Ich möchte meinen Mitarbeitern bei MilliporeSigma, Philip J. Morrissey und Sherree L. Friend, für ihre Unterstützung und Führung im Laufe der Jahre danken. Ich möchte auch Vidya Venkatachalam und Bryan R. Davidson für ihre Hilfe bei der BDC3-Funktion in der IDEAS-Software , Ryan P. Jessup für die Bearbeitung dieses Manuskripts, Raymond Kong für Hilfe am Tag des Schießens und ein besonderes Dankeschön danken Zum Maskenbildner Cynthia Xamonthiene.

<ol>
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Ich bin bei MilliporeSigma beschäftigt, dem Hersteller der Amnis-Marke ImageStream, die in dieser Studie verwendet wurde.

Bei der Durchführung dieser Analyse gibt es ein paar Dinge zu beachten. Es ist wichtig, entsprechende Kontrollproben zu haben. Für dieses Experiment wurden zwei verschiedene Kontrollen verwendet: Kontrolle und Kontrolle + Chloroquin. Die Kontrollprobe wurde verwendet, um die Schwelle für die Regionen festzulegen. Es stellt die Grundstufe der Autophagie dar, ohne den lysosomalen Abbau zu stoppen und ist die Kontrolle für die verstorbene Probe. Allerdings ist die Kontrollprobe keine geeignete Kontrolle, um mit den Ergebnissen der Starved + Chloroquine Probe zu vergleichen, da Chloroquin selbst die Kontrollprobe beeinflusst. Daher war es notwendig, eine Kontrolle + Chloroquin Probe zu haben. Vor der Durchführung einer Analyse für Autophagie, ist es wichtig, nur analysieren / Gate auf einzelne Zellen, die im Fokus sind ( dh Gradient RMS größer als 60), da die Ergebnisse betroffen sein könnten, wenn es mehr als eine Zelle oder die Bilder sind unscharf. Es ist entscheidend, dass das AutophagosomEs und Lysosomen sind im Fokus für die richtige Punktzählung und BDC3-Analyse. Apoptotische Zellen müssen vor der Autophagie-Analyse entfernt werden, da sie Ergebnisse schneiden können und nicht aufgenommen werden sollten. Es sollte eine angemessene Färbung für alle drei Marker ( dh LC3, p62 und LAMP1) geben. Zum Beispiel sind alle drei Marker intrazellulär und sollten ein punktuelles Signal haben; Wenn das Signal nicht punktiert ist oder ob es sich auf der Oberfläche der Zelle befindet, wäre die Färbung nicht angemessen und das Experiment / Färben sollte erneuert werden. Darüber hinaus, für BDC3 genau zu sein, ist es wichtig, auf Zellen, die hell sind für alle drei fluoreszierenden Marker von Interesse. Gating auf positive Ereignisse ist erforderlich, um die Messung von BDC3 auf unspezifische Bindung, Bildgebung Artefakte und / oder Rauschen zu verhindern. Dies ist entscheidend, da BDC3 potenziell Artefakte verstärken kann, die keine wahren Signale sind. Da BDC3 nur bei hellen positiven Ereignissen durchgeführt werden kann, können viele Zellen nicht in die endgültige Analyse einbezogen werden; Das ist especEcht für Kontrollzellen, die keine Akkumulation von LC3, p62 und / oder LAMP1 haben. Eine Einschränkung dieses Assays besteht also darin, dass BDC3 nur Zellen untersucht, die für alle drei Marker positiv sind, die für alle Autophagieexperimente nicht geeignet sind. Wie BDS, die bereits gemeldet wurde, 15 , 16 , 17 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , BDC3 allein, berücksichtigt nicht die Anzahl der autophagischen Organellen, die sich lokalisieren, was zu einem großen Teil führt Der Variabilität in der Anzahl der Autophagosomen. Daher ist der bivariate Ansatz von Rajan et al. war angestellt. Wenn man die bivariate Plots betrachtet, könnte man fragen, obDie Zellen müssen positiv für LC3, p62 und LAMP1 sein; Warum gibt es so viele Zellen, die 0 Spots haben? Dies liegt daran, dass das LC3-Signal für die Co-Lokalisierung hell genug sein könnte, aber es könnte nicht die von der Peak-Maske eingestellte Schwelle (Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4)) erfüllen, die für die Verwendung als a erforderlich ist Stelle. Das hier vorgestellte Protokoll verwendete MIFC, um LC3 puncta zu zählen und die Co-Lokalisierung von drei Autophagie-Markern zur Messung des autophagischen Flusses. Unter basalen Bedingungen (Kontrollprobe) war die Anzahl der Autophagosomen niedrig, und wenige Zellen wurden mit &quot;High Spots&quot; gefunden. Mit der Zugabe von Chloroquin, das die Autophagosom / Lysosomen-Fusion hemmt, kam es zu einer Erhöhung der Anzahl der LC3-Spots. Da das Lysosom nicht in der Lage ist, das Autophagosom zu brechen und das p62, das im Autophagosom liegt, führt dies zu einer Erhöhung der Co-Lokalisation der LC3-, p62- und LAMP1-Autolysosomen-Akkumulation. Dieser Effekt wurde unter Nährstoff-Starvat verstärktIonen, die Autophagie induziert. Allerdings, ohne die Zugabe von Chloroquin, gab es keine signifikante Erhöhung der Anzahl der Autophagosomen, wahrscheinlich aufgrund einer Erhöhung der Rate der autophagischen Umsatz. Als die Zellen in Gegenwart von Chloroquin verhungert wurden, gab es eine Zunahme der Co-Lokalisierung und Anzahl der Autophagosomen, die die Schlussfolgerung unterstützt, dass der Hunger den autophagischen Fluss erhöht. EBSS ist bekannt als ein leistungsfähiger Induktor der Autophagie. Daher ist zu erwarten, dass die Zunahme groß wäre. Wenn ein anderes Verfahren, wie z. B. Arzneimittelinduktion, verwendet wird, um Autophagie zu induzieren, kann der Unterschied zwischen der Kontrolle und den behandelten Proben subtiler sein. Dieses spezielle Protokoll wurde entwickelt, um Autophagie in menschlichen Zelllinien zu messen, aber der Assay könnte an andere Spezies angepasst werden, indem er auf Antikörper für diese spezielle Spezies umschaltet. Darüber hinaus könnte die Analyse-Methode für jede intrazelluläre Anwendung, die die Co-Lokalisierung erfordert verwendet werdenVon drei Sonden / Markern.

Makroautophagie, im Folgenden Autophagie genannt, ist ein katabolischer Weg, in dem beschädigte oder dysfunktionelle Komponenten, langlebige Proteine ​​und Organellen über das Lysosom abgebaut und recycelt werden 1 . Autophagie ist ein dynamischer, mehrstufiger Prozess, der die Bildung eines Autophagosoms beinhaltet; Die Verschmelzung des Autophagosoms mit dem Lysosom, die das Autolysosom bildet; Und der Abbau des Inhalts des Autolysosoms 2 . Der entscheidende biologische Marker, der zur Identifizierung von Autophagie in Säugetiersystemen verwendet wird, ist das Mikrotubuli-assoziierte Protein 1A / 1B-leichte Kette 3 (LC3), das die autophagosomale Membran bildet. Während der Autophagie wird zytosolisches LC3-1 an Phosphatidylethanolamin konjugiert, um LC3-II zu bilden; LC3-II wird dann in die autophagosomale Membran 3 eingearbeitet. Ein weiterer weit verbreiteter Marker für autophagischen Fluss ist das Autophagie-Rezeptor-Sequestosom 1 (SQSTM1, p62), das physisch liNaut autophagische Ladung an die autophagische Membran 4 , 5 . Methoden, die traditionell verwendet wurden, um Autophagie zu messen, sind Western Blots und Fluoreszenzmikroskopie 7 . Jedoch werden keine dieser Methoden als der &quot;Goldstandard&quot; betrachtet 2 , 6, da es Herausforderungen gibt, die mit diesen beiden Techniken verbunden sind. Western Blots geben nur einen Durchschnitt, weil sie eine homogenate Probe verwenden, so dass Beobachter nicht sehen können, was in einzelnen Zellen passiert. Auf der anderen Seite gibt die Fluoreszenzmikroskopie eine Beobachterinformation auf der einzelligen Ebene, aber es fehlt die Durchsatzfähigkeit, so dass es schwierig ist, objektive und statistisch rigorose Einschätzungen zu erhalten. In den letzten Jahren hat die Messung von LC3 und p62 durch multispektrale Bildgebungsdurchflusszytometrie (MIFC, siehe Tabelle der Materialien ) popu gewonnenGröße durch seine quantitative Leistung, hohe Durchsatzfähigkeiten, Multiplex-Potential und die Fähigkeit, jede Zelle abzubilden. Eine der am weitesten verbreiteten Methoden zur Messung der Autophagie mit MIFC, zusammen mit ihrer Begleitanalyse-Software (siehe Tabelle der Materialien ), ist durch die Punktzählung von LC3 puncta oder autophagosomen 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . Allerdings bedeutet eine Erhöhung der Autophagosomen nicht zwangsläufig, dass es eine Erhöhung der Autophagie gibt, da sie auch eine Blockade im Prozess darstellen könnte 2 . LC3-II Umsatz ist ein nützlicher Parameter, um autophagischen Fluss zu messen durch die Analyse von Zellen in der Gegenwart undAbwesenheit eines lysosomalen Abbauinhibitors, wie Chloroquin. Chloroquin inhibiert die Fusion des Autophagosom zum Lysosom, wodurch die Quantifizierung der Autophagosom Bildung als Maß für den Grad der durch autophagy autophagischen Flußmittel vor dem lysosomalen Abbau Arretieren kann 18 auftreten. Darüber hinaus wird p62 primär durch Autophagie abgebaut, und wenn der lysosomale Abbau des Autophagosoms und seines Inhalts blockiert wird, wird eine Anreicherung von p62 erwartet, 17 , 19 . Autophagy ist ein mehrstufiger Prozess, und die Messung von LC3 oder p62 allein liefert kein vollständiges Bild dessen, was in den Zellen passiert. Die jüngsten Veröffentlichungen haben die Notwendigkeit betont, die gleichzeitige Bildung des Autolysosoms 2 , 17 , 20 , 21 zu untersuchen . MIFC istDie die Bildung des Autolysosoms durch die Abbildung der Co-Lokalisierung des Autophagosoms an das Lysosom 15 - 17 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 eindeutig messen kann. Darüber hinaus wurde auch die Co-Lokalisierung von p62 und LC3 unter Verwendung von MIFC untersucht, um den autophagischen Fluss 5 zu messen. In der referenzierten Analysesoftware heißt das &quot;Merkmal&quot;, das die Co-Lokalisierung misst, &quot;Bright Detail Similarity R3&quot; (BDS) und wurde speziell entworfen, um die kleinen, hellen Bilddetails von zwei Bildern zu vergleichen. BDS ist der logarithmierte Pearson-Korrelationskoeffizient der lokalisierten hellen Flecken mit einem Radius von 3 Pixeln oder weniger; Mit anderen Worten, BDS berechnet den Grad von oVerkürzte Pixel aus zwei verschiedenen Fluoreszenzkanälen. Die hellen Flecken sind entweder korreliert ( dh gleiche räumliche Lage) oder unkorrelierte ( dh unterschiedliche räumliche Orte). Daher variiert der Korrelationskoeffizient zwischen 0 (unkorreliert) und 1 (perfekte Korrelation). Der Koeffizient wird log-transformiert, um den Bereich zwischen null und unendlich 26 , 27 zu erhöhen. BDS allein darf nicht ausreichen; Rajan et al. Dass mit nur BDS zu falsch-positiven oder falsch-negativen Ergebnissen führen könnte 21 . BDS bewertet die Co-Lokalisierung von zwei Marker der Autophagie, aber nicht die Anzahl der Autophagosomen. Um die Anzahl der Autophagosomen zu berücksichtigen, haben Rajan et al. Inklusive Punktzählung der LC3 puncta 21 . Rajan et al. Vorgeschlagen, mit einem bivariate Scatter-Plot von LC3-Spot-Zählung gegenüber BDS. Mit dieser bivariate Handlung, zwei Populationen werE zuerst identifiziert: eine mit Zellen, die ein hohes Maß an LC3 Spots und eine mit Zellen, die ein niedriges Niveau von LC3 Spots haben. Die Hoch-LC3-Punkt-Population wurde weiter in zwei Populationen unterteilt: Zellen mit geringer Co-Lokalisierung ( dh Akkumulation von Autophagosomen) und Zellen mit hoher Co-Lokalisierung ( dh Akkumulation von Autolysosomen). Diese bivariate Handlung erlaubt es, zwischen Zellen mit sehr wenigen Autophagosomen und Zellen mit einer Anhäufung von Autophagosomen und / oder Autolysosomen zu unterscheiden 21 . Bisher war die gleichzeitige Ko-Lokalisierung von LC3, p62 und LAMP1 (lysosomaler Marker) nicht möglich mit einem einzigen &quot;Feature Type&quot; in der MIFC Companion Analysesoftware (siehe Tabelle der Materialien ). Ein neues Feature, das kürzlich in Version 6.1 eingeführt wurde, heißt Bright Detail Colocalization 3 (BDC3). BDC3 vergleicht die hellen Detailbilder von jedem der drei Bilder (in diesem Fall LC3, p62 und LAMP1) und quantifiziert die Co-Lokalisierung der drei Sonden ( dh LC3, p62 und LAMP1). Die BDC3-Funktion berechnet den Korrekturkoeffizienten des Pearson, der modifiziert wurde, um auf drei Bilder zu erweitern. Da die hellen Flecken in den drei Bildern entweder korreliert oder unkorreliert sind, variiert der Korrelationskoeffizient zwischen 0 (unkorreliert) und 1 (perfekte Korrelation). Der Koeffizient wird log-transformiert, um den Dynamikbereich zwischen 0 und unendlich zu erhöhen. Durch das Ausschalten der BDS-Funktion mit der BDC3-Funktion, die Analyse-Methode von Rajan et al. Kann nun die drei am häufigsten verwendeten Marker zur Messung der Autophagie in einem System zur gleichen Zeit einbinden. Die Fähigkeit, diese drei Marker von Autophagie in einem einzigen Assay zu lokalisieren, könnte zu neuartigen Einsichten in die Induktion und Regulierung der Autophagie führen. Das folgende Protokoll skizziert die Schritte, um Autophagie in Jurkat-Zellen zu induzieren; Markieren Sie die Zellen mit LC3-, p62- und LAMP1-Antikörpern; Erwerben von Daten auf einem MultispEctral Bildgebungsdurchflusszytometer; Und analysieren die Daten, um autophagischen Fluss zu beurteilen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1012">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">15 mL centrifuge tube</td>
			<td style="width:244px;">Falcon</td>
			<td style="width:161px;">352096</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="121">
			<td height="121" style="height:121px;">AF647 labeled Donkey anti-Mouse - IgG&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-31571</td>
			<td style="width:299px;">Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647. Concntration 2mg/mL. https://www.thermofisher.com/antibody/product/Donkey-anti-Mouse-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-31571</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:308px;">anti-human CD107a-PE (LAMP1)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>328607</td>
			<td style="width:299px;">Clone H4A3. Concentration 400 &#181;g/mL. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;">anti-human CD45- AF488</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304017</td>
			<td style="width:299px;">Clone HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-488-anti-human-cd45-antibody-2738.html</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;">anti-human CD45- PE&#160;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304008</td>
			<td style="width:299px;">Clone HI30.&#160; http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd45-antibody-708.html</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;">anti-human CD45-AF647&#160;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304018</td>
			<td style="width:299px;">Clone HI30.&#160; http://www.biolegend.com/alexa-fluor-647-anti-human-cd45-antibody-2739.html</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:308px;">Anti-LC3 (Human) mAb clone 4E12</td>
			<td>MBL International Corporation</td>
			<td>M152-3</td>
			<td style="width:299px;">Clone 4E+12.&#160; Concentration 2 mg/mL.&#160; https://www.mblintl.com/products/m152-3</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:308px;">Anti-SQSTM1 / p62 antibody [EPR4844] - Autophagosome Marker (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab185015</td>
			<td style="width:299px;">Clone EPR4844.&#160; Concentration 0.5 mg/mL.&#160; http://www.abcam.com/sqstm1-p62-antibody-epr4844-autophagosome-marker-alexa-fluor-488-ab185015.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Chloroquine diphosphate Salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6628-25G</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:308px;">Cleanser - Coulter Clenz&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>8546931</td>
			<td style="width:299px;">Fill container with 200 mL of Cleanser.&#160; https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:308px;">DAPI Stain 5mg/mL</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>508741</td>
			<td style="width:299px;">http://www.emdmillipore.com/US/en/product/DAPI-Stain---CAS-28718-90-3---Calbiochem,EMD_BIO-508741</td>
		</tr>
		<tr height="121">
			<td height="121" style="height:121px;width:308px;">Debubbler - 70% Isopropanol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>1.3704</td>
			<td style="width:299px;">Fill container with 200 mL of Debubbler.&#160; http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:308px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 10X</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>BSS-2010-B</td>
			<td style="width:299px;">&#160;Ca++Mg++ Free&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 1X</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td style="width:299px;">PBS Ca++Mg++ Free&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Earle&#39;s Balanced Salt Solution 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14155</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="241">
			<td height="241" style="height:241px;width:308px;">Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>04018</td>
			<td style="width:299px;">This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed.&#160; Irritating to the eyes, respiratory systems and skin.&#160; May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes.&#160; Potential cancer hazard.&#160; http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Hanks&#39; Balanced Salt Solution 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:308px;">Jurkat, Clone E6-1 (ATCC TIB-152)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-152</td>
			<td style="width:299px;">https://www.atcc.org/products/all/TIB-152.aspx</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">MEM Non-Essential Amino Acids 100X</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30238.01</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="201">
			<td height="201" style="height:201px;width:308px;">MIFC - ImageStreamX Mark II</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>100220</td>
			<td style="width:299px;">A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405nm, 488nm, and 642nm lasers was used. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:308px;">MIFC analysis software - IDEAS 6.2</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>100220</td>
			<td style="width:299px;">The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII).&#160; IDEAS version 6.2</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:308px;">MIFC software - INSPIRE</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>100220</td>
			<td style="width:299px;">This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII). INSPIRE version 200.1.388.0</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:308px;">PE anti-human CD107a (LAMP-1) Antibody clone H4A3</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>328608</td>
			<td style="width:299px;">http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:308px;">Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30082.1</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:308px;">Rinse - Ultrapure water or deionized water</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td style="width:299px;">You can use any ultrapure water or deionized water.&#160; Fill container with 900 mL of Rinse.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">RPMI-1640 Medium 1X</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30027.01</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:308px;">Sheath - PBS</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td style="width:299px;">This is the same as Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 1X&#160; Ca++MG++ free.&#160; Fill container with 900mL of Sheath.</td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:308px;">Siliconized polypropylene microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-681-320</td>
			<td style="width:299px;">Fisherbran Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5 mL. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-siliconized-low-retention-microcentrifuge-tubes-8/p-193936</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Sodium Pyruvate solution (100mM)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30239.01</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:308px;">Sterilizer - 0.4-0.7% Hypochlorite</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JT9416-1</td>
			<td style="width:299px;">This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water.&#160; Fill container with 200 mL of Sterilzer.</td>
		</tr>
		<tr height="121">
			<td height="121" style="height:121px;width:308px;">System Calibration Reagent - SpeedBead</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>400041</td>
			<td style="width:299px;">Each tube holds ~10 mL.&#160; https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">T75 flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:308px;">TRITON X-100, PROTEIN GRADE Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>648463-50ML</td>
			<td style="width:299px;">http://www.emdmillipore.com/US/en/product/TRITON-X-100,-PROTEIN-GRADE-Detergent,-10%25-Solution,-Sterile-Filtered---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648463</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Water, Cell Culture Grade&#160;</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30529.03</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing autophagic flux by measuring lc3, p62, and lamp1 co-localization using multispectral imaging flow cytometry

Autophagie ist ein katabolischer Weg, in dem normale oder dysfunktionelle zelluläre Komponenten, die sich während des Wachstums und der Differenzierung ansammeln, über das Lysosom abgebaut und recycelt werden. Während der Autophagie wird das zytoplasmatische LC3-Protein lipidiert und an die autophagosomalen Membranen rekrutiert. Das Autophagosom verschmilzt dann mit dem Lysosom, um das Autolysosom zu bilden, wo der Abbau der Autophagosomen-Vesikel und deren Inhalt auftritt. Das ubiquitin-assoziierte Protein p62, das an LC3 bindet, wird auch zur Überwachung des autophagischen Flusses verwendet. Zellen, die sich einer Autophagie unterziehen, sollten die Co-Lokalisierung von p62, LC3 und lysosomalen Markern nachweisen. Immunfluoreszenzmikroskopie wurde verwendet, um LC3 puncta, p62 und / oder Lysosomen auf einer per-Zell-Basis visuell zu identifizieren. Eine objektive und statistisch rigorose Bewertung kann jedoch schwierig sein. Um diese Probleme zu überwinden, wurde die multispektrale Bildgebungsdurchflusszytometrie zusammen mit einem analytischen Merkmal verwendet, das die helle de vergleicht(LC3, p62 und lysosomale LAMP1) und quantifiziert ihre Co-Lokalisierung in Kombination mit LC3-Punktzählung, um Autophagie in einer objektiven, quantitativen und statistisch robusten Weise zu messen.

Diese Analysemethode verwendet mehrere Merkmale, um den autophagischen Fluss zu bekämpfen. Um die endgültige bivariate Handlung vollständig zu verstehen, müssen zunächst die einzelnen Analysemerkmale untersucht werden. Das Zählen von Autophagosomen ist ein logischer Weg, um Autophagie zu messen; Allerdings kann die Größe / Form / Helligkeit von LC3 puncta drastisch zwischen den Zellen variieren. Variation kann es schwierig machen, Autophagosomen manuell zu zählen oder eine Spot-Zählfunktion in der Analysesoftware zu verwenden. Daher ist kein Punktzähler-Feature perfekt aufgrund dieser großen Variabilität in Autophagosomen. Jedoch wird ein gutes Punktzählungsmerkmal an den meisten Zellen arbeiten 26 . Abbildung 3 zeigt Beispiele für die Punktmaskierung von LC3-Puncta in Jurkat-Zellen mit verschiedenen Spotmasken. Die für diesen Datensatz ausgewählte Spot-Count-Funktion ist Spot Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4) _4, was bedeutet, dass die Spot-Zähl-Funktion die Spots gezählt hatAk-Maske (M11) auf Kanal 11 (Ch11-LC3-AF647) mit einem Punkt-zu-Zellen-Hintergrundverhältnis von 4 (Bright, 4) identifiziert. Fig. 4 zeigt Spot-Zähl-Histogramme und repräsentative Bilder für die mittlere Spotzahl für die mit Anti-LC3-AF647 markierten Kontroll-, Kontroll- + Chloroquin-, verhungerten und verhungerten + Chloroquin-Jurkat-Zellen. Die Kontrolle und die verhungerten Mittelpunkte sind nicht signifikant unterschiedlich; Bei der Zugabe von Chloroquin gibt es einen großen Unterschied im Mittel der Kontrolle + Chloroquin im Vergleich zu dem Starved + Chloroquin. Die nächste zu untersuchende Funktion ist BDC3. BDC3 ist ein Maß für die Co-Lokalisierung von drei Markern / Sonden, in diesem Fall LC3, p62 und LAMP1. Abbildung 5A - 5D zeigt BDC3-Histogramme für die mit Anti-p62-AF488 markierten Kontroll-, Kontroll- + Chloroquin-, verhungerten und verhungerten + Chloroquin-Jurkat-Zellen, Anti-LAMP1-PE und Anti-LC3-AF647. Es gibt eine Verschiebung zwischen dem Kontrollmittel zum verhungerten Mittelwert, sowie die Kontrolle + Chloroquin bedeutet für das Starved + Chloroquin-Mittel. Wenn man jedoch die Bilder von Zellen aus den mittleren BDC3-Scores in Abbildung 5E- 5H betrachtet , gibt es einen größeren Unterschied zwischen den Proben, als die Histogramme einen zu glauben führen können. Dies ist, weil BDC3 nicht die Anzahl der Autophagie Organellen, die co-lokalisieren, was zu einem großen Maß an Variabilität in der Anzahl der Autophagosomen für die gleiche BDC3-Score. In den meisten Fällen gibt es eine Überlappung zwischen allen drei Sonden, da auch in Basalstufen p62, LAMP1 und LC3 bis zu einem gewissen Grad in ähnlichen Bereichen in den Zellen co-lokalisieren oder sich befinden sollen. Als Kontrast kann ein Beispiel für drei Sonden, die nicht ko-lokalisieren sollten, anti-p62-AF488, anti-LC3-AF647 und DAPI-Kernfarbstoff für die Starved + Chloroquine-Probe, wie in Abbildung 6 gezeigt/ P&gt; Wenn das Spot-Zählmerkmal und die BDC3-Funktion kombiniert werden, ist das Vorhandensein unterschiedlicher Subpopulationen, die die Fähigkeit zur Unterscheidung zwischen den verschiedenen Proben / Bedingungen verbessern, offensichtlich. Abbildung 7 zeigt die bivariate Darstellung der Spotzahl von LC3 gegenüber BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 für die vier Proben: Kontrolle, Kontrolle + Chloroquin, verhungert und verhungert + Chloroquin. Die Kontrollprobe wurde verwendet, um die Gating-Strategie für drei Populationen festzulegen: Low Spots, High Spots / Low BDC3 und High Spots / High BDC3. Die Kontrollproben zeigten, dass mehr als 98% der Zellen 1 oder weniger Flecken hatten. Die Grenze zwischen den High Spots / Low BDC3 und High Spots / High BDC3 wurde auf einen BDC3 Score von 1 gesetzt, da mehr als 91% der Control Probe einen BDC3 Score von weniger als 1 hatten. Eine Zusammenfassung der Ergebnisse für die bivariate Plots Ist in Tabelle 1 dargestellt . Alter = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Abbildung 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig1.jpg" /> Abbildung 1: Einstellung des MIFC-Geräts. Ein Screenshot der MIFC-Instrumenteneinstellungen, die für dieses Experiment verwendet wurden, in Schritt 8 des Protokolls skizziert. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig2.jpg" /> Abbildung 2: Analyse-Software-Gating-Strategie. Ein Screenshot der Analyse-Software-Gating-Schema, skizziert in Schritt 9 des Protokolls. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Fig3.jpg &quot;/&gt; Abbildung 3: LC3-Spot-Maskierung. Jurkat Zelle Bilder und Masken verwendet, um die Spot-Zähl-Feature zu erstellen. Gezeigt sind BrightField (BF), LC3-AF647, Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 2), Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4), Peak (M11, Ch11-LC3-AF647) , Bright, 5), Spot (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 5,3,1) und Spot (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 6,2,1). Die Maske, die am besten für alle gezeigten Zellen funktionierte, war Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig4.jpg" /> Abbildung 4: LC3-Spot-Count-Histogramme. Verwenden Sie die Spot-Count-Funktion Spot Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4) _4 und die LC3-AF647 Spot-Zähler-Histogramme für Control ( A , hellblau), Control + ChloroquinE ( B , blau), verhungert ( C , rosa) und verhungert + Chloroquin ( D , rot). Der mittlere Punkt zählt für Kontrolle, Kontrolle + Chloroquin, verhungert und verhungert + Chloroquin sind 0,07, 1,13, 0,10 bzw. 2,77. BF, LC3-AF647 (rot), DAPI-Kernfarbstoff (blau) und ein Komposit der LC3-AF647- und DAPI-Bilder von repräsentativen Zellen für die mittlere Punktzahl sind für die Kontrolle ( E , 0-Punkte), Control + Chloroquin ( F , 1 Stelle), Starved ( G , 0 Spots) und Starved + Chloroquine ( H , 3 Spots). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig5.jpg" /> Abbildung 5: BDC3 Histogramme von p62 / LAMP1 / LC3. BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 Histogramme fürR Kontrolle ( A , hellblau), Kontrolle + Chloroquin ( B , Blau), Verhungert ( C , Rosa) und Starved + Chloroquin ( D , Rot). Die mittlere BDC3-Punktzahl für Kontrolle, Kontrolle + Chloroquin, Starved und Starved + Chloroquin beträgt 0,57, 0,82, 0,74 bzw. 0,98. BF; P62-AF488 (grün); LAMP1-PE (gelb); LC3-AF647 (rot); Und ein Composite der p62-AF488-, LAMP1-PE- und LC3-AF647-Bilder von repräsentativen Zellen für den mittleren BDC3 sind für die Kontrolle ( E ), Control + Chloroquin ( F ), Starved ( G ) und Starved + Chloroquin ( H ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig6.jpg" /> Abbildung 6: BDC3 Histogramme von p62 / LC3 / DAPI für die Starved + Chloroquine Probe. ( A ) BDC3 p62 / LC3 / DAPI-Histogramm für die Starved + Chloroquin-Probe wird gezeigt. Die mittlere BDC3-Punktzahl beträgt 0,07. ( B ) BF; P62-AF488 (grün); LC3-AF647 (rot); DAPI (blau); Und ein Komposit der p62-AF488-, LC3-AF647- und DAPI-Bilder von repräsentativen Zellen für den mittleren BDC3 ist für die Starved + Chloroquin-Probe gezeigt. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig7.jpg" /> Abbildung 7: Bivariate Plots von LC3 Spot Count gegen BDC3 p62 / LAMP1 / LC3. ( A ) Bivariate Plots der LC3-Spotzahl gegenüber BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 für Control, Control + Chloroquine, Starved und Starved + Chloroquine Jurkat-Zellen. ( B ) BF; P62-AF488 (Grün); LAMP1-PE (gelb); LC3-AF647 (rot); Und ein Verbund der p62-AF488-, LAMP1-PE- und LC3-AF647-Bilder aus drei Regionen ( dh Low Spots, High Spots / Low BDC3 und High Spots / High BDC3) sind für die Starved + Chloroquine-Probe gezeigt. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Anzahl der Zellen </td><td> Helles Detail Kolokalisierung 3 Mittelwert </td><td> Spot Count LC3 Mittler </td><td> % Niedriger Punkt </td><td> % High Spot / Low BDC3 </td><td> % High Spot / High BDC3 </td></tr><tr><td> Steuern </td><td> 439 </td><td> 0,57 </td><td> 0,07 </td><td> 98.2 </td><td> 1.8 </td><td> 0,0 </td></tr><tr><td> Kontrolle + Chloroquin </td><td> 1432 </td><td> 0,82 </td><td> 1.13 </td><td> 68,9 </Td&gt; <td> 19.5 </td><td> 11.7 </td></tr><tr><td> Verhungert </td><td> 1204 </td><td> 0,74 </td><td> 0.10 </td><td> 98.4 </td><td> 0,6 </td><td> 1,0 </td></tr><tr><td> Verhungert + Chloroquin </td><td> 1811 </td><td> 0,98 </td><td> 2.77 </td><td> 32.1 </td><td> 36,9 </td><td> 31.0 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Zusammenfassung der Jurkat LC3 Spotzählung gegenüber BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 Bivariate Plot

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Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

Hier wurde die multispektrale bildgebende Durchflusszytometrie mit einem analytischen Merkmal, das helle Detailbilder von 3 Autophagie-Markern vergleicht und deren Co-Lokalisierung zusammen mit der LC3-Spotzählung quantifiziert, verwendet, um Autophagie objektiv, quantitativ und statistisch robust zu messen.

Assessing Autophagic Flux durch Messung von LC3, p62 und LAMP1 Co-Lokalisierung mittels Multispektral Imaging Flow Cytometry

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via ...

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Research

JoVE Journal

Biology

31.0K Aufrufe.  MilliporeSigma.  Hier wurde die multispektrale bildgebende Durchflusszytometrie mit einem analytischen Merkmal, das helle Detailbilder von 3 Autophagie-Markern vergleicht und deren Co-Lokalisierung zusammen mit der LC3-Spotzählung quantifiziert, verwendet, um Autophagie objektiv, quantitativ und statistisch robust zu messen. 

Serie: Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic principle extends that of sandwich ELISA, wherein the captured primary analyte can be detected together with other molecules physically associated within multiprotein complexes. The procedure involves covalent coupling of polystyrene latex microbeads with immunoprecipitating monoclonal antibodies (mAb) specific for a protein of interest, incubating these beads with cell lysates, probing captured protein complexes with fluorochrome-conjugated probes, and analyzing bead-associated fluorescence by flow cytometry. IP-FCM is extremely sensitive, allows analysis of proteins in their native (non-denatured) state, and is amenable to either semi-quantitative or quantitative analysis. As additional advantages, IP-FCM requires no genetic engineering or specialized equipment, other than a flow cytometer, and it can be readily adapted for high-throughput applications.

The IP-FCM method is presented, which allows a sensitive, robust, biochemical assessment of native protein-protein interactions, without requiring genetic engineering or large sample sizes.

IP-FCM: Immunpräzipitation mittels Durchflusszytometrie Detected

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic ...

Forschung

Biologie

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Durchflusszytometrie Reinigung der Maus meiotischen Zellen

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating cells. Cell cycle division is an integral part of growth and reproduction and deregulation of key cell cycle components have been implicated in the precipitating events of carcinogenesis 1,2. Molecular agents in anti-cancer therapies frequently target biological pathways responsible for the regulation and coordination of cell cycle division 3. Although cell cycle kinetics tend to vary according to cell type, the distribution of cells amongst the four stages of the cell cycle is rather consistent within a particular cell line due to the consistent pattern of mitogen and growth factor expression. Genotoxic events and other cellular stressors can result in a temporary block of cell cycle progression, resulting in arrest or a temporary pause in a particular cell cycle phase to allow for instigation of the appropriate response mechanism. 
The ability to experimentally observe the behavior of a cell population with reference to their cell cycle progression stage is an important advance in cell biology. Common procedures such as mitotic shake off, differential centrifugation or flow cytometry-based sorting are used to isolate cells at specific stages of the cell cycle 4-6. These fractionated, cell cycle phase-enriched populations are then subjected to experimental treatments. Yield, purity and viability of the separated fractions can often be compromised using these physical separation methods. As well, the time lapse between separation of the cell populations and the start of experimental treatment, whereby the fractionated cells can progress from the selected cell cycle stage, can pose significant challenges in the successful implementation and interpretation of these experiments.
Other approaches to study cell cycle stages include the use of chemicals to synchronize cells. Treatment of cells with chemical inhibitors of key metabolic processes for each cell cycle stage are useful in blocking the progression of the cell cycle to the next stage. For example, the ribonucleotide reductase inhibitor hydroxyurea halts cells at the G1/S juncture by limiting the supply of deoxynucleotides, the building blocks of DNA. Other notable chemicals include treatment with aphidicolin, a polymerase alpha inhibitor for G1 arrest, treatment with colchicine and nocodazole, both of which interfere with mitotic spindle formation to halt cells in M phase and finally, treatment with the DNA chain terminator 5-fluorodeoxyridine to initiate S phase arrest 7-9. Treatment with these chemicals is an effective means of synchronizing an entire population of cells at a particular phase. With removal of the chemical, cells rejoin the cell cycle in unison. Treatment of the test agent following release from the cell cycle blocking chemical ensures that the drug response elicited is from a uniform, cell cycle stage-specific population. However, since many of the chemical synchronizers are known genotoxic compounds, teasing apart the participation of various response pathways (to the synchronizers vs. the test agents) is challenging. 
Here we describe a metabolic labeling method for following a subpopulation of actively cycling cells through their progression from the DNA replication phase, through to the division and separation of their daughter cells. Coupled with flow cytometry quantification, this protocol enables for measurement of kinetic progression of the cell cycle in the absence of either mechanically- or chemically- induced cellular stresses commonly associated with other cell cycle synchronization methodologies 10. In the following sections we will discuss the methodology, as well as some of its applications in biomedical research.

Tracking subtle changes in the progression and kinetics of cell cycle stages can be accomplished by use of a combination of metabolic labeling of nucleic acids with BrdU and total genomic DNA staining via Propidium Iodide. This method avoids the need of chemical synchronization of cycling cells, thereby preventing the introduction of non-specific DNA damage, which in turn affects cell cycle progression.

Mess-Zellzyklus-Progression Kinetics mit Metabolische Markierung und Durchflusszytometrie

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

Optimiert Färbung und Proliferation Modeling-Methoden für die Zellteilung Überwachung mit Cell-Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Spermatozoa are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be prepared to face a constantly changing environment and to overcome several physical barriers. Being in essence transcriptionally and translationally silent, these motile cells rely profoundly on diverse signaling mechanisms to orient themselves and swim in a directed fashion, and to contend with challenging environmental conditions during their journey to find the egg. In particular, Ca2+-mediated signaling is pivotal for several sperm functions: activation of motility, capacitation (a complex process that prepares sperm for the acrosome reaction) and the acrosome reaction (an exocytotic event that allows sperm-egg fusion). The use of fluorescent dyes to track intracellular fluctuations of this ion is of remarkable importance due to their ease of application, sensitivity, and versatility of detection. Using one single dye-loading protocol we utilize four different fluorometric techniques to monitor sperm Ca2+ dynamics. Each technique provides distinct information that enables spatial and/or temporal resolution, generating data both at single cell and cell population levels.

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Intracellular Ca2+ dynamics are very important in sperm physiology and Ca2+-sensitive fluorescent dyes constitute a versatile tool to study them. Population experiments (fluorometry and stopped flow fluorometry) and single cell experiments (flow cytometry and single cell imaging) are used to track spatio-temporal [Ca2+] changes in human sperm cells.

Mess-intrazellulären Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Änderungen in menschlichen Spermien mit vier Techniken: Konventionelle Fluorometrie, Stopped Flußfluorometrie, Durchflusszytometrie und Single Cell Imaging

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

Identification of a Murine Erythroblast Subpopulation  Enriched in Enucleating Events by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Erythropoiesis in mammals concludes with the dramatic process of enucleation that results in reticulocyte formation. The mechanism of enucleation has not yet been fully elucidated. A common problem encountered when studying the localization of key proteins and structures within enucleating erythroblasts by microscopy is the difficulty to observe a sufficient number of cells undergoing enucleation.&#160;We have developed a novel analysis protocol using multiparameter high-speed cell imaging in flow (Multi-Spectral Imaging Flow Cytometry), a method that combines immunofluorescent microscopy with flow cytometry, in order to identify efficiently a significant number of enucleating events, that allows to obtain measurements and perform statistical analysis.
We first describe here two in vitro erythropoiesis culture methods used in order to synchronize murine erythroblasts and increase the probability of capturing enucleation at the time of evaluation.&#160;Then, we describe in detail the staining of erythroblasts after fixation and permeabilization in order to study the localization of intracellular proteins or lipid rafts during enucleation by multi-spectral imaging flow cytometry.&#160;Along with size and DNA/Ter119 staining which are used to identify the orthochromatic erythroblasts, we utilize the parameters &#8220;aspect ratio&#8221; of a cell in the bright-field channel that aids in the recognition of elongated cells and &#8220;delta centroid XY Ter119/Draq5&#8221; that allows the identification of cellular events in which the center of Ter119 staining (nascent reticulocyte) is far apart from the center of Draq5 staining (nucleus undergoing extrusion), thus indicating a cell about to enucleate.&#160;The subset of the orthochromatic erythroblast population with high delta centroid and low aspect ratio is highly enriched in enucleating cells.

The present protocol describes a novel method of identifying a population of enucleating orthochromatic erythroblasts by multi-spectral imaging flow cytometry, providing a visualization of the erythroblast enucleation process.

Identifizierung einer Subpopulation Murine Erythroblast Enriched in Enucleating Veranstaltungen durch multispektrale Imaging Durchflusszytometrie

Erythropoiesis in mammals concludes with the dramatic process of enucleation that results in reticulocyte formation. The mechanism of enucleation has not ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

Cytosolischen Calcium Messungen in Nierenepithelzellen mittels Durchflusszytometrie

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within tissues. Many semi-quantitative systems have been developed for scoring expression using immunohistochemistry, but inherent subjectivity limits reproducibility and accuracy of results. Furthermore, the investigation of spatially overlapping biomarkers such as nuclear transcription factors is difficult with current immunohistochemistry techniques. We have developed and optimized a system for simultaneous investigation of multiple proteins using high throughput methods of multiplexed immunohistochemistry and multispectral imaging. Multiplexed immunohistochemistry is performed by sequential application of primary antibodies with secondary antibodies conjugated to horseradish peroxidase or alkaline phosphatase. Different chromogens are used to detect each protein of interest. Stained slides are loaded into an automated slide scanner and a protocol is created for automated image acquisition. A spectral library is created by staining a set of slides with a single chromogen on each. A subset of representative stained images are imported into multispectral imaging software and an algorithm for distinguishing tissue type is created by defining tissue compartments on images. Subcellular compartments are segmented by using hematoxylin counterstain and adjusting the intrinsic algorithm. Thresholding is applied to determine positivity and protein co-localization. The final algorithm is then applied to the entire set of tissues. Resulting data allows the user to evaluate protein expression based on tissue type (ex. epithelia vs. stroma) and subcellular compartment (nucleus vs. cytoplasm vs. plasma membrane). Co-localization analysis allows for investigation of double-positive, double-negative, and single-positive cell types. Combining multispectral imaging with multiplexed immunohistochemistry and automated image acquisition is an objective, high-throughput method for investigation of biomarkers within tissues.

Immunohistochemistry is a powerful lab technique for evaluating protein localization and expression within tissues. Current semi-automated methods for quantitation introduce subjectivity and often create irreproducible results. Herein, we describe methods for multiplexed immunohistochemistry and objective quantitation of protein expression and co-localization using multispectral imaging.

Die Quantifizierung der Proteinexpression und Co-Lokalisation Mit Multiplexed immunhistochemischen Anfärbung und Multispektraltechnik

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within ...

Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated with specialization, development and increase in cellular size. In plants, endoreduplication seems to facilitate the growth and expansion of certain tissues and organs. Among them is the tuber of potato (Solanum tuberosum), which undergoes considerable cellular expansion in fulfilling its function of carbohydrate storage. Thus, endoreduplication may play an important role in how tubers are able to accommodate this abundance of carbon. However, the cellular debris resulting from crude nuclear isolation methods of tubers, methods that can be used effectively with leaves, precludes the estimation of the tuber endoreduplication index (EI). This article presents a technique for assessing tuber endoreduplication through the isolation of protoplasts while demonstrating representative results obtained from different genotypes and compartmentalized tuber tissues. The major limitations of the protocol are the time and reagent costs required for sample preparation as well as relatively short lifespan of samples after lysis of protoplasts. While the protocol is sensitive to technical variation, it represents an improvement over traditional methods of nuclear isolation from these large specialized cells. Possibilities for improvements to the protocol such as recycling enzyme, the use of fixatives, and other alterations are proposed.

The protocol described herein is a method for measuring endoreduplication within tubers of potato (Solanum tuberosum). It includes plasmolysis and protoplast extraction steps to decrease the noise and debris in downstream flow cytometric analysis.

Messung der Endoreduplikation durch Durchflusszytometrie von isolierten Knolle Protoplasten

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated ...