필자는 MilliporeSigma, Philip J. Morrissey 및 Sherree L. Friend의 동료들에게 수년 간 도움과지도를 해주신 것에 대해 감사드립니다. 이 책을 편집하는 데 도움을 준 IDEAS 소프트웨어의 BDC3 기능 , Ryan P. Jessup, 촬영 당일 도움을 준 Raymond Kong 및 특별 감사의 도움을 주신 Vidya Venkatachalam 및 Bryan R. Davidson에게도 감사드립니다. 메이크업 아티스트 Cynthia Xamonthiene.

<ol>
	<li>Levine, B., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+by+self-digestion:+molecular+mechanisms+and+biological+functions+of+autophagy.">Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy.</a> Developmental Cell. 6, 463-477 (2004).</li><li>Zhang, X. J., Chen, S., Huang, K. X., Le, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+should+autophagic+flux+be+assessed?.">Why should autophagic flux be assessed?.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 34, 595-599 (2013).</li><li>Tanida, I., Takashi, U., Kominami, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3+and+Autophagy.">LC3 and Autophagy.</a> Methods Mol Biol. 445, 77-88 (2008).</li><li>Larsen, K. B., Lamark, T., &#216;vervatn, A., Harneshaug, I., Johansen, T., Bj&#248;rk&#248;y, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reporter+cell+system+to+monitor+autophagy+based+on+p62/SQSTM1.">A reporter cell system to monitor autophagy based on p62/SQSTM1.</a> Autophagy. 6 (6), 784-793 (2010).</li><li>Demishtein, A., Porat, Z., Elazar, Z., Shvets, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+flow+cytometry+for+measurement+of+autophagy.">Applications of flow cytometry for measurement of autophagy.</a> Methods. 75, 87-95 (2015).</li><li>Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+mammalian+autophagy+research.">Methods in mammalian autophagy research.</a> Cell. 140 (3), 313-326 (2010).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy.">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy.</a> Autophagy. 8 (4), 445-544 (2012).</li><li>Arsov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAC-mediated+transgenic+expression+of+fluorescent+autophagic+protein+Beclin+1+reveals+a+role+for+Beclin+1+in+lymphocyte+development.">BAC-mediated transgenic expression of fluorescent autophagic protein Beclin 1 reveals a role for Beclin 1 in lymphocyte development.</a> Cell Death Differ. 15 (9), 1385-1395 (2008).</li><li>Maloyan, A., Sayegh, J., Osinska, H., Chua, B. H., Robbins, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+death+pathways+in+desmin-related+cardiomyopathy.">Manipulation of death pathways in desmin-related cardiomyopathy.</a> Circ Res. 106 (9), 1524-1532 (2010).</li><li>Altman, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+is+essential+to+suppress+cell+stress+and+to+allow+BCR-Abl-mediated+leukemogenesis.">Autophagy is essential to suppress cell stress and to allow BCR-Abl-mediated leukemogenesis.</a> Oncogene. 30 (16), 1855-1867 (2011).</li><li>Suarez, A. L., Kong, R., George, T., He, L., Yue, Z., van Dyk, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gammaherpesvirus+68+infection+of+endothelial+cells+requires+both+host+autophagy+genes+and+viral+oncogenes+for+optimal+survival+and+persistence.">Gammaherpesvirus 68 infection of endothelial cells requires both host autophagy genes and viral oncogenes for optimal survival and persistence.</a> J Virol. 85 (13), 6293-6308 (2011).</li><li>Tra, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+human+embryonic+stem+cells.">Autophagy in human embryonic stem cells.</a> PLoS One. 6 (11), (2011).</li><li>Yuan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bafilomycin+A1+targets+both+autophagy+and+apoptosis+pathways+in+pediatric+B-cell+acute+lymphoblastic+leukemia.">Bafilomycin A1 targets both autophagy and apoptosis pathways in pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Haematologica. 100 (3), 345-356 (2015).</li><li>Leveque-El Mouttie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+is+required+for+stem+cell+mobilization+by+G-CSF.">Autophagy is required for stem cell mobilization by G-CSF.</a> Blood. 125 (19), 2933-2936 (2015).</li><li>Watson, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+limits+proliferation+and+glycolytic+metabolism+in+acute+myeloid+leukemia.">Autophagy limits proliferation and glycolytic metabolism in acute myeloid leukemia.</a> Cell Death Discov. 1, 15008 (2015).</li><li>Stranks, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+Controls+Acquisition+of+Aging+Features+in+Macrophages.">Autophagy Controls Acquisition of Aging Features in Macrophages.</a> J Innate Immun. 7 (4), 375-391 (2015).</li><li>Clarke, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+is+activated+in+systemic+lupus+erythematosus+and+required+for+plasmablast+development.">Autophagy is activated in systemic lupus erythematosus and required for plasmablast development.</a> Ann Rheum Dis. 74 (5), 912-920 (2015).</li><li>Warnes, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+assays+for+the+study+of+autophagy.">Flow cytometric assays for the study of autophagy.</a> Methods. 82, 21-28 (2015).</li><li>Bj&#248;rk&#248;y, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p62/SQSTM1+forms+protein+aggregates+degraded+by+autophagy+and+has+a+protective+effect+on+huntingtin-induced+cell+death.">p62/SQSTM1 forms protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect on huntingtin-induced cell death.</a> J Cell Biol. 171 (4), 603-614 (2005).</li><li>Phadwal, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+autophagy+detection+in+primary+cells:+Impaired+levels+of+macroautophagy+in+immunosenescent+T+cells.">A novel method for autophagy detection in primary cells: Impaired levels of macroautophagy in immunosenescent T cells.</a> Autophagy. 8 (4), 677-689 (2012).</li><li>Rajan, R., Karbowniczek, M., Pugsley, H. R., Sabnani, M. K., Astrinidis, A., La-Beck, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+autophagosomes+and+autolysosomes+in+cells+using+imaging+flow+cytometry.">Quantifying autophagosomes and autolysosomes in cells using imaging flow cytometry.</a> Cytometry A. 87 (5), 451-458 (2015).</li><li>Kwok, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HspB8+mutation+causing+hereditary+distal+motor+neuropathy+impairs+lysosomal+delivery+of+autophagosomes.">HspB8 mutation causing hereditary distal motor neuropathy impairs lysosomal delivery of autophagosomes.</a> J Neurochem. 119 (6), 1155-1161 (2011).</li><li>Lopez-Herrera, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deleterious+Mutations+in+LRBA+Are+Associated+with+a+Syndrome+of+Immune+Deficiency+and+Autoimmunity.">Deleterious Mutations in LRBA Are Associated with a Syndrome of Immune Deficiency and Autoimmunity.</a> Am J Hum Genet. 90 (6), 986-1001 (2012).</li><li>Pike, L. R., Phadwal, K., Simon, A. K., Harris, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATF4+orchestrates+a+program+of+BH3-only+protein+expression+in+severe+hypoxia.">ATF4 orchestrates a program of BH3-only protein expression in severe hypoxia.</a> Mol Biol Rep. 39 (12), 10811-10822 (2012).</li><li>Pike, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+up-regulation+of+ULK1+by+ATF4+contributes+to+cancer+cell+survival.">Transcriptional up-regulation of ULK1 by ATF4 contributes to cancer cell survival.</a> Biochem J. 449 (2), 389-400 (2013).</li><li>Pugsley, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+autophagy:+Measuring+LC3+puncta+and+autolysosome+formation+in+cells+using+multispectral+imaging+flow+cytometry.">Quantifying autophagy: Measuring LC3 puncta and autolysosome formation in cells using multispectral imaging flow cytometry.</a> Methods. 112, 147-156 (2017).</li><li>IDEAS. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Image Data Exploration and Analysis Software User's Manual Version 6.2. , (2015).</li></ol>

저는이 연구에서 사용 된 Amnis 브랜드 ImageStream의 제작자 인 MilliporeSigma에 고용되었습니다.

이 분석을 수행 할 때 고려해야 할 몇 가지 사항이 있습니다. 적절한 컨트롤 샘플을 갖는 것이 중요합니다. 이 실험을 위해 두 개의 다른 컨트롤이 사용되었습니다 : Control + Control + Chloroquine. Control 샘플을 사용하여 영역의 임계 값을 설정했습니다. 그것은 리소좀 분해를 멈추지 않으면 서 autophagy의 기초 수준을 나타내며 Starved 샘플의 컨트롤입니다. 그러나, Control 샘플은 Starved + Chloroquine 샘플의 결과와 비교할 수있는 적절한 컨트롤이 아닙니다. 왜냐하면 클로로퀸 자체가 컨트롤 샘플에 영향을 미치기 때문입니다. 그러므로 Control + Chloroquine 샘플이 필요했습니다. autophagy에 대한 분석을 수행하기 전에 하나 이상의 셀이 있거나 이미지가있는 경우 결과에 영향을 줄 수 있으므로 포커스가있는 단일 셀 ( 즉, 60보다 큰 그래디언트 RMS)에서만 분석 / 게이트를 분석하는 것이 중요합니다. 초점없는. 자궁이 중요하다.es와 lysosome은 적절한 spot count와 BDC3 분석에 초점을 맞추고있다. Apoptotic 세포는 autophagy 분석 전에 제거해야합니다, 그들은 결과를 왜곡 할 수 있으므로 포함되어서는 안됩니다. 세 가지 마커 ( 즉, LC3, p62 및 LAMP1) 모두에 대해 적절한 염색이 있어야합니다. 예를 들어, 3 개의 마커 모두는 세포 내 (intracellular)이며 점선 신호가 있어야합니다. 신호가 점을 찍지 않았거나 세포 표면에 있다면 염색이 적절하지 않아 실험 / 염색을 다시해야합니다. 또한 BDC3가 정확하려면 3 개의 형광 마커 모두에 밝은 셀을 게이트하는 것이 필수적입니다. 비특이적 결합, 이미징 인공물 및 / 또는 소음에 대한 BDC3 측정을 방지하려면 양성 반응에 대한 게이팅이 필요합니다. BDC3은 실제 신호가 아닌 인공물을 증폭시킬 수 있기 때문에 이것은 중요합니다. BDC3은 밝은 양성 반응에서만 수행 할 수 있으므로 많은 세포가 최종 분석에 포함되지 않을 수 있습니다. 이것은 특별하다.LC3, p62 및 / 또는 LAMP1의 축적이없는 대조군 세포에 대해서는 사실이다. 따라서,이 분석법의 한계는 BDC3가 세 가지 마커 모두에 대해 양성인 세포를 검사한다는 것인데, 이는 모든 자동 운동 실험에 적합하지 않을 수 있습니다. 이전에 15 , 16 , 17 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26으로 보고 된 BDS와 마찬가지로 BDC3만으로는 공동 위치를 결정하는 autophagy organelles의 수를 고려하지 않았기 때문에 autophagosomes의 수에있는 가변성의. 따라서, Rajan et al. 고용되었다. bivariate plot을 보면, if세포는 LC3, p62 및 LAMP1에 대해 양성이어야합니다. 0 점이있는 셀이 왜 그렇게 많습니까? 이는 LC3 신호가 동일 위치에 충분히 밝을 수 있기 때문에 피크 마스크 (피크 (M11, Ch11-LC3-AF647, 밝기, 4))로 설정된 임계 값을 충족시키지 못하기 때문입니다 자리. 여기에 제시된 프로토콜은 LC3 puncta를 계산하기 위해 MIFC를 사용하였고, autophagic 플럭스를 측정하기 위해 세 개의 autophagy 마커의 co-localization을 사용했습니다. 기초 조건 (Control sample) 하에서,자가 형광체의 수가 적었고, &quot;High Spot&quot;으로 세포가 거의 발견되지 않았다. autophagosome / lysosome 융합을 억제하는 chloroquine의 첨가로 LC3 spot의 수가 증가했다. 리소좀이 autophagosome과 autophagosome에있는 p62를 파괴 할 수 없기 때문에 LC3, p62 및 LAMP1 autolysosome 축적의 공존이 증가합니다. 이 효력은 영양이되는 starvat이온, autophagy를 유도합니다. 그러나 chloroquine을 첨가하지 않으면 autophagosom의 수는 현저히 증가하지 않았고, autophagos turnover의 속도가 증가했기 때문인 것으로 보인다. 세포가 chloroquine의 존재 하에서 굶어 죽었을 때, autophagosomes의 co-localization과 수의 증가가 있었는데, 기아가 autophagic 플럭스를 증가 시킨다는 결론을지지한다. EBSS는 강력한 autophagy 유도제로 알려져 있습니다. 따라서 증가가 클 것으로 예상됩니다. 약물 유도와 같은 다른 방법을 사용하여 autophagy를 유도하는 경우, 대조군과 치료 된 시료의 차이는 미묘합니다. 이 특정 프로토콜은 인간 세포주에서 autophagy를 측정하도록 고안되었지만 특정 종에 대한 항체로 전환하여 다른 종에 적용 할 수 있습니다. 또한, 분석 방법은 공동 지역화를 필요로하는 모든 세포 내 응용에 사용될 수있다3 개의 프로브 / 마커로 구성됩니다.

이후 autophagy라고 불리는 Macroautophagy는 손상되었거나 기능 불능 인 성분, 수명이 긴 단백질 및 세포 소기관이 리소좀을 통해 분해되어 재활용되는 이화 과정입니다 1 . Autophagy는 autophagosome의 형성을 포함하는 동적 인 다단계 프로세스입니다. autophagosome과 lysosome의 융합, autolysosome 형성; 및 autolysosome 2 의 내용의 저하. 포유류 시스템에서 autophagy를 확인하는 데 사용되는 중요한 생물학적 마커는 autophagosomal membrane을 구성하는 미세 소관 관련 단백질 1A / 1B-L 鎖 사슬 3 (LC3)입니다. autophagy 동안, cytosolic LC3-1은 포스파티딜 에탄올 아민에 접합되어 LC3-II를 형성한다; LC3-II는 autophagosomal 막 3에 통합됩니다. autophagic 플럭스에 널리 사용되는 또 다른 마커는 autophagy 수용체 sequestosome 1 (SQSTM1, p62)입니다.autophagic 막에 autophagic화물을 nks 4 , 5 . 전통적으로 자식 작용을 측정하는 데 사용 된 방법은 서양 오 점 및 형광 현미경 (7)이다. 그러나 이들 방법 중 어느 것도이 두 가지 기법과 관련된 문제가 있기 때문에 &quot;황금 표준&quot; 2 , 6 으로 간주되지 않습니다. 웨스턴 블 롯은 균질 샘플을 사용하기 때문에 평균값을 제공하므로 관찰자는 개별 세포에서 일어나는 현상을 볼 수 없습니다. 반면에 형광 현미경 검사는 단일 셀 수준에서 관찰자 정보를 제공하지만 처리량 기능이 부족하여 객관적이고 통계적으로 엄격한 평가를 얻지 못합니다. 최근 몇 년 동안 multispectral imaging flow cytometry (MIFC, Table of Materials 참조)에 의한 LC3와 p62의 측정이 popu정량 전력, 높은 처리량 기능, 다중화 가능성 및 모든 셀을 이미지화 할 수있는 능력으로 인해 희소성이 희박합니다. (재료의 도표 참조) 컴패니언 분석 소프트웨어와 함께 MIFC를 이용하여 자식 작용을 측정하기 위해 가장 널리 사용되는 방법 중 하나는, LC3의 puncta에 또는 autophagosomes 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14의 스폿 카운트 통해서 , 15 , 16 , 17 . 그러나, autophagosomes의 증가는 autophagy의 증가가 반드시 과정 2 의 봉쇄를 나타낼 수 있음을 의미하지는 않습니다. LC3 - II 회전율은 세포의 존재와 존재를 분석하여 autophagic 유동을 측정하는 데 유용한 매개 변수입니다.클로로퀸과 같은 리소좀 분해 억제제의 부재. 클로로퀸하여 18 발생할 수 리소좀 분해 전에 autophagic 플럭스 체포하여 자식 작용의 정도의 척도로서 autophagosome 형성의 정량을 허용, 리소좀에 autophagosome의 융합을 억제한다. 또한, p62는 주로 autophagy에 의해 분해되며, autophagosome의 lysosomal 분해와 그 내용물이 차단되면 p62의 축적이 예상됩니다 17 , 19 . Autophagy는 다단계 프로세스이며 LC3 또는 p62만으로는 세포에서 일어나는 일을 완벽하게 파악할 수 없습니다. 최근의 논문은 autolysosome 2 , 17 , 20 , 21 의 동시 형성을 조사 할 필요성을 강조했다. MIFC17, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 - 15 리소좀에 autophagosome의 공동 촬상 지역화하여 autolysosome의 형성을 측정 할 수 의적. 또한, MIFC를 사용하여 p62와 LC3의 co-localization 또한 autophagic 플럭스 5 측정하기 위해 탐험되었습니다. 참조 된 분석 소프트웨어에서 동일 지역화를 측정하는 &quot;특징&quot;은 &quot;밝기 정보 유사성 R3&quot;(BDS)라고하며 두 이미지의 작고 밝은 이미지 세부 정보를 비교하도록 특별히 설계되었습니다. BDS는 로그 변환 된 Pearson의 반지름이 3 픽셀 이하인 지역화 된 밝은 점의 상관 계수입니다. 즉, BDS는 o의 정도를 계산합니다.두 개의 다른 형광 채널에서 픽셀을 verlapping. 밝은 지점은 상호 연관되어 있습니다 ( 즉, 동일한 공간 위치) 또는 비 상관 ( 즉, 다른 공간 위치). 따라서 상관 계수는 0 (상관 없음)과 1 (완전 상관) 사이에서 달라집니다. 계수를 로그 변환하여 범위를 0과 무한대 사이에서 26 , 27 로 증가시킵니다. BDS만으로는 충분하지 않을 수 있습니다. Rajan et al. BDS 만 사용하면 위양성 또는 위음성 결과가 발생할 수 있음을 발견했습니다 21 . BDS는 autophagy의 두 마커의 co-localization 평가하지만 autophagosomes의 수를 고려하지 않습니다. autophagosomes의 수를 설명하기 위해, Rajan et al. LC3 puncta 21 의 spot-counting을 포함합니다. Rajan et al. BDS에 비해 LC3 스폿 카운트의 2 변수 스 캐터 플롯을 사용하여 제안되었습니다. 이 두 변수를 사용하여, 두 집단먼저 확인 된 것은 LC3 스폿이 높은 세포와 LC3 스팟이 낮은 세포가있는 것입니다. 고 -LC3 자리 집단은 두 개의 집단으로 분류되었다 : 낮은 공 - 위치 화 ( 즉, 자가 - 포자충의 축적)를 갖는 세포 및 높은 공 - 위치 화 ( 즉, 오토 리소좀의 축적)를 갖는 세포. 이 2 변이 플롯은 극소수의자가 포식 세포와 autophagosomes 및 / 또는 autolysosome 21이 축적 된 세포를 구분할 수있게합니다. 지금까지 LC3, p62 및 LAMP1 (리소좀 마커)의 동시 공동 위치 화는 MIFC 동반자 분석 소프트웨어의 단일 &quot;피처 유형&quot;을 사용하여 가능하지 않았습니다 ( 재료 표 참조). 그러나 최근에 버전 6.1에서 소개 된 새로운 기능은 Bright Detail Colocalization 3 (BDC3)입니다. BDC3은 3 가지 이미지 각각의 밝은 디테일 이미지를 비교합니다 (이 경우 LC3, p62 및 LAMP1)를 측정하고 세 가지 프로브 ( 즉, LC3, p62 및 LAMP1)의 동일 지역화를 정량화합니다. BDC3 기능은 Pearson의 상관 계수를 수정하여 세 개의 이미지로 확장합니다. 세 이미지의 밝은 점이 상관되었거나 상관 관계가 없기 때문에 상관 계수는 0 (비 상관)과 1 (완벽한 상관) 사이에서 다릅니다. 계수는 0에서 무한대 사이의 동적 범위를 증가 시키도록 로그 변환됩니다. BDC3 기능을 사용하여 BDS 기능을 전환하면 Rajan et al. 동시에 하나의 시스템에서 자동 학습을 측정하기 위해 가장 많이 사용되는 3 개의 마커를 통합 할 수 있습니다. autophagy의 이러한 3 개의 마커를 단일 분석으로 공동 위치시킬 수있는 능력은 autophagy의 유도와 조절에 대한 새로운 통찰력을 이끌어 낼 수 있습니다. 다음 프로토콜은 Jurkat 세포에서 autophagy를 유도하는 단계를 개략적으로 보여줍니다. LC3, p62 및 LAMP1 항체로 세포를 표지하십시오. 멀티 스피어에서 데이터를 얻다.외과 적 이미징 유동 세포 계측기; autophagic 플럭스를 평가하기 위해 데이터를 분석 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>15 mL centrifuge tube</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>50 mL centrifuge tube</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>AF647 labeled Donkey anti-Mouse - IgG&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-31571</td><td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647. Concntration 2 mg/mL. https://www.thermofisher.com/antibody/product/Donkey-anti-Mouse-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-31571</td></tr><tr><td>anti-human CD107a-PE (LAMP1)</td><td>BioLegend</td><td>328607</td><td>Clone H4A3. Concentration 400 &amp;micro;g/mL. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html</td></tr><tr><td>anti-human CD45- AF488</td><td>BioLegend</td><td>304017</td><td>Clone HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-488-anti-human-cd45-antibody-2738.html</td></tr><tr><td>anti-human CD45- PE&amp;nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>304008</td><td>Clone HI30.&amp;nbsp; http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd45-antibody-708.html</td></tr><tr><td>anti-human CD45-AF647&amp;nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>304018</td><td>Clone HI30.&amp;nbsp; http://www.biolegend.com/alexa-fluor-647-anti-human-cd45-antibody-2739.html</td></tr><tr><td>Anti-LC3 (Human) mAb clone 4E12</td><td>MBL International Corporation</td><td>M152-3</td><td>Clone 4E+12.&amp;nbsp; Concentration 2 mg/mL.&amp;nbsp; https://www.mblintl.com/products/m152-3</td></tr><tr><td>Anti-SQSTM1 / p62 antibody [EPR4844] - Autophagosome Marker (Alexa Fluor 488)</td><td>abcam</td><td>ab185015</td><td>Clone EPR4844.&amp;nbsp; Concentration 0.5 mg/mL.&amp;nbsp; http://www.abcam.com/sqstm1-p62-antibody-epr4844-autophagosome-marker-alexa-fluor-488-ab185015.html</td></tr><tr><td>Chloroquine diphosphate Salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6628-25G</td><td></td></tr><tr><td>Cleanser - Coulter Clenz&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>8546931</td><td>Fill container with 200 mL of Cleanser.&amp;nbsp; https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/</td></tr><tr><td>DAPI Stain 5 mg/mL</td><td>MilliporeSigma</td><td>508741</td><td>http://www.emdmillipore.com/US/en/product/DAPI-Stain---CAS-28718-90-3---Calbiochem,EMD_BIO-508741</td></tr><tr><td>Debubbler - 70% Isopropanol</td><td>MilliporeSigma</td><td>1.3704</td><td>Fill container with 200 mL of Debubbler.&amp;nbsp; http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline 10x</td><td>MilliporeSigma</td><td>BSS-2010-B</td><td>&amp;nbsp;Ca++Mg++ Free&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline 1x</td><td>MilliporeSigma</td><td>BSS-1006-B</td><td>PBS Ca++Mg++ Free&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Earle&#039;s Balanced Salt Solution 1x</td><td>Gibco</td><td>14155</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>04018</td><td>This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed.&amp;nbsp; Irritating to the eyes, respiratory systems and skin.&amp;nbsp; May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes.&amp;nbsp; Potential cancer hazard.&amp;nbsp; http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/</td></tr><tr><td>Hanks&#039; Balanced Salt Solution 1x</td><td>Gibco</td><td>14175</td><td></td></tr><tr><td>Jurkat, Clone E6-1 (ATCC TIB-152)</td><td>ATCC</td><td>TIB-152</td><td>https://www.atcc.org/products/all/TIB-152.aspx</td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids 100x</td><td>HyClone</td><td>SH30238.01</td><td></td></tr><tr><td>MIFC - ImageStreamX Mark II</td><td>MilliporeSigma</td><td>100220</td><td>A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405nm, 488nm, and 642nm lasers was used. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006</td></tr><tr><td>MIFC analysis software - IDEAS 6.2</td><td>MilliporeSigma</td><td>100220</td><td>The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII).&amp;nbsp; IDEAS version 6.2</td></tr><tr><td>MIFC software - INSPIRE</td><td>MilliporeSigma</td><td>100220</td><td>This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII). INSPIRE version 200.1.388.0</td></tr><tr><td>PE anti-human CD107a (LAMP-1) Antibody clone H4A3</td><td>BioLegend</td><td>328608</td><td>http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html</td></tr><tr><td>Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100x</td><td>HyClone</td><td>SV30082.1</td><td></td></tr><tr><td>Rinse - Ultrapure water or deionized water</td><td>NA</td><td>NA</td><td>You can use any ultrapure water or deionized water.&amp;nbsp; Fill container with 900 mL of Rinse.</td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium 1x</td><td>HyClone</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>Sheath - PBS</td><td>MilliporeSigma</td><td>BSS-1006-B</td><td>This is the same as Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline 1X&amp;nbsp; Ca++MG++ free.&amp;nbsp; Fill container with 900 mL of Sheath.</td></tr><tr><td>Siliconized polypropylene microcentrifuge tubes</td><td>Fisherbrand</td><td>02-681-320</td><td>Fisherbran Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5 mL. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-siliconized-low-retention-microcentrifuge-tubes-8/p-193936</td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate solution (100 mM)</td><td>HyClone</td><td>SH30239.01</td><td></td></tr><tr><td>Sterilizer - 0.4 - 0.7% Hypochlorite</td><td>VWR</td><td>JT9416-1</td><td>This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water.&amp;nbsp; Fill container with 200 mL of Sterilzer.</td></tr><tr><td>System Calibration Reagent - SpeedBead</td><td>MilliporeSigma</td><td>400041</td><td>Each tube holds ~10 mL.&amp;nbsp; https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>T75 flask</td><td>Falcon</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>TRITON X-100, PROTEIN GRADE Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered</td><td>MilliporeSigma</td><td>648463-50ML</td><td>http://www.emdmillipore.com/US/en/product/TRITON-X-100,-PROTEIN-GRADE-Detergent,-10%25-Solution,-Sterile-Filtered---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648463</td></tr><tr><td>Water, Cell Culture Grade&amp;nbsp;</td><td>HyClone</td><td>SH30529.03</td><td></td></tr></tbody></table>

assessing autophagic flux by measuring lc3, p62, and lamp1 co-localization using multispectral imaging flow cytometry

Autophagy는 성장 및 분화 과정에서 축적되는 정상 또는 기능 장애 세포 구성 요소가 리소좀을 통해 분해되어 재활용되는 이화 경로입니다. autophagy 동안, cytoplasmic LC3 단백질은 지방화되고 autophagosomal membranes에 보충된다. autophagosome은 lysosome과 융합하여 autolysosome을 형성하는데, autophagosome 소포와 그 내용물의 분해가 일어난다. LC3에 결합하는 유비퀴틴 관련 단백질 p62는 또한 autophagic 플럭스를 모니터하는 데 사용됩니다. autophagy를 수행하는 세포는 p62, LC3 및 리소좀 마커의 동일 지역화를 입증해야합니다. Immunofluorescence 현미경 검사는 세포 단위로 LC3 puncta, p62 및 / 또는 lysosomes를 시각적으로 확인하는 데 사용되었습니다. 그러나 객관적이고 통계적으로 엄격한 평가는 얻기가 어려울 수 있습니다. 이러한 문제를 극복하기 위해 multispectral imaging flow cytometry와 함께 밝은 de3 개의 autophagy 마커 (LC3, p62 및 lysosomal LAMP1)로부터 꼬리 이미지를 추출하고 객관적이고 정량적이며 통계적으로 견고한 방식으로 자동 계수를 측정하기 위해 LC3 스폿 카운팅과 함께 공동 위치를 정량화합니다.

이 분석 방법은 autophagic 플럭스를 분석하기 위해 여러 기능을 사용합니다. 최종 2 변량 플롯을 완전히 이해하려면 개별 분석 기능을 먼저 조사해야합니다. autophagosomes의 계산은 autophagy를 측정하는 논리적 인 방법입니다; 그러나 LC3 puncta의 크기 / 모양 / 밝기는 세포간에 크게 다를 수 있습니다. 변이로 인해 자동자가 염색체를 수동으로 계산하거나 분석 소프트웨어의 스폿 카운트 기능을 사용하기가 어려울 수 있습니다. 따라서, autophagosomes의 큰 변화 때문에 spot-count 기능은 완벽하지 않습니다. 그러나, 좋은 장소 카운트 기능은 대부분의 세포 (26)에 작동합니다. 도 3 은 상이한 스폿 마스크를 사용하여 Jurkat 셀에서 LC3 점을 스팟 마스킹하는 예를 도시한다. 이 데이터 세트에 대해 선택된 스폿 카운트 기능은 Spot Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4) _4입니다. 즉, 스폿 카운트 기능이spot-to-cell 배경 비율이 4 (Bright, 4) 인 채널 11 (Ch11-LC3-AF647)의 기본 채널 11 마스크 (M11) 내에서 식별 된 마스크. 그림 4 는 대조군, Control + Chloroquine, Starved 및 Starved + Chloroquine Jurkat 세포에 대한 평균 스팟 카운트에 대한 스폿 카운트 히스토그램과 대표 이미지를 보여줍니다 (anti-LC3-AF647로 표시). 대조군과 굶주린 평균 자리 수는 크게 다르지 않습니다. chloroquine을 첨가하면 Starved + Chloroquine에 비해 Control + Chloroquine의 평균값에 큰 차이가 있습니다. 조사 할 다음 기능은 BDC3입니다. BDC3은 세 개의 마커 / 프로브 (이 경우 LC3, p62 및 LAMP1)의 동일 위치 측정 값입니다. 그림 5A - 5D 는 Control, Control + Chloroquine, Starved 및 Starved + Chloroquine Jurkat 세포에 대한 BDC3 히스토그램을 보여줍니다. anti-p62-AF488, 항 -LAMP1-PE 및 항 -LC3-AF647을 포함한다. Control + Chloroquine은 Starved + Chloroquine 평균을 의미합니다. 그러나, 그림 5E - 5H 의 평균 BDC3 점수에서 세포의 이미지를 보면, 히스토그램이 믿을 수있는 것보다 더 큰 차이가 있습니다. 이것은 BDC3가 동일한 BDC3 점수에 대해자가 염색체의 수에 큰 변동성을 초래하는 동시에 공동 위치하는자가 작용 세포 소기관의 수를 고려하지 않기 때문입니다. 대부분의 경우, 기초 수준 에서조차, p62, LAMP1 및 LC3은 어느 정도까지는 세포의 유사한 영역에 공동 위치하거나 상주해야하기 때문에 세 가지 프로브 사이에 중첩이 존재합니다. 대조적으로, 그림 6 과 같이 Starved + Chloroquine 샘플에 대해 anti-p62-AF488, anti-LC3-AF647 및 DAPI 핵 염료가 공존하지 않아야하는 세 가지 프로브의 예 &lt;/ p&gt; 스폿 카운트 기능과 BDC3 기능이 결합되면 다양한 샘플 / 조건을 구별하는 기능을 향상시키는 하위 모집단의 존재가 분명합니다. 그림 7 은 Control, Control + Chloroquine, Starved 및 Starved + Chloroquine의 네 가지 샘플에 대한 LC3 대 BDC3 p62 / LAMP1 / LC3의 스팟 카운트의 이변 변수 플롯을 보여줍니다. Control 샘플은 Low Spots, High Spots / Low BDC3 및 High Spots / High BDC3의 세 가지 집단에 대한 게이팅 전략을 설정하는 데 사용되었습니다. 대조군 샘플은 세포의 98 % 이상이 1 개 이하의 반점을 갖는 것으로 나타났다. High Spots / Low BDC3과 High Spots / High BDC3 사이의 경계는 대조 샘플의 91 % 이상이 1 미만의 BDC3 스코어를 가졌기 때문에 BDC3 스코어가 1로 설정되었습니다. bivariate 플롯에 대한 결과 요약 표 1 에 나타냈다 . age = &quot;1&quot;&gt; <img alt="그림 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig1.jpg" /> 그림 1 : MIFC 악기 설정. 이 실험에 사용 된 MIFC 기기 설정의 스크린 샷으로 프로토콜의 8 단계에 설명되어 있습니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig2.jpg" /> 그림 2 : 분석 소프트웨어 게이팅 전략. 프로토콜 9 단계에서 설명한 분석 소프트웨어 게이팅 구성표의 스크린 샷입니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> fig3.jpg &quot;/&gt; 그림 3 : LC3 스폿 마스킹. 스폿 카운트 기능을 만드는 데 사용되는 Jurkat 셀 이미지 및 마스크. BrightField (BF), LC3-AF647, 피크 (M11, Ch11-LC3-AF647, 밝기, 2), 피크 (M11, Ch11-LC3-AF647, 밝기, 4), 피크 (M11, Ch11-LC3-AF647 Bright, 5), Spot (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 5,3,1) 및 Spot (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 6,2,1) 표시된 모든 셀에서 가장 잘 작동하는 마스크는 Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4)입니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig4.jpg" /> 그림 4 : LC3 스폿 카운트 히스토그램. 컨트롤 ( A , 연한 파란색), 스팟 카운트 기능 Spot Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, 밝기, 4) _4 및 LC3-AF647 스폿 카운트 히스토그램을 사용하여 Control + Chloroquine ( B , 파란색), Starved ( C , 분홍색) 및 Starved + Chloroquine ( D , 빨간색). Control, Control + Chloroquine, Starved 및 Starved + Chloroquine의 평균 스팟 카운트는 각각 0.07, 1.13, 0.10 및 2.77입니다. (spot) 수에 대한 대표적인 세포의 LC3-AF647 및 DAPI 이미지의 복합체 인 BF, LC3-AF647 (적색), DAPI 핵 염료 (청색) 및 대조군 ( E , 0 스팟), 대조 + 클로로퀸 F , 1 지점), Starved ( G , 0 지점), Starved + Chloroquine ( H 지점, 3 지점). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig5.jpg" /> 그림 5 : p62 / LAMP1 / LC3의 BDC3 히스토그램. BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 히스토그램 fo( A , 연한 파란색), Control + Chloroquine ( B , 파란색), Starved ( C , 분홍색), Starved + Chloroquine ( D , 빨간색 Control, Control + Chloroquine, Starved 및 Starved + Chloroquine의 평균 BDC3 점수는 각각 0.57, 0.82, 0.74 및 0.98입니다. BF; p62-AF488 (녹색); LAMP1-PE (황색); LC3-AF647 (적색); Control ( E ), Control + Chloroquine ( F ), Starved ( G ), 및 Starved + Chloroquine에 대한 대표적인 세포의 p62-AF488, LAMP1-PE 및 LC3- H ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig6.jpg" /> 그림 6 : p62 / L의 BDC3 히스토그램굶주린 + 클로로퀸 시료의 경우 C3 / DAPI. ( A ) Starved + Chloroquine 샘플에 대한 BDC3 p62 / LC3 / DAPI 히스토그램이 표시됩니다. 평균 BDC3 점수는 0.07입니다. ( B ) BF; p62-AF488 (녹색); LC3-AF647 (적색); DAPI (파란색); Starved + Chloroquine 샘플의 경우 평균 BDC3에 대한 대표 세포의 p62-AF488, LC3-AF647 및 DAPI 이미지의 합성이 표시됩니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig7.jpg" /> 그림 7 : LC3 스팟 카운트 대 BDC3 p62 / LAMP1 / LC3의 2 변이 플롯. ( A ) Control, Control + Chloroquine, Starved 및 Starved + Chloroquine Jurkat 세포에 대한 LC3 스팟 카운트 대 BDC3 p62 / LAMP1 / LC3의 2 변이 플롯. ( B ) BF; p62-AF488 (녹색); LAMP1-PE (황색); LC3-AF647 (적색); Starved + Chloroquine 샘플의 경우 3 개 영역 ( 즉, 낮은 스폿, 하이 스팟 / 로우 BDC3 및 하이 스팟 / 하이 BDC3)의 p62-AF488, LAMP1-PE 및 LC3-AF647 이미지가 합성되어 표시됩니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> 세포 수 </td><td> 밝은 세부 Colocalization 3 평균 </td><td> 스팟 카운트 LC3 평균 </td><td> 낮은 곳 (%) </td><td> 높음 높음 / 낮음 BDC3 </td><td> 높은 반점 / 높음 BDC3 </td></tr><tr><td> 제어 </td><td> 439 </td><td> 0.57 </td><td> 0.07 </td><td> 98.2 </td><td> 1.8 </td><td> 0.0 </td></tr><tr><td> 대조 + 클로로퀸 </td><td> 1432 년 </td><td> 0.82 </td><td> 1.13 </td><td> 68.9 </td&gt; <td> 19.5 </td><td> 11.7 </td></tr><tr><td> 굶주린 </td><td> 1204 </td><td> 0.74 </td><td> 0.10 </td><td> 98.4 </td><td> 0.6 </td><td> 1.0 </td></tr><tr><td> 굶주린 + Chloroquine </td><td> 1811 년 </td><td> 0.98 </td><td> 2.77 </td><td> 32.1 </td><td> 36.9 </td><td> 31.0 </td></tr></tbody></table> 표 1 : Jurkat LC3 스팟 카운트 대 BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 2 변량 플롯의 요약

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Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

여기에 LC3 spot counting과 함께 3 개의 autophagy marker의 밝은 디테일 이미지를 비교하고 co-localization을 정량화하는 분석적인 특징을 가진 multispectral imaging flow cytometry가 객관적이고 정량적이며 통계적으로 강력한 방식으로 autophagy를 측정하는 데 사용되었습니다.

Multispectral Imaging Flow Cytometry를 사용하여 LC3, p62 및 LAMP1 Co-Localization 측정을 통한 Autophagic Flux 평가

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via ...

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Research

JoVE Journal

Biology

31.1K 조회수.  MilliporeSigma.  여기에 LC3 spot counting과 함께 3 개의 autophagy marker의 밝은 디테일 이미지를 비교하고 co-localization을 정량화하는 분석적인 특징을 가진 multispectral imaging flow cytometry가 객관적이고 정량적이며 통계적으로 강력한 방식으로 autophagy를 측정하는 데 사용되었습니다. 

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A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

효모에서 모니터링 Mitophagy을위한 형광 현미경 분석 Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

연구

생물학

<meta charset="utf8"></head><body>리소좀 융합이 손상된 자가포식에서 LC3-II-양성 EV 방출 평가

Evaluation of LC3-II Release via Extracellular Vesicles in Relation to the Accumulation of Intracellular LC3-positive Vesicles

(Macro)autophagy represents a fundamental cellular degradation pathway. In this process, double-membraned vesicles known as autophagosomes engulf cytoplasmic contents, subsequently fusing with lysosomes for degradation. Beyond the canonical role, autophagy-related genes also modulate a secretory pathway involving the release of inflammatory molecules, tissue repair factors, and extracellular vesicles (EVs). Notably, the process of disseminating pathological proteins between cells, particularly in neurodegenerative diseases affecting the brain and spinal cord, underscores the significance of understanding this phenomenon. Recent research suggests that the transactive response DNA-binding protein 43 kDa (TDP-43), a key player in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal lobar degeneration, is released in an autophagy-dependent manner via EVs enriched with the autophagosome marker microtubule-associated proteins 1A/1B light chain 3B-II (LC3-II), especially when autophagosome-lysosome fusion is inhibited.
To elucidate the mechanism underlying the formation and release of LC3-II-positive EVs, it is imperative to establish an accessible and reproducible method for evaluating both intracellular and extracellular LC3-II-positive vesicles. This study presents a detailed protocol for assessing LC3-II levels via immunoblotting in cellular and EV fractions obtained through differential centrifugation. Bafilomycin A1 (Baf), an inhibitor of autophagosome-lysosome fusion, serves as a positive control to enhance the levels of intracellular and extracellular LC3-II-positive vesicles. Tumor susceptibility gene 101 (TSG101) is used as a marker for multivesicular bodies. Applying this protocol, it is demonstrated that siRNA-mediated knockdown of syntaxin-6 (STX6), a genetic risk factor for sporadic Creutzfeldt-Jakob disease, augments LC3-II levels in the EV fraction of cells treated with Baf while showing no significant effect on TSG101 levels. These findings suggest that STX6 may negatively regulate the extracellular release of LC3-II via EVs, particularly under conditions where autophagosome-lysosome fusion is impaired. Combined with established methods for evaluating autophagy, this protocol provides valuable insights into the role of specific molecules in the formation and release of LC3-II-positive EVs.

<meta charset="utf8"></head><body>세포 내 LC3 양성 소포의 축적과 관련하여 세포외 소포를 통한 LC3-II 방출 평가

Here, we present the methodology for concisely assessing autophagosome marker LC3-II levels in extracellular vesicles (EVs) by immunoblotting. Analysis for LC3-II levels in EVs, autolysosome formation, and omegasome formation suggests the new role of STX6 in the release of LC3-II-positive EVs when autophagosome-lysosome fusion is inhibited.

세포 내 LC3 양성 소포의 축적과 관련하여 세포외 소포를 통한 LC3-II 방출 평가

(Macro)autophagy represents a fundamental cellular degradation pathway. In this process, double-membraned vesicles known as autophagosomes engulf ...

생화학

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

고급 3D 형광 현미경을 사용하여 자식 작용의 정량 분석

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

초기 자식 작용 이벤트의 셀 이미징 라이브 : Omegasomes을 넘어

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a simple protocol to monitor this process is described. Moreover, typical results and experimental validation of the method under autophagy-inducing conditions in various types of cultured mammalian cells are provided. During bulk autophagy, autophagosomes sequester cytosol, and thereby also soluble cytosolic proteins, alongside other autophagic cargo. LDH is a stable and highly abundant, soluble cytosolic enzyme that is non-selectively sequestered into autophagosomes. The amount of LDH sequestration therefore reflects the amount of bulk autophagic sequestration. To efficiently and accurately determine LDH sequestration in cells, we employ an electrodisruption-based fractionation protocol that effectively separates sedimentable from cytosolic LDH, followed by measurement of enzymatic activity in sedimentable fractions versus whole-cell samples. Autophagic sequestration is determined by subtracting the proportion of sedimentable LDH in untreated cells from that in treated cells. The advantage of the LDH sequestration assay is that it gives a quantitative measure of the autophagic sequestration of endogenous cargo, as opposed to other methods that either involve ectopic expression of sequestration probes or semi-quantitative protease protection analyses of autophagy markers or receptors.

Here a simple and well-validated protocol for measuring bulk autophagic sequestration activity in mammalian cells is described. The method is based on quantifying the proportion of lactate dehydrogenase (LDH) in sedimentable cell fractions compared to total cellular LDH levels.

젖 산 효소 격리 분석 결과-간단 하 고 신뢰할 수 있는 결정 하는 방법을 포유류 세포에서 대량 Autophagic 격리 활동

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a ...

Sensitive Measurement of Mitophagy by Flow Cytometry Using the pH-dependent Fluorescent Reporter mt-Keima

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between defective mitophagy and various human diseases, including neurodegenerative diseases, cancer, and metabolic diseases. In addition, recent studies have shown that mitophagy is involved in normal cellular processes, such as differentiation and development. However, the precise role of and molecular mechanisms underlying mitophagy require further study. Therefore, it is critical to develop a robust and convenient method for measuring changes in mitophagy activity. Here, we describe a detailed protocol for quantitatively assessing mitophagy activity through flow cytometry using the mitochondria-targeted fluorescent protein Keima (mt-Keima). This flow cytometry assay can analyze mitophagy activity more rapidly and sensitively than conventional microscopy- or immunoblotting-based methods. This protocol can be applied to analyze mitophagy activity in various cell types.

Mitophagy, the selective degradation of mitochondria, has been implicated in mitochondrial homeostasis and is deregulated in various human diseases. However, convenient experimental methods for measuring mitophagy activity are very limited. Here, we provide a sensitive assay for measuring mitophagy activity using flow cytometry.

형광 기자 흐름 Cytometry 사용 pH-종속 mt-Keima에 의해 Mitophagy의 중요 한 측정

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between ...

Measuring Diurnal Rhythms in Autophagic and Proteasomal Flux

Cells employ several methods for recycling unwanted proteins and other material, including lysosomal and non-lysosomal pathways. The main lysosome-dependent pathway is called autophagy, while the primary non-lysosomal method for protein catabolism is the ubiquitin-proteasome system. Recent studies in model organisms suggest that the activity of both autophagy and the ubiquitin-proteasome system is not constant across the day but instead varies according to a daily (circadian) rhythm. The ability to measure biological rhythms in protein turnover is important for understanding how cellular quality control is achieved and for understanding the dynamics of specific proteins of interest. Here we present a standardized protocol for quantifying autophagic and proteasomal flux in vivo that captures the circadian component of protein turnover. Our protocol includes details for mouse handling, tissue processing, fractionation, and autophagic flux quantification using mouse liver as the starting material.

We describe our protocol for measuring biological rhythms in protein catabolism via autophagy and the proteasome in mouse liver.

자동 및 프로테아소말 플럭스에서 일주 리듬 측정

Cells employ several methods for recycling unwanted proteins and other material, including lysosomal and non-lysosomal pathways. The main ...

Flux-Based Assay for the Identification of Autophagy Modulators for Osteoarthritis

Autophagy is a central mechanism to regulate homeostasis. Alterations of autophagy contribute to aging-related diseases. Phenotypic methods to identify regulators of autophagy could be used for the identification of novel therapeutics. This article describes a cell-based imaging screening workflow developed to monitor autophagic flux using LC3 as a reporter of autophagic flux (mCherry-EGFP-LC3B) in human chondrocytes. Data acquisition is performed using an automated High Content Imaging Screening System microscope. An algorithm-based automated image analysis protocol was developed and validated to identify molecules activating autophagic flux. Critical steps, explanatory notes, and improvements over current autophagy monitoring protocols are reported. Physiologically relevant phenotypic screening approaches to target hallmarks of aging can facilitate more effective drug discovery strategies for age-related musculoskeletal diseases.

<meta charset="utf8"></head><body>골관절염에 대한 자가포식 조절제의 식별을 위한 플럭스 기반 분석

This paper details monitoring autophagy flux to identify new molecules by cell-based imaging screening.

골관절염에 대한 자가포식 조절제의 식별을 위한 플럭스 기반 분석

Autophagy is a central mechanism to regulate homeostasis. Alterations of autophagy contribute to aging-related diseases. Phenotypic methods to identify ...

Multispectral Imaging Flow Cytometry를 사용하여 LC3, p62 및 LAMP1 Co-Localization 측정을 통한 Autophagic Flux 평가

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젖 산 효소 격리 분석 결과-간단 하 고 신뢰할 수 있는 결정 하는 방법을 포유류 세포에서 대량 Autophagic 격리 활동

형광 기자 흐름 Cytometry 사용 pH-종속 mt-Keima에 의해 Mitophagy의 중요 한 측정

자동 및 프로테아소말 플럭스에서 일주 리듬 측정

골관절염에 대한 자가포식 조절제의 식별을 위한 플럭스 기반 분석