אני רוצה להודות לעמיתים לעבודה במיליפור סיגמה, פיליפ ג &#39;מוריסי ושרי ל&#39;, על תמיכתם והדרכתם לאורך השנים. אני גם רוצה להודות Vidya Venkatachalam ו בריאן ר דוידסון על עזרתם עם תכונה BDC3 בתוכנה IDEAS , ראיין פ Jessup לעזרה בעריכת כתב היד הזה, ריימונד קונג לעזרה ביום הירי, תודה מיוחדת לך האמן סינתיה Xamonthiene.

<ol>
	<li>Levine, B., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+by+self-digestion:+molecular+mechanisms+and+biological+functions+of+autophagy.">Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy.</a> Developmental Cell. 6, 463-477 (2004).</li><li>Zhang, X. J., Chen, S., Huang, K. X., Le, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+should+autophagic+flux+be+assessed?.">Why should autophagic flux be assessed?.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 34, 595-599 (2013).</li><li>Tanida, I., Takashi, U., Kominami, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3+and+Autophagy.">LC3 and Autophagy.</a> Methods Mol Biol. 445, 77-88 (2008).</li><li>Larsen, K. B., Lamark, T., &#216;vervatn, A., Harneshaug, I., Johansen, T., Bj&#248;rk&#248;y, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reporter+cell+system+to+monitor+autophagy+based+on+p62/SQSTM1.">A reporter cell system to monitor autophagy based on p62/SQSTM1.</a> Autophagy. 6 (6), 784-793 (2010).</li><li>Demishtein, A., Porat, Z., Elazar, Z., Shvets, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+flow+cytometry+for+measurement+of+autophagy.">Applications of flow cytometry for measurement of autophagy.</a> Methods. 75, 87-95 (2015).</li><li>Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+mammalian+autophagy+research.">Methods in mammalian autophagy research.</a> Cell. 140 (3), 313-326 (2010).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy.">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy.</a> Autophagy. 8 (4), 445-544 (2012).</li><li>Arsov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAC-mediated+transgenic+expression+of+fluorescent+autophagic+protein+Beclin+1+reveals+a+role+for+Beclin+1+in+lymphocyte+development.">BAC-mediated transgenic expression of fluorescent autophagic protein Beclin 1 reveals a role for Beclin 1 in lymphocyte development.</a> Cell Death Differ. 15 (9), 1385-1395 (2008).</li><li>Maloyan, A., Sayegh, J., Osinska, H., Chua, B. H., Robbins, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+death+pathways+in+desmin-related+cardiomyopathy.">Manipulation of death pathways in desmin-related cardiomyopathy.</a> Circ Res. 106 (9), 1524-1532 (2010).</li><li>Altman, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+is+essential+to+suppress+cell+stress+and+to+allow+BCR-Abl-mediated+leukemogenesis.">Autophagy is essential to suppress cell stress and to allow BCR-Abl-mediated leukemogenesis.</a> Oncogene. 30 (16), 1855-1867 (2011).</li><li>Suarez, A. L., Kong, R., George, T., He, L., Yue, Z., van Dyk, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gammaherpesvirus+68+infection+of+endothelial+cells+requires+both+host+autophagy+genes+and+viral+oncogenes+for+optimal+survival+and+persistence.">Gammaherpesvirus 68 infection of endothelial cells requires both host autophagy genes and viral oncogenes for optimal survival and persistence.</a> J Virol. 85 (13), 6293-6308 (2011).</li><li>Tra, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+human+embryonic+stem+cells.">Autophagy in human embryonic stem cells.</a> PLoS One. 6 (11), (2011).</li><li>Yuan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bafilomycin+A1+targets+both+autophagy+and+apoptosis+pathways+in+pediatric+B-cell+acute+lymphoblastic+leukemia.">Bafilomycin A1 targets both autophagy and apoptosis pathways in pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Haematologica. 100 (3), 345-356 (2015).</li><li>Leveque-El Mouttie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+is+required+for+stem+cell+mobilization+by+G-CSF.">Autophagy is required for stem cell mobilization by G-CSF.</a> Blood. 125 (19), 2933-2936 (2015).</li><li>Watson, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+limits+proliferation+and+glycolytic+metabolism+in+acute+myeloid+leukemia.">Autophagy limits proliferation and glycolytic metabolism in acute myeloid leukemia.</a> Cell Death Discov. 1, 15008 (2015).</li><li>Stranks, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+Controls+Acquisition+of+Aging+Features+in+Macrophages.">Autophagy Controls Acquisition of Aging Features in Macrophages.</a> J Innate Immun. 7 (4), 375-391 (2015).</li><li>Clarke, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+is+activated+in+systemic+lupus+erythematosus+and+required+for+plasmablast+development.">Autophagy is activated in systemic lupus erythematosus and required for plasmablast development.</a> Ann Rheum Dis. 74 (5), 912-920 (2015).</li><li>Warnes, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+assays+for+the+study+of+autophagy.">Flow cytometric assays for the study of autophagy.</a> Methods. 82, 21-28 (2015).</li><li>Bj&#248;rk&#248;y, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p62/SQSTM1+forms+protein+aggregates+degraded+by+autophagy+and+has+a+protective+effect+on+huntingtin-induced+cell+death.">p62/SQSTM1 forms protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect on huntingtin-induced cell death.</a> J Cell Biol. 171 (4), 603-614 (2005).</li><li>Phadwal, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+autophagy+detection+in+primary+cells:+Impaired+levels+of+macroautophagy+in+immunosenescent+T+cells.">A novel method for autophagy detection in primary cells: Impaired levels of macroautophagy in immunosenescent T cells.</a> Autophagy. 8 (4), 677-689 (2012).</li><li>Rajan, R., Karbowniczek, M., Pugsley, H. R., Sabnani, M. K., Astrinidis, A., La-Beck, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+autophagosomes+and+autolysosomes+in+cells+using+imaging+flow+cytometry.">Quantifying autophagosomes and autolysosomes in cells using imaging flow cytometry.</a> Cytometry A. 87 (5), 451-458 (2015).</li><li>Kwok, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HspB8+mutation+causing+hereditary+distal+motor+neuropathy+impairs+lysosomal+delivery+of+autophagosomes.">HspB8 mutation causing hereditary distal motor neuropathy impairs lysosomal delivery of autophagosomes.</a> J Neurochem. 119 (6), 1155-1161 (2011).</li><li>Lopez-Herrera, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deleterious+Mutations+in+LRBA+Are+Associated+with+a+Syndrome+of+Immune+Deficiency+and+Autoimmunity.">Deleterious Mutations in LRBA Are Associated with a Syndrome of Immune Deficiency and Autoimmunity.</a> Am J Hum Genet. 90 (6), 986-1001 (2012).</li><li>Pike, L. R., Phadwal, K., Simon, A. K., Harris, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATF4+orchestrates+a+program+of+BH3-only+protein+expression+in+severe+hypoxia.">ATF4 orchestrates a program of BH3-only protein expression in severe hypoxia.</a> Mol Biol Rep. 39 (12), 10811-10822 (2012).</li><li>Pike, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+up-regulation+of+ULK1+by+ATF4+contributes+to+cancer+cell+survival.">Transcriptional up-regulation of ULK1 by ATF4 contributes to cancer cell survival.</a> Biochem J. 449 (2), 389-400 (2013).</li><li>Pugsley, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+autophagy:+Measuring+LC3+puncta+and+autolysosome+formation+in+cells+using+multispectral+imaging+flow+cytometry.">Quantifying autophagy: Measuring LC3 puncta and autolysosome formation in cells using multispectral imaging flow cytometry.</a> Methods. 112, 147-156 (2017).</li><li>IDEAS. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Image Data Exploration and Analysis Software User's Manual Version 6.2. , (2015).</li></ol>

אני מועסק על ידי MilliporeSigma, יצרנית של ImageStream המותג Amnis, אשר שימש במחקר זה.

בעת ביצוע ניתוח זה, יש כמה דברים לשקול. חשוב שיהיה דגימות בקרה מתאימות. עבור ניסוי זה, שני בקרות שונות שימשו: שליטה ובקרה + Chloroquine. מדגם הבקרה שימש לקביעת הסף עבור האזורים. הוא מייצג את רמת הבסיס של autophagy מבלי לעצור השפלה ליזוזומלית היא שליטה על המדגם מורעב. עם זאת, מדגם בקרה אינו שליטה נאותה להשוות עם התוצאות מדגם מורעב + כלורוקווין כי chloroquine עצמה משפיעה על מדגם שליטה. לכן, היה צורך להיות מדגם + כלורוקואין בקרה. לפני ביצוע כל ניתוח עבור autophagy, חשוב לנתח רק / שער על תאים בודדים ממוקדים ( כלומר, RMS שיפוע גדול מ -60), כמו התוצאות יכול להיות מושפע אם יש יותר מתא אחד או התמונות לא ממוקד. זה חיוני כי autophagosomEs ו lysosomes ממוקדים ספירת ספוט הנכון ניתוח BDC3. תאים אפופטוטיים יש להסיר לפני ניתוח autophagy, כפי שהם עשויים להטות תוצאות ולא צריך להיכלל. לא צריך להיות מכתים המתאים לכל שלושת הסמנים ( כלומר, LC3, p62, LAMP1). לדוגמה, כל שלושת הסמנים הם תאיים, ויש להם אות נקודתי; אם האות לא לדקלם, או אם הוא על פני השטח של התא, מכתים לא יהיה מתאים את הניסוי / מכתים צריך להיות משוחזר. בנוסף, עבור BDC3 להיות מדויק, זה חיוני השער על תאים בהירים עבור כל שלושה סמנים ניאון של עניין. Gating על אירועים חיוביים יש צורך למנוע את המדידה של BDC3 על שאינם ספציפיים מחייב, הדמיה artifacts, ו / או רעש. זה חיוני, כמו BDC3 יכול פוטנציאל להגביר artifacts שאינם אותות אמיתי. מאז BDC3 יכול להתבצע רק על אירועים חיוביים בהירים, תאים רבים עשויים שלא להיכלל בניתוח הסופי; זה especEly נכון לתאי בקרה שאין להם הצטברות של LC3, p62 ו / או LAMP1. לפיכך, הגבלה של assay זה הוא BDC3 רק בוחן תאים חיוביים עבור כל שלושת הסמנים, אשר עשוי שלא להיות מתאים לכל הניסויים autophagy. כמו BDS, אשר כבר דווחו בעבר 15 , 16 , 17 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , BDC3 לבדו אינו לוקח בחשבון את מספר האורגנים autophagy שיתוף מקומי, וכתוצאה מכך במידה רבה של השתנות במספר האוטופגוזומים. לכן, הגישה הדו-כיוונית שהציג ראג&#39;אן ואח &#39; היה מועסק. בהסתכלות על המגרשים הדו-פעמיים, אפשר לשאול אםהתאים חייבים להיות חיוביים עבור LC3, p62 ו- LAMP1; למה יש כל כך הרבה תאים שיש להם 0 נקודות? הסיבה לכך היא כי האות LC3 עשוי להיות בהיר מספיק עבור שיתוף לוקליזציה, אבל זה לא יכול לענות על סף שנקבע על ידי מסיכת שיא (שיא (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4)) זה נחוץ כדי להיחשב לְזַהוֹת. הפרוטוקול שהוצג כאן השתמשו MIFC לספור LC3 puncta ואת שיתוף לוקליזציה של שלושה סמנים autophagy למדוד שטף autophagic. בתנאים הבסיסיים (מדגם בקרה), מספר האוטופגוזומים היה נמוך, ומעטים נמצאו תאים עם &quot;נקודות גבוהות&quot;. עם תוספת של chloroquine, אשר מעכב היתוך אוטופאגוזום / lysosome, חלה עלייה במספר כתמים LC3. מאז lysosome אינו מסוגל לשבור את autophagosome ואת p62, אשר מתגורר autophagosome, זה מוביל לעלייה של לוקליזציה של LC3, p62, ו LAMP1 autolysosome הצטברות. השפעה זו היתה מוגברת תחת starvat מזיןיון, אשר גורם autophagy. עם זאת, ללא תוספת של chloroquine, לא היה גידול משמעותי במספר autophagosomes, ככל הנראה בשל עלייה בשיעור של autophagic מחזור. כאשר התאים רעבו בנוכחות כלורוקין, חלה עלייה בלוקליזציה המשותפת ובמספר האוטופגוזומים, התומכת במסקנה שהרעבה מגבירה את השטף האוטופאגי. EBSS ידוע כגורם חזק של autophagy. לכן, צפוי כי הגידול יהיה גדול. אם שיטה אחרת, כגון אינדוקציה של סמים, משמשת להפקת אוטופאגי, ההבדל בין הדגימה לשליטה והדגימה עשוי להיות מתוחכם יותר. פרוטוקול מסוים זה נועד למדוד autophagy שורות תאים אנושיים, אבל assay יכול להיות מותאם למינים אחרים על ידי מעבר נוגדנים עבור מינים מסוימים. בנוסף, שיטת הניתוח יכול לשמש עבור כל יישום תאיים הדורש שיתוף לוקליזציהשל שלושה בדיקות / סמנים.

Macroautophagy, המכונה להלן autophagy, הוא מסלול קטבולית שבה רכיבים פגומים או מתפקדת, חלבונים ארוכי טווח, ואת האברונים מושפלים באמצעות lysosome ו ממוחזרים 1 . Autophagy הוא תהליך דינמי, רב-כיווני הכולל את היווצרותו של אוטופגוזום; את ההיתוך של האוטופגוזום עם הליזוזום, שיצר את האוטוליזוסום; ואת השפלה של התוכן של autolysosome 2 . סמן ביולוגי חיוני המשמש לזיהוי autophagy במערכות יונקים הוא חלבון המשויך microtubule 1A / 1B-Light שרשרת 3 (LC3), המהווה את הממברנה האוטופאגוסומלית. במהלך autophagy, cytosolic LC3-1 הוא מצומדות כדי phosphatidylethanolamine כדי ליצור LC3-II; LC3-II משולב אז לתוך קרום autophagosal 3 . סמן נוסף בשימוש נרחב עבור השטף autophagic הוא autophagy receptor sequestosome 1 (SQSTM1, p62) אשר פיזית liמטען אוטופאגית אל הממברנה האוטופאטית 4 , 5 . שיטות אשר שימשו באופן מסורתי למדוד autophagy הם כתמים המערבי מיקרוסקופ פלואורסצנטי 7 . עם זאת, אף אחת משיטות אלה נחשבים &quot;תקן הזהב&quot; , 2 , 6 כמו ישנם אתגרים הקשורים בשתי הטכניקות הללו. כתמים מערביים נותנים רק בממוצע משום שהם משתמשים במדגם הומוגני, כך שצופים לא יכולים לראות מה קורה בתאים בודדים. מצד שני, מיקרוסקופ פלואורסצנטי נותן מידע צופה ברמה אחת התא, אבל זה חסר יכולות התפוקה, מה שהופך אותו קשה להשיג אובייקטיבי הערכות סטטיסטית קפדנית. בשנים האחרונות, את המדידה של LC3 ו p62 על ידי cytometry זרימת multispectral הדמיה (MIFC, ראה טבלה של חומרים ) כבר צובר popuLarity בשל כוח כמותי, יכולות תפוקה גבוהה, פוטנציאל ריבוב, ואת היכולת התמונה כל תא. אחת השיטות הנפוצות ביותר למדידת autophagy באמצעות MIFC, יחד עם תוכנת ניתוח לוויה שלה (ראה טבלה של חומרים ), היא באמצעות ספירת ספוט של LC3 puncta או autophagosomes 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . עם זאת, עלייה autophagosomes לא בהכרח אומר כי קיימת עלייה autophagy, כפי שהוא יכול גם לייצג המצור בתהליך 2 . מחזור LC3-II הוא פרמטר שימושי למדוד שטף autophagic על ידי ניתוח תאים בנוכחות והיעדר מעכב השפלה ליזוזומלית, כגון כלורוקין. Chloroquine מעכב את היתוך של autophagosome כדי lysosome, ובכך לאפשר את quantitation של היווצרות autophagosome כמדד של מידת autophagy על ידי עצירת השטף autophagic לפני השפלה lysosomal יכול להתרחש 18 . בנוסף, p62 הוא מושפל בעיקר על ידי autophagy, ואם השפלה ליזוזומלית של autophagosome ותכולתו חסומה, הצטברות של p62 צפוי 17 , 19 . Autophagy הוא תהליך multistep, ואת המדידה של LC3 או p62 לבד אינו מספק תמונה מלאה של מה שקורה בתאים. פרסומים אחרונים הדגישו את הצורך לבחון את התהוות בו זמנית של autolysosome 2 , 17 , 20 , 21 . MIFC הואבאופן ייחודי מסוגלים למדוד את ההיווצרות של autolysosome ידי הדמית שיתוף הלוקליזציה של autophagosome אל 15 הליזוזום - 17, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26. בנוסף, שיתוף לוקליזציה של p62 ו LC3 באמצעות MIFC יש גם נחקרו למדוד שטף autophagic 5 . בתוכנה ניתוח הפניה, &quot;תכונה&quot; זה מודד שיתוף לוקליזציה נקרא &quot;פרט מפורטת הדמיון R3&quot; (BDS) ו תוכנן במיוחד כדי להשוות את הפרטים הקטנים, התמונה בהירים של שתי תמונות. BDS הוא מקדם המתאם של Pearson המתאם ביומן של נקודות האור המצויות עם רדיוס של 3 פיקסלים או פחות; במילים אחרות, BDS מחשבת את מידת oוריקלינג פיקסלים משני ערוצי ניאון שונים. נקודות האור הן מתואמות ( כלומר, מיקום מרחבי זהה) או בלתי מתואמות ( כלומר, מיקומים מרחביים שונים). לכן, מקדם המתאם משתנה בין 0 (לא מתואם) לבין 1 (קורלציה מושלמת). מקדם הוא יומן- transformed כדי להגדיל את טווח בין אפס לאינסוף 26 , 27 . BDS לבדה לא יכול להיות מספיק; Rajan et al. נמצא כי שימוש רק BDS יכול להוביל לתוצאות חיוביות שגויות או שגויות שלילי 21 . BDS מעריך את שיתוף לוקליזציה של שני סמנים של autophagy אבל לא מחשיב את מספר autophagosomes. כדי להסביר את מספר autophagosomes, Rajan et al. כללה ספירת ספוט של LC3 puncta 21 . Rajan et al. המוצע באמצעות פיזור bivariate העלילה של ספירה LC3 ספוט לעומת BDS. באמצעות העלילה דו-שנתית זו, שתי אוכלוסיותE מזוהה הראשון: אחד עם תאים בעלי רמה גבוהה של כתמים LC3 ואחד עם תאים בעלי רמה נמוכה של כתמים LC3. אוכלוסיית הנקודה הגבוהה של LC3 סווגה לשתי אוכלוסיות: תאים עם לוקליזציה משותפת נמוכה ( כלומר, הצטברות של אוטופגוזומים) ותאים בעלי לוקליזציה גבוהה ( כלומר, הצטברות של אוטוליזוזומים). זו העלילה bivariate מאפשר להבחין בין תאים עם מעט מאוד autophagosoms ותאים עם הצטברות של autophagosomes ו / או autolysosomes 21 . עד כה, לוקליזציה משותפת של LC3, p62, LAMP1 (סמן lysosomal) לא היה אפשרי באמצעות &quot;סוג תכונה&quot; יחיד בתוכנת ניתוח לוויה MIFC (ראה טבלה של חומרים ). עם זאת, תכונה חדשה, הציג לאחרונה בגירסה 6.1, נקרא Bright Detail Colocalization 3 (BDC3). BDC3 משווה את התמונות פירוט בהיר מכל אחת משלוש התמונות (במקרה זה, LC3, p62, ו LAMP1) וכימות co-localization של שלושה בדיקות ( כלומר, LC3, p62, LAMP1). תכונה BDC3 מחשב את מקדם המתאם של פירסון שונה כדי להאריך עד שלוש תמונות. מאחר והנקודות הבהירות בשלוש התמונות הן מתואמות או בלתי מתואמות, מקדם המתאם משתנה בין 0 (לא מתואם) לבין 1 (קורלציה מושלמת). מקדם הוא יומן- transformed כדי להגדיל את טווח דינמי בין 0 ו אינסוף. על ידי החלפת תכונה BDS עם תכונה BDC3, שיטת הניתוח שהוצגו על ידי Rajan et al. יכול כעת לשלב את שלושת הסמנים המשמשים ביותר למדוד autophagy במערכת אחת בעת ובעונה אחת. היכולת co-localize אלה שלושה סמנים של autophagy ב assay אחד יכול להוביל תובנות הרומן לתוך אינדוקציה ו הרגולציה של autophagy. הפרוטוקול הבא מתאר את השלבים כדי לגרום autophagy בתאי Jurkat; תווית התאים עם LC3, p62, ו LAMP1 נוגדנים; לרכוש נתונים על multispEctral זרימת הדמיה cytometer; ולנתח את הנתונים כדי להעריך שטף autophagic.

<table><tbody><tr><td>15 mL centrifuge tube</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>50 mL centrifuge tube</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>AF647 labeled Donkey anti-Mouse - IgG&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-31571</td><td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647. Concntration 2 mg/mL. https://www.thermofisher.com/antibody/product/Donkey-anti-Mouse-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-31571</td></tr><tr><td>anti-human CD107a-PE (LAMP1)</td><td>BioLegend</td><td>328607</td><td>Clone H4A3. Concentration 400 &amp;micro;g/mL. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html</td></tr><tr><td>anti-human CD45- AF488</td><td>BioLegend</td><td>304017</td><td>Clone HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-488-anti-human-cd45-antibody-2738.html</td></tr><tr><td>anti-human CD45- PE&amp;nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>304008</td><td>Clone HI30.&amp;nbsp; http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd45-antibody-708.html</td></tr><tr><td>anti-human CD45-AF647&amp;nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>304018</td><td>Clone HI30.&amp;nbsp; http://www.biolegend.com/alexa-fluor-647-anti-human-cd45-antibody-2739.html</td></tr><tr><td>Anti-LC3 (Human) mAb clone 4E12</td><td>MBL International Corporation</td><td>M152-3</td><td>Clone 4E+12.&amp;nbsp; Concentration 2 mg/mL.&amp;nbsp; https://www.mblintl.com/products/m152-3</td></tr><tr><td>Anti-SQSTM1 / p62 antibody [EPR4844] - Autophagosome Marker (Alexa Fluor 488)</td><td>abcam</td><td>ab185015</td><td>Clone EPR4844.&amp;nbsp; Concentration 0.5 mg/mL.&amp;nbsp; http://www.abcam.com/sqstm1-p62-antibody-epr4844-autophagosome-marker-alexa-fluor-488-ab185015.html</td></tr><tr><td>Chloroquine diphosphate Salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6628-25G</td><td></td></tr><tr><td>Cleanser - Coulter Clenz&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>8546931</td><td>Fill container with 200 mL of Cleanser.&amp;nbsp; https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/</td></tr><tr><td>DAPI Stain 5 mg/mL</td><td>MilliporeSigma</td><td>508741</td><td>http://www.emdmillipore.com/US/en/product/DAPI-Stain---CAS-28718-90-3---Calbiochem,EMD_BIO-508741</td></tr><tr><td>Debubbler - 70% Isopropanol</td><td>MilliporeSigma</td><td>1.3704</td><td>Fill container with 200 mL of Debubbler.&amp;nbsp; http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline 10x</td><td>MilliporeSigma</td><td>BSS-2010-B</td><td>&amp;nbsp;Ca++Mg++ Free&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline 1x</td><td>MilliporeSigma</td><td>BSS-1006-B</td><td>PBS Ca++Mg++ Free&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Earle&#039;s Balanced Salt Solution 1x</td><td>Gibco</td><td>14155</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>04018</td><td>This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed.&amp;nbsp; Irritating to the eyes, respiratory systems and skin.&amp;nbsp; May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes.&amp;nbsp; Potential cancer hazard.&amp;nbsp; http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/</td></tr><tr><td>Hanks&#039; Balanced Salt Solution 1x</td><td>Gibco</td><td>14175</td><td></td></tr><tr><td>Jurkat, Clone E6-1 (ATCC TIB-152)</td><td>ATCC</td><td>TIB-152</td><td>https://www.atcc.org/products/all/TIB-152.aspx</td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids 100x</td><td>HyClone</td><td>SH30238.01</td><td></td></tr><tr><td>MIFC - ImageStreamX Mark II</td><td>MilliporeSigma</td><td>100220</td><td>A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405nm, 488nm, and 642nm lasers was used. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006</td></tr><tr><td>MIFC analysis software - IDEAS 6.2</td><td>MilliporeSigma</td><td>100220</td><td>The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII).&amp;nbsp; IDEAS version 6.2</td></tr><tr><td>MIFC software - INSPIRE</td><td>MilliporeSigma</td><td>100220</td><td>This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII). INSPIRE version 200.1.388.0</td></tr><tr><td>PE anti-human CD107a (LAMP-1) Antibody clone H4A3</td><td>BioLegend</td><td>328608</td><td>http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html</td></tr><tr><td>Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100x</td><td>HyClone</td><td>SV30082.1</td><td></td></tr><tr><td>Rinse - Ultrapure water or deionized water</td><td>NA</td><td>NA</td><td>You can use any ultrapure water or deionized water.&amp;nbsp; Fill container with 900 mL of Rinse.</td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium 1x</td><td>HyClone</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>Sheath - PBS</td><td>MilliporeSigma</td><td>BSS-1006-B</td><td>This is the same as Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline 1X&amp;nbsp; Ca++MG++ free.&amp;nbsp; Fill container with 900 mL of Sheath.</td></tr><tr><td>Siliconized polypropylene microcentrifuge tubes</td><td>Fisherbrand</td><td>02-681-320</td><td>Fisherbran Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5 mL. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-siliconized-low-retention-microcentrifuge-tubes-8/p-193936</td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate solution (100 mM)</td><td>HyClone</td><td>SH30239.01</td><td></td></tr><tr><td>Sterilizer - 0.4 - 0.7% Hypochlorite</td><td>VWR</td><td>JT9416-1</td><td>This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water.&amp;nbsp; Fill container with 200 mL of Sterilzer.</td></tr><tr><td>System Calibration Reagent - SpeedBead</td><td>MilliporeSigma</td><td>400041</td><td>Each tube holds ~10 mL.&amp;nbsp; https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>T75 flask</td><td>Falcon</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>TRITON X-100, PROTEIN GRADE Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered</td><td>MilliporeSigma</td><td>648463-50ML</td><td>http://www.emdmillipore.com/US/en/product/TRITON-X-100,-PROTEIN-GRADE-Detergent,-10%25-Solution,-Sterile-Filtered---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648463</td></tr><tr><td>Water, Cell Culture Grade&amp;nbsp;</td><td>HyClone</td><td>SH30529.03</td><td></td></tr></tbody></table>

assessing autophagic flux by measuring lc3, p62, and lamp1 co-localization using multispectral imaging flow cytometry

Autophagy הוא מסלול קטבולית שבה רכיבים סלולריים נורמלי או מתפקדת כי לצבור במהלך הצמיחה והבחנה מושפלות באמצעות lysosome ו ממוחזרים. במהלך autophagy, חלבון LC3 cytoplasmic הוא lipidated וגויסו את הממברנות האוטופאגוסומליות. האוטופאגוזום מתמזג עם הליזוזום כדי ליצור את האוטוליזוזום, שם מתרחש התמוטטות שלפוחית ​​האוטופגוזום ותכולתו. חלבון ה- p62 הקשור ל- Ubiquitin, אשר נקשר ל- LC3, משמש גם לניטור השטף האוטופאגי. תאים שעוברים autophagy צריך להדגים את שיתוף לוקליזציה של p62, LC3, ו lysosomal סמנים. מיקרוסקופיה Immunofluorescence נעשה שימוש כדי לזהות חזותית LC3 puncta, p62, ו / או lysosomes על בסיס לכל תא. עם זאת, הערכה אובייקטיבית וסטטיסטית קפדנית יכול להיות קשה להשיג. כדי להתגבר על בעיות אלה, cytometry זרימת multispectral הדמיה שימש יחד עם תכונה אנליטית שמשווה את דה בהירהזנב תמונות של שלושה סמנים autophagy (LC3, p62 ו lysosomal LAMP1) ו לכמת שלהם שיתוף לוקליזציה, בשילוב עם ספירה LC3 ספירת למדוד autophagy באופן אובייקטיבי, כמותי, סטטיסטית וחסכונית.

שיטה זו ניתוח משתמשת תכונות מרובות כדי התחת השטף autophagic. על מנת להבין את המגרש הדו-שנתי הסופי, יש לבחון תחילה את מאפייני הניתוח האינדיבידואליים. ספירת האוטופגוזומים היא דרך הגיונית למדידת אוטופאגי; עם זאת, גודל / צורה / בהירות של LC3 puncta יכול להשתנות באופן דרסטי בין תאים. וריאציה יכולה להקשות על ספירת האוטופגוזומים באופן ידני או באמצעות תכונה ספירת ספוט בתוכנת הניתוח. לכן, לא תכונה ספירת ספוט יהיה מושלם בשל השתנות זו גדולה autophagosomes. עם זאת, תכונה טובה ספירת נקודה יעבוד על רוב התאים 26 . איור 3 מציג דוגמאות של מסיכה ספוט של LC3 puncta בתאי Jurkat באמצעות מסכות ספוט שונים. התכונה ספירת ספוט שנבחרה עבור ערכת נתונים זו היא ספוט ספירת_מספר (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4) _4, כלומר התכונה ספירת ספירה ספרה את הנקודות שבהןAk מסומנת במסך ברירת המחדל של ערוץ 11 (M11) בערוץ 11 (Ch11-LC3-AF647) עם יחס רקע ל-תא של 4 (Bright, 4). איור 4 מציג ספירה ספירת היסטוגרמות ותמונות נציג עבור ספוט נקודה ממוצע של שליטה, שליטה + כלורוקווין, מורעב, מורעב + תאים כלורוקין Jurkat שכותרתו אנטי LC3-AF647. שליטה ומורעבת ספירת ספירת ממוצע אינם שונים באופן משמעותי; עם תוספת של chloroquine, יש הבדל גדול בממוצע של כלורוקין + שליטה לעומת כלורוקין מורעב +. התכונה הבאה לחקור היא BDC3. BDC3 הוא מדידה של שיתוף לוקליזציה של שלושה סמנים / בדיקות, במקרה זה, LC3, p62, ו LAMP1. איור 5A - 5D מציג היסטוגרמות BDC3 עבור שליטה, שליטה + כלורוקווין, מורעב, מורעב + תאים כלורוקווין Jurkat שכותרתו עם אנטי p62-AF488, אנטי LAMP1-PE, ו אנטי LC3-AF647. יש מעבר בין ממוצע שליטה לממוצע מורעב, כמו גם את השליטה + Chloroquine מתכוון למוות מורעב Chloroquine. עם זאת, מסתכל על התמונות של תאים מן הציונים BDC3 ממוצע בתרשים 5E - 5H , יש הבדל גדול יותר בין דגימות מאשר היסטוגרמות עשוי להוביל אחד להאמין. הסיבה לכך היא כי BDC3 אינו מחשיב את מספר האורגנים autophagy שיתוף מקומי, וכתוצאה מכך מידה רבה של השתנות במספר autophagosomes עבור ציון BDC3 אותו. ברוב המקרים, יש חפיפה בין כל שלושת הבדיקות, כי גם ברמות הבסיסיות, p62, LAMP1 ו- LC3 צריכים, במידה מסוימת, לשתף-מקום או להתגורר באזורים דומים בתאים. בניגוד לכך, דוגמה של שלושה בדיקות כי לא צריך שיתוף לוקליזציה הם אנטי p62-AF488, אנטי LC3-AF647, צבע DAPI גרעיני עבור מדגם מורעב + Chloroquine, שמוצג באיור 6. &lt;<html> / P&gt; כאשר תכונה ספירת ספוט התכונה BDC3 משולבים, נוכחות של subpopulations שונים המשפרים את היכולת להבחין בין הדוגמאות / התנאים השונים ניכרים. איור 7 מציג את חלקה דו-ספרתית של ספירת ספוט של LC3 לעומת BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 עבור ארבעת הדגימות: בקרה, בקרה + כלורוקין, מורעבים, מורעבים + כלורוקין. מדגם הבקרה שימש כדי לקבוע את אסטרטגיית gating עבור שלוש אוכלוסיות: נקודות נמוכה, נקודות גבוהות / נמוך BDC3, ו גבוה כתמים / גבוהה BDC3. הדגימות בקרה הראו כי יותר מ 98% של תאים היו 1 או פחות כתמים. הגבול בין הנקודות הגבוהות / נמוך BDC3 ו גבוה כתמים / גבוה BDC3 נקבעה ציון BDC3 של 1 כי יותר מ 91% של מדגם בקרה היה ציון BDC3 פחות מ 1. סיכום של התוצאות עבור bivariate מגרשים מוצג בטבלה 1 . <html> גיל = &quot;1&quot;&gt; <img alt="איור 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig1.jpg" /> איור 1: MIFC הגדרת מכשיר. צילום מסך של הגדרות מכשיר MIFC המשמש לניסוי זה, המתואר בשלב 8 של הפרוטוקול. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig2.jpg" /> איור 2: ניתוח תוכנה Gating אסטרטגיה. צילום מסך של תוכנת ניתוח gating התוכנית, המתואר בשלב 9 של הפרוטוקול. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> 10&quot;ג them/ /&gt; איור 3: LC3 מסכת ספוט. Jurkat תא תמונות ומסיכות השתמשו כדי ליצור את ספירת ספירת תכונה. מודגשים (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4), שיא (M11, Ch11-LC3-AF647) , מוארת, 5), ספוט (M11, Ch11-LC3-AF647, מוארת, 5,3,1), ספוט (M11, Ch11-LC3-AF647, מוארת, 6,2,1). המסכה שעבדה הכי טוב עבור כל התאים המוצגים היה שיא (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig4.jpg" /> איור 4: LC3 ספירת ספירת היסטוגרמות. באמצעות ספירת ספוט תכונה ספוט Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4) _4 ו LC3-AF647 ספוט ספירת היסטוגרמות עבור בקרה ( A , כחול בהיר), שליטה + ChloroquinE ( B , כחול), מורעב ( C , ורוד), מורעב + Chloroquine ( D , אדום). ספירת הנקודות הממוצעת עבור בקרה, בקרה + כלורוקין, מורעב, מורעב + כלורוקואין הם 0.07, 1.13, 0.10, 2.77, בהתאמה. BF, LC3-AF647 (אדום), צבע DAPI גרעיני (כחול), וכן מורכב של LC3-AF647 ו תמונות DAPI של תאים נציג עבור ספוט נקודה ממוצע מוצגים עבור בקרה ( E , 0 כתמים), שליטה + Chloroquine ( F , 1 נקודה), מורעב ( G , 0 כתמים), מורעב + Chloroquine ( H , 3 כתמים). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig5.jpg" /> איור 5: היסטוגרמות BDC3 של p62 / LAMP1 / LC3. BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 היסטוגרמות עבורR שליטה ( A , כחול בהיר), שליטה + Chloroquine ( B , כחול), מורעב ( C , ורוד), מורעב + Chloroquine ( D , אדום). ציון BDC3 הממוצע עבור בקרה, בקרה + כלורוקין, מורעב, מורעב + כלורוקווין הם 0.57, 0.82, 0.74, ו 0.98, בהתאמה. BF; P62-AF488 (ירוק); LAMP1-PE (צהוב); LC3-AF647 (אדום); ו - Composite של P62-AF488, LAMP1-PE, ו LC3-AF647 תמונות של תאים נציג של BDC3 הממוצע מוצגים שליטה ( E ), שליטה + כלורוקווין ( F ), מורעב ( G ), מורעב + כלורוקווין H). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig6.jpg" /> איור 6: היסטוגרמות BDC3 של p62 / LC3 / DAPI עבור מדגם מורעב + Chloroquine. ( A ) BDC3 p62 / LC3 / DAPI היסטוגרמה עבור מדגם מורעב + Chloroquine מוצג. הציון הממוצע של BDC3 הוא 0.07. ( B ) BF; P62-AF488 (ירוק); LC3-AF647 (אדום); DAPI (כחול); ואת מורכב של P62-AF488, LC3-AF647, ותמונות DAPI של תאים נציג עבור BDC3 הממוצע מוצג עבור מדגם מורעב + Chloroquine. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig7.jpg" /> איור 7: מגרשים דו-ספריים של LC3 ספוט לעומת BDC3 p62 / LAMP1 / LC3. ( א ) חלקות Bivariate של ספירה LC3 ספוט לעומת BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 לבקרה, שליטה + כלורוקווין, מורעבים, מורעבים + כלורוקווין תאים Jurkat. ( B ) BF; P62-AF488 (ירוק); LAMP1-PE (צהוב); LC3-AF647 (אדום); ואת מרוכבים של p62-AF488, LAMP1-PE, ו LC3-AF647 תמונות משלושה אזורים ( כלומר, נמוך כתמים, כתמים גבוהים / נמוכה BDC3, גבוה כתמים / גבוה BDC3) מוצגים עבור מדגם מורעב + Chloroquine. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> ספירת תאים </td><td> מוארת פירוט קולוקליזציה 3 ממוצע </td><td> ספירת ספוט LC3 ממוצע </td><td> נמוך נקודה </td><td> נקודה גבוהה / נמוכה BDC3 </td><td> נקודה גבוהה / גבוהה BDC3 </td></tr><tr><td> לִשְׁלוֹט </td><td> 439 </td><td> 0.57 </td><td> 0.07 </td><td> 98.2 </td><td> 1.8 </td><td> 0.0 </td></tr><tr><td> שליטה + כלורוקין </td><td> 1432 </td><td> 0.82 </td><td> 1.13 </td><td> 68.9 </Td&gt; <td> 19.5 </td><td> 11.7 </td></tr><tr><td> מוּרעָב </td><td> 1204 </td><td> 0.74 </td><td> 0.10 </td><td> 98.4 </td><td> 0.6 </td><td> 1.0 </td></tr><tr><td> מורעבים + כלורוקין </td><td> 1811 </td><td> 0.98 </td><td> 2.77 </td><td> 32.1 </td><td> 36.9 </td><td> 31.0 </td></tr></tbody></table> טבלה 1: סיכום Jorkat LC3 ספוט ספוט לעומת BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 חלקת Bivariate

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry at JoVE.com

Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

הנה, cytometry זרימת multispectral הדמיה עם תכונה אנליטית שמשווה תמונות פירוט בהיר של 3 סמנים autophagy ו quantifies שיתוף שלהם לוקליזציה, יחד עם ספירת LC3 ספוט, שימש למדוד autophagy באופן אובייקטיבי, כמותי, סטטיסטית וחסכונית.

הערכת השטף autofagic ידי מדידת LC3, p62, ו LAMP1 Co-localization באמצעות multispectral הדמיה cytometry

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via ...

assessing-autophagic-flux-measuring-lc3-p62-lamp1-co-localization

Research

JoVE Journal

Biology

31.0K Views.  MilliporeSigma.  הנה, cytometry זרימת multispectral הדמיה עם תכונה אנליטית שמשווה תמונות פירוט בהיר של 3 סמנים autophagy ו quantifies שיתוף שלהם לוקליזציה, יחד עם ספירת LC3 ספוט, שימש למדוד autophagy באופן אובייקטיבי, כמותי, סטטיסטית וחסכונית. 

Video: Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Assay מיקרוסקופ פלואורסצנטי עבור Mitophagy ניטור השמרים Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

<meta charset="utf8"></head><body>הערכת שחרור EV חיובי LC3-II באוטופגיה עם היתוך ליזוזום לקוי

Evaluation of LC3-II Release via Extracellular Vesicles in Relation to the Accumulation of Intracellular LC3-positive Vesicles

(Macro)autophagy represents a fundamental cellular degradation pathway. In this process, double-membraned vesicles known as autophagosomes engulf cytoplasmic contents, subsequently fusing with lysosomes for degradation. Beyond the canonical role, autophagy-related genes also modulate a secretory pathway involving the release of inflammatory molecules, tissue repair factors, and extracellular vesicles (EVs). Notably, the process of disseminating pathological proteins between cells, particularly in neurodegenerative diseases affecting the brain and spinal cord, underscores the significance of understanding this phenomenon. Recent research suggests that the transactive response DNA-binding protein 43 kDa (TDP-43), a key player in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal lobar degeneration, is released in an autophagy-dependent manner via EVs enriched with the autophagosome marker microtubule-associated proteins 1A/1B light chain 3B-II (LC3-II), especially when autophagosome-lysosome fusion is inhibited.
To elucidate the mechanism underlying the formation and release of LC3-II-positive EVs, it is imperative to establish an accessible and reproducible method for evaluating both intracellular and extracellular LC3-II-positive vesicles. This study presents a detailed protocol for assessing LC3-II levels via immunoblotting in cellular and EV fractions obtained through differential centrifugation. Bafilomycin A1 (Baf), an inhibitor of autophagosome-lysosome fusion, serves as a positive control to enhance the levels of intracellular and extracellular LC3-II-positive vesicles. Tumor susceptibility gene 101 (TSG101) is used as a marker for multivesicular bodies. Applying this protocol, it is demonstrated that siRNA-mediated knockdown of syntaxin-6 (STX6), a genetic risk factor for sporadic Creutzfeldt-Jakob disease, augments LC3-II levels in the EV fraction of cells treated with Baf while showing no significant effect on TSG101 levels. These findings suggest that STX6 may negatively regulate the extracellular release of LC3-II via EVs, particularly under conditions where autophagosome-lysosome fusion is impaired. Combined with established methods for evaluating autophagy, this protocol provides valuable insights into the role of specific molecules in the formation and release of LC3-II-positive EVs.

<meta charset="utf8"></head><body>הערכה של שחרור LC3-II באמצעות שלפוחיות חוץ-תאיות ביחס להצטברות שלפוחיות חיוביות ל-LC3 תוך תאיות

Here, we present the methodology for concisely assessing autophagosome marker LC3-II levels in extracellular vesicles (EVs) by immunoblotting. Analysis for LC3-II levels in EVs, autolysosome formation, and omegasome formation suggests the new role of STX6 in the release of LC3-II-positive EVs when autophagosome-lysosome fusion is inhibited.

הערכה של שחרור LC3-II באמצעות שלפוחיות חוץ-תאיות ביחס להצטברות שלפוחיות חיוביות ל-LC3 תוך תאיות

(Macro)autophagy represents a fundamental cellular degradation pathway. In this process, double-membraned vesicles known as autophagosomes engulf ...

Biochemistry

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a wide variety of disorders including metabolic diseases, premature aging syndromes, and neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD). Maintenance of mitochondrial health depends on mitochondrial biogenesis and the efficient clearance of dysfunctional mitochondria through mitophagy. Experimental methods to accurately detect autophagy/mitophagy, especially in animal models, have been challenging to develop. Recent progress towards the understanding of the molecular mechanisms of mitophagy has enabled the development of novel mitophagy detection techniques. Here, we introduce several versatile techniques to monitor mitophagy in human cells, Caenorhabditis elegans (e.g., Rosella and DCT-1/ LGG-1 strains), and mice (mt-Keima). A combination of these mitophagy detection techniques, including cross-species evaluation, will improve the accuracy of mitophagy measurements and lead to a better understanding of the role of mitophagy in health and disease.

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

Mitophagy, the process of clearing damaged mitochondria, is necessary for mitochondrial homeostasis and health maintenance. This article presents some of the latest mitophagy detection methods in human cells, Caenorhabditis elegans, and mice.

במבחנה and In Vivo זיהוי של Mitophagy ב תאים אנושיים, C. Elegansועכברים

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...

Medicine

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

ניתוח כמותי של Autophagy באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי 3D מתקדם

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

לחיות תא הדמיה של אירועי autophagy מוקדמים: Omegasomes ומעבר

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a simple protocol to monitor this process is described. Moreover, typical results and experimental validation of the method under autophagy-inducing conditions in various types of cultured mammalian cells are provided. During bulk autophagy, autophagosomes sequester cytosol, and thereby also soluble cytosolic proteins, alongside other autophagic cargo. LDH is a stable and highly abundant, soluble cytosolic enzyme that is non-selectively sequestered into autophagosomes. The amount of LDH sequestration therefore reflects the amount of bulk autophagic sequestration. To efficiently and accurately determine LDH sequestration in cells, we employ an electrodisruption-based fractionation protocol that effectively separates sedimentable from cytosolic LDH, followed by measurement of enzymatic activity in sedimentable fractions versus whole-cell samples. Autophagic sequestration is determined by subtracting the proportion of sedimentable LDH in untreated cells from that in treated cells. The advantage of the LDH sequestration assay is that it gives a quantitative measure of the autophagic sequestration of endogenous cargo, as opposed to other methods that either involve ectopic expression of sequestration probes or semi-quantitative protease protection analyses of autophagy markers or receptors.

Here a simple and well-validated protocol for measuring bulk autophagic sequestration activity in mammalian cells is described. The method is based on quantifying the proportion of lactate dehydrogenase (LDH) in sedimentable cell fractions compared to total cellular LDH levels.

לקטט דהידרוגנאז פחמיות וזמינותו — שיטה פשוטה ואמינה לקביעת נפח פעילות פחמיות Autophagic בתאים בתרבית

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a ...

Measuring Diurnal Rhythms in Autophagic and Proteasomal Flux

Cells employ several methods for recycling unwanted proteins and other material, including lysosomal and non-lysosomal pathways. The main lysosome-dependent pathway is called autophagy, while the primary non-lysosomal method for protein catabolism is the ubiquitin-proteasome system. Recent studies in model organisms suggest that the activity of both autophagy and the ubiquitin-proteasome system is not constant across the day but instead varies according to a daily (circadian) rhythm. The ability to measure biological rhythms in protein turnover is important for understanding how cellular quality control is achieved and for understanding the dynamics of specific proteins of interest. Here we present a standardized protocol for quantifying autophagic and proteasomal flux in vivo that captures the circadian component of protein turnover. Our protocol includes details for mouse handling, tissue processing, fractionation, and autophagic flux quantification using mouse liver as the starting material.

We describe our protocol for measuring biological rhythms in protein catabolism via autophagy and the proteasome in mouse liver.

מדידת מקצבים הדיורnal בתצוגה מקדימה של הזרם ופרוטאספאל השטף

Cells employ several methods for recycling unwanted proteins and other material, including lysosomal and non-lysosomal pathways. The main ...

Flux-Based Assay for the Identification of Autophagy Modulators for Osteoarthritis

Autophagy is a central mechanism to regulate homeostasis. Alterations of autophagy contribute to aging-related diseases. Phenotypic methods to identify regulators of autophagy could be used for the identification of novel therapeutics. This article describes a cell-based imaging screening workflow developed to monitor autophagic flux using LC3 as a reporter of autophagic flux (mCherry-EGFP-LC3B) in human chondrocytes. Data acquisition is performed using an automated High Content Imaging Screening System microscope. An algorithm-based automated image analysis protocol was developed and validated to identify molecules activating autophagic flux. Critical steps, explanatory notes, and improvements over current autophagy monitoring protocols are reported. Physiologically relevant phenotypic screening approaches to target hallmarks of aging can facilitate more effective drug discovery strategies for age-related musculoskeletal diseases.

This paper details monitoring autophagy flux to identify new molecules by cell-based imaging screening.

Autophagy is a central mechanism to regulate homeostasis. Alterations of autophagy contribute to aging-related diseases. Phenotypic methods to identify ...

הערכת השטף autofagic ידי מדידת LC3, p62, ו LAMP1 Co-localization באמצעות multispectral הדמיה cytometry

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

Assay מיקרוסקופ פלואורסצנטי עבור Mitophagy ניטור השמרים Saccharomyces cerevisiae

הערכה של שחרור LC3-II באמצעות שלפוחיות חוץ-תאיות ביחס להצטברות שלפוחיות חיוביות ל-LC3 תוך תאיות

הערכה של שחרור LC3-II באמצעות שלפוחיות חוץ-תאיות ביחס להצטברות שלפוחיות חיוביות ל-LC3 תוך תאיות

הערכה של שחרור LC3-II באמצעות שלפוחיות חוץ-תאיות ביחס להצטברות שלפוחיות חיוביות ל-LC3 תוך תאיות

במבחנה and In Vivo זיהוי של Mitophagy ב תאים אנושיים, C. Elegansועכברים

ניתוח כמותי של Autophagy באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי 3D מתקדם

לחיות תא הדמיה של אירועי autophagy מוקדמים: Omegasomes ומעבר

לקטט דהידרוגנאז פחמיות וזמינותו — שיטה פשוטה ואמינה לקביעת נפח פעילות פחמיות Autophagic בתאים בתרבית

מדידת מקצבים הדיורnal בתצוגה מקדימה של הזרם ופרוטאספאל השטף

Flux-Based Assay for the Identification of Autophagy Modulators for Osteoarthritis