Dr. Iain Drummond ve Dr. Vladimir Korzh&#39;a böbrek GFP transgenik hatlarını paylaştıkları için teşekkür ediyoruz. Ayrıca, bu çalışmayı yürütmek için gerekli kaynaklar sağladığı için NYITCOM&#39;a teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen hibe desteği ile sağlanmıştır: K08DK082782, R03DK097443 (NIH) ve HSCI Pilot Grant (AV).

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu&#39;ndaki tavsiyelere uygun olarak gerçekleştirildi. Protokol, NYIT Osteopatik Tıp Kurumu Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (NYITCOM IACUC) tarafından onaylandı. Tüm cerrahi ve in vivo deneyler tricaine anestezi altında yapıldı ve acı en aza indirmek için tüm çaba gösterildi. 1. Embriyoların Elde Edilmesi ve Bakımı <ol><li> Böbrek GFP floresan zebrabalığı geçerek embriyolar elde edin. Not: Floresan etiketli zebra balığı transgenik hatlarının örnekleri Tablo 1&#39;de listelenmiştir. </li><li> Döllenmeden 24 saat sonra embriyoları E3 çözeltisinde 28.5 ° C&#39;de tutun. </li><li> 24 saat sonra ortamı% 0.003 1-fenil-2-tiyoüre (PTU) içeren bir E3 çözeltisi ile değiştirin. NOT: PTU kullanılır, çünkü melanogenezdeki tirozinaza bağlı adımları bloke ederVe dolayısıyla pigmentlemeyi önler. Burada, bu çözüm E3-PTU olarak anılır. </li><li> Döllenmiş embriyoları,&gt; 6 dpf olana kadar 28.5 ° C&#39;de kaldırın, bu noktada böbrekler olgunlaştı. NOT: 7-9 dpf penceresinde larva kullanmak en iyisidir. </li><li> 40X büyütme ve yeşil floresan emisyon filtrelerinde floresan bir diseksiyon mikroskopu kullanarak, parlak böbrek GFP floresanslı larvaları seçin. </li></ol> 2. Canlı görüntüleme için Zebra bağı montajı <ol><li> Embriyoları 3 dpf&#39;den önce fotoablat ediyorsanız, görüntü için zebrafish&#39;i takmadan önce porsiyonu herhangi bir hamurlanmamış zebrafish&#39;ten çıkarın. <ol><li> Forseps ile elle dechorinate (tercih edilir) veya bir proteaz karışımı ile kimyasal bir işlem kullanın. NOT: Dechorination en iyi görüntüleme sonuçlarını sağlar. </li></ol></li><li> E3-PTU solüsyonunu kullanarak petri kabındaki porsiyon pisliğini durulayın ve çanağı E3-PTU ile tekrar doldurun. </li><li> PrepaYeniden% 1-2 Düşük Erime Noktası (LMP) agarozu, 0.2 mg / mL tricaine solüsyonu ile zebrafish&#39;i böbrek fotoablaksiyonu ve canlı görüntüleme için monte edin. <ol><li> LMP agaroz önceden hazırlanmışsa, eritmek için mikrodalga fırında yeniden ısıtın. </li></ol></li><li> LMP agaroz hazırlandıktan sonra, bir diseksiyon mikroskop 35 mm plastik petri kabı yerleştirin. Anestezi uygulanmış larvaları düzgün şekilde yönlendirmek için çekilmiş bir cam probu yerleştirin. NOT: Bu adımı zamanında yapmak ve her şeyi yerine getirmek önemlidir çünkü agaroz yaklaşık 1-3 dakika içinde katılaşmadan önce yönlendirilmelidir. </li><li> Embriyonun agaroza aktarılmasından önce, agarozun serin olduğundan ( örn . Vücut sıcaklığının yaklaşık olduğu) emin olun. Embriyo soğutulmuş eritilmiş agaroz-tricaine çözeltisine yerleştirmek için bir plastik veya cam transfer pipeti kullanın. NOT: Bu, çok sıcak olan agarozun embriyoya zararlı olabileceği, çünkü kardiyak arreste yol açtığı için yapılır.Veya ölüm </li><li> Bir transfer pipet kullanarak, agaroz çözüm embriyo yeniden çizin ve embriyo / larva 35 mm çanağın ortasında konumlandırın. </li><li> 35 mm çanağın tabanını eşit olarak örtmek için embriyo / larva içeren agarozu hızla yaymak; Agarozun en iyi hacmi ~ 1-1.1 mL&#39;dir. </li><li> Embriyonun foto-ablaj ve görüntüleme için mümkün olan en iyi konuma yönlendirilmesi için cam probu kullanın. NOT: Film 1, tek taraflı fotoablasyon için embriyo / larva&#39;nın en iyi yönlendirmesini gösterir. Bu adım en çok zamana duyarlıdır ve agaroz jöle başlamadan önce çabucak yapılmalıdır, çünkü jöleleme başladıktan sonra balıkların yönünü değiştirmek için herhangi bir girişim zararlıdır. <ol><li> Karşı taraf segment lazer ışınından uzakta iken, ilgi çeken böbrek segmenti ışın yoluna dik olacak şekilde larvaları yönlendirin (bkz. Film 1 ). NOT: Bu, larvaları Film 1&#39;de gösterildiği gibi çevirerek elde edilebilir. </li&gt; </ol></li><li> Agarozun katılaşması için yaklaşık 15 dakika bekleyin. Buharlaşmayı en aza indirgemek için petri kabını örtün. Agaroz katılaştıktan sonra embriyo veya larva fotoablasyona hazırdır. </li></ol> 3. Lazer Ablasyon <ol><li> Konfokal görüntüleme sistemini çalıştırın. NOT: Referans görüntüleme platformunu kullanırken (materyal tablosuna bakın), 40X büyütme, 0.8 NA su daldırma lensi ve ilk dikroik ayna hem numunenin hem 488 hem de 405 nm aydınlatmasına izin vermek için ayarlanır. Algılama yeşil kanal üzerinde gerçekleştirilmelidir. </li><li> Hareketsizleştirilmiş zebra balığı içeren çanağı konfokal bir aşamaya yerleştirin. NOT: Bu prosedür, 40-60X su daldırma lensi kullanarak dikey konfigürasyon için optimize edilmiştir. Bununla birlikte, ters çevrilmiş mikroskop için prosedürü değiştirmek mümkün olmalıdır. </li><li> Dik konfigürasyonda, embriyo içeren petri kabını bir mikroskobunun üzerine yerleştirinKaymayı önleyin ve modelleme kili ( ör. Plastik bez) kullanarak yerine tutun. Koniokal mikroskop sahnesine petri ile cam slayt konumlandırın. </li><li> 0.2 mg / mL tricaine ile 3 mL görüntüleme çözeltisi E3-PTU (bkz. Adım 1.3) ekleyin. NOT: Görüntü çözümü, sahneye slayt yerleştirmeden hemen önce eklenebilir. Görüntüleme çözeltisinin eklenmesi, agarozun tabağın tabanından yüzmesini önlemek için çok dikkatli yapılmalıdır. </li><li> Su daldırma lensine (40 veya 60X) geçin. Havanın kiriş yolunda sıkışıp kalmasını önlemek için merceğin hafifçe açılı olduğundan emin olun ve sahneyi yavaşça kaldırın. Objektif çözeltiye bir açıyla dokunduktan sonra onu embriyonların görüş alanına yerleştirin. </li><li> Floresan ışık kaynağını kullanarak ilgi segmentini bulun. Işık saçılmasını en aza indirgemek için yaralanmaya neden olan dalın yüzeysel olarak konumlandırılması (bkz. Film 1 ). NOT: SubsequenT basamakları, başvurulan yazılımı kullanmaktadır (bkz. Malzeme Tablosu), ancak prosedür diğer platformlara kolayca adapte edilebilir. </li><li> Yazılımı açın. &quot;Görünüm&quot; e gidin | &quot;Satın Alma Kontrolü&quot; | &quot;C2plus Compact GUI&quot; ve &quot;piksel bekleme süresi&quot; &#39;ye &quot;1.9 μs&quot;, &quot;çerçeve boyutu&quot; &quot;512 x 512 piksel&quot; ve &quot;iğne deliği boyutu&quot; &quot;90 μm&quot; olarak ayarlayın. &quot;405 nm (veya bazı sistemlerde 408 nm) lazer yoğunluğunu&quot; sıfır ve &quot;488 lazer yoğunluğunu&quot; &quot;düşük&quot; (tercihen &lt;% 1) olarak ayarlayın. İyi bir dinamik aralık elde etmek için &quot;kazancı&quot; ayarlayın, ancak sinyali doyurmayın. NOT: Bu değerler kritik değildir ve tutarlılık için kullanılırlar. 405 nm lazer kullanıldığında, GFP floresansında artışa neden olur. Fotobloklama (adım 3.11) sırasında sinyalin doygunluğunu önlemek için, sinyal kazancı değeri yeşil kanal üzerinde ölçeklendirilmelidir. Mavi kanal kazancı sıfırda kalabilir, çünkü sa için kullanılmaz.mpling. </li><li> 488 nm lazer kullanarak böbrek taraması için yazılım arabirimindeki &quot;Tarama&quot; yı tıklayın. Kiriş yoluna dik olan ve iyi GFP flüoresansı ile iyi görüntülenen ilgi segmentini bulun. Bu bölge belirlendikten sonra eliptik bir Bölge (ROI) kullanarak bir ilgi bölgesi çizin. <ol><li> &quot;ROI&quot; &#39;ya gidin | &quot;Eliptik ROI çizin.&quot; NOT: Bu, photobleaching gerçekleşirken, ortalama bir GFP yoğunluğunu sürekli olarak ölçmek için kullanılacak ve hassas bir lazer uygulaması dozuna izin verecektir. </li></ol></li><li> &quot;Görünüm&quot; e gidin | &quot;Satınalma denetimleri&quot; | &quot;C2plus Tarama Alanı&quot; nı seçin ve &quot;Bant Tarama Alanı&quot; nı seçin. Dikdörtgen maskesi bu arayüzde görünecektir. İmleci kullanarak lazer ablasyon için hedeflenen segmenti kapsayacak şekilde dikdörtgen bir tarama penceresi manuel olarak tanımlayın ( örn . Sürükleyin, yeniden boyutlandırın ve maskeyi döndürün). Içindeki sağ tıklayınSeçimi kabul etmek için maske alanı. NOT: Yalnızca seçilen bölge taranacaktır. </li><li> GFP&#39;yi etkinleştirmek için sadece 488 nm lazer kullanarak yeşil kanalı izlerken zaman ölçümünü başlatın. 488 lazerin yoğunluğunun nispeten düşük (~% 1) olduğundan emin olun. &quot;Ölçü&quot; yi seçerek ilgi bölgesinde GFP&#39;nin ortalama yoğunluğunu ölçün | &quot;Zaman Ölçümü&quot; ROI içindeki ortalama yoğunluk değerlerini izlemek için &quot;Grafik&quot; veya &quot;Veri&quot; sekmelerini kullanın. NOT: Toplama oranı piksel durma zamanı ve adım 3.9&#39;da ayarlanan dikdörtgen pencerenin boyutu tarafından tanımlanır, ancak genel olarak sinyalin hızlı izlenmesine (~ 2-10 kare / sn) izin verir. </li><li> &quot;Lazer gücü&quot; kontrolünü sağa kaydırarak yoğunluğu% 100 arttırarak mor lazerle (405 nm) böbrek hücrelerine hasar verin. 488 nm lazer, yoğunluk düşükse aktif kalabilir. <ol><li> Bir çizgiye dikkat et&quot;Grafikler&quot; sekmesini veya &quot;Veri&quot; sekmesini kullanarak GFP yoğunluğunun sayısal değerlerini kullanarak işaretleyin ve başlangıç ​​seviyesinin% 50&#39;si gibi istenen bir seviyeye düşene kadar bekleyin ( Şekil 1&#39;de gösterildiği gibi). NOT: Referans lazer ünitesinin bir parçası olarak 20 mW lazer kullanılmıştır (Malzeme Tablosuna bakınız ); Sistemler arasında maksimum yoğunluk farklılık gösterebilir. Daha düşük yoğunluk, daha uzun maruz kalma ile telafi edilebilir ( diğer bir deyişle , toplam maruz kalmanın bir ölçüsü olarak yüzde GFP ağartma kullanılarak). </li></ol></li><li> Eliptik ROI (adım 3.8) içindeki GFP yoğunluğu istenen seviyeye düştükten sonra &quot;lazer gücü&quot; kaydırıcıyı sola doğru kaydırarak hemen mor (405 nm) lazer yoğunluğunu &quot;0&quot; a düşürün Yazılım kontrol paneli. <ol><li> Yeni bir GFP floresan tabanını elde edin. Ablasyonun, X / Y oranını elde ederek onaylayın. NOT: Bkz. Şekil1B; Y = ROI içindeki ortalama 4 ardışık örneği kullanarak ablasyon öncesi ortalama yoğunluk ve ablasyon sonrası ortalama yoğunluk X =. Tam hedef oranı (% 50,% 60, vb .) Belirli bir deney için istenen yaralanma miktarına bağlıdır. </li></ol></li></ol> 4. Propidyum İyodür Boyamalı Zaman Aşımlı Mikroskopi <ol><li> Fotovlasyon sonrası böbrek hücre hasarının bir korelasyonu olarak propidyum iyodür boyasını görselleştirmek için genel zaman kaybı konuları (önceki bir çalışmada 15&#39;te özetlenmiştir) uygulayın. </li><li> Sırasıyla adım 2 ve 3.7&#39;de açıklandığı üzere, embriple ve fotoablatasyondan önce 3 saat boyunca larvaları 30 uM propidyum iyodür solüsyonunda (E3-PTU&#39;da% 1 DMSO) önceden inkübe edin. NOT: Agaroz veya görüntüleme çözeltisinde ilave propidyum iyodür gerekli değildir. </li><li> Adımlar 3.1-3.12&#39;de açıklandığı gibi segmental böbrek yaralanmasına neden olun. </li><li> Zaman atlamalı resim yığınlarını, açıklandığı gibi elde edin488 nm lazer (GFP) ve 461 nm lazer (Propidium Iodide, PI) kullanılarak önceki bir çalışmada yatağa yatırıldı. NOT: İki renk, GFP&#39;nin kaybolması ve propidyum iyodür boyamanın görünüşüyle ​​bağlantılı olarak konfokal yığınlara bindirilir. </li><li> Zaman atlamalı resim yığınlarını elde etmek için parametreleri şu şekilde ayarlayın: sanal dilim kalınlığı = 4 μm, z-yığın aralığı = 2 μm, piksel bekleme süresi = 1.9 μs, görüntü boyutları = 512 x 512 ve ortalama = 2. NOT: Bu parametreler, 4 larvaya kadar 10 ila 15 dakikalık aralıklarla kayıt yapmayı ve numunenin minimum fotoblokajının yapılmasını sağlar. </li><li> Verileri görselleştirmek ve analiz etmek için kayıt dosyası formatı ile uyumlu görüntüleme yazılımını kullanın. </li></ol>

<ol>
	<li>Chertow, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Kidney+Injury,+Mortality,+Length+of+Stay,+And+Costs+In+Hospitalized+Patients.">Acute Kidney Injury, Mortality, Length of Stay, And Costs In Hospitalized Patients.</a> J Am Soc Nephrol. 16 (11), 3365-3370 (2005).</li><li>Yasuda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+And+Clinical+Outcomes+of+Acute+Kidney+Injury+Requiring+Renal+Replacement+Therapy+In+Japan.">Incidence And Clinical Outcomes of Acute Kidney Injury Requiring Renal Replacement Therapy In Japan.</a> Ther Apher Dial. 14 (6), 541-546 (2010).</li><li>Waikar, S. S., Liu, K. D., Chertow, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis,+Epidemiology+And+Outcomes+of+Acute+Kidney+Injury.">Diagnosis, Epidemiology And Outcomes of Acute Kidney Injury.</a> Clin J Am Soc Nephrol. 3 (3), 844-861 (2008).</li><li>Lameire, N., Van Biesen, W., Vanholder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Kidney+Injury.">Acute Kidney Injury.</a> The Lancet. 372 (9653), 1863-1865 (2008).</li><li>Esson, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+And+Treatment+of+Acute+Tubular+Necrosis.">Diagnosis And Treatment of Acute Tubular Necrosis.</a> Ann Intern Med. 137 (9), 744 (2002).</li><li>Vaidya, V. S., Ferguson, M. A., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarkers+of+Acute+Kidney+Injury.">Biomarkers of Acute Kidney Injury.</a> Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 48 (1), 463-493 (2008).</li><li>Hentschel, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Renal+Failure+In+Zebrafish:+A+Novel+System+To+Study+A+Complex+Disease.">Acute Renal Failure In Zebrafish: A Novel System To Study A Complex Disease.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 288 (5), F923-F929 (2005).</li><li>Cianciolo Cosentino, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+Microinjections+of+Zebrafish+Larvae+To+Study+Acute+Kidney+Injury.">Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae To Study Acute Kidney Injury.</a> J Vis Exp. (42), (2010).</li><li>Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Ablation+of+The+Zebrafish+Pronephros+To+Study+Renal+Epithelial+Regeneration.">Laser Ablation of The Zebrafish Pronephros To Study Renal Epithelial Regeneration.</a> J Vis Exp. (54), (2011).</li><li>Drummond, I. A., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Kidney+Development.">Zebrafish Kidney Development.</a> Methods Cell Biol. , 233-260 (2010).</li><li>Toback, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+After+Acute+Tubular+Necrosis.">Regeneration After Acute Tubular Necrosis.</a> Kidney Int. 41 (1), 226-246 (1992).</li><li>Witzgall, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+Proliferating+Cell+Nuclear+Antigen,+Vimentin,+C-Fos,+And+Clusterin+In+The+Postischemic+Kidney.+Evidence+For+A+Heterogenous+Genetic+Response+Among+Nephron+Segments,+And+A+Large+Pool+of+Mitotically+Active+And+Dedifferentiated+Cells.">Localization of Proliferating Cell Nuclear Antigen, Vimentin, C-Fos, And Clusterin In The Postischemic Kidney. Evidence For A Heterogenous Genetic Response Among Nephron Segments, And A Large Pool of Mitotically Active And Dedifferentiated Cells.</a> J Clin Invest. 93 (5), 2175-2188 (1994).</li><li>Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedifferentiation+And+Proliferation+of+Surviving+Epithelial+Cells+In+Acute+Renal+Failure.">Dedifferentiation And Proliferation of Surviving Epithelial Cells In Acute Renal Failure.</a> J Am Soc Nephrol. 14 (90001), (2003).</li><li>Palmyre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+Epithelial+Migration+Drives+Kidney+Repair+After+Acute+Injury.">Collective Epithelial Migration Drives Kidney Repair After Acute Injury.</a> PLoS ONE. 9 (7), e101304 (2014).</li><li>Vasilyev, A., Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+Kidney+Development+In+Zebrafish.">Live Imaging Kidney Development In Zebrafish.</a> Methods Mol Biol. , 55-70 (2012).</li><li>Korzh, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Compound+Transgenic+Zebrafish+In+Development:+A+Tale+of+Green+Fluorescent+Protein+And+Killerred+.">Visualizing Compound Transgenic Zebrafish In Development: A Tale of Green Fluorescent Protein And Killerred .</a> Zebrafish. 8 (1), 23-29 (2011).</li><li>Bollig, F., Mehringer, R., Perner, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+comparative+expression+analysis+of+a+second+wt1+gene+in+zebrafish.">Identification and comparative expression analysis of a second wt1 gene in zebrafish.</a> Dev Dyn. 235 (2), 554-561 (2006).</li><li>Liu, Y., Pathak, N., Kramer-Zucker, A., Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+controls+the+differentiation+of+transporting+epithelia+and+multiciliated+cells+in+the+zebrafish+pronephros.">Notch signaling controls the differentiation of transporting epithelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros.</a> Development. 134 (6), 1111-1122 (2007).</li><li>Diep, C. Q., Ma, D., Deo, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+adult+nephron+progenitors+capable+of+kidney+regeneration+in+zebrafish.">Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish.</a> Nature. 470 (7332), 95-100 (2011).</li><li>Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mesonephric+development+and+regeneration+using+transgenic+zebra+fish.">Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebra fish.</a> Am J Physiol. 299 (5), F1040-F1047 (2010).</li><li>Fisher, S., Grice, E. A., Vinton, R. M., Bessling, S. L., McCallion, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+RET+regulatory+function+from+human+to+zebrafish+without+sequence+similarity.">Conservation of RET regulatory function from human to zebrafish without sequence similarity.</a> Science. 312 (5771), 276-279 (2006).</li><li>Seiler, C., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+labeling+of+the+zebrafish+pronephric+duct+and+tubules+using+a+promoter+from+the+enpep+gene.">Transgenic labeling of the zebrafish pronephric duct and tubules using a promoter from the enpep gene.</a> Gene Expr Patterns. 11, 118-121 (2011).</li><li>Lin, H. F., Traver, D., Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+thrombocyte+development+in+CD41-GFP+transgenic+zebrafish.">Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish.</a> Blood. 106 (12), 3803-3810 (2005).</li><li>Choo, B. G., Kondrichin, I., Parinov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+transgenic+Enhancer+TRAP+line+database+(ZETRAP).">Zebrafish transgenic Enhancer TRAP line database (ZETRAP).</a> BMC Dev Biol. 6 (1), 5 (2006).</li><li>Parinov, S., Kondrichin, I., Korzh, V., Emelyanov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tol2+transposon-mediated+enhancer+trap+to+identify+developmentally+regulated+zebrafish+genes+in+vivo.">Tol2 transposon-mediated enhancer trap to identify developmentally regulated zebrafish genes in vivo.</a> Dev Dyn. 231 (2), 449-459 (2004).</li></ol>

Yazarlar, rekabet eden mali çıkarlarının olmadığını beyan ettiler.

Toplam lazer gücünün, sistemlere göre değiştiği unutulmamalıdır. Bununla birlikte, yüzde GFP fotobloklama kullanıldığında, floresan böbrekine gönderilen toplam enerjinin, lazer gücündeki değişimden bağımsız olarak okunması ve maruz kalma süresi boyunca telafi edilmesine izin verilmektedir. Bununla birlikte, farklı dokuların bu fotoablasyon yöntemine tepkisinin değiştiğini unutmayın. Böbrek olgunlaşması sırasında bile, genç embriyolarda olgun larvalara göre GFP floresansında% 50&#3...

Akut Böbrek Hasarı (AKI) 1 , 2 , aynı zamanda akut böbrek yetmezliği olarak da adlandırılabilir, böbrek fonksiyonunda ani bir bozukluk olarak tanımlanır 3 . Bu durumun anlaşılma düzeyi yıllar içinde kayda değer ölçüde gelişme gösterirken, morbidite ve mortalite oranları 1 , 2 gibi yüksek kalmıştır. İlaç tedavisinin çoklu klinik çalışmalarından elde edilen sonuçlar negatif 4 , 5 olduğu için, bu durum için mevcut tedavi çoğunlukla destekleyici niteliktedir. Böbrek kendine tamir etme kabiliyeti açısından eşsizdir. Bu nedenle, AKI&#39;nın erken tanısından sonra destekleyici tedavi morbiditeyi sınırlamanın en iyi yoludur 6 . Bununla birlikte, AKI&#39;nın erken tespit edilmesi zordur ve mortalite oranı diyaliz gerektirenler için% 50-80 arasında inanılmaz derecede yüksektir 5. Böbreklerin kendini onarma becerisi ve bu durum için tedavi seçenekleri bulunmaması nedeniyle, bu nefron rejenerasyon sürecini zenginleştirmek için yöntemler geliştirmek önemlidir. Farklı yaralanma ve hayvan modelleri içeren AKI araştırması için kullanılan birçok farklı model olmuştur. Böbrek hasarı ajanları açısından, aminoglikozid antibiyotik gentamisin nefrotoksik bir madde olarak kullanılır ve bu da AKI 7,8&#39;e yol açar. Bununla birlikte, birkaç grup gentamisin tedavisinin zebra balığı embriyo 9 için ölümcül olduğunu buldu. Embriyo iyileşmesi için çok ciddi boru hasarına neden olur, böylece bir yenilenme türü olmaksızın yenileme çalışmasını zorlaştırır. Fare ve fare gibi memeli modelleri de değerli sayılır, ancak AKI çalışması sırasında birçok sınırlama ile karşı karşıya kalırlar. Belki de kemirgen modellerin en büyük dezavantajı visua&#39;daki zorlukturKemirgen böbreğini hafifletir ve böylece epitel ölümüne ve onarımına yol açan spatio-temporal süreçleri belirler. Johnson ve ark. Embriyonik ve larval zebrafish 9 akut böbrek hasarını indüklemek için bir lazer ablasman tabanlı teknik bildirdiniz. Dekstran konjügatları ile intramusküler bir enjeksiyon sonrasında böbrek hasarına pulsed lazer ablasyon uyguluyorlardı. Dekstran konjügatlarından gelen flüoresans, tübül epitelinde hasarın ve rejenerasyonun görselleştirilmesine izin verir 9 . Bu model, yukarıda bahsedilen iki sınırlamanın üstesinden gelmekle birlikte, dereceli yaralanmalara izin vermez ve büyük, keyfi hücre gruplarında gerçekleştirmek zordur. Burada açıklanan yeni lazer ablasyon tabanlı zebrafish modeli, yukarıdaki tüm sınırlamaları ele almaktadır. Larval zebra biflinde pronefrik böbrek, memeli hayvanlara benzer kesimler içeren olgun, işleyen bir organtır.Bir glomerulus, proksimal ve distal tübüller ve bir toplama kanalı 10 dahil olmak üzere phron. Zebra balığı larva da optik olarak şeffaftır, böylelikle flüoresan teknikleri ile böbrek gözlemlenebilir. Dolayısıyla, zebra balığı, AKI&#39;nın in vivo bir değerli modelidir ve böbrek hasarına ve onarımına katılan hücresel ve moleküler işlemleri incelemek için larval pronefrik böbrek (5-12 gün-dölleme sonrası (dpf)) kullanılabilir. Bu makale, belirli Green Floresan Protein (GFP) ifade eden nefron bölümlerinin, düşük enerjili (darbeli bir lazer sistemi ile karşılaştırıldığında) mor renkli lazer ışığını (405 nm) kullanarak fotoablat edebildiği bir yöntem sunmaktadır. GFP floresansı, bir grup hücrenin hedeflenmesini sağlar; bu da, GFP photobleaching gözlemiyle görünür olan değişiklikleri yapar. Ek olarak, GFP (mor ışığı absorbe ederek), GFP ifade eden böbrek hücrelerindeki yaralanmayı güçlendiren bir enerji havuzu olarak görev yapmaktadır. Zaman atlamalı mikrolerOnarım işlemini incelemek için kopya kullanılabilir. Çalışmalar, hücre çoğalması, hücre göçü ve hücre metaplazisinin 11 , 12 , 13&#39;ün hepsinin böbrek tamirinde önemli bir rol oynayabilecek potansiyel süreç olduğunu bulmuştur. Bununla birlikte, mevcut AKI modellerinin sınırlamaları nedeniyle, bu süreçlerin nispi önemi ve etkileşimlerinin ayrıntılarının ortaya çıkması zor olmuştur. Bu yeni yaklaşımı kullanarak akut hasardan sonra böbrek tamirinde hücre göçünün merkezi bir rol oynadığını göstermek mümkün oldu 14 .

<table><tbody><tr><td>Petri Dishes, 35 x 10 mm</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-103</td><td>Procedural Usage: Step 2.4, 2.7</td></tr><tr><td>Petri Dishes, 100 x 15 mm</td><td>Midwest Scientific</td><td>910</td><td>Procedural Usage: Step 1</td></tr><tr><td>Dechorination forceps - Electron Microscopy Sciences Dumont Tweezers 5 Dumostar</td><td>Fischer Scientific</td><td>50-241-57</td><td>Procedural Usage: Step 2.1.1</td></tr><tr><td>Plastic Transfer Pipet</td><td>Globe Scientific</td><td>135030</td><td>Procedural Usage: Step 2.5, 3.6</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5040-25G</td><td>Procedural Usage: Step 2.3, 3.4</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP165-25</td><td>Procedural Usage: Step 2.3</td></tr><tr><td>Pulled glass probe (manufactured manually from glass capillary tubes)</td><td>Fischer Scientific</td><td>21-1640-2C</td><td>Procedural Usage: Step 2.4</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ1270</td><td>Procedural Usage: Step 1.5</td></tr><tr><td>SOLA Light Engine</td><td>Lumencor</td><td>SOLA SM-5-LCR-SB</td><td>Procedural Usage: Step 1.5</td></tr><tr><td>Eclipse C2 Plus Confocal Microscope System</td><td>Nikon</td><td></td><td>Procedural Usage: Step 3</td></tr><tr><td>1x E3 Solution</td><td></td><td></td><td>Recipe used to generate: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; , 0.33 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; Procedural Step Usage: 1.2, 1.3, 2.2, 2.3</td></tr><tr><td>PTU</td><td>Sigma</td><td>P7629-10G</td><td>Procedural Step Usage: 1.3, 2.2, 3.4, 4.2</td></tr><tr><td>NIS Elements Software</td><td>Nikon</td><td>C2+</td><td>Procedural Usage: Step 3</td></tr><tr><td>Laser Unit</td><td>Agilent</td><td>MLC 400</td><td>Procedural Step 3.11</td></tr><tr><td>Propidium Iodide (PI)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4170-100MG</td><td>Procedural Step Usage: 4.2</td></tr></tbody></table>

precise cellular ablation approach for modeling acute kidney injury in developing zebrafish

Akut Böbrek Hasarı (AKI), mortalite oranının yüksek olduğu ortak bir tıbbi durumdur. Böbreğin onarım yetenekleri ile, destekleyici tedaviden sonra yeterli böbrek fonksiyonunun sağlanması mümkündür. Bununla birlikte, nefron hücresi ölümünün ve onarımının hücre düzeyinde nasıl gerçekleştiğinin daha iyi anlaşılması, hücre ölümünü en aza indirgemek ve rejeneratif işlemi arttırmak için gereklidir. Zebrafish pronephros, memeli nefronuna benzer anatomik bölümler içerdiğinden, bu amaca ulaşmak için iyi bir model sistemdir. Daha önce, balıkta böbrek hasarını incelemek için kullanılan en yaygın model, farmakolojik gentamisin modeli idi. Bununla birlikte, bu model yaralanmanın spesifik zamansal olmayan kontrolüne izin vermemektedir ve böylelikle böbrek onarımı ile ilgili hücresel ve moleküler işlemleri incelemek zordur. Bu kısıtlılığın üstesinden gelmek için, bu çalışma, gentamisin yaklaşımının tersine, belirli bir Yeşil Fuoresent Protein (GFP) -ex&#39;inNefron kesimi, mor bir lazer ışığı (405 nm) ile fotoablat edilebilir. AKI&#39;nın bu yeni modeli, diğer epitelyal yaralanma yöntemlerinin eksik olduğu birçok avantaj sağlar. Başlıca avantajları, in vivo canlı hayvan modelinde, yaralanma seviyesini &quot;aramak&quot; ve spatio-temporal kontrolün doğru olmasıdır. Bu yeni yöntem, böbrek hasarının ve onarım mekanizmalarının anlaşılma düzeyini önemli ölçüde ilerletme potansiyeline sahiptir.

Bu protokolün ET (krt8: EGFP) sqet11-9, ET (krt8: EGFP) sqet33-d10 ve Tg&#39;yi (atp1a1a.4: GFP) içeren bir dizi böbrek GFP transgen hattı ile başarıyla kullanıldığını unutmayın. Burada gösterilen örnek sonuçlar ET (krt8: EGFP) sqet11-9 hattı kullanılarak elde edilmiştir. Şekil 1 , örnek fotoablasyon protokolünü göstermektedir. Ortalama GFP yoğunluğu ilgi bölgesi içinde ...

Watch this Scientific Journal Video about Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish at JoVE.com

Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish

Bu çalışma, böbrek GFP transgenik zebra balığı kullanılarak segmental böbrek hasarının yeni bir in vivo modeli sunmaktadır. Model böbrek epitel hücrelerinin hedeflenen ablasyonunun indüksiyonuna izin vererek nefron hasarının ve onarımının hücresel mekanizmalarını gösterir.

Zebra balığı Gelişen Akut Böbrek Hasarının Modellenmesi İçin Hassas Hücresel Ablasyon Yaklaşımı

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore ...

precise-cellular-ablation-approach-for-modeling-acute-kidney-injury

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.6K Görüntüleme.  NYITCOM.  Bu çalışma, böbrek GFP transgenik zebra balığı kullanılarak segmental böbrek hasarının yeni bir in vivo modeli sunmaktadır. Model böbrek epitel hücrelerinin hedeflenen ablasyonunun indüksiyonuna izin vererek nefron hasarının ve onarımının hücresel mekanizmalarını gösterir. 

Video: Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

Gentamisin Kaynaklı Sakatlık tarafından Yetişkin Zebra balığı Böbrek Rejenerasyon

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Gelişim Biyolojisi

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes. External development and optical transparency make these embryos especially amenable to microscopy, and numerous transgenic lines that label specific cell types with fluorescent proteins are available, making the zebrafish embryo an ideal system for visualizing the interaction of vascular, hematopoietic, and other cell types during injury and repair in vivo. Forward and reverse genetics in zebrafish are well developed, and pharmacological manipulation is possible. We describe a mechanical vascular injury model using micromanipulation techniques that exploits several of these features to study responses to vascular injury including hemostasis and blood vessel repair. Using a combination of video and timelapse microscopy, we demonstrate that this method of vascular injury results in measurable and reproducible responses during hemostasis and wound repair. This method provides a system for studying vascular injury and repair in detail in a whole animal model.

This article describes a method for creating a mechanical vessel injury in zebrafish embryos. This injury model provides a platform for studying hemostasis, injury-related inflammation, and wound healing in an organism ideally suited for real-time microscopy.

Zebra balığı Embriyolar Mekanik Gemi Sakatlık

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or biliary-driven liver regeneration. In hepatocyte-driven liver regeneration, regenerating hepatocytes are derived from preexisting hepatocytes, whereas, in biliary-driven regeneration, regenerating hepatocytes are derived from biliary epithelial cells (BECs). For hepatocyte-driven liver regeneration, there are excellent rodent models that have significantly contributed to the current understanding of liver regeneration. However, no such rodent model exists for biliary-driven liver regeneration. We recently reported on a zebrafish liver injury model in which BECs extensively give rise to hepatocytes upon severe hepatocyte loss. In this model, hepatocytes are specifically ablated by a pharmacogenetic means. Here we present in detail the methods to ablate hepatocytes and to analyze the BEC-driven liver regeneration process. This hepatocyte-specific ablation model can be further used to discover the underlying molecular and cellular mechanisms of biliary-driven liver regeneration. Moreover, these methods can be applied to chemical screens to identify small molecules that augment or suppress liver regeneration.

To help assess the molecular mechanisms underlying zebrafish biliary-driven liver regeneration, we established a liver injury model in which the nitroreductase-expressing hepatocytes are genetically ablated upon metronidazole treatment. In this protocol, we describe how to adeptly manipulate, monitor and analyze hepatocyte ablation and biliary-driven liver regeneration.

Biliyer odaklı Karaciğer Rejenerasyon Eğitim Zebra balığı hepatosite özgü Ablasyon

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

Akut Böbrek Sakatlık Eğitim Zebra balığı Larva İntravenöz Microinjections

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Biyoloji

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

Doğrudan Yetişkin Zebra balığı Böbrek Hücre Nakli

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in renal failure1. AKI can be caused by a number of factors including ischemia, drug-based toxicity, or obstructive injury1. This results in an inability to maintain fluid and electrolyte homeostasis. While AKI has been observed for decades, effective clinical therapies have yet to be developed. Intriguingly, some patients with AKI recover renal functions over time, a mysterious phenomenon that has been only rudimentally characterized1,2. Research using mammalian models of AKI has shown that ischemic or nephrotoxin-injured kidneys experience epithelial cell death in nephron tubules1,2, the functional units of the kidney that are made up of a series of specialized regions (segments) of epithelial cell types3. Within nephrons, epithelial cell death is highest in proximal tubule cells. There is evidence that suggests cell destruction is followed by dedifferentiation, proliferation, and migration of surrounding epithelial cells, which can regenerate the nephron entirely1,2. However, there are many unanswered questions about the mechanisms of renal epithelial regeneration, ranging from the signals that modulate these events to reasons for the wide variation of abilities among humans to regenerate injured kidneys.
The larval zebrafish provides an excellent model to study kidney epithelial regeneration as its pronephric kidney is comprised of nephrons that are conserved with higher vertebrates including mammals4,5. The nephrons of zebrafish larvae can be visualized with fluorescence techniques because of the relative transparency of the young zebrafish6. This provides a unique opportunity to image cell and molecular changes in real-time, in contrast to mammalian models where nephrons are inaccessible because the kidneys are structurally complex systems internalized within the animal. Recent studies have employed the aminoglycoside gentamicin as a toxic causative agent for study of AKI and subsequent renal failure: gentamicin and other antibiotics have been shown to cause AKI in humans, and researchers have formulated methods to use this agent to trigger kidney damage in zebrafish7,8. However, the effects of aminoglycoside toxicity in zebrafish larvae are catastrophic and lethal, which presents a difficulty when studying epithelial regeneration and function over time. Our method presents the use of targeted cell ablation as a novel tool for the study of epithelial injury in zebrafish. Laser ablation gives researchers the ability to induce cell death in a limited population of cells. Varying areas of cells can be targeted based on morphological location, function, or even expression of a particular cellular phenotype. Thus, laser ablation will increase the specificity of what researchers can study, and can be a powerful new approach to shed light on the mechanisms of renal epithelial regeneration. This protocol can be broadly applied to target cell populations in other organs in the zebrafish embryo to study injury and regeneration in any number of contexts of interest.

Acute kidney injury (AKI) in humans is a common clinical problem caused by damage to the epithelial cells that comprise kidney nephrons, and AKI is associated with high mortality rates of 50-70%1. Following epithelial cell destruction, nephrons have a limited ability to regenerate, though the mechanisms and limitations that guide this phenomenon remain poorly understood. In this video article, we describe our technique for targeted laser ablation of kidney nephron cells in the zebrafish embryo kidney, or pronephros. Our new method can be used to complement nephrotoxicity-induced models of AKI and gain a high-resolution understanding of the cell and molecular alterations that are associated with epithelial regeneration in the kidney nephron.

Zebra balığı Pronephros Lazer Ablasyon Böbrek Epitel Rejenerasyon Eğitim

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys are composed of functional units known as nephrons, which are highly conserved with other vertebrates, including mammals. Research in zebrafish has recently demonstrated that two distinctive phenomena transpire after adult nephrons incur damage: first, there is robust regeneration within existing nephrons that replaces the destroyed tubule epithelial cells; second, entirely new nephrons are produced from renal progenitors in a process known as neonephrogenesis. In contrast, humans and other mammals seem to have only a limited ability for nephron epithelial regeneration. To date, the mechanisms responsible for these kidney regeneration phenomena remain poorly understood. Since adult zebrafish kidneys undergo both nephron epithelial regeneration and neonephrogenesis, they provide an outstanding experimental paradigm to study these events. Further, there is a wide range of genetic and pharmacological tools available in the zebrafish model that can be used to delineate the cellular and molecular mechanisms that regulate renal regeneration. One essential aspect of such research is the evaluation of nephron structure and function. This protocol describes a set of labeling techniques that can be used to gauge renal composition and test nephron functionality in the adult zebrafish kidney. Thus, these methods are widely applicable to the future phenotypic characterization of adult zebrafish kidney injury paradigms, which include but are not limited to, nephrotoxicant exposure regimes or genetic methods of targeted cell death such as the nitroreductase mediated cell ablation technique. Further, these methods could be used to study genetic perturbations in adult kidney formation and could also be applied to assess renal status during chronic disease modeling.

The zebrafish adult kidney is an excellent system for renal regeneration and disease studies. An essential aspect of such research is the assessment of nephron structure and function. This protocol describes several methodologies that can be implemented to assess nephron tubule composition and to evaluate renal reabsorption.

Yetişkin Zebra balığı Böbrek Nefron Kompozisyon ve Fonksiyon Analizi

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

Acute Kidney Injury Model Induced by Cisplatin in Adult Zebrafish

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney due to its low molecular weight. Such accumulation causes the death of tubular cells and can induce the development of Acute Kidney Injury (AKI), which is characterized by a quick decrease in kidney function, tissue damage, and immune cells infiltration. If administered in specific doses cisplatin can be a useful tool as an AKI inducer in animal models. The zebrafish has appeared as an interesting model to study renal function, kidney regeneration, and injury, as renal structures conserve functional similarities with mammals. Adult zebrafish injected with cisplatin shows decreased survival, kidney cell death, and increased inflammation markers after 24 h post-injection (hpi). In this model, immune cells infiltration and cell death can be assessed by flow cytometry and TUNEL assay. This protocol describes the procedures to induce AKI in adult zebrafish by intraperitoneal cisplatin injection and subsequently demonstrates how to collect the renal tissue for flow cytometry processing and cell death TUNEL assay. These techniques will be useful to understand the effects of cisplatin as a nephrotoxic agent and will contribute to the expansion of AKI models in adult zebrafish. This model can also be used to study kidney regeneration, in the search for compounds that treat or prevent kidney damage and to study inflammation in AKI. Moreover, the methods used in this protocol will improve the characterization of tissue damage and inflammation, which are therapeutic targets in kidney-associated comorbidities.

This protocol describes the procedures to induce Acute Kidney Injury (AKI) in adult zebrafish using cisplatin as a nephrotoxic agent. We detailed the steps to evaluate the reproducibility of the technique and two techniques to analyze inflammation and cell death in the renal tissue, flow cytometry and TUNEL, respectively.

Yetişkin Zebra Balıklarında Cisplatin tarafından İndüklenen Akut Böbrek Yaralanması Modeli

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney ...

Tıp

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish kidney develops and functions in almost the same way as humans. A major difference in the construction of the human kidney is the presence of millions of nephrons compared to the zebrafish that has only two. However, simplifying such a complex system into basic functional units has aided our understanding of how the kidney develops and operates. In zebrafish, the midline located glomerulus is responsible for the initial blood filtration into two pronephric tubules that diverge to run bilaterally down the embryonic axis before fusing to each other at the cloaca. The pronephric tubules are heavily populated by motile cilia that facilitate the movement of filtrate along the segmented tubule, allowing the exchange of various solutes before finally exiting via the cloaca2-4. Many genes responsible for CKD, including those related to ciliogenesis, have been studied in zebrafish5. However, a major draw back has been the difficulty in evaluating zebrafish kidney function after genetic manipulation. Traditional assays to measure kidney dysfunction in humans have proved non translational to zebrafish, mainly due to their aquatic environment and small size. For example, it is not physically possible to extract blood from embryonic staged fish for analysis of urea and creatinine content, as they are too small. In addition, zebrafish do not produce enough urine for testing on a simple proteinuria &#8216;dipstick&#8217;, which is often performed during initial patient examinations. We describe a fluorescent assay that utilizes the optical transparency of the zebrafish to quantitatively monitor the clearance of a fluorescent dye, over time, from the vasculature and out through the kidney, to give a read out of renal function1,6-9.

The zebrafish is a popular tool to model chronic kidney disease (CKD). However, their small size makes it impossible to evaluate renal function using traditional methods. We describe a fluorescent dye kidney clearance assay1 that allows quantitative analysis of zebrafish kidney function in CKD.

Bir Floresan Gümrükleme Testi kullanarak Zebra balığı Böbrek Fonksiyon Değerlendirilmesi

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Zebra balığı Nephrotoxin Mikroenjeksiyon Akut Böbrek Yaralanması Model

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...