explain&#160;the processes of Gateway site-specific cloning, Tol2 transposon-based zebrafish transgenesis, and the imaging process for early-stage fish embryos and fish tumors using regular epifluorescent microscopes. Using this fish line, we found that there are cellular electric voltage changes during zebrafish embryogenesis, and fish larval movement. Furthermore, it was observed that in a few zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors, the tumor cells were generally polarized compared to the surrounding normal tissues.

Here, we show the process of creating a cellular electric voltage reporter zebrafish line to visualize embryonic development, movement, and fish tumor cells in vivo.

ויזואליזציה של הפעילות החשמלית הסלולר עוברי מוקדם דג זברה, גידולים

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows within roughly two weeks after injury. Furthermore, zebrafish are able to heal bone rapidly after trepanation of the skull, and repair fractures that can be easily introduced into zebrafish bony fin rays. These injury assays represent feasible experimental paradigms to test the effect of administered drugs on rapidly forming bone. Here, we describe the use of these 3 injury models and their combined use with systemic glucocorticoid treatment, which exerts bone inhibitory and immunosuppressive effects. We provide a workflow on how to prepare for immunosuppressive treatment in adult zebrafish, illustrate how to perform fin amputation, trepanation of calvarial bones, and fin fractures, and describe how the use of glucocorticoids affects both bone forming osteoblasts and cells of the monocyte/macrophage lineage as part of innate immunity in bone tissue.

Here, we describe 3 adult zebrafish injury models and their combined use with immunosuppressive drug treatment. We provide guidance on imaging of regenerating tissues and on detecting bone mineralization therein.

דג זברה בוגרת מודלים פציעה ללמוד את השפעות Prednisolone רגנרציה רקמת העצם

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...

Confocal Microscope-Based Laser Ablation and Regeneration Assay in Zebrafish Interneuromast Cells

Hair cells are mechanosensory cells that mediate the sense of hearing. These cells do not regenerate after damage in humans, but they are naturally replenished in non-mammalian vertebrates such as zebrafish. The zebrafish lateral line system is a useful model for characterizing sensory hair cell regeneration. The lateral line is comprised of hair cell-containing organs called neuromasts, which are linked together by a string of interneuromast cells (INMCs). INMCs act as progenitor cells that give rise to new neuromasts during development. INMCs can repair gaps in the lateral line system created by&#160;cell death. A method is described here for selective INMC ablation using a conventional laser-scanning confocal microscope and transgenic fish that express green fluorescent protein in INMCs. Time-lapse microscopy is then used to monitor INMC regeneration and determine the rate of gap closure. This represents an accessible protocol for cell ablation that does not require specialized equipment, such as a high-powered pulsed ultraviolet laser. The ablation protocol may serve broader interests, as it could be useful for the ablation of additional cell types, employing a tool set that is already available to many users. This technique will further enable the characterization of INMC regeneration under different conditions and from different genetic backgrounds, which will advance the understanding of sensory progenitor cell regeneration.

Laser ablation is a widely applicable technology for studying regeneration in biological systems. The presented protocol describes use of a standard laser-scanning confocal microscope for laser ablation and subsequent time-lapse imaging of regenerating interneuromast cells in the zebrafish lateral line.

מיקרוסקופ Confocal מבוסס לייזר אבלציה והתחדשות אדון בתאים Interneuromast דגי זברה

Hair cells are mechanosensory cells that mediate the sense of hearing. These cells do not regenerate after damage in humans, but they are naturally ...