This work was supported by NIH grant F32DK091998 to CNK; NIH grant RO1DK041071 and Harvard Stem Cell Institute grant D001229 to IAD. The authors thank Neil Hukriede for the lhx1ain situ probe.

הצהרת אתיקה:: הערה כל הניסויים נערכו בהתאם להנחיות בית החולים כלליים מסצ&#39;וסטס לשימוש בבעלי חיים במחקר. 1. הכנה מראש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע כמה מבוגרים דג הזברה ישן 6-12 חודשים כדי לפגוע. תכנית לפגוע בדגים 10-20% יותר מאשר יהיה צורך. על מנת למזער את השונות, גיל שימוש בהתאמת דגי אח שגדלו יחד באותו טנק, כך שהם בערך באותו גודל ויש לי שונות גנטיות פחות. דגי נקבה הם הרבה יותר קלים להזריק בהשוואה לדגי זכרים, בשל הקיבולת הגדולה יותר של הבטן. עם זאת, זכרים ונקבות לתת תוצאות דומות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר עושה הניסוי בפעם הראשונה, עלילה עקומת מינון כדי לקבוע את המינון המתאים לגנטמיצין זן ספציפי של דגים. לבדוק כל אצווה חדשה של גנטמיצין לפני השימוש בניסויים מאז טוהר גנטמיצין משתנה מיצוו אצווה. מינון נכון צריך להיקבע על ידי הערכת expressiעל פציעה של סמנים כגון lhx1a. (ראה איור 1 א - ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון גנטמיצין. פתרון מניות גנטמיצין עשוי להיות מאוחסן ב-20 ° C ומופשר לשימוש מאוחר יותר. לדוגמא, עבור 80 מ&quot;ג / קילוגרם מינון (80 גנטמיצין מ&quot;ג / קילוגרם ממשקל הגוף) בדגים במשקל 0.5 גרם, להכין 2 מ&quot;ג / מיליליטר של גנטמיצין בופר פוספט כפתרון נוח עבודה. זה מספק 20 μl של גנטמיצין לזריקת intraperitoneal לדגים. הערה: באופן כללי, 80-120 מ&quot;ג / קילוגרם להשיג תוצאות טובות, אך במינונים נמוכות כמו 40 מ&quot;ג / קילוגרם עשוי להיות מתאים. גנטמיצין גם ניתן לרכוש בפתרון כדי למזער את החשיפה מסוכנת לאנשי מעבדה. הערה: גנטמיצין במינונים גבוהים יכול להיות רעיל. ללבוש כפפות ומסכה כאשר משקל אבקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן של 0.016% מים tricaine 100 מיליליטר להרדמת דגים. הכן מלאי 25x של tricaine (4 g / L 1) מומסת במי MilliQ סטרילי להתאים לpH 7 וחנות על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. לדלל 4 מ &#39;l במי דגים 100 מיליליטר לריכוז עבודה של 0.016%. הערה: Tricaine הוא גירוי הרדמה ועור, ללבוש כפפות בעת הטיפול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך דגים לגרוף מתוך pipet העברת פלסטיק על ידי חיתוך את הנורה לצורת כדור וחיתוך 2 חריצים בתחתית לניקוז מים. מזרקים 1ml העומס (עם 10 דרגות μl) עם פתרון גנטמיצין מוכן ולצרף מחט G 30½. הסר את כל בועות אוויר. לסובב את המחט על המזרק כדי לוודא שקצה הזווית על המחט פונה משם ואת סימוני המזרק הם פונים קדימה וקריאים. לזריקות שליטה, להכין מזרק ומחט עם PBS סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בקנה מידה עם משטח נקי או לשקול סירה, כמו גם מגבות נייר לייבוש דגים ולהחזקת דגים להזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מכולות חצי ליטר קטנים בודדות עם מכסים להחזקת דגים לפוסט לילה תצפית הזרקה. כלובי הזדווגות פלסטיק שקופים קטנים שימושיים למטרה זו. אלהמכולות לא צריכים להיות לבנה - באופן אידיאלי הם צריכים להיות ברורים כדי שיציקות אפיתל הלבנות לשפוך על ידי הדגים יכולות להיות שנצפו על גבי שחור ספסל. ממלא כל מיכל עם מספיק מים דגים לדגים לשחות בנוחות. </li></ol> 2. הזרקת Intraperitoneal של גנטמיצין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את הדגים ב0.016% פתרון tricaine במי דגים. חכה לקצב תחלופת אוויר הזימים כדי להאט ולדגים להגיב כבר לא לגעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את הדגים באמצעות הסקופ הדגים, עובר מהראש לכיוון זנב על מנת למנוע פגיעה בזימים או סנפירים. מניחים את הדג על מגבות נייר לספיגת עודפי המים על ידי הפיכת הדגים החוצה בעדינות על צידו ולהתנער מעודפי מים מהכדור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את הדגים שוב ולמקם אותו בסירה לשקול בסולם מאופס ולשקול את הדגים. עגול ל0.25 גר &#39;הקרוב, ולחשב את הכמות המתאימה של גנטמיצין להזריק. הערה: לדגים 0.5 גרם להשתמש הזרקת 20 μl בשעה 80 מ&quot;ג / קילוגרם מינון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את הדגים שוב ומניח אותו על מגבת נייר מקופלת יבשה. אם הזרקה באמצעות יד ימין, להחזיק את מגבת נייר ביד השמאל והנח את ראשו של הדג הצביע שמאלה, עם הבטן נגישה בקלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את המזרק עם המחט בזווית של 45 מעלות לעור של הבטן, הקדמי לביב. לדחוף את המחט מתחת לעור, ואז להקטין את הזווית והחלק את המחט קדימה מתחת לעור, הימנעות האיברים הפנימיים. לוחץ על המתג הכמות המתאימה, להשהות כדי לוודא שאף נוזל יוצא סביב המחט, אז למשוך את המחט. אם מחזיק את הדגים יציבים הוא בעיה, מרפקי סד נגד פלג גוף עליון כדי לייצב אותם. הערה: יש להשתמש בכפפות בעת הטיפול בפתרון גנטמיצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרוק כל דגים למכל בודד. שים לב לדגים ולהבטיח ההתאוששות שלה מהרדמה. לשמור על דגים על 28.5 מעלות צלזיוס למשך הלילה. הערה: אם הדג לא להחיות באופן מיידי, להשתמש טרנס פלסטיקpipet FER להשקיית מים על פני הזימים שלו להחיות אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באותו מזרק ומחט כאשר הזרקת דגים מרובים עם אותו המינון של גנטמיצין. השלך את המזרק המשומש ומחט לתוך המכל החדים Biohazard המתאים. </li></ol> 3. תצפית הזרקת הודעה של פגיעה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת (יום לאחר פציעת 1), למקם את הדגים המוזרקים במכל שלה על משטח כהה. יציקות לבנה של רקמת האפיתל המתה מופרשת על ידי הדגים נפצעו צריכה להיות גלויות. (ראה איור 1E - H). אם אין יציקות, גם הדגים לא נפגע על ידי הזרקת גנטמיצין (או המינון היה נמוך מדי, או חלק מגנטמיצין דלף במהלך תהליך ההזרקה) או הדג נפצע קשה וכתוצאה מכך החסימה של השופכנים וביב מלא עם רקמת שהושל. הערה: אם הדגים אינם יכולים לנקות את היציקות מהגוף שלה זה בדרך כלל ימותו תוך 2-3 ימים ולכן לא שמיש למשך זמן ארוך יותרמבחני. אם לא יציקות גלויות, להרדים את הדג במי tricaine ידי טבילה לפחות 10 דקות אחרי תנועת הזימים מפסיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יציקות רקמה הלבנות גלויות, להגדיר את הדגים בצד ולהמשיך לבדוק את הדגים האחרים. מינון מתאים של גנטמיצין יגרום 80-90% מלהיות שמיש הדגים. בריכת הדגים נפצעו ואז לפצל אותם לקבוצות טיפול שונות אם תרצה בכך. </li></ol> 4. טיפול בדגי שחזור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על דגים במים נקיים וסביבה צפופות. מים וצפיפות מלוכלכים יובילו לזיהומים ומוות בלתי צפויה. נסה לשמור על לא יותר מ 6 דגים / 500 מיליליטר של מים דגים ולהחליף את המים מדי יום במידת האפשר. הערה: זהו היקף מינימאלי לשימור של שטח או אם החוקר מבקש לבצע ניסויים באמצעות טיפולים תרופתיים יקרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לא להאכיל את הדגים עד 3 ימים לאחר פציעה. דגי שחזור לא לאכול בהתחלה, ואוכל כל שבטנק לפרק ולקדם גר חיידקיםowth. החל מ 3 ימים לאחר פציעה, להאכיל כמות קטנה פעם אחת ביום. </li></ol> 5. ניתוח של כליות נפגעים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכלאה באתר לביטוי mRNA lhx1a, ניתן לקצור כליות מדגים בנקודתי זמן רצויים. להרדים דג במי tricaine על קרח לפחות 10 דקות עד שתנועת זימים מפסיקה, ולאחר מכן להסיר את הראש עם סכין גילוח ולפתוח את חלל הגוף ולהסיר את האיברים הפנימיים עם מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את הכליות במקום (איבר פיגמנט מחובר לקיר גוף הגב) ולתקן את הדגים בparaformaldehyde 4% ב- ​​PBS לילה. לנתח את הכליות 15 ותמשיך עם תקן הכלאה באתר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה, לשטוף את הכליות בPBST (פוספט Tween 0.5% שנאגרו המלוח 20), permeabilized עם proteinase K בPBST (10 מיקרוגרם / מיליליטר) במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר. פוסט לתקן עם paraformaldehyde 4%, ושטף שוב עם PBST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אז לפני להכליא כליות לילה בשעה 68; ° C במאגר הכלאה (פוראמיד 50%, SSC 5x, 50 מיקרוגרם / מיליליטר הפרין, 500 מיקרוגרם / מיליליטר tRNA, 0.1% Tween20, pH 6.0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הדגימות עם הבדיקה digoxigenin שכותרתו במאגר הכלאה, ולאחר מכן לשטוף למשך 5-10 דקות כל אחד עם 100%, 75%, 50%, 25% חיץ הכלאה 68 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן עבר לטמפרטורת חדר ולשטוף פעמיים למשך 30 דקות עם 2x SSC עם 0.1% Tween20, ולשטוף פעמיים למשך 30 דקות עם SSC 0.2X עם 0.1% Tween20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן דקות המדגם 3x 5 בMAB (0.1 חומצת M maleic, 0.15 מ &#39;NaCl, pH 7.5) וחסמו את הלילה ב 4 מעלות צלזיוס בMAB עם סרום עיזים 10%. אז דגירה דגימות לילה באנטי digoxigenin-AP Fab 1: 5,000 בMAB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את 5x המדגם עבור שעה 1 בMAB, ולאזן 3x במשך 15 דקות בNTMT (0.1 מ &#39;טריס pH9.5, 0.05 M MgCl 2, 0.01 M NaCl, 50 μl Tween20). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן לטפל בכליות עם NBT / BCIP כדי לזהות אותות. תקן את הכליות עם paraformaldehyde 4% וטופחו בdimethylformamide לרםיש עודף NBT / BCIP, מולבן לילה במים ללא יונים. לשטוף את הכליות ולאחר מכן לצלם בPBST עם גליצרול 50% מתחת coverslip. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Humphreys, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+epithelial+cells+repair+the+kidney+after+injury.">Intrinsic epithelial cells repair the kidney after injury.</a> Cell Stem Cell. 2, 284-291 (2008).</li><li>Humphreys, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+injured+proximal+tubule+does+not+involve+specialized+progenitors.">Repair of injured proximal tubule does not involve specialized progenitors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9226-9231 (2011).</li><li>Guo, J. K., Cantley, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+maintenance+and+repair+of+the+kidney.">Cellular maintenance and repair of the kidney.</a> Annu Rev Physiol. 72, 357-376 (2010).</li><li>Cirio, M. C., de Groh, E. D., de Caestecker, M. P., Davidson, A. J., Hukriede, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+regeneration:+common+themes+from+the+embryo+to+the+adult.">Kidney regeneration: common themes from the embryo to the adult.</a> Pediatr Nephrol. , (2013).</li><li>Little, M. H., Bertram, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+there+such+a+thing+as+a+renal+stem+cell.">Is there such a thing as a renal stem cell.</a> J Am Soc Nephrol. 20, 2112-2117 (2009).</li><li>Reimschuessel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fish+model+of+renal+regeneration+and+development.">A fish model of renal regeneration and development.</a> ILAR J. 42, 285-291 (2001).</li><li>Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mesonephric+development+and+regeneration+using+transgenic+zebrafish.">Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 299, F1040-F1047 (2010).</li><li>Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+regeneration+in+zebrafish.">Heart regeneration in zebrafish.</a> Science. 298, 2188-2190 (2002).</li><li>Goessling, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APC+mutant+zebrafish+uncover+a+changing+temporal+requirement+for+wnt+signaling+in+liver+development.">APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development.</a> Dev Biol. 320, 161-174 (2008).</li><li>Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+ablation+of+beta+cells+in+the+embryonic+zebrafish+pancreas+using+E.+coli+nitroreductase.">Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase.</a> Mech Dev. 124, 218-229 (2007).</li><li>Swanhart, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+an+lhx1a+transgenic+reporter+in+zebrafish.">Characterization of an lhx1a transgenic reporter in zebrafish.</a> Int J Dev Biol. 54, 731-736 (2010).</li><li>Diep, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+adult+nephron+progenitors+capable+of+kidney+regeneration+in+zebrafish.">Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish.</a> Nature. 470, 95-100 (2011).</li><li>Lopez-Novoa, J. M., Quiros, Y., Vicente, L., Morales, A. I., Lopez-Hernandez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+mechanism+of+aminoglycoside+nephrotoxicity:+an+integrative+point+of+view.">New insights into the mechanism of aminoglycoside nephrotoxicity: an integrative point of view.</a> Kidney Int. 79, 33-45 (2011).</li><li>Hentschel, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+renal+failure+in+zebrafish:+a+novel+system+to+study+a+complex+disease.">Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 288, F923-F929 (2005).</li><li>Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+adult+zebrafish+kidney.">Dissection of the adult zebrafish kidney.</a> J Vis Exp. , (2011).</li><li>Fogazzi, G. B., Cameron, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+microscopy+from+the+seventeenth+century+to+the+present+day.">Urinary microscopy from the seventeenth century to the present day.</a> Kidney Int. 50, 1058-1068 (1996).</li><li>Nachtrab, G., Czerwinski, M., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexually+dimorphic+fin+regeneration+in+zebrafish+controlled+by+androgen/GSK3+signaling.">Sexually dimorphic fin regeneration in zebrafish controlled by androgen/GSK3 signaling.</a> Curr Biol. 21, 1912-1917 (2011).</li><li>Zhou, W., Hildebrandt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+podocyte+injury+and+proteinuria+in+transgenic+zebrafish.">Inducible podocyte injury and proteinuria in transgenic zebrafish.</a> J Am Soc Nephrol. 23, 1039-1047 (2012).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+zebrafish+model+of+conditional+targeted+podocyte+ablation+and+regeneration.">A zebrafish model of conditional targeted podocyte ablation and regeneration.</a> Kidney Int. 83, 1193-1200 (2013).</li></ol>

The authors have no competing financial interests to disclose.

דג הזברה היא אידיאלי ללימוד התחדשות של איברים בוגרים כולל המבוגרים כליות mesonephric 6. מחקרים שנעשו לאחרונה ניצלו סמנים מולקולריים וקווי כתב מהונדס חדשים לאפיין טוב יותר את הצעדים המתרחשים במהלך התחדשות נפרון ומה תאים עשויים להיות אחראי 7,12. תצפית של יציקות ש?...

הכליות היא חיוניות להומאוסטזיס נוזל, ויסות לחץ דם וסינון של פסולת מהגוף. למרות יונקים מסוגלים לתקן nephrons הקיים לאחר פציעה באמצעות תאים אפיתל מובחנים 1-4, נראה שהם חסרי מאגר של תאי גזע שמורים 5 ולא מצליחין ליצור nephrons החדש דה נובו. בניגוד ליונקים, דגים בוגרים יכולים ליצור nephrons החדש לאורך כל חיים בוגרים כדי לתמוך בצמיחה של הדגים ובתגובה לפציעה 6,7. דג הזברה, Danio rerio, הוא אורגניזם מודל לא יסולא בפז לחקר התחדשות איבר 8-10 ויש לו הפוטנציאל לספק תובנות רבות עוצמה ליישומים להנדסת התיקון של כליות אנושיות. Tg (Lhx1a: EGFP) transgene 11 הוכח תווית בריכה של תאי נפרון בכליות דג הזברה המבוגר 12, לעומת זאת מנגנוני שליטה התגובה של lhx1a + תאים לימין פציעהemain לא ברור. גנטמיצין aminoglycoside הוא אנטיביוטיקה בשימוש נרחבת עם אפקטי nephrotoxic וototoxic ידועים בבני אדם 13. זריקת intraperitoneal של גנטמיצין היא שיטה מבוססת של גרימת ניזק כלייתי חריף בדגים 6. פגיעה זו במחקה דגי אובדן אפיתל וצלקות של glomeruli המתרחשת בבני אדם לאחר גנטמיצין מנת יתר 14 צינור. גרימת פציעה בדג זברה על ידי הזרקת גנטמיצין היא דרך נוחה של גרימת תגובת התחדשות חזקה, סינכרוני, עם הרבה nephrons החדש מיוצר ובו זמנית ממשיך דרך שלבים של היווצרות, שגשוג והתמיינות. פרוטוקול זה מפרט את השיטה שלנו לפגיעה חזקה ושחזור בכליות דג הזברה המבוגר על ידי ניצול תהליך מיון חזותי לא פולשנית כדי למזער חריגים. אנו מנצלים את העובדה שפציעה עם גנטמיצין מובילה למוות של רקמת הכליה אפיתל ופורמטיון של יציקות צינורי כליות, אשר לאחר מכן לצבור להמונים בצינורות וביב mesonephric. אלה הועברו על ידי הדגים וניתן לצפות מבחינה ויזואלית במים. זה מאפשר לנו להקרין לדגים עם פגיעה קטלנית חזקה, אשר לאחר מכן ניתן נקוותה לניסויים נוספים. מזעור המספרים של דגים או דגים ללא כל פגע שימותו לפני שהם מגיעים לנקודת הסיום של הניסוי מובילה ליותר אחיד ואיסוף נתונים יעיל וניתוח. בנוסף, אין התקנים או חומרים כימיים מיוחדים נדרשים, מה שהופך את השיטה זו חסכונית ומתאימה לשימוש בסביבה אקדמית או הוראה. שימוש בשיטה שלנו, כאן אנו מראים את ההשפעות הגוברים של מינון גנטמיצין על התחדשות בכליות, כמו גם את ההשפעה של טמפרטורה עלתה.

<table><tbody><tr><td>gentamicin sodium sulfate</td><td>Sigma</td><td>G1264</td><td>TOXIC, purity varies from batch to batch</td></tr><tr><td>plastic transfer pipets</td><td>Fisher</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Norm-Ject syringes</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72520</td><td>green plastic syringes, ordinary 1 ml syringes are OK, but harder to read accurately</td></tr><tr><td>30 G1/2 needles</td><td>Becton Dickinson</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>ethyl 3-aminobenzoaate methanesulfonate salt (tricaine)</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td>IRRITANT</td></tr><tr><td>16% paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>Make 4% in 1x PBS for working solution</td></tr></tbody></table>

kidney regeneration in adult zebrafish by gentamicin induced injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

פציעת גנטמיצין ניתן לאשר באופן חזותי על ידי ההתבוננות ביציקות אפיתל כליות במים (איור 1). מינונים שונים של גנטמיצין שמשו לפגוע דג הזברה TuAB wildtype מבוגר, וכתוצאה מכך הגדלת מספרם של lhx1a + אגרגטים הסלולר בכליות ההתחדשות (איור 1 א - ד). יכולות בקל...

Watch this Scientific Journal Video about Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury at JoVE.com

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

התחדשות בכליות למבוגרי דג הזברה על ידי גנטמיצין מושרה פגיעה

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

kidney-regeneration-in-adult-zebrafish-by-gentamicin-induced-injury

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.8K Views.  Massachusetts General Hospital. Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons. 

Video: Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore adequate kidney function after supportive treatment. However, a better understanding of how nephron cell death and repair occur on the cellular level is required to minimize cell death and to enhance the regenerative process. The zebrafish pronephros is a good model system to accomplish this goal because it contains anatomical segments that are similar to the mammalian nephron. Previously, the most common model used to study kidney injury in fish was the pharmacological gentamicin model. However, this model does not allow for precise spatiotemporal control of injury, and hence it is difficult to study cellular and molecular processes involved in kidney repair. To overcome this limitation, this work presents a method through which, in contrast to the gentamicin approach, a specific Green Fuorescent Protein (GFP)-expressing nephron segment can be photoablated using a violet laser light (405 nm). This novel model of AKI provides many advantages that other methods of epithelial injury lack. Its main advantages are the ability to &#34;dial&#34; the level of injury and the precise spatiotemporal control in the robust in vivo animal model. This new method has the potential to significantly advance the level of understanding of kidney injury and repair mechanisms.

This work presents a new in vivo model of segmental kidney injury using kidney GFP transgenic zebrafish. The model allows for the induction of the targeted ablation of kidney epithelial cells to show the cellular mechanisms of nephron injury and repair.

גישה אבולרית מדויק עבור דוגמנות פגיעה בכליות חריפה בפיתוח דג הזברה

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows within roughly two weeks after injury. Furthermore, zebrafish are able to heal bone rapidly after trepanation of the skull, and repair fractures that can be easily introduced into zebrafish bony fin rays. These injury assays represent feasible experimental paradigms to test the effect of administered drugs on rapidly forming bone. Here, we describe the use of these 3 injury models and their combined use with systemic glucocorticoid treatment, which exerts bone inhibitory and immunosuppressive effects. We provide a workflow on how to prepare for immunosuppressive treatment in adult zebrafish, illustrate how to perform fin amputation, trepanation of calvarial bones, and fin fractures, and describe how the use of glucocorticoids affects both bone forming osteoblasts and cells of the monocyte/macrophage lineage as part of innate immunity in bone tissue.

Here, we describe 3 adult zebrafish injury models and their combined use with immunosuppressive drug treatment. We provide guidance on imaging of regenerating tissues and on detecting bone mineralization therein.

דג זברה בוגרת מודלים פציעה ללמוד את השפעות Prednisolone רגנרציה רקמת העצם

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...

Stab Wound Injury of the Zebrafish Adult Telencephalon: A Method to Investigate Vertebrate Brain Neurogenesis and Regeneration

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular mechanisms involved in zebrafish adult central nervous system (CNS) regeneration and repair, we developed a zebrafish model of adult telencephalic injury.
In this approach, we manually generate an injury by pushing an insulin syringe needle into the zebrafish adult telencephalon. At different post injury days, fish are sacrificed, their brains are dissected out and stained by immunohistochemistry and/or in situ hybridization (ISH) with appropriate markers to observe cell proliferation, gliogenesis, and neurogenesis. The contralateral unlesioned hemisphere serves as an internal control. This method combined for example with RNA deep sequencing can help to screen for new genes with a role in zebrafish adult telencephalon neurogenesis, regeneration, and repair.

To shed light on the cellular and molecular mechanisms of zebrafish adult neurogenesis and regeneration, we developed a protocol for invasive surgery causing mechanical injuries in the zebrafish adult telencephalon and subsequent monitoring of changes in the stabbed hemisphere by immunohistochemistry or in situ hybridization.

פציעה דקירת פצע של דג הזברה telencephalon מבוגרים: שיטה לחקר המוח של בעלי החוליות Neurogenesis והתחדשות

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular ...

Neuroscience

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

Microinjections תוך ורידי של הזחלים דג הזברה לחקר פגיעה כליות חריפה

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Biology

Stab Wound Injury Model of the Adult Optic Tectum Using Zebrafish and Medaka for the Comparative Analysis of Regenerative Capacity

While zebrafish have a superior capacity to regenerate their central nervous system (CNS), medaka has a lower CNS regenerative capacity. A brain injury model was developed in the adult optic tectum of zebrafish and medaka and comparative histological and molecular analyses were performed to elucidate the molecular mechanisms regulating the high regenerative capacity of this tissue across these fish species. Here a stab wound injury model is presented for the adult optic tectum using a needle and histological analyses for proliferation and differentiation of the neural stem cells (NSCs). A needle was manually inserted into the central region of the optic tectum, and then the fish were intracardially perfused, and their brains were dissected. These tissues were then cryosectioned and evaluated using immunostaining against the appropriate NSC proliferation and differentiation markers. This tectum injury model provides robust and reproducible results in both zebrafish and medaka, allowing for comparing NSC responses after injury. This method is available for small teleosts, including zebrafish, medaka, and African killifish, and enables us to compare their regenerative capacity and investigate unique molecular mechanisms.

A mechanical brain injury model in the adult zebrafish is described to investigate the molecular mechanisms regulating their high regenerative capacity. The method explains to create a stab wound injury in the optic tectum of multiple species of small fish to evaluate the regenerative responses using fluorescent immunostaining.

מודל פציעת פצע דקירה של הטקטום האופטי הבוגר באמצעות דגי זברה ומדאקה לניתוח השוואתי של יכולת התחדשות

While zebrafish have a superior capacity to regenerate their central nervous system (CNS), medaka has a lower CNS regenerative capacity. A brain injury ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

השתלה של תאים ישירות לתוך הכליה של דג הזברה למבוגרים

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in renal failure1. AKI can be caused by a number of factors including ischemia, drug-based toxicity, or obstructive injury1. This results in an inability to maintain fluid and electrolyte homeostasis. While AKI has been observed for decades, effective clinical therapies have yet to be developed. Intriguingly, some patients with AKI recover renal functions over time, a mysterious phenomenon that has been only rudimentally characterized1,2. Research using mammalian models of AKI has shown that ischemic or nephrotoxin-injured kidneys experience epithelial cell death in nephron tubules1,2, the functional units of the kidney that are made up of a series of specialized regions (segments) of epithelial cell types3. Within nephrons, epithelial cell death is highest in proximal tubule cells. There is evidence that suggests cell destruction is followed by dedifferentiation, proliferation, and migration of surrounding epithelial cells, which can regenerate the nephron entirely1,2. However, there are many unanswered questions about the mechanisms of renal epithelial regeneration, ranging from the signals that modulate these events to reasons for the wide variation of abilities among humans to regenerate injured kidneys.
The larval zebrafish provides an excellent model to study kidney epithelial regeneration as its pronephric kidney is comprised of nephrons that are conserved with higher vertebrates including mammals4,5. The nephrons of zebrafish larvae can be visualized with fluorescence techniques because of the relative transparency of the young zebrafish6. This provides a unique opportunity to image cell and molecular changes in real-time, in contrast to mammalian models where nephrons are inaccessible because the kidneys are structurally complex systems internalized within the animal. Recent studies have employed the aminoglycoside gentamicin as a toxic causative agent for study of AKI and subsequent renal failure: gentamicin and other antibiotics have been shown to cause AKI in humans, and researchers have formulated methods to use this agent to trigger kidney damage in zebrafish7,8. However, the effects of aminoglycoside toxicity in zebrafish larvae are catastrophic and lethal, which presents a difficulty when studying epithelial regeneration and function over time. Our method presents the use of targeted cell ablation as a novel tool for the study of epithelial injury in zebrafish. Laser ablation gives researchers the ability to induce cell death in a limited population of cells. Varying areas of cells can be targeted based on morphological location, function, or even expression of a particular cellular phenotype. Thus, laser ablation will increase the specificity of what researchers can study, and can be a powerful new approach to shed light on the mechanisms of renal epithelial regeneration. This protocol can be broadly applied to target cell populations in other organs in the zebrafish embryo to study injury and regeneration in any number of contexts of interest.

Acute kidney injury (AKI) in humans is a common clinical problem caused by damage to the epithelial cells that comprise kidney nephrons, and AKI is associated with high mortality rates of 50-70%1. Following epithelial cell destruction, nephrons have a limited ability to regenerate, though the mechanisms and limitations that guide this phenomenon remain poorly understood. In this video article, we describe our technique for targeted laser ablation of kidney nephron cells in the zebrafish embryo kidney, or pronephros. Our new method can be used to complement nephrotoxicity-induced models of AKI and gain a high-resolution understanding of the cell and molecular alterations that are associated with epithelial regeneration in the kidney nephron.

אבלציה בלייזר של דג הזברה כלית ראשית לחקר התחדשות אפיתל הכליה

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

An Assay for Lateral Line Regeneration in Adult Zebrafish

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line development and regeneration. The zebrafish is particularly attractive for such studies because of its rapid development time and its high regenerative capacity. To date, zebrafish studies of lateral line regeneration have mainly utilized fish of the embryonic and larval stages because of the lower number of neuromasts at these stages. This has made quantitative analysis of lateral line regeneration/and or development easier in the earlier developmental stages. Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish and not in the embryo/larvae, we focused on developing a quantitative lateral line regenerative assay in adult zebrafish so that an assay was available that could be applied to current adult zebrafish disease models. Building on previous studies by Van Trump et al.17&#160;that described procedures for ablation of hair cells in adult Mexican blind cave fish and zebrafish (Danio rerio), our assay was designed to allow quantitative comparison between control and experimental groups. This was accomplished by developing a regenerative neuromast standard curve based on the percent of neuromast reappearance over a 24 hr time period following gentamicin-induced necrosis of hair cells in a defined region of the lateral line. The assay was also designed to allow extension of the analysis to the individual hair cell level when a higher level of resolution is required.

Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish rather than the embryo/larvae, we developed a quantitative lateral line regenerative assay that can be applied to adult zebrafish disease models. The assay involved resolution at the 1) neuromast and 2) individual hair cell levels.

Assay עבור התחדשות קו לרוחב בדג הזברה למבוגר

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys are composed of functional units known as nephrons, which are highly conserved with other vertebrates, including mammals. Research in zebrafish has recently demonstrated that two distinctive phenomena transpire after adult nephrons incur damage: first, there is robust regeneration within existing nephrons that replaces the destroyed tubule epithelial cells; second, entirely new nephrons are produced from renal progenitors in a process known as neonephrogenesis. In contrast, humans and other mammals seem to have only a limited ability for nephron epithelial regeneration. To date, the mechanisms responsible for these kidney regeneration phenomena remain poorly understood. Since adult zebrafish kidneys undergo both nephron epithelial regeneration and neonephrogenesis, they provide an outstanding experimental paradigm to study these events. Further, there is a wide range of genetic and pharmacological tools available in the zebrafish model that can be used to delineate the cellular and molecular mechanisms that regulate renal regeneration. One essential aspect of such research is the evaluation of nephron structure and function. This protocol describes a set of labeling techniques that can be used to gauge renal composition and test nephron functionality in the adult zebrafish kidney. Thus, these methods are widely applicable to the future phenotypic characterization of adult zebrafish kidney injury paradigms, which include but are not limited to, nephrotoxicant exposure regimes or genetic methods of targeted cell death such as the nitroreductase mediated cell ablation technique. Further, these methods could be used to study genetic perturbations in adult kidney formation and could also be applied to assess renal status during chronic disease modeling.

The zebrafish adult kidney is an excellent system for renal regeneration and disease studies. An essential aspect of such research is the assessment of nephron structure and function. This protocol describes several methodologies that can be implemented to assess nephron tubule composition and to evaluate renal reabsorption.

ניתוח של הרכב נפרון ותפקוד בכליות דג הזברה למבוגר

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

Acute Kidney Injury Model Induced by Cisplatin in Adult Zebrafish

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney due to its low molecular weight. Such accumulation causes the death of tubular cells and can induce the development of Acute Kidney Injury (AKI), which is characterized by a quick decrease in kidney function, tissue damage, and immune cells infiltration. If administered in specific doses cisplatin can be a useful tool as an AKI inducer in animal models. The zebrafish has appeared as an interesting model to study renal function, kidney regeneration, and injury, as renal structures conserve functional similarities with mammals. Adult zebrafish injected with cisplatin shows decreased survival, kidney cell death, and increased inflammation markers after 24 h post-injection (hpi). In this model, immune cells infiltration and cell death can be assessed by flow cytometry and TUNEL assay. This protocol describes the procedures to induce AKI in adult zebrafish by intraperitoneal cisplatin injection and subsequently demonstrates how to collect the renal tissue for flow cytometry processing and cell death TUNEL assay. These techniques will be useful to understand the effects of cisplatin as a nephrotoxic agent and will contribute to the expansion of AKI models in adult zebrafish. This model can also be used to study kidney regeneration, in the search for compounds that treat or prevent kidney damage and to study inflammation in AKI. Moreover, the methods used in this protocol will improve the characterization of tissue damage and inflammation, which are therapeutic targets in kidney-associated comorbidities.

This protocol describes the procedures to induce Acute Kidney Injury (AKI) in adult zebrafish using cisplatin as a nephrotoxic agent. We detailed the steps to evaluate the reproducibility of the technique and two techniques to analyze inflammation and cell death in the renal tissue, flow cytometry and TUNEL, respectively.

מודל פגיעה בכליות חריפה המושרה על ידי ציספלטין בדג זברה למבוגרים

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney ...