המטרה הכוללת של הליך זה, מוסבר השימוש ציספלטין כסוכן nephrotoxic בדגי זברה למבוגרים, ניתוח דלקת, ומוות תאים ברקמת הכליה. כדי להשיג את זה דג זברה למבוגרים הוא מורדם ושוקל להזריק במינון מסוים של ציספלטין בחלל הצפק. לאחר ניטור התמותה, הכליה מנותחת והתאים מבודדים עבור ציטומטריית זרימה או קבועים ומנותחים כדי להיות מנותחים על ידי מבחני TUNEL פלואורסצנטיים.
ההליכים הבאים יכולים לעזור לענות על שאלות מפתח בשדה הכלייתי באמצעות ההשפעות הנפרוטוקסיות של ציספלטין ככלי לפיתוח מודל פגיעה בכליות חריף ודגי זברה בוגרים. מודל זה יכול לשמש לחקר מטרות טיפוליות חדשות בהגנה על הכליות, כמו גם להבהיר את מנגנון ההתחדשות בכליית דג הזברה. ציספלטין הוא סוכן כימותרפי המשמש לטיפול במגוון רחב של סרטן.
עם זאת, יכול בקלות לצבור בכליה, יצירת מוות תאי, דלקת, ולהפחית את תפקוד הכליות. ההשפעה של ציספלטין תלוי מינון, כך שאתה יכול להוריד את הגידול שלנו של מינון תלוי המטרות שלך. הטכניקות המשמשות כאן לניתוח דלקת ומוות תאים אינן מיועדות אך ורק להפצת מודל המחלה.
זרימת ציטומטריה בדגי זברה יכולה לעזור להבהיר את המצבים הדלקתיים של החיה בצורה כמותית, ואילו ב- TUNEL אנו אומרים שיכולים להבהיר את נוכחותם של תאים מוקפצים בהקשרים הפיזיולוגיים והפתולוגיים. לפני תחילת הניסוי, הכינו את פתרון העבודה של ציספלטין על ידי דילול תמיסת המלאי ל-820 מיקרוגרם למיליון ב-0.9% נתרן כלורי. לאחר מכן, יש למרדים דג זברה נוסף ולייבש את עודף המים על כמה מגבות נייר.
לשקול את הדגים על ידי הצבת אותם על סולם, לשים לב למשקל. בצע את החישובים כדי לדעת את הנפח המדויק להזרקה. כדי להשיג את המינון של 120 מיקרוגרם לכל גרם של משקל, להשתמש בנוסחה הבאה.
לחלק את המנה הסופית על ידי המינון של הפתרון עובד להמיר מספר זה microliters, על ידי הכפלת עבור 1000 כדי לקבל את הנפח של 120 מיקרוגרם של ציספלטין. לאחר מכן, להכפיל את המספר הזה על ידי המשקל של הדג כדי לקבל את הנפח הסופי להיות מוזרק. מניחים דג על ספוג רטוב, עם קטנה להחזיק אותו.
עם הצד הגחוני למעלה ולמלא מזרק אינסולין עם נפח מחושב של ציספלטין. הכנס את המחט על קו האמצע הגחוני בזווית רדודה, בעדינות מושך את הקיר הגחוני למעלה, כדי למנוע לנקב איברים פנימיים. ואז להזריק את הפתרון.
לאחר ההזרקה, מניחים דג במיכל כדי להתאושש מהרדמה, ומחכים לסימני התאוששות כגון שחייה ותנועות מתאימות. לפקח על הדגים פעמיים ביום לימים הבאים. במינון זה, ציספלטין לגרום סביב 30% של תמותה על 24 השעות הראשונות.
המתת חסד לדגים ויבשו את עודף המים במגבת נייר. לאחר הסרת הראש והאיברים הפנימיים, השתמש מחטי ניתוח להצמיד את קירות הגוף. לאתר את הכליה בדופן הגב של הדג, ולהשתמש מלקחיים כדי לנתק את הכליה.
מניחים את הכליה בצלחת שש באר עם פתרון קריר של אחד 1X PBS, 2%FBS ולשמור על קרח. לאחר מכן, להרים את הרקמה עם קצת נוזל ולהעביר אותו דרך מסננת תאים 40 מיקרון, בעדינות macerate הרקמה עם בוכנה מזרק. לשטוף פעמיים עם אחד 1X PBS, 2%FBS.
ולאסוף את התאים בצינור בז 50 מיל. ואז צנטריפוגה במשך חמש דקות ב 400 G.זהירות לאסוף את supernatant עם פיפטה ולזרוק אותו. הוסף 500 מיקרוליטרים של PBS 1X קר כדי להשעות מחדש את התאים ולמקם אותם בצינור cytometry זרימה חמישה מיל.
תשאיר אותם על הקרח. קח 10 microliters של המדגם ומערבבים אותו עם 90 microliters של כחול trypan בצינור Eppendorf. מוסיפים 10 מיקרוליטרים של התערובת לתא Neobauer וסופרים תאים במיקרוסקופ.
קח את התאים להיקרא על ידי ציטומטר, ולאחר מכן לנתח את התוצאות בחירת האוכלוסייה של תחומי העניין שלך. עבור הליך זה, המתת חסד דג ולהסיר איברים פנימיים עוזב את הכליה מחובר לגוף. לאחר מכן, הצמד את קירות הגוף למשטח פקק והנח אותו על פתרון הקיבעון.
שמור את זה ארבע מעלות לילה. למחרת, לנתח את הכליה עם מלקוח דק. נסה לא לשבש את זה.
מניחים אותו בצלחת פטרי קטנה או צינור Eppendorf עם 1X PBS לשטוף. לשנות את PBS ולהכין 2%agarose כדי ליצור מטריצת תמיכה עבור הכליה לפני שהם בתהליך מוצק. השלך את כל PBS הנותרים ויוצקים את agarose לאט.
לאחר מכן, למקם את הכליה עם מלקחיים עדינים כדי למנוע ממנו לקפל. בואו agarose לחזק בטמפרטורת החדר. לאחר התגבשות agarose, להשתמש אזמל לחתוך Agarose סביב הכליות ויוצרים קוביות קטנות.
מניחים את קוביות האגורוז בתוך קלטת היסטולוגית ושולחים אותה לעיבוד היסטולוגי כדי להטמיע את הרקמה בפרפין. בלוקי הפרפין, לאחר מכן נחתוך בחמישה מקטעי עובי מיקרון. דה-שעווה שקופיות ולשמור אותם במים מזוקקים.
מכינים תא אינקובטור כהה, מניחים מגבות נייר רטובות בתחתית. מניחים את השקופיות בתא הכהה, ומוסיפים Proteinase K עבור חדירה של הרקמה. דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
בעוד דגימות הם דגירה, להכין את תערובת תגובת TUNEL, על ידי הוספת 50 microliters של פתרון אנזים על 450 microliters של פתרון תווית. ולשמור מוגן מפני אור. להרים את התא הכהה ולשטוף פרוסה פעמיים עם אחד 1X PBS.
לאחר מכן, יבש את השקופיות ועל תערובת תגובת TUNEL. ולהדגיר ב-37 מעלות צלזיוס לשעתיים. לאחר הדגירה, לשטוף שקופיות זה שוב עם אחד 1X PBS.
ולהוסיף DAPI עבור כתמי מונה גרעינים. דגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות, מוגנת מפני אור. יש לשטוף שלוש פעמים עם פי 1X PBS אחד.
ואז, לעצב את השקופיות עם מדיום הידרופילי נגד דהייה. הנח תלוש כיסוי. ולאטום עם לק.
דמיינו את הדגימות במיקרוסקופ פלואורסצנטי. בגרף זה, ניתן לראות כי ציספלטין יש השפעה תגובת מנה על הישרדות דגים, לעומת שליטה מוזרק רק עם 0.9% נתרן כלורי. הקו האדום בגרף זה מייצג מנה של 120 מיקרוגרם לגרם המשמש בסרטון זה.
מינון זה יכול להיות מיושם על זכרים ונקבות, כמו שום הבדל סטטיסטי לא נמצא ביניהם. ציטומטריית זרימה מאפשרת לכמת תאים שונים הנמצאים ברקמה. אוכלוסיות תאים hematopoietic מזוהים בכליות של מספר דגים לפי גודל או פיזור קדימה וצפיפות או פיזור גודל.
בדרך זו, ניתן להפריד בין האוכלוסיות אריתרוציטים, לימפוציטים, גרנולוציטים, ומבשרים hematopoietic. כאן, אסטרטגיית השער הנוכחית בחירת granulocytes, סינגלים ותאים חיוביים MPO לאפשר למצוא את האוכלוסייה של נויטרופילים בכליה מסומן על ידי ביטוי פלואורסצנטי של myeloperoxidase. במקרה זה, הזרקת ציספלטין גרמה לעלייה באחוז הנויטרופילים הקיימים בכליה.
מבחני TUNEL מאפשרים לזהות תאים אפופטוטיים ברקמה על ידי התבוננות בשקופית רקמה של הכליה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי, אפשר לראות אות אפופטוטי בתוך הגרעינים של תאים מסוימים, כאן באדום. בניגוד לכתם גרעיני ב-DAPI כזה כאן בכחול. הזרקת ציספלטין הגדילה את נוכחותם של תאים אפופטוטיים בכליה, אשר ניתן לכמת באופן ידני או באמצעות תוכנת תמונה.
בסוף וידאו זה אתה אמור להיות מסוגל לדעת איך להזריק ולהתאים את המינון של ציספלטין כדי לגרום לפגיעה בכליות חריפה דגים זברה למבוגרים. ואיך לנתח את הכליה למטרות שונות. Cytometry זרימה הוא כלי מצוין שיעזור לך להבין את הפרופיל של סוגי תאים שונים תלויים הזמינות של קווי tragenclave במעבדה שלך.
זכור לשקול את הצבע של קווי המשגרים אם אתה רוצה להשתמש בנוגדן כדי לתייג את כל סוגי התאים שלהם. ה- TUNEL assay הוא כלי פשוט המאפשר לנו לזהות תאים ורקמות אפופטוטיים, וניתן לנתח אותו לא רק על ידי מיקרוסקופיה, אלא גם על ידי ציטומטריית זרימה. זכור, תמיד להשתמש בציוד מגן אישי במהלך כל ההליך.
