필자는 MilliporeSigma, Philip J. Morrissey 및 Sherree L. Friend의 동료들에게 수년 간 도움과지도를 해주신 것에 대해 감사드립니다. 이 책을 편집하는 데 도움을 준 IDEAS 소프트웨어의 BDC3 기능 , Ryan P. Jessup, 촬영 당일 도움을 준 Raymond Kong 및 특별 감사의 도움을 주신 Vidya Venkatachalam 및 Bryan R. Davidson에게도 감사드립니다. 메이크업 아티스트 Cynthia Xamonthiene.

<ol>
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저는이 연구에서 사용 된 Amnis 브랜드 ImageStream의 제작자 인 MilliporeSigma에 고용되었습니다.

이 분석을 수행 할 때 고려해야 할 몇 가지 사항이 있습니다. 적절한 컨트롤 샘플을 갖는 것이 중요합니다. 이 실험을 위해 두 개의 다른 컨트롤이 사용되었습니다 : Control + Control + Chloroquine. Control 샘플을 사용하여 영역의 임계 값을 설정했습니다. 그것은 리소좀 분해를 멈추지 않으면 서 autophagy의 기초 수준을 나타내며 Starved 샘플의 컨트롤입니다. 그러나, Control 샘플은 Starved + Chloroquine 샘플의 결과와 비교할 수있는 적절한 컨트롤이 아닙니다. 왜냐하면 클로로퀸 자체가 컨트롤 샘플에 영향을 미치기 때문입니다. 그러므로 Control + Chloroquine 샘플이 필요했습니다. autophagy에 대한 분석을 수행하기 전에 하나 이상의 셀이 있거나 이미지가있는 경우 결과에 영향을 줄 수 있으므로 포커스가있는 단일 셀 ( 즉, 60보다 큰 그래디언트 RMS)에서만 분석 / 게이트를 분석하는 것이 중요합니다. 초점없는. 자궁이 중요하다.es와 lysosome은 적절한 spot count와 BDC3 분석에 초점을 맞추고있다. Apoptotic 세포는 autophagy 분석 전에 제거해야합니다, 그들은 결과를 왜곡 할 수 있으므로 포함되어서는 안됩니다. 세 가지 마커 ( 즉, LC3, p62 및 LAMP1) 모두에 대해 적절한 염색이 있어야합니다. 예를 들어, 3 개의 마커 모두는 세포 내 (intracellular)이며 점선 신호가 있어야합니다. 신호가 점을 찍지 않았거나 세포 표면에 있다면 염색이 적절하지 않아 실험 / 염색을 다시해야합니다. 또한 BDC3가 정확하려면 3 개의 형광 마커 모두에 밝은 셀을 게이트하는 것이 필수적입니다. 비특이적 결합, 이미징 인공물 및 / 또는 소음에 대한 BDC3 측정을 방지하려면 양성 반응에 대한 게이팅이 필요합니다. BDC3은 실제 신호가 아닌 인공물을 증폭시킬 수 있기 때문에 이것은 중요합니다. BDC3은 밝은 양성 반응에서만 수행 할 수 있으므로 많은 세포가 최종 분석에 포함되지 않을 수 있습니다. 이것은 특별하다.LC3, p62 및 / 또는 LAMP1의 축적이없는 대조군 세포에 대해서는 사실이다. 따라서,이 분석법의 한계는 BDC3가 세 가지 마커 모두에 대해 양성인 세포를 검사한다는 것인데, 이는 모든 자동 운동 실험에 적합하지 않을 수 있습니다. 이전에 15 , 16 , 17 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26으로 보고 된 BDS와 마찬가지로 BDC3만으로는 공동 위치를 결정하는 autophagy organelles의 수를 고려하지 않았기 때문에 autophagosomes의 수에있는 가변성의. 따라서, Rajan et al. 고용되었다. bivariate plot을 보면, if세포는 LC3, p62 및 LAMP1에 대해 양성이어야합니다. 0 점이있는 셀이 왜 그렇게 많습니까? 이는 LC3 신호가 동일 위치에 충분히 밝을 수 있기 때문에 피크 마스크 (피크 (M11, Ch11-LC3-AF647, 밝기, 4))로 설정된 임계 값을 충족시키지 못하기 때문입니다 자리. 여기에 제시된 프로토콜은 LC3 puncta를 계산하기 위해 MIFC를 사용하였고, autophagic 플럭스를 측정하기 위해 세 개의 autophagy 마커의 co-localization을 사용했습니다. 기초 조건 (Control sample) 하에서,자가 형광체의 수가 적었고, &quot;High Spot&quot;으로 세포가 거의 발견되지 않았다. autophagosome / lysosome 융합을 억제하는 chloroquine의 첨가로 LC3 spot의 수가 증가했다. 리소좀이 autophagosome과 autophagosome에있는 p62를 파괴 할 수 없기 때문에 LC3, p62 및 LAMP1 autolysosome 축적의 공존이 증가합니다. 이 효력은 영양이되는 starvat이온, autophagy를 유도합니다. 그러나 chloroquine을 첨가하지 않으면 autophagosom의 수는 현저히 증가하지 않았고, autophagos turnover의 속도가 증가했기 때문인 것으로 보인다. 세포가 chloroquine의 존재 하에서 굶어 죽었을 때, autophagosomes의 co-localization과 수의 증가가 있었는데, 기아가 autophagic 플럭스를 증가 시킨다는 결론을지지한다. EBSS는 강력한 autophagy 유도제로 알려져 있습니다. 따라서 증가가 클 것으로 예상됩니다. 약물 유도와 같은 다른 방법을 사용하여 autophagy를 유도하는 경우, 대조군과 치료 된 시료의 차이는 미묘합니다. 이 특정 프로토콜은 인간 세포주에서 autophagy를 측정하도록 고안되었지만 특정 종에 대한 항체로 전환하여 다른 종에 적용 할 수 있습니다. 또한, 분석 방법은 공동 지역화를 필요로하는 모든 세포 내 응용에 사용될 수있다3 개의 프로브 / 마커로 구성됩니다.

이후 autophagy라고 불리는 Macroautophagy는 손상되었거나 기능 불능 인 성분, 수명이 긴 단백질 및 세포 소기관이 리소좀을 통해 분해되어 재활용되는 이화 과정입니다 1 . Autophagy는 autophagosome의 형성을 포함하는 동적 인 다단계 프로세스입니다. autophagosome과 lysosome의 융합, autolysosome 형성; 및 autolysosome 2 의 내용의 저하. 포유류 시스템에서 autophagy를 확인하는 데 사용되는 중요한 생물학적 마커는 autophagosomal membrane을 구성하는 미세 소관 관련 단백질 1A / 1B-L 鎖 사슬 3 (LC3)입니다. autophagy 동안, cytosolic LC3-1은 포스파티딜 에탄올 아민에 접합되어 LC3-II를 형성한다; LC3-II는 autophagosomal 막 3에 통합됩니다. autophagic 플럭스에 널리 사용되는 또 다른 마커는 autophagy 수용체 sequestosome 1 (SQSTM1, p62)입니다.autophagic 막에 autophagic화물을 nks 4 , 5 . 전통적으로 자식 작용을 측정하는 데 사용 된 방법은 서양 오 점 및 형광 현미경 (7)이다. 그러나 이들 방법 중 어느 것도이 두 가지 기법과 관련된 문제가 있기 때문에 &quot;황금 표준&quot; 2 , 6 으로 간주되지 않습니다. 웨스턴 블 롯은 균질 샘플을 사용하기 때문에 평균값을 제공하므로 관찰자는 개별 세포에서 일어나는 현상을 볼 수 없습니다. 반면에 형광 현미경 검사는 단일 셀 수준에서 관찰자 정보를 제공하지만 처리량 기능이 부족하여 객관적이고 통계적으로 엄격한 평가를 얻지 못합니다. 최근 몇 년 동안 multispectral imaging flow cytometry (MIFC, Table of Materials 참조)에 의한 LC3와 p62의 측정이 popu정량 전력, 높은 처리량 기능, 다중화 가능성 및 모든 셀을 이미지화 할 수있는 능력으로 인해 희소성이 희박합니다. (재료의 도표 참조) 컴패니언 분석 소프트웨어와 함께 MIFC를 이용하여 자식 작용을 측정하기 위해 가장 널리 사용되는 방법 중 하나는, LC3의 puncta에 또는 autophagosomes 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14의 스폿 카운트 통해서 , 15 , 16 , 17 . 그러나, autophagosomes의 증가는 autophagy의 증가가 반드시 과정 2 의 봉쇄를 나타낼 수 있음을 의미하지는 않습니다. LC3 - II 회전율은 세포의 존재와 존재를 분석하여 autophagic 유동을 측정하는 데 유용한 매개 변수입니다.클로로퀸과 같은 리소좀 분해 억제제의 부재. 클로로퀸하여 18 발생할 수 리소좀 분해 전에 autophagic 플럭스 체포하여 자식 작용의 정도의 척도로서 autophagosome 형성의 정량을 허용, 리소좀에 autophagosome의 융합을 억제한다. 또한, p62는 주로 autophagy에 의해 분해되며, autophagosome의 lysosomal 분해와 그 내용물이 차단되면 p62의 축적이 예상됩니다 17 , 19 . Autophagy는 다단계 프로세스이며 LC3 또는 p62만으로는 세포에서 일어나는 일을 완벽하게 파악할 수 없습니다. 최근의 논문은 autolysosome 2 , 17 , 20 , 21 의 동시 형성을 조사 할 필요성을 강조했다. MIFC17, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 - 15 리소좀에 autophagosome의 공동 촬상 지역화하여 autolysosome의 형성을 측정 할 수 의적. 또한, MIFC를 사용하여 p62와 LC3의 co-localization 또한 autophagic 플럭스 5 측정하기 위해 탐험되었습니다. 참조 된 분석 소프트웨어에서 동일 지역화를 측정하는 &quot;특징&quot;은 &quot;밝기 정보 유사성 R3&quot;(BDS)라고하며 두 이미지의 작고 밝은 이미지 세부 정보를 비교하도록 특별히 설계되었습니다. BDS는 로그 변환 된 Pearson의 반지름이 3 픽셀 이하인 지역화 된 밝은 점의 상관 계수입니다. 즉, BDS는 o의 정도를 계산합니다.두 개의 다른 형광 채널에서 픽셀을 verlapping. 밝은 지점은 상호 연관되어 있습니다 ( 즉, 동일한 공간 위치) 또는 비 상관 ( 즉, 다른 공간 위치). 따라서 상관 계수는 0 (상관 없음)과 1 (완전 상관) 사이에서 달라집니다. 계수를 로그 변환하여 범위를 0과 무한대 사이에서 26 , 27 로 증가시킵니다. BDS만으로는 충분하지 않을 수 있습니다. Rajan et al. BDS 만 사용하면 위양성 또는 위음성 결과가 발생할 수 있음을 발견했습니다 21 . BDS는 autophagy의 두 마커의 co-localization 평가하지만 autophagosomes의 수를 고려하지 않습니다. autophagosomes의 수를 설명하기 위해, Rajan et al. LC3 puncta 21 의 spot-counting을 포함합니다. Rajan et al. BDS에 비해 LC3 스폿 카운트의 2 변수 스 캐터 플롯을 사용하여 제안되었습니다. 이 두 변수를 사용하여, 두 집단먼저 확인 된 것은 LC3 스폿이 높은 세포와 LC3 스팟이 낮은 세포가있는 것입니다. 고 -LC3 자리 집단은 두 개의 집단으로 분류되었다 : 낮은 공 - 위치 화 ( 즉, 자가 - 포자충의 축적)를 갖는 세포 및 높은 공 - 위치 화 ( 즉, 오토 리소좀의 축적)를 갖는 세포. 이 2 변이 플롯은 극소수의자가 포식 세포와 autophagosomes 및 / 또는 autolysosome 21이 축적 된 세포를 구분할 수있게합니다. 지금까지 LC3, p62 및 LAMP1 (리소좀 마커)의 동시 공동 위치 화는 MIFC 동반자 분석 소프트웨어의 단일 &quot;피처 유형&quot;을 사용하여 가능하지 않았습니다 ( 재료 표 참조). 그러나 최근에 버전 6.1에서 소개 된 새로운 기능은 Bright Detail Colocalization 3 (BDC3)입니다. BDC3은 3 가지 이미지 각각의 밝은 디테일 이미지를 비교합니다 (이 경우 LC3, p62 및 LAMP1)를 측정하고 세 가지 프로브 ( 즉, LC3, p62 및 LAMP1)의 동일 지역화를 정량화합니다. BDC3 기능은 Pearson의 상관 계수를 수정하여 세 개의 이미지로 확장합니다. 세 이미지의 밝은 점이 상관되었거나 상관 관계가 없기 때문에 상관 계수는 0 (비 상관)과 1 (완벽한 상관) 사이에서 다릅니다. 계수는 0에서 무한대 사이의 동적 범위를 증가 시키도록 로그 변환됩니다. BDC3 기능을 사용하여 BDS 기능을 전환하면 Rajan et al. 동시에 하나의 시스템에서 자동 학습을 측정하기 위해 가장 많이 사용되는 3 개의 마커를 통합 할 수 있습니다. autophagy의 이러한 3 개의 마커를 단일 분석으로 공동 위치시킬 수있는 능력은 autophagy의 유도와 조절에 대한 새로운 통찰력을 이끌어 낼 수 있습니다. 다음 프로토콜은 Jurkat 세포에서 autophagy를 유도하는 단계를 개략적으로 보여줍니다. LC3, p62 및 LAMP1 항체로 세포를 표지하십시오. 멀티 스피어에서 데이터를 얻다.외과 적 이미징 유동 세포 계측기; autophagic 플럭스를 평가하기 위해 데이터를 분석 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>15 mL centrifuge tube</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>50 mL centrifuge tube</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>AF647 labeled Donkey anti-Mouse - IgG&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-31571</td><td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647. Concntration 2 mg/mL. https://www.thermofisher.com/antibody/product/Donkey-anti-Mouse-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-31571</td></tr><tr><td>anti-human CD107a-PE (LAMP1)</td><td>BioLegend</td><td>328607</td><td>Clone H4A3. Concentration 400 &amp;micro;g/mL. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html</td></tr><tr><td>anti-human CD45- AF488</td><td>BioLegend</td><td>304017</td><td>Clone HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-488-anti-human-cd45-antibody-2738.html</td></tr><tr><td>anti-human CD45- PE&amp;nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>304008</td><td>Clone HI30.&amp;nbsp; http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd45-antibody-708.html</td></tr><tr><td>anti-human CD45-AF647&amp;nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>304018</td><td>Clone HI30.&amp;nbsp; http://www.biolegend.com/alexa-fluor-647-anti-human-cd45-antibody-2739.html</td></tr><tr><td>Anti-LC3 (Human) mAb clone 4E12</td><td>MBL International Corporation</td><td>M152-3</td><td>Clone 4E+12.&amp;nbsp; Concentration 2 mg/mL.&amp;nbsp; https://www.mblintl.com/products/m152-3</td></tr><tr><td>Anti-SQSTM1 / p62 antibody [EPR4844] - Autophagosome Marker (Alexa Fluor 488)</td><td>abcam</td><td>ab185015</td><td>Clone EPR4844.&amp;nbsp; Concentration 0.5 mg/mL.&amp;nbsp; http://www.abcam.com/sqstm1-p62-antibody-epr4844-autophagosome-marker-alexa-fluor-488-ab185015.html</td></tr><tr><td>Chloroquine diphosphate Salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6628-25G</td><td></td></tr><tr><td>Cleanser - Coulter Clenz&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>8546931</td><td>Fill container with 200 mL of Cleanser.&amp;nbsp; https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/</td></tr><tr><td>DAPI Stain 5 mg/mL</td><td>MilliporeSigma</td><td>508741</td><td>http://www.emdmillipore.com/US/en/product/DAPI-Stain---CAS-28718-90-3---Calbiochem,EMD_BIO-508741</td></tr><tr><td>Debubbler - 70% Isopropanol</td><td>MilliporeSigma</td><td>1.3704</td><td>Fill container with 200 mL of Debubbler.&amp;nbsp; http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline 10x</td><td>MilliporeSigma</td><td>BSS-2010-B</td><td>&amp;nbsp;Ca++Mg++ Free&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline 1x</td><td>MilliporeSigma</td><td>BSS-1006-B</td><td>PBS Ca++Mg++ Free&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Earle&#039;s Balanced Salt Solution 1x</td><td>Gibco</td><td>14155</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>04018</td><td>This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed.&amp;nbsp; Irritating to the eyes, respiratory systems and skin.&amp;nbsp; May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes.&amp;nbsp; Potential cancer hazard.&amp;nbsp; http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/</td></tr><tr><td>Hanks&#039; Balanced Salt Solution 1x</td><td>Gibco</td><td>14175</td><td></td></tr><tr><td>Jurkat, Clone E6-1 (ATCC TIB-152)</td><td>ATCC</td><td>TIB-152</td><td>https://www.atcc.org/products/all/TIB-152.aspx</td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids 100x</td><td>HyClone</td><td>SH30238.01</td><td></td></tr><tr><td>MIFC - ImageStreamX Mark II</td><td>MilliporeSigma</td><td>100220</td><td>A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405nm, 488nm, and 642nm lasers was used. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006</td></tr><tr><td>MIFC analysis software - IDEAS 6.2</td><td>MilliporeSigma</td><td>100220</td><td>The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII).&amp;nbsp; IDEAS version 6.2</td></tr><tr><td>MIFC software - INSPIRE</td><td>MilliporeSigma</td><td>100220</td><td>This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII). INSPIRE version 200.1.388.0</td></tr><tr><td>PE anti-human CD107a (LAMP-1) Antibody clone H4A3</td><td>BioLegend</td><td>328608</td><td>http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html</td></tr><tr><td>Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100x</td><td>HyClone</td><td>SV30082.1</td><td></td></tr><tr><td>Rinse - Ultrapure water or deionized water</td><td>NA</td><td>NA</td><td>You can use any ultrapure water or deionized water.&amp;nbsp; Fill container with 900 mL of Rinse.</td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium 1x</td><td>HyClone</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>Sheath - PBS</td><td>MilliporeSigma</td><td>BSS-1006-B</td><td>This is the same as Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline 1X&amp;nbsp; Ca++MG++ free.&amp;nbsp; Fill container with 900 mL of Sheath.</td></tr><tr><td>Siliconized polypropylene microcentrifuge tubes</td><td>Fisherbrand</td><td>02-681-320</td><td>Fisherbran Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5 mL. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-siliconized-low-retention-microcentrifuge-tubes-8/p-193936</td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate solution (100 mM)</td><td>HyClone</td><td>SH30239.01</td><td></td></tr><tr><td>Sterilizer - 0.4 - 0.7% Hypochlorite</td><td>VWR</td><td>JT9416-1</td><td>This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water.&amp;nbsp; Fill container with 200 mL of Sterilzer.</td></tr><tr><td>System Calibration Reagent - SpeedBead</td><td>MilliporeSigma</td><td>400041</td><td>Each tube holds ~10 mL.&amp;nbsp; https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>T75 flask</td><td>Falcon</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>TRITON X-100, PROTEIN GRADE Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered</td><td>MilliporeSigma</td><td>648463-50ML</td><td>http://www.emdmillipore.com/US/en/product/TRITON-X-100,-PROTEIN-GRADE-Detergent,-10%25-Solution,-Sterile-Filtered---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648463</td></tr><tr><td>Water, Cell Culture Grade&amp;nbsp;</td><td>HyClone</td><td>SH30529.03</td><td></td></tr></tbody></table>

assessing autophagic flux by measuring lc3, p62, and lamp1 co-localization using multispectral imaging flow cytometry

Autophagy는 성장 및 분화 과정에서 축적되는 정상 또는 기능 장애 세포 구성 요소가 리소좀을 통해 분해되어 재활용되는 이화 경로입니다. autophagy 동안, cytoplasmic LC3 단백질은 지방화되고 autophagosomal membranes에 보충된다. autophagosome은 lysosome과 융합하여 autolysosome을 형성하는데, autophagosome 소포와 그 내용물의 분해가 일어난다. LC3에 결합하는 유비퀴틴 관련 단백질 p62는 또한 autophagic 플럭스를 모니터하는 데 사용됩니다. autophagy를 수행하는 세포는 p62, LC3 및 리소좀 마커의 동일 지역화를 입증해야합니다. Immunofluorescence 현미경 검사는 세포 단위로 LC3 puncta, p62 및 / 또는 lysosomes를 시각적으로 확인하는 데 사용되었습니다. 그러나 객관적이고 통계적으로 엄격한 평가는 얻기가 어려울 수 있습니다. 이러한 문제를 극복하기 위해 multispectral imaging flow cytometry와 함께 밝은 de3 개의 autophagy 마커 (LC3, p62 및 lysosomal LAMP1)로부터 꼬리 이미지를 추출하고 객관적이고 정량적이며 통계적으로 견고한 방식으로 자동 계수를 측정하기 위해 LC3 스폿 카운팅과 함께 공동 위치를 정량화합니다.

이 분석 방법은 autophagic 플럭스를 분석하기 위해 여러 기능을 사용합니다. 최종 2 변량 플롯을 완전히 이해하려면 개별 분석 기능을 먼저 조사해야합니다. autophagosomes의 계산은 autophagy를 측정하는 논리적 인 방법입니다; 그러나 LC3 puncta의 크기 / 모양 / 밝기는 세포간에 크게 다를 수 있습니다. 변이로 인해 자동자가 염색체를 수동으로 계산하거나 분석 소프트웨어의 스폿 카운트 기능을 사용하기가 어려울 수 있습니다. 따라서, autophagosomes의 큰 변화 때문에 spot-count 기능은 완벽하지 않습니다. 그러나, 좋은 장소 카운트 기능은 대부분의 세포 (26)에 작동합니다. 도 3 은 상이한 스폿 마스크를 사용하여 Jurkat 셀에서 LC3 점을 스팟 마스킹하는 예를 도시한다. 이 데이터 세트에 대해 선택된 스폿 카운트 기능은 Spot Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4) _4입니다. 즉, 스폿 카운트 기능이spot-to-cell 배경 비율이 4 (Bright, 4) 인 채널 11 (Ch11-LC3-AF647)의 기본 채널 11 마스크 (M11) 내에서 식별 된 마스크. 그림 4 는 대조군, Control + Chloroquine, Starved 및 Starved + Chloroquine Jurkat 세포에 대한 평균 스팟 카운트에 대한 스폿 카운트 히스토그램과 대표 이미지를 보여줍니다 (anti-LC3-AF647로 표시). 대조군과 굶주린 평균 자리 수는 크게 다르지 않습니다. chloroquine을 첨가하면 Starved + Chloroquine에 비해 Control + Chloroquine의 평균값에 큰 차이가 있습니다. 조사 할 다음 기능은 BDC3입니다. BDC3은 세 개의 마커 / 프로브 (이 경우 LC3, p62 및 LAMP1)의 동일 위치 측정 값입니다. 그림 5A - 5D 는 Control, Control + Chloroquine, Starved 및 Starved + Chloroquine Jurkat 세포에 대한 BDC3 히스토그램을 보여줍니다. anti-p62-AF488, 항 -LAMP1-PE 및 항 -LC3-AF647을 포함한다. Control + Chloroquine은 Starved + Chloroquine 평균을 의미합니다. 그러나, 그림 5E - 5H 의 평균 BDC3 점수에서 세포의 이미지를 보면, 히스토그램이 믿을 수있는 것보다 더 큰 차이가 있습니다. 이것은 BDC3가 동일한 BDC3 점수에 대해자가 염색체의 수에 큰 변동성을 초래하는 동시에 공동 위치하는자가 작용 세포 소기관의 수를 고려하지 않기 때문입니다. 대부분의 경우, 기초 수준 에서조차, p62, LAMP1 및 LC3은 어느 정도까지는 세포의 유사한 영역에 공동 위치하거나 상주해야하기 때문에 세 가지 프로브 사이에 중첩이 존재합니다. 대조적으로, 그림 6 과 같이 Starved + Chloroquine 샘플에 대해 anti-p62-AF488, anti-LC3-AF647 및 DAPI 핵 염료가 공존하지 않아야하는 세 가지 프로브의 예 &lt;/ p&gt; 스폿 카운트 기능과 BDC3 기능이 결합되면 다양한 샘플 / 조건을 구별하는 기능을 향상시키는 하위 모집단의 존재가 분명합니다. 그림 7 은 Control, Control + Chloroquine, Starved 및 Starved + Chloroquine의 네 가지 샘플에 대한 LC3 대 BDC3 p62 / LAMP1 / LC3의 스팟 카운트의 이변 변수 플롯을 보여줍니다. Control 샘플은 Low Spots, High Spots / Low BDC3 및 High Spots / High BDC3의 세 가지 집단에 대한 게이팅 전략을 설정하는 데 사용되었습니다. 대조군 샘플은 세포의 98 % 이상이 1 개 이하의 반점을 갖는 것으로 나타났다. High Spots / Low BDC3과 High Spots / High BDC3 사이의 경계는 대조 샘플의 91 % 이상이 1 미만의 BDC3 스코어를 가졌기 때문에 BDC3 스코어가 1로 설정되었습니다. bivariate 플롯에 대한 결과 요약 표 1 에 나타냈다 . age = &quot;1&quot;&gt; <img alt="그림 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig1.jpg" /> 그림 1 : MIFC 악기 설정. 이 실험에 사용 된 MIFC 기기 설정의 스크린 샷으로 프로토콜의 8 단계에 설명되어 있습니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig2.jpg" /> 그림 2 : 분석 소프트웨어 게이팅 전략. 프로토콜 9 단계에서 설명한 분석 소프트웨어 게이팅 구성표의 스크린 샷입니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> fig3.jpg &quot;/&gt; 그림 3 : LC3 스폿 마스킹. 스폿 카운트 기능을 만드는 데 사용되는 Jurkat 셀 이미지 및 마스크. BrightField (BF), LC3-AF647, 피크 (M11, Ch11-LC3-AF647, 밝기, 2), 피크 (M11, Ch11-LC3-AF647, 밝기, 4), 피크 (M11, Ch11-LC3-AF647 Bright, 5), Spot (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 5,3,1) 및 Spot (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 6,2,1) 표시된 모든 셀에서 가장 잘 작동하는 마스크는 Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4)입니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig4.jpg" /> 그림 4 : LC3 스폿 카운트 히스토그램. 컨트롤 ( A , 연한 파란색), 스팟 카운트 기능 Spot Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, 밝기, 4) _4 및 LC3-AF647 스폿 카운트 히스토그램을 사용하여 Control + Chloroquine ( B , 파란색), Starved ( C , 분홍색) 및 Starved + Chloroquine ( D , 빨간색). Control, Control + Chloroquine, Starved 및 Starved + Chloroquine의 평균 스팟 카운트는 각각 0.07, 1.13, 0.10 및 2.77입니다. (spot) 수에 대한 대표적인 세포의 LC3-AF647 및 DAPI 이미지의 복합체 인 BF, LC3-AF647 (적색), DAPI 핵 염료 (청색) 및 대조군 ( E , 0 스팟), 대조 + 클로로퀸 F , 1 지점), Starved ( G , 0 지점), Starved + Chloroquine ( H 지점, 3 지점). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig5.jpg" /> 그림 5 : p62 / LAMP1 / LC3의 BDC3 히스토그램. BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 히스토그램 fo( A , 연한 파란색), Control + Chloroquine ( B , 파란색), Starved ( C , 분홍색), Starved + Chloroquine ( D , 빨간색 Control, Control + Chloroquine, Starved 및 Starved + Chloroquine의 평균 BDC3 점수는 각각 0.57, 0.82, 0.74 및 0.98입니다. BF; p62-AF488 (녹색); LAMP1-PE (황색); LC3-AF647 (적색); Control ( E ), Control + Chloroquine ( F ), Starved ( G ), 및 Starved + Chloroquine에 대한 대표적인 세포의 p62-AF488, LAMP1-PE 및 LC3- H ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig6.jpg" /> 그림 6 : p62 / L의 BDC3 히스토그램굶주린 + 클로로퀸 시료의 경우 C3 / DAPI. ( A ) Starved + Chloroquine 샘플에 대한 BDC3 p62 / LC3 / DAPI 히스토그램이 표시됩니다. 평균 BDC3 점수는 0.07입니다. ( B ) BF; p62-AF488 (녹색); LC3-AF647 (적색); DAPI (파란색); Starved + Chloroquine 샘플의 경우 평균 BDC3에 대한 대표 세포의 p62-AF488, LC3-AF647 및 DAPI 이미지의 합성이 표시됩니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig7.jpg" /> 그림 7 : LC3 스팟 카운트 대 BDC3 p62 / LAMP1 / LC3의 2 변이 플롯. ( A ) Control, Control + Chloroquine, Starved 및 Starved + Chloroquine Jurkat 세포에 대한 LC3 스팟 카운트 대 BDC3 p62 / LAMP1 / LC3의 2 변이 플롯. ( B ) BF; p62-AF488 (녹색); LAMP1-PE (황색); LC3-AF647 (적색); Starved + Chloroquine 샘플의 경우 3 개 영역 ( 즉, 낮은 스폿, 하이 스팟 / 로우 BDC3 및 하이 스팟 / 하이 BDC3)의 p62-AF488, LAMP1-PE 및 LC3-AF647 이미지가 합성되어 표시됩니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> 세포 수 </td><td> 밝은 세부 Colocalization 3 평균 </td><td> 스팟 카운트 LC3 평균 </td><td> 낮은 곳 (%) </td><td> 높음 높음 / 낮음 BDC3 </td><td> 높은 반점 / 높음 BDC3 </td></tr><tr><td> 제어 </td><td> 439 </td><td> 0.57 </td><td> 0.07 </td><td> 98.2 </td><td> 1.8 </td><td> 0.0 </td></tr><tr><td> 대조 + 클로로퀸 </td><td> 1432 년 </td><td> 0.82 </td><td> 1.13 </td><td> 68.9 </td&gt; <td> 19.5 </td><td> 11.7 </td></tr><tr><td> 굶주린 </td><td> 1204 </td><td> 0.74 </td><td> 0.10 </td><td> 98.4 </td><td> 0.6 </td><td> 1.0 </td></tr><tr><td> 굶주린 + Chloroquine </td><td> 1811 년 </td><td> 0.98 </td><td> 2.77 </td><td> 32.1 </td><td> 36.9 </td><td> 31.0 </td></tr></tbody></table> 표 1 : Jurkat LC3 스팟 카운트 대 BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 2 변량 플롯의 요약

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Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

여기에 LC3 spot counting과 함께 3 개의 autophagy marker의 밝은 디테일 이미지를 비교하고 co-localization을 정량화하는 분석적인 특징을 가진 multispectral imaging flow cytometry가 객관적이고 정량적이며 통계적으로 강력한 방식으로 autophagy를 측정하는 데 사용되었습니다.

Multispectral Imaging Flow Cytometry를 사용하여 LC3, p62 및 LAMP1 Co-Localization 측정을 통한 Autophagic Flux 평가

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via ...

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Research

JoVE Journal

Biology

31.0K 조회수.  MilliporeSigma.  여기에 LC3 spot counting과 함께 3 개의 autophagy marker의 밝은 디테일 이미지를 비교하고 co-localization을 정량화하는 분석적인 특징을 가진 multispectral imaging flow cytometry가 객관적이고 정량적이며 통계적으로 강력한 방식으로 autophagy를 측정하는 데 사용되었습니다. 

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Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to antigen presenting cells1-5. Internalization of nanoparticles (NP) by antigen presenting cells is a critical step in generating an effective immune response to the encapsulated antigen. To determine how changes in nanoparticle formulation impact function, we sought to develop a high throughput, quantitative experimental protocol that was compatible with detecting internalized nanoparticles as well as bacteria. To date, two independent techniques, microscopy and flow cytometry, have been the methods used to study the phagocytosis of nanoparticles. The high throughput nature of flow cytometry generates robust statistical data. However, due to low resolution, it fails to accurately quantify internalized versus cell bound nanoparticles. Microscopy generates images with high spatial resolution; however, it is time consuming and involves small sample sizes6-8. Multi-spectral imaging flow cytometry (MIFC) is a new technology that incorporates aspects of both microscopy and flow cytometry that performs multi-color spectral fluorescence and bright field imaging simultaneously through a laminar core. This capability provides an accurate analysis of fluorescent signal intensities and spatial relationships between different structures and cellular features at high speed.
	Herein, we describe a method utilizing MIFC to characterize the cell populations that have internalized polyanhydride nanoparticles or Salmonella enterica serovar Typhimurium. We also describe the preparation of nanoparticle suspensions, cell labeling, acquisition on an ImageStreamX system and analysis of the data using the IDEAS application. We also demonstrate the application of a technique that can be used to differentiate the internalization pathways for nanoparticles and bacteria by using cytochalasin-D as an inhibitor of actin-mediated phagocytosis.

In this article, we describe a method utilizing multi-spectral imaging flow cytometry to quantify the internalization of polyanhydride nanoparticles or bacteria by RAW 264.7 cells.

멀티 스펙트럼 이미징 유동세포계측법 의해 Nanoparticles과 박테리아의 세포 내면화 분석

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

연구

생체공학

Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy (ATOM)

Scaling the number of measurable parameters, which allows for multidimensional data analysis and thus higher-confidence statistical results, has been the main trend in the advanced development of flow cytometry. Notably, adding high-resolution imaging capabilities allows for the complex morphological analysis of cellular/sub-cellular structures. This is not possible with standard flow cytometers. However, it is valuable for advancing our knowledge of cellular functions and can benefit life science research, clinical diagnostics, and environmental monitoring. Incorporating imaging capabilities into flow cytometry compromises the assay throughput, primarily due to the limitations on speed and sensitivity in the camera technologies. To overcome this speed or throughput challenge facing imaging flow cytometry while preserving the image quality, asymmetric-detection time-stretch optical microscopy (ATOM) has been demonstrated to enable high-contrast, single-cell imaging with sub-cellular resolution, at an imaging throughput as high as 100,000 cells/s. Based on the imaging concept of conventional time-stretch imaging, which relies on all-optical image encoding and retrieval through the use of ultrafast broadband laser pulses, ATOM further advances imaging performance by enhancing the image contrast of unlabeled/unstained cells. This is achieved by accessing the phase-gradient information of the cells, which is spectrally encoded into single-shot broadband pulses. Hence, ATOM is particularly advantageous in high-throughput measurements of single-cell morphology and texture &#8211; information indicative of cell types, states, and even functions. Ultimately, this could become a powerful imaging flow cytometry platform for the biophysical phenotyping of cells, complementing the current state-of-the-art biochemical-marker-based cellular assay. This work describes a protocol to establish the key modules of an ATOM system (from optical frontend to data processing and visualization backend), as well as the workflow of imaging flow cytometry based on ATOM, using human cells and micro-algae as the examples.

Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy ATOM

This protocol describes the implementation of an asymmetric-detection time-stretch optical microscopy system for single-cell imaging in ultrafast microfluidic flow and its applications in imaging flow cytometry.

Scaling the number of measurable parameters, which allows for multidimensional data analysis and thus higher-confidence statistical results, has been the ...

공학

Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, senescence is a fundamentally different machinery restraining&#160;propagation of cancer cells. Decades of scientific studies have revealed the complex pathological effects of senescent cancer cells in tumors and microenvironments that modulate cancer cells and stromal cells. New evidence suggests that senescence is a potent prognostic factor during cancer treatment, and therefore rapid and accurate detection of senescent cells in cancer samples is essential. This paper presents a method to visualize and detect therapy-induced senescence (TIS) in cancer cells. Diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) cell lines were treated with mafosfamide (MAF) or daunorubicin (DN) and examined for the senescence marker, senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-gal), the DNA synthesis marker 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU), and the DNA damage marker gamma-H2AX (&#947;H2AX). Flow cytometer imaging can help generate high-resolution single-cell images in a short period of time to simultaneously visualize and quantify the three markers in cancer cells.

Here we present a flow cytometry-based method for visualization and quantification of multiple senescence-associated markers in single cells.

치료 유도 노인성 암 세포에서 다중 형광 노화 마커의 동시 이미징 및 유동 세포 측정 기반 검출

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, ...

암 연구학

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

망막 미세 아교 식세포의 기능을 평가<em&gt; 생체</em&gt;은 유동 세포 계측법 기반 분석을 사용하여

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

면역학 및 감염병학

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and introduces uncertainty in results due to variability between scorers. To remedy this, automated slide-scanning microscopy as well as conventional flow cytometry methods have been introduced in an attempt to remove scorer bias and improve throughput. However, these methods have their own inherent limitations such as inability to visualize the cytoplasm of the cell and the lack of visual MN verification or image data storage with flow cytometry. Multispectral Imaging Flow Cytometry (MIFC) has the potential to overcome these limitations. MIFC combines the high resolution fluorescent imagery of microscopy with the statistical robustness and speed of conventional flow cytometry. In addition, all collected imagery can be stored in dose-specific files. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the MN assay on MIFC. Human lymphoblastoid TK6 cells were enlarged using a hypotonic solution (75 mM KCl), fixed with 4% formalin and the nuclear content was stained with Hoechst 33342. All samples were run in suspension on the MIFC, permitting acquisition of high resolution images of all key events required for the assay (e.g. binucleated cells with and without MN as well as mononucleated and polynucleated cells). Images were automatically identified, categorized and enumerated in the MIFC data analysis software, allowing for automated scoring of both cytotoxicity and genotoxicity. Results demonstrate that using MIFC to perform the in vitro MN assay allows statistically significant increases in MN frequency to be detected at several different levels of cytotoxicity when compared to solvent controls following exposure of TK6 cells to Mitomycin C and Colchicine, and that no significant increases in MN frequency are observed following exposure to Mannitol.

The in vitro micronucleus assay is a well-established method for evaluating genotoxicity and cytotoxicity but scoring the assay using manual microscopy is laborious and suffers from subjectivity and inter-scorer variability. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the assay using multispectral imaging flow cytometry.

다중 스펙트럼 화상 진찰 교류 세포측정을 사용하여 시험관 내 미세핵 분석기를 능력을 발휘하는 자동화된 방법

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular components responsible for supplying cell energy; however, excess mitochondria also produce reactive oxygen species (ROS) that could cause cell death. Therefore, the number of mitochondria must constantly be adjusted to fit the needs of the cells. This dynamic regulation is achieved in part through the function of lysosomes that remove surplus/damaged organelles and macromolecules. Hence, cellular mitochondrial and lysosomal contents are key indicators to evaluate the metabolic adjustment of cells. With the development of probes for organelles, well-characterized lysosome or mitochondria-specific dyes have become available in various formats to label cellular lysosomes and mitochondria. Multicolor flow cytometry is a common tool to profile cell phenotypes, and has the capability to be integrated with other assays. Here, we present a detailed protocol of how to combine organelle-specific dyes with surface markers staining to measure the amount of lysosomes and mitochondria in different T cell populations on a flow cytometer.

This article illustrates a powerful method to quantify mitochondria or lysosomes in living cells. The combination of lysosome- or mitochondria-specific dyes with fluorescently conjugated antibodies against surface markers allows the quantification of these organelles in mixed cell populations, like primary cells harvested from tissue samples, by using multicolor flow cytometry.

미토 콘 드리 아와 T 세포에서는 리소좀의 다 색 흐름 Cytometry 기반 정량화

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Identification of a Murine Erythroblast Subpopulation  Enriched in Enucleating Events by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Erythropoiesis in mammals concludes with the dramatic process of enucleation that results in reticulocyte formation. The mechanism of enucleation has not yet been fully elucidated. A common problem encountered when studying the localization of key proteins and structures within enucleating erythroblasts by microscopy is the difficulty to observe a sufficient number of cells undergoing enucleation.&#160;We have developed a novel analysis protocol using multiparameter high-speed cell imaging in flow (Multi-Spectral Imaging Flow Cytometry), a method that combines immunofluorescent microscopy with flow cytometry, in order to identify efficiently a significant number of enucleating events, that allows to obtain measurements and perform statistical analysis.
We first describe here two in vitro erythropoiesis culture methods used in order to synchronize murine erythroblasts and increase the probability of capturing enucleation at the time of evaluation.&#160;Then, we describe in detail the staining of erythroblasts after fixation and permeabilization in order to study the localization of intracellular proteins or lipid rafts during enucleation by multi-spectral imaging flow cytometry.&#160;Along with size and DNA/Ter119 staining which are used to identify the orthochromatic erythroblasts, we utilize the parameters &#8220;aspect ratio&#8221; of a cell in the bright-field channel that aids in the recognition of elongated cells and &#8220;delta centroid XY Ter119/Draq5&#8221; that allows the identification of cellular events in which the center of Ter119 staining (nascent reticulocyte) is far apart from the center of Draq5 staining (nucleus undergoing extrusion), thus indicating a cell about to enucleate.&#160;The subset of the orthochromatic erythroblast population with high delta centroid and low aspect ratio is highly enriched in enucleating cells.

The present protocol describes a novel method of identifying a population of enucleating orthochromatic erythroblasts by multi-spectral imaging flow cytometry, providing a visualization of the erythroblast enucleation process.

멀티 스펙트럼 이미징 유동 세포 계측법에 의한 탈핵 이벤트에 쥐의 적혈구 모세포 모집단 인리 치드의 확인

Erythropoiesis in mammals concludes with the dramatic process of enucleation that results in reticulocyte formation. The mechanism of enucleation has not ...

생물학

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

스펙트럼 유동 세포 계측법에 의해 고체 조직에서 분리 한 세포 현탁액의 분석

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Sensitive Measurement of Mitophagy by Flow Cytometry Using the pH-dependent Fluorescent Reporter mt-Keima

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between defective mitophagy and various human diseases, including neurodegenerative diseases, cancer, and metabolic diseases. In addition, recent studies have shown that mitophagy is involved in normal cellular processes, such as differentiation and development. However, the precise role of and molecular mechanisms underlying mitophagy require further study. Therefore, it is critical to develop a robust and convenient method for measuring changes in mitophagy activity. Here, we describe a detailed protocol for quantitatively assessing mitophagy activity through flow cytometry using the mitochondria-targeted fluorescent protein Keima (mt-Keima). This flow cytometry assay can analyze mitophagy activity more rapidly and sensitively than conventional microscopy- or immunoblotting-based methods. This protocol can be applied to analyze mitophagy activity in various cell types.

Mitophagy, the selective degradation of mitochondria, has been implicated in mitochondrial homeostasis and is deregulated in various human diseases. However, convenient experimental methods for measuring mitophagy activity are very limited. Here, we provide a sensitive assay for measuring mitophagy activity using flow cytometry.

형광 기자 흐름 Cytometry 사용 pH-종속 mt-Keima에 의해 Mitophagy의 중요 한 측정

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between ...

Flux-Based Assay for the Identification of Autophagy Modulators for Osteoarthritis

Autophagy is a central mechanism to regulate homeostasis. Alterations of autophagy contribute to aging-related diseases. Phenotypic methods to identify regulators of autophagy could be used for the identification of novel therapeutics. This article describes a cell-based imaging screening workflow developed to monitor autophagic flux using LC3 as a reporter of autophagic flux (mCherry-EGFP-LC3B) in human chondrocytes. Data acquisition is performed using an automated High Content Imaging Screening System microscope. An algorithm-based automated image analysis protocol was developed and validated to identify molecules activating autophagic flux. Critical steps, explanatory notes, and improvements over current autophagy monitoring protocols are reported. Physiologically relevant phenotypic screening approaches to target hallmarks of aging can facilitate more effective drug discovery strategies for age-related musculoskeletal diseases.

This paper details monitoring autophagy flux to identify new molecules by cell-based imaging screening.

Autophagy is a central mechanism to regulate homeostasis. Alterations of autophagy contribute to aging-related diseases. Phenotypic methods to identify ...