This work was supported by NIH grant F32DK091998 to CNK; NIH grant RO1DK041071 and Harvard Stem Cell Institute grant D001229 to IAD. The authors thank Neil Hukriede for the lhx1ain situ probe.

הצהרת אתיקה:: הערה כל הניסויים נערכו בהתאם להנחיות בית החולים כלליים מסצ&#39;וסטס לשימוש בבעלי חיים במחקר. 1. הכנה מראש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע כמה מבוגרים דג הזברה ישן 6-12 חודשים כדי לפגוע. תכנית לפגוע בדגים 10-20% יותר מאשר יהיה צורך. על מנת למזער את השונות, גיל שימוש בהתאמת דגי אח שגדלו יחד באותו טנק, כך שהם בערך באותו גודל ויש לי שונות גנטיות פחות. דגי נקבה הם הרבה יותר קלים להזריק בהשוואה לדגי זכרים, בשל הקיבולת הגדולה יותר של הבטן. עם זאת, זכרים ונקבות לתת תוצאות דומות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר עושה הניסוי בפעם הראשונה, עלילה עקומת מינון כדי לקבוע את המינון המתאים לגנטמיצין זן ספציפי של דגים. לבדוק כל אצווה חדשה של גנטמיצין לפני השימוש בניסויים מאז טוהר גנטמיצין משתנה מיצוו אצווה. מינון נכון צריך להיקבע על ידי הערכת expressiעל פציעה של סמנים כגון lhx1a. (ראה איור 1 א - ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון גנטמיצין. פתרון מניות גנטמיצין עשוי להיות מאוחסן ב-20 ° C ומופשר לשימוש מאוחר יותר. לדוגמא, עבור 80 מ&quot;ג / קילוגרם מינון (80 גנטמיצין מ&quot;ג / קילוגרם ממשקל הגוף) בדגים במשקל 0.5 גרם, להכין 2 מ&quot;ג / מיליליטר של גנטמיצין בופר פוספט כפתרון נוח עבודה. זה מספק 20 μl של גנטמיצין לזריקת intraperitoneal לדגים. הערה: באופן כללי, 80-120 מ&quot;ג / קילוגרם להשיג תוצאות טובות, אך במינונים נמוכות כמו 40 מ&quot;ג / קילוגרם עשוי להיות מתאים. גנטמיצין גם ניתן לרכוש בפתרון כדי למזער את החשיפה מסוכנת לאנשי מעבדה. הערה: גנטמיצין במינונים גבוהים יכול להיות רעיל. ללבוש כפפות ומסכה כאשר משקל אבקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן של 0.016% מים tricaine 100 מיליליטר להרדמת דגים. הכן מלאי 25x של tricaine (4 g / L 1) מומסת במי MilliQ סטרילי להתאים לpH 7 וחנות על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. לדלל 4 מ &#39;l במי דגים 100 מיליליטר לריכוז עבודה של 0.016%. הערה: Tricaine הוא גירוי הרדמה ועור, ללבוש כפפות בעת הטיפול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך דגים לגרוף מתוך pipet העברת פלסטיק על ידי חיתוך את הנורה לצורת כדור וחיתוך 2 חריצים בתחתית לניקוז מים. מזרקים 1ml העומס (עם 10 דרגות μl) עם פתרון גנטמיצין מוכן ולצרף מחט G 30½. הסר את כל בועות אוויר. לסובב את המחט על המזרק כדי לוודא שקצה הזווית על המחט פונה משם ואת סימוני המזרק הם פונים קדימה וקריאים. לזריקות שליטה, להכין מזרק ומחט עם PBS סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בקנה מידה עם משטח נקי או לשקול סירה, כמו גם מגבות נייר לייבוש דגים ולהחזקת דגים להזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מכולות חצי ליטר קטנים בודדות עם מכסים להחזקת דגים לפוסט לילה תצפית הזרקה. כלובי הזדווגות פלסטיק שקופים קטנים שימושיים למטרה זו. אלהמכולות לא צריכים להיות לבנה - באופן אידיאלי הם צריכים להיות ברורים כדי שיציקות אפיתל הלבנות לשפוך על ידי הדגים יכולות להיות שנצפו על גבי שחור ספסל. ממלא כל מיכל עם מספיק מים דגים לדגים לשחות בנוחות. </li></ol> 2. הזרקת Intraperitoneal של גנטמיצין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את הדגים ב0.016% פתרון tricaine במי דגים. חכה לקצב תחלופת אוויר הזימים כדי להאט ולדגים להגיב כבר לא לגעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את הדגים באמצעות הסקופ הדגים, עובר מהראש לכיוון זנב על מנת למנוע פגיעה בזימים או סנפירים. מניחים את הדג על מגבות נייר לספיגת עודפי המים על ידי הפיכת הדגים החוצה בעדינות על צידו ולהתנער מעודפי מים מהכדור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את הדגים שוב ולמקם אותו בסירה לשקול בסולם מאופס ולשקול את הדגים. עגול ל0.25 גר &#39;הקרוב, ולחשב את הכמות המתאימה של גנטמיצין להזריק. הערה: לדגים 0.5 גרם להשתמש הזרקת 20 μl בשעה 80 מ&quot;ג / קילוגרם מינון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את הדגים שוב ומניח אותו על מגבת נייר מקופלת יבשה. אם הזרקה באמצעות יד ימין, להחזיק את מגבת נייר ביד השמאל והנח את ראשו של הדג הצביע שמאלה, עם הבטן נגישה בקלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את המזרק עם המחט בזווית של 45 מעלות לעור של הבטן, הקדמי לביב. לדחוף את המחט מתחת לעור, ואז להקטין את הזווית והחלק את המחט קדימה מתחת לעור, הימנעות האיברים הפנימיים. לוחץ על המתג הכמות המתאימה, להשהות כדי לוודא שאף נוזל יוצא סביב המחט, אז למשוך את המחט. אם מחזיק את הדגים יציבים הוא בעיה, מרפקי סד נגד פלג גוף עליון כדי לייצב אותם. הערה: יש להשתמש בכפפות בעת הטיפול בפתרון גנטמיצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרוק כל דגים למכל בודד. שים לב לדגים ולהבטיח ההתאוששות שלה מהרדמה. לשמור על דגים על 28.5 מעלות צלזיוס למשך הלילה. הערה: אם הדג לא להחיות באופן מיידי, להשתמש טרנס פלסטיקpipet FER להשקיית מים על פני הזימים שלו להחיות אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באותו מזרק ומחט כאשר הזרקת דגים מרובים עם אותו המינון של גנטמיצין. השלך את המזרק המשומש ומחט לתוך המכל החדים Biohazard המתאים. </li></ol> 3. תצפית הזרקת הודעה של פגיעה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת (יום לאחר פציעת 1), למקם את הדגים המוזרקים במכל שלה על משטח כהה. יציקות לבנה של רקמת האפיתל המתה מופרשת על ידי הדגים נפצעו צריכה להיות גלויות. (ראה איור 1E - H). אם אין יציקות, גם הדגים לא נפגע על ידי הזרקת גנטמיצין (או המינון היה נמוך מדי, או חלק מגנטמיצין דלף במהלך תהליך ההזרקה) או הדג נפצע קשה וכתוצאה מכך החסימה של השופכנים וביב מלא עם רקמת שהושל. הערה: אם הדגים אינם יכולים לנקות את היציקות מהגוף שלה זה בדרך כלל ימותו תוך 2-3 ימים ולכן לא שמיש למשך זמן ארוך יותרמבחני. אם לא יציקות גלויות, להרדים את הדג במי tricaine ידי טבילה לפחות 10 דקות אחרי תנועת הזימים מפסיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יציקות רקמה הלבנות גלויות, להגדיר את הדגים בצד ולהמשיך לבדוק את הדגים האחרים. מינון מתאים של גנטמיצין יגרום 80-90% מלהיות שמיש הדגים. בריכת הדגים נפצעו ואז לפצל אותם לקבוצות טיפול שונות אם תרצה בכך. </li></ol> 4. טיפול בדגי שחזור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על דגים במים נקיים וסביבה צפופות. מים וצפיפות מלוכלכים יובילו לזיהומים ומוות בלתי צפויה. נסה לשמור על לא יותר מ 6 דגים / 500 מיליליטר של מים דגים ולהחליף את המים מדי יום במידת האפשר. הערה: זהו היקף מינימאלי לשימור של שטח או אם החוקר מבקש לבצע ניסויים באמצעות טיפולים תרופתיים יקרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לא להאכיל את הדגים עד 3 ימים לאחר פציעה. דגי שחזור לא לאכול בהתחלה, ואוכל כל שבטנק לפרק ולקדם גר חיידקיםowth. החל מ 3 ימים לאחר פציעה, להאכיל כמות קטנה פעם אחת ביום. </li></ol> 5. ניתוח של כליות נפגעים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכלאה באתר לביטוי mRNA lhx1a, ניתן לקצור כליות מדגים בנקודתי זמן רצויים. להרדים דג במי tricaine על קרח לפחות 10 דקות עד שתנועת זימים מפסיקה, ולאחר מכן להסיר את הראש עם סכין גילוח ולפתוח את חלל הגוף ולהסיר את האיברים הפנימיים עם מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את הכליות במקום (איבר פיגמנט מחובר לקיר גוף הגב) ולתקן את הדגים בparaformaldehyde 4% ב- ​​PBS לילה. לנתח את הכליות 15 ותמשיך עם תקן הכלאה באתר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה, לשטוף את הכליות בPBST (פוספט Tween 0.5% שנאגרו המלוח 20), permeabilized עם proteinase K בPBST (10 מיקרוגרם / מיליליטר) במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר. פוסט לתקן עם paraformaldehyde 4%, ושטף שוב עם PBST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אז לפני להכליא כליות לילה בשעה 68; ° C במאגר הכלאה (פוראמיד 50%, SSC 5x, 50 מיקרוגרם / מיליליטר הפרין, 500 מיקרוגרם / מיליליטר tRNA, 0.1% Tween20, pH 6.0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הדגימות עם הבדיקה digoxigenin שכותרתו במאגר הכלאה, ולאחר מכן לשטוף למשך 5-10 דקות כל אחד עם 100%, 75%, 50%, 25% חיץ הכלאה 68 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן עבר לטמפרטורת חדר ולשטוף פעמיים למשך 30 דקות עם 2x SSC עם 0.1% Tween20, ולשטוף פעמיים למשך 30 דקות עם SSC 0.2X עם 0.1% Tween20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן דקות המדגם 3x 5 בMAB (0.1 חומצת M maleic, 0.15 מ &#39;NaCl, pH 7.5) וחסמו את הלילה ב 4 מעלות צלזיוס בMAB עם סרום עיזים 10%. אז דגירה דגימות לילה באנטי digoxigenin-AP Fab 1: 5,000 בMAB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את 5x המדגם עבור שעה 1 בMAB, ולאזן 3x במשך 15 דקות בNTMT (0.1 מ &#39;טריס pH9.5, 0.05 M MgCl 2, 0.01 M NaCl, 50 μl Tween20). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן לטפל בכליות עם NBT / BCIP כדי לזהות אותות. תקן את הכליות עם paraformaldehyde 4% וטופחו בdimethylformamide לרםיש עודף NBT / BCIP, מולבן לילה במים ללא יונים. לשטוף את הכליות ולאחר מכן לצלם בPBST עם גליצרול 50% מתחת coverslip. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Humphreys, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+epithelial+cells+repair+the+kidney+after+injury.">Intrinsic epithelial cells repair the kidney after injury.</a> Cell Stem Cell. 2, 284-291 (2008).</li><li>Humphreys, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+injured+proximal+tubule+does+not+involve+specialized+progenitors.">Repair of injured proximal tubule does not involve specialized progenitors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9226-9231 (2011).</li><li>Guo, J. K., Cantley, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+maintenance+and+repair+of+the+kidney.">Cellular maintenance and repair of the kidney.</a> Annu Rev Physiol. 72, 357-376 (2010).</li><li>Cirio, M. C., de Groh, E. D., de Caestecker, M. P., Davidson, A. J., Hukriede, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+regeneration:+common+themes+from+the+embryo+to+the+adult.">Kidney regeneration: common themes from the embryo to the adult.</a> Pediatr Nephrol. , (2013).</li><li>Little, M. H., Bertram, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+there+such+a+thing+as+a+renal+stem+cell.">Is there such a thing as a renal stem cell.</a> J Am Soc Nephrol. 20, 2112-2117 (2009).</li><li>Reimschuessel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fish+model+of+renal+regeneration+and+development.">A fish model of renal regeneration and development.</a> ILAR J. 42, 285-291 (2001).</li><li>Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mesonephric+development+and+regeneration+using+transgenic+zebrafish.">Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 299, F1040-F1047 (2010).</li><li>Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+regeneration+in+zebrafish.">Heart regeneration in zebrafish.</a> Science. 298, 2188-2190 (2002).</li><li>Goessling, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APC+mutant+zebrafish+uncover+a+changing+temporal+requirement+for+wnt+signaling+in+liver+development.">APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development.</a> Dev Biol. 320, 161-174 (2008).</li><li>Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+ablation+of+beta+cells+in+the+embryonic+zebrafish+pancreas+using+E.+coli+nitroreductase.">Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase.</a> Mech Dev. 124, 218-229 (2007).</li><li>Swanhart, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+an+lhx1a+transgenic+reporter+in+zebrafish.">Characterization of an lhx1a transgenic reporter in zebrafish.</a> Int J Dev Biol. 54, 731-736 (2010).</li><li>Diep, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+adult+nephron+progenitors+capable+of+kidney+regeneration+in+zebrafish.">Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish.</a> Nature. 470, 95-100 (2011).</li><li>Lopez-Novoa, J. M., Quiros, Y., Vicente, L., Morales, A. I., Lopez-Hernandez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+mechanism+of+aminoglycoside+nephrotoxicity:+an+integrative+point+of+view.">New insights into the mechanism of aminoglycoside nephrotoxicity: an integrative point of view.</a> Kidney Int. 79, 33-45 (2011).</li><li>Hentschel, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+renal+failure+in+zebrafish:+a+novel+system+to+study+a+complex+disease.">Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 288, F923-F929 (2005).</li><li>Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+adult+zebrafish+kidney.">Dissection of the adult zebrafish kidney.</a> J Vis Exp. , (2011).</li><li>Fogazzi, G. B., Cameron, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+microscopy+from+the+seventeenth+century+to+the+present+day.">Urinary microscopy from the seventeenth century to the present day.</a> Kidney Int. 50, 1058-1068 (1996).</li><li>Nachtrab, G., Czerwinski, M., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexually+dimorphic+fin+regeneration+in+zebrafish+controlled+by+androgen/GSK3+signaling.">Sexually dimorphic fin regeneration in zebrafish controlled by androgen/GSK3 signaling.</a> Curr Biol. 21, 1912-1917 (2011).</li><li>Zhou, W., Hildebrandt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+podocyte+injury+and+proteinuria+in+transgenic+zebrafish.">Inducible podocyte injury and proteinuria in transgenic zebrafish.</a> J Am Soc Nephrol. 23, 1039-1047 (2012).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+zebrafish+model+of+conditional+targeted+podocyte+ablation+and+regeneration.">A zebrafish model of conditional targeted podocyte ablation and regeneration.</a> Kidney Int. 83, 1193-1200 (2013).</li></ol>

The authors have no competing financial interests to disclose.

דג הזברה היא אידיאלי ללימוד התחדשות של איברים בוגרים כולל המבוגרים כליות mesonephric 6. מחקרים שנעשו לאחרונה ניצלו סמנים מולקולריים וקווי כתב מהונדס חדשים לאפיין טוב יותר את הצעדים המתרחשים במהלך התחדשות נפרון ומה תאים עשויים להיות אחראי 7,12. תצפית של יציקות ש?...

הכליות היא חיוניות להומאוסטזיס נוזל, ויסות לחץ דם וסינון של פסולת מהגוף. למרות יונקים מסוגלים לתקן nephrons הקיים לאחר פציעה באמצעות תאים אפיתל מובחנים 1-4, נראה שהם חסרי מאגר של תאי גזע שמורים 5 ולא מצליחין ליצור nephrons החדש דה נובו. בניגוד ליונקים, דגים בוגרים יכולים ליצור nephrons החדש לאורך כל חיים בוגרים כדי לתמוך בצמיחה של הדגים ובתגובה לפציעה 6,7. דג הזברה, Danio rerio, הוא אורגניזם מודל לא יסולא בפז לחקר התחדשות איבר 8-10 ויש לו הפוטנציאל לספק תובנות רבות עוצמה ליישומים להנדסת התיקון של כליות אנושיות. Tg (Lhx1a: EGFP) transgene 11 הוכח תווית בריכה של תאי נפרון בכליות דג הזברה המבוגר 12, לעומת זאת מנגנוני שליטה התגובה של lhx1a + תאים לימין פציעהemain לא ברור. גנטמיצין aminoglycoside הוא אנטיביוטיקה בשימוש נרחבת עם אפקטי nephrotoxic וototoxic ידועים בבני אדם 13. זריקת intraperitoneal של גנטמיצין היא שיטה מבוססת של גרימת ניזק כלייתי חריף בדגים 6. פגיעה זו במחקה דגי אובדן אפיתל וצלקות של glomeruli המתרחשת בבני אדם לאחר גנטמיצין מנת יתר 14 צינור. גרימת פציעה בדג זברה על ידי הזרקת גנטמיצין היא דרך נוחה של גרימת תגובת התחדשות חזקה, סינכרוני, עם הרבה nephrons החדש מיוצר ובו זמנית ממשיך דרך שלבים של היווצרות, שגשוג והתמיינות. פרוטוקול זה מפרט את השיטה שלנו לפגיעה חזקה ושחזור בכליות דג הזברה המבוגר על ידי ניצול תהליך מיון חזותי לא פולשנית כדי למזער חריגים. אנו מנצלים את העובדה שפציעה עם גנטמיצין מובילה למוות של רקמת הכליה אפיתל ופורמטיון של יציקות צינורי כליות, אשר לאחר מכן לצבור להמונים בצינורות וביב mesonephric. אלה הועברו על ידי הדגים וניתן לצפות מבחינה ויזואלית במים. זה מאפשר לנו להקרין לדגים עם פגיעה קטלנית חזקה, אשר לאחר מכן ניתן נקוותה לניסויים נוספים. מזעור המספרים של דגים או דגים ללא כל פגע שימותו לפני שהם מגיעים לנקודת הסיום של הניסוי מובילה ליותר אחיד ואיסוף נתונים יעיל וניתוח. בנוסף, אין התקנים או חומרים כימיים מיוחדים נדרשים, מה שהופך את השיטה זו חסכונית ומתאימה לשימוש בסביבה אקדמית או הוראה. שימוש בשיטה שלנו, כאן אנו מראים את ההשפעות הגוברים של מינון גנטמיצין על התחדשות בכליות, כמו גם את ההשפעה של טמפרטורה עלתה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="726">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:101px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:291px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">gentamicin sodium sulfate</td>
			<td style="width:101px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G1264</td>
			<td>TOXIC, purity varies from batch to batch</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">plastic transfer pipets</td>
			<td style="width:101px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">1 ml Norm-Ject syringes</td>
			<td style="width:101px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">72520</td>
			<td>green plastic syringes, ordinary 1ml syringes are OK, but harder to read accurately</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">30G1/2 needles</td>
			<td style="width:101px;">Becton Dickinson</td>
			<td align="right" style="width:119px;">305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">ethyl 3-aminobenzoaate methanesulfonate salt (tricaine)</td>
			<td style="width:101px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A5040</td>
			<td>IRRITANT</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">16% paraformaldehyde</td>
			<td style="width:101px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15710</td>
			<td>Make 4% in 1xPBS for working solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

kidney regeneration in adult zebrafish by gentamicin induced injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

פציעת גנטמיצין ניתן לאשר באופן חזותי על ידי ההתבוננות ביציקות אפיתל כליות במים (איור 1). מינונים שונים של גנטמיצין שמשו לפגוע דג הזברה TuAB wildtype מבוגר, וכתוצאה מכך הגדלת מספרם של lhx1a + אגרגטים הסלולר בכליות ההתחדשות (איור 1 א - ד). יכולות בקל...

Watch this Scientific Journal Video about Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury at JoVE.com

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

התחדשות בכליות למבוגרי דג הזברה על ידי גנטמיצין מושרה פגיעה

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

kidney-regeneration-in-adult-zebrafish-by-gentamicin-induced-injury

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.8K Views.  Massachusetts General Hospital. Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons. 

Video: Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes. External development and optical transparency make these embryos especially amenable to microscopy, and numerous transgenic lines that label specific cell types with fluorescent proteins are available, making the zebrafish embryo an ideal system for visualizing the interaction of vascular, hematopoietic, and other cell types during injury and repair in vivo. Forward and reverse genetics in zebrafish are well developed, and pharmacological manipulation is possible. We describe a mechanical vascular injury model using micromanipulation techniques that exploits several of these features to study responses to vascular injury including hemostasis and blood vessel repair. Using a combination of video and timelapse microscopy, we demonstrate that this method of vascular injury results in measurable and reproducible responses during hemostasis and wound repair. This method provides a system for studying vascular injury and repair in detail in a whole animal model.

This article describes a method for creating a mechanical vessel injury in zebrafish embryos. This injury model provides a platform for studying hemostasis, injury-related inflammation, and wound healing in an organism ideally suited for real-time microscopy.

פגיעה כלי מכאנית בעוברי דג הזברה

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or biliary-driven liver regeneration. In hepatocyte-driven liver regeneration, regenerating hepatocytes are derived from preexisting hepatocytes, whereas, in biliary-driven regeneration, regenerating hepatocytes are derived from biliary epithelial cells (BECs). For hepatocyte-driven liver regeneration, there are excellent rodent models that have significantly contributed to the current understanding of liver regeneration. However, no such rodent model exists for biliary-driven liver regeneration. We recently reported on a zebrafish liver injury model in which BECs extensively give rise to hepatocytes upon severe hepatocyte loss. In this model, hepatocytes are specifically ablated by a pharmacogenetic means. Here we present in detail the methods to ablate hepatocytes and to analyze the BEC-driven liver regeneration process. This hepatocyte-specific ablation model can be further used to discover the underlying molecular and cellular mechanisms of biliary-driven liver regeneration. Moreover, these methods can be applied to chemical screens to identify small molecules that augment or suppress liver regeneration.

To help assess the molecular mechanisms underlying zebrafish biliary-driven liver regeneration, we established a liver injury model in which the nitroreductase-expressing hepatocytes are genetically ablated upon metronidazole treatment. In this protocol, we describe how to adeptly manipulate, monitor and analyze hepatocyte ablation and biliary-driven liver regeneration.

אבלציה Hepatocyte הספציפי בדג הזברה לחקר התחדשות כבד מונע מרה

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

טכניקה לכוון Microinjection אל פיתוח<em&gt; Xenopus</em&gt; כליה

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading to cirrhosis with hepatocellular dysfunction. Among multiple hepatic insults, alcohol abuse can lead to significant health problems including liver failure and hepatocellular carcinoma. Nonetheless, the identity of endogenous cellular sources that regenerate hepatocytes in response to alcohol has not been properly investigated. Moreover, few studies have effectively modeled hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury. We recently reported on establishing an ethanol (EtOH)-induced fibrotic liver model in zebrafish in which hepatic progenitor cells (HPCs) gave rise to hepatocytes upon near-complete hepatocyte loss in the presence of fibrogenic stimulus. Furthermore, through chemical screens using this model, we identified multiple small molecules that enhance hepatocyte regeneration. Here we describe in detail the procedures to develop an EtOH-induced fibrotic liver model and to perform chemical screens using this model in zebrafish. This protocol will be a critical tool to delineate the molecular and cellular mechanisms of how hepatocyte regenerates in the fibrotic liver. Furthermore, these methods will facilitate potential discovery of novel therapeutic strategies for chronic liver disease in vivo.

Sustained fibrosis with deposition of excessive extracellular matrix proteins leads to cirrhosis. Alcohol abuse is one of the main causes of severe liver disease. We established an ethanol-induced zebrafish fibrotic liver model to study the mechanisms and strategies of promoting hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury.

פיתוח מודל כבד אתנול-induced fibrotic דג הזברה ללמוד ובתאים בתיווך תא התחדשות Hepatocyte

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The M&#252;ller glia re-enter the cell cycle and produce neuronal progenitor cells that undergo subsequent rounds of cell divisions and differentiate into the lost neuronal cell types. Both M&#252;ller glia and neuronal progenitor cell nuclei replicate their DNA and undergo mitosis in distinct locations of the retina, i.e. they migrate between the basal Inner Nuclear Layer (INL) and the Outer Nuclear Layer (ONL), respectively, in a process described as Interkinetic Nuclear Migration (INM). INM has predominantly been studied in the developing retina. To examine the dynamics of INM in the adult regenerating zebrafish retina in detail, live-cell imaging of fluorescently-labeled M&#252;ller glia/neuronal progenitor cells is required. Here, we provide the conditions to isolate and culture dorsal retinas from Tg[gfap:nGFP]mi2004 zebrafish that were exposed to constant intense light for 35 h. We also show that these retinal cultures are viable to perform live-cell imaging experiments, continuously acquiring z-stack images throughout the thickness of the retinal explant for up to 8 h using multiphoton microscopy to monitor the migratory behavior of gfap:nGFP-positive cells. In addition, we describe the details to perform post-imaging analysis to determine the velocity of apical and basal INM. To summarize, we established conditions to study the dynamics of INM in an adult model of neuronal regeneration. This will advance our understanding of this crucial cellular process and allow us to determine the mechanisms that control INM.

Zebrafish retinal regeneration has mostly been studied using fixed retinas. However, dynamic processes such as interkinetic nuclear migration occur during the regenerative response and require live-cell imaging to investigate the underlying mechanisms. Here, we describe culture and imaging conditions to monitor Interkinetic Nuclear Migration (INM) in real-time using multiphoton microscopy.

תרבות של מבוגר דג הזברה טראנסגנטי רשתית Explants עבור Live- תא הדמיה ידי multiphoton מיקרוסקופי

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore adequate kidney function after supportive treatment. However, a better understanding of how nephron cell death and repair occur on the cellular level is required to minimize cell death and to enhance the regenerative process. The zebrafish pronephros is a good model system to accomplish this goal because it contains anatomical segments that are similar to the mammalian nephron. Previously, the most common model used to study kidney injury in fish was the pharmacological gentamicin model. However, this model does not allow for precise spatiotemporal control of injury, and hence it is difficult to study cellular and molecular processes involved in kidney repair. To overcome this limitation, this work presents a method through which, in contrast to the gentamicin approach, a specific Green Fuorescent Protein (GFP)-expressing nephron segment can be photoablated using a violet laser light (405 nm). This novel model of AKI provides many advantages that other methods of epithelial injury lack. Its main advantages are the ability to &#34;dial&#34; the level of injury and the precise spatiotemporal control in the robust in vivo animal model. This new method has the potential to significantly advance the level of understanding of kidney injury and repair mechanisms.

This work presents a new in vivo model of segmental kidney injury using kidney GFP transgenic zebrafish. The model allows for the induction of the targeted ablation of kidney epithelial cells to show the cellular mechanisms of nephron injury and repair.

גישה אבולרית מדויק עבור דוגמנות פגיעה בכליות חריפה בפיתוח דג הזברה

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore ...

Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related morbidity and mortality and affects more than 2 million people in the United States. A better understanding of the cellular and molecular mechanisms underlying alcohol-induced liver injury is crucial for developing effective treatment for ALD. Zebrafish larvae exhibit hepatic steatosis and fibrogenesis after just 24 h of exposure to 2% ethanol, making them useful for the study of acute alcoholic liver injury. This work describes the procedure for acute ethanol treatment in zebrafish larvae and shows that it causes steatosis and swelling of the hepatic blood vessels. A detailed protocol for Hematoxylin and Eosin (H&#38;E) staining that is optimized for the histological analysis of the zebrafish larval liver, is also described. H&#38;E staining has several unique advantages over immunofluorescence, as it marks all liver cells and extracellular components simultaneously and can readily detect hepatic injury, such as steatosis and fibrosis. Given the increasing usage of zebrafish in modeling toxin and virus-induced liver injury, as well as inherited liver diseases, this protocol serves as a reference for the histological analyses performed in all these studies.

This protocol describes histological analyses of the livers from zebrafish larvae that have been treated with 2% ethanol for 24 h. Such acute ethanol treatment results in hepatic steatosis and swelling of the hepatic vasculature.

ניתוח היסטולוגית של פגיעה חריפה בכבד אלכוהול דג הזברה

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical applications. The conventional isolation method of human keratinocytes involves a two-step sequential enzymatic digestion procedure, which has been proven to be inefficient in generating primary cells from adult tissues due to the low cell recovery rate and reduced cell viability. We recently reported an advanced method to isolate human primary epidermal progenitor cells from skin tissues that utilizes the Rho kinase inhibitor Y-27632 in the medium. Compared with the traditional protocol, this new method is simpler, easier, and less time-consuming, and increases epithelial stem cell yield and enhances their stem cell characteristics. Moreover, the new methodology does not require the separation of the epidermis from the dermis, and, therefore, is suitable for isolating cells from different types of adult tissues. This new isolation method overcomes the major shortcomings of conventional methods and is more suitable for producing large numbers of epidermal cells with high potency both for laboratory and for clinical applications. Here, we describe the new method in detail.

Here we present a protocol to efficiently isolate primary human keratinocytes from adult skin tissues. This method simplifies the conventional procedure by using the ROCK Inhibitor Y-27632 in the inoculation medium to spontaneously separate epidermal cells from dermal cells.

שיטה פשוטה ויעילה כדי לבודד Keratinocytes האנושי העיקרי של רקמת עור מבוגר

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart after apex resection or cryoinjury, making it an important model organism for heart regeneration study. However, the lack of loss-of-function methods for adult organs has restricted insights into the mechanisms underlying heart regeneration. RNA interference via different delivery systems is a powerful tool for silencing genes in mammalian cells and model organisms. We have previously reported that siRNA-encapsulated nanoparticles successfully enter cells and result in a remarkable gene-specific knockdown in the regenerating adult zebrafish heart. Here, we present a simple, rapid, and efficient protocol for the dendrimer-mediated siRNA delivery and gene-silencing in the regenerating adult zebrafish heart. This method provides an alternative approach for determining gene functions in adult organs in zebrafish and can be extended to other model organisms as well.

It remains a major challenge to develop conditional gene-knockout or effective gene-knockdown in adult zebrafish organs. Here we report a protocol for performing nanoparticle-mediated siRNA gene-silencing in adult zebrafish heart, thus providing a new loss-of-function method for studying adult organs in zebrafish and other model organisms.

בתיווך Nanoparticle siRNA ג'ין להחרשת בלב דג זברה למבוגרים

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows within roughly two weeks after injury. Furthermore, zebrafish are able to heal bone rapidly after trepanation of the skull, and repair fractures that can be easily introduced into zebrafish bony fin rays. These injury assays represent feasible experimental paradigms to test the effect of administered drugs on rapidly forming bone. Here, we describe the use of these 3 injury models and their combined use with systemic glucocorticoid treatment, which exerts bone inhibitory and immunosuppressive effects. We provide a workflow on how to prepare for immunosuppressive treatment in adult zebrafish, illustrate how to perform fin amputation, trepanation of calvarial bones, and fin fractures, and describe how the use of glucocorticoids affects both bone forming osteoblasts and cells of the monocyte/macrophage lineage as part of innate immunity in bone tissue.

Here, we describe 3 adult zebrafish injury models and their combined use with immunosuppressive drug treatment. We provide guidance on imaging of regenerating tissues and on detecting bone mineralization therein.

דג זברה בוגרת מודלים פציעה ללמוד את השפעות Prednisolone רגנרציה רקמת העצם

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...