הפרוטוקול שלנו מאפשר מדידה של קצב פעילות אוטופגיה ופרוטאסומאלית ברקמות העכבר והוא רגיש מספיק כדי לזהות וריאציות סביבה בתוך פעילויות אלה. טכניקה זו יכולה לשמש vivo כדי להעריך קטבוליזם חלבון בתאים ורקמות ואת החומרים הנדרשים הם נמוכים יחסית טק ונגיש לכל מעבדה ביולוגיה מולקולרית. מדגים את ההליך יהיה מיכאיל Ryzhikov, פוסט דוקטורט מהמעבדה שלי.
במשך רבע שעה לפני כל נקודת זמן, לחמם את פתרונות מלאי leupeptin ו bortezomib לטמפרטורת החדר לדלל את bortezomib מופשר PBS סטרילי להניב פתרון עבודה 50 מיליגרם למיליליטר. עבור ניהול מעכבי פרוטאז, להזריק תוך-אפית 40 מיליגרם לקילוגרם של leupeptin או 1.6 מיקרוגרם לקילוגרם של bortezomib לתוך כל חיה ניסיונית. עבור שליטה שלילית, להזריק עכברים עם 0.5 מיליליטר של PBS.
להחזיר כל עכבר לכלובים מקובצים לפי סוג הטיפול המתקבל כפי שהם מוזרקים ולתזמן את הזמן כי העכברים מטופלים או מניפולציה בטבלה מתוקנת. שעתיים לאחר ההזרקה, להטביע את האונה הכבד השמאלי שנקטפו מכל חיה ניסיונית מוקרבת בשבעה מיליליטר של חיץ הומוגניזציה קר קרח כראוי שכותרתו 15 צינורות חרוט מיליליטר על קרח. כאשר כל הדגימות נרכשו, להעביר את המדגם הראשון ואת כל נפח של חיץ הומוגניזציה לתוך קיבולת 15 מיליליטר Dounce homogenizer הומוגניזציה המדגם עם 10 משיכות של בוכנה רופפת 15 משיכות של הבוכנה הדוק.
להחזיר את הומוגנט גולמי וכתוצאה מכך לצינור המקורי שלה הומוגניזציה המדגם הבא כפי שהודגם רק. כאשר כל הדגימות כבר homogenized, משכן את הגרעינים הומוגנית ופסולת על ידי צנטריפוגה ולהעביר את ארבעת המיליליטרים העליונים של כל על טבעי פוסט גרעיני לתוך צינורות חדשים 15 מיליליטר. לקבוע את ריכוז החלבון של שבר טבעי ראשון זה על פי פרוטוקולים סטנדרטיים ולהשוות את הריכוזים של כל הדגימות ל 2.1 מיליגרם למיליליטר עם מאגר הומוגניזציה טרי לפי הצורך.
לניתוח במורד הזרם ושיפור האיכות, aliquot 500 microliters של שברי החלבון הכולל מנורמל לתוך 1.5 צינורות מיקרוצנטריפוגה מיליליטר עבור אחסון מינוס 80 מעלות צלזיוס. מעבירים 1.5 מיליליטר מכל אחד משברי החלבון הנותרים לצינורות מיקרוצנטריפוגה בודדים ומעבירים את דגימות החלבון על ידי צנטריפוגה. מעבירים מיליליטר אחד של השבר השני של העל-טבעיים לצינורות מיקרוצנטריפוגה חדשים על הקרח ושואפים את שאר העל-טבעיים.
לשטוף את כדורי 3K פעמיים ב 1.5 מיליליטר של חיץ הומוגניזציה קר טרי לכל לשטוף, ולאחר מכן resuspend גלולה 3K ב 200 microliters של מאגר מדגם SDS-PAGE ולהרתיח את הדגימות ב 95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לסובב את השבר השני supernatants במשך 20 דקות ב 20, 000 x g וארבע מעלות צלזיוס ולהעביר את השבר הציטופלזמי השלישי וכתוצאה מכך supernatants לתוך צינור microcentrifuge חדש. לניתוח SDS-PAGE, שלבו 150 מיקרוליטרים של השבר הציטופלסמי עם 50 מיקרוליטרים של מאגר מדגם SDS-PAGE 4x והרתיחו את דגימות השבר הציטופלסמי ב-95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.
שאפו את העל-טבעי הנותר מכדורי ה-20K ושטפו את הדגימות פעמיים עם 1.5 מיליליטר של חיץ הומוגניזציה קר טרי לכל שטיפה. לאחר מכן בצעו שימוש חוזר בכדור 20K ב-100 מיקרוליטרים של מאגר מדגם SDS-PAGE לרתיחה ב-95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לניתוח כתם מערבי, לדלל באופן סדרתי חלבונים עקומה סטנדרטית אחד עד שלושה במאגר מדגם 1x עבור סך של שישה דילולים לטעון 10 microliters של כל דגימת עקומה סטנדרטית לתוך באר אחת של 26 גם ארבעה עד 12% SDS-PAGE midi ג'ל, ולאחר מכן לטעון תקן משקל מולקולרי מסחרי prestained.
כדי למדוד את שטף autophagic, לטעון 12 microliters של כל דגימת גלולה 3K לתוך בארות המתאימות. כדי למדוד את שטף proteasomal, לטעון 12 microliters של כל שבר ציטופלסמי לתוך בארות המתאימות. כאשר כל הבקרה ודגימות הניסוי נטענו, להפריד את דגימות החלבון על ידי SDS-PAGE לפני העברת החלבונים קרום פלואוריד פוליווינילידין על פי פרוטוקולים סטנדרטיים.
לניתוח שטף מקרואוטופי, ממברנות כתם המכילות את דגימות גלולת 3K עם נוגדן אנטי p62 או אנטי LcB לילה בארבע מעלות צלזיוס. לניתוח שטף פרוטאסומאלי, קרום כתם המכיל את דגימות שבר ציטופלסמי עם נוגדן אנטי ליזן 48 ספציפי פולי ubiquitin לילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן תדמיין את הכתמים המערביים באמצעות נוגדנים משניים סטנדרטיים והתקני הדמיה.
כדי לבצע מדידות צפיפות על רצועות מעניינות הן עבור העקומה הסטנדרטית והן עבור דגימות ניסיוניות, פתח תוכנה מתאימה לניתוח תמונה וצייר מלבן ארוך המקיף את מונומר החלבון המעניין בתחתית התמונה הכתום המשתרעת לראש הממברנה. העתק והדבק כדי להעביר את המלבן לדגימות הנותרות, תוך שמירה על עקביות המלבן בין הדוגמאות. שמור את הכימות בגיליון אלקטרוני וליצור עקומה סטנדרטית densitometric בתוך הגיליון האלקטרוני באמצעות מדגם סטנדרטי מדולל סדרתי רגרסיה ליניארית או פולינומית כדי להשיג משוואת עקומה סטנדרטית בכושר הטוב ביותר.
באמצעות משוואה זו, לשער את כמות המונומרים של עניין בתוך הדגימות הניסיוניות. כדי להשיג מדידות שטף, הפחת את כמות החלבון המוערך של כל מעכב שטופל מדגם מהערך הממוצע של דגימות PBS מאותה נקודת זמן. לאחר מכן להעריך את המובהקת הסטטיסטית של וריאציה זמנית במחזור החלבון באמצעות ANOVA חד-כיוון.
הקריאה העיקרית של שטף אוטופגי בכל נקודת זמן נתונה היא ההבדל בכמות סמנים ספציפיים מקרואוטופיים בין leupeptin שטופלו לעומת דגימות מזויפות בשבר גלולה 3K מועשר lysosome מחולק לשניים. בדרך כלל, התוצאות מנורמלות ל הממוצע אשר מפשט את ההשוואה על פני ניסויים עצמאיים. ההליך שלנו למדידת שטף פרוטאוליטי תלוי ביכולת של leupeptin או bortezomib לגרום הצטברות של מצעים autophagy ו proteasome, שהוא תהליך תלוי זמן.
טכניקה זו אפשרה לחקור כיצד מקצבים ביולוגיים לתכנת קטבוליזם חלבון בכבד. אנו מקווים שזה יסלול את הדרך לחקירת השפעות המחלה על תפקודי משק הבית התאיים.
