MilliporeSigma, Philip J. Morrissey ve Sherree L. Friend&#39;deki meslektaşlarımıza yıllar boyunca destek ve rehberlik yaptıkları için teşekkür etmek istiyorum. Vidya Venkatachalam&#39;a ve Bryan R. Davidson&#39;a, IDEAS yazılımındaki BDC3 özelliği ile ilgili yardımlarından ötürü teşekkür ediyorum , bu el yazması için Raymond Kong&#39;a yardımcı olmak için Ryan P. Jessup çekim gününde yardım ve özel teşekkürler Makyaj sanatçısı Cynthia Xamonthiene&#39;e.

<ol>
	<li>Levine, B., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+by+self-digestion:+molecular+mechanisms+and+biological+functions+of+autophagy.">Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy.</a> Developmental Cell. 6, 463-477 (2004).</li><li>Zhang, X. J., Chen, S., Huang, K. X., Le, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+should+autophagic+flux+be+assessed?.">Why should autophagic flux be assessed?.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 34, 595-599 (2013).</li><li>Tanida, I., Takashi, U., Kominami, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3+and+Autophagy.">LC3 and Autophagy.</a> Methods Mol Biol. 445, 77-88 (2008).</li><li>Larsen, K. B., Lamark, T., &#216;vervatn, A., Harneshaug, I., Johansen, T., Bj&#248;rk&#248;y, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reporter+cell+system+to+monitor+autophagy+based+on+p62/SQSTM1.">A reporter cell system to monitor autophagy based on p62/SQSTM1.</a> Autophagy. 6 (6), 784-793 (2010).</li><li>Demishtein, A., Porat, Z., Elazar, Z., Shvets, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+flow+cytometry+for+measurement+of+autophagy.">Applications of flow cytometry for measurement of autophagy.</a> Methods. 75, 87-95 (2015).</li><li>Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+mammalian+autophagy+research.">Methods in mammalian autophagy research.</a> Cell. 140 (3), 313-326 (2010).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy.">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy.</a> Autophagy. 8 (4), 445-544 (2012).</li><li>Arsov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAC-mediated+transgenic+expression+of+fluorescent+autophagic+protein+Beclin+1+reveals+a+role+for+Beclin+1+in+lymphocyte+development.">BAC-mediated transgenic expression of fluorescent autophagic protein Beclin 1 reveals a role for Beclin 1 in lymphocyte development.</a> Cell Death Differ. 15 (9), 1385-1395 (2008).</li><li>Maloyan, A., Sayegh, J., Osinska, H., Chua, B. H., Robbins, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+death+pathways+in+desmin-related+cardiomyopathy.">Manipulation of death pathways in desmin-related cardiomyopathy.</a> Circ Res. 106 (9), 1524-1532 (2010).</li><li>Altman, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+is+essential+to+suppress+cell+stress+and+to+allow+BCR-Abl-mediated+leukemogenesis.">Autophagy is essential to suppress cell stress and to allow BCR-Abl-mediated leukemogenesis.</a> Oncogene. 30 (16), 1855-1867 (2011).</li><li>Suarez, A. L., Kong, R., George, T., He, L., Yue, Z., van Dyk, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gammaherpesvirus+68+infection+of+endothelial+cells+requires+both+host+autophagy+genes+and+viral+oncogenes+for+optimal+survival+and+persistence.">Gammaherpesvirus 68 infection of endothelial cells requires both host autophagy genes and viral oncogenes for optimal survival and persistence.</a> J Virol. 85 (13), 6293-6308 (2011).</li><li>Tra, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+human+embryonic+stem+cells.">Autophagy in human embryonic stem cells.</a> PLoS One. 6 (11), (2011).</li><li>Yuan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bafilomycin+A1+targets+both+autophagy+and+apoptosis+pathways+in+pediatric+B-cell+acute+lymphoblastic+leukemia.">Bafilomycin A1 targets both autophagy and apoptosis pathways in pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Haematologica. 100 (3), 345-356 (2015).</li><li>Leveque-El Mouttie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+is+required+for+stem+cell+mobilization+by+G-CSF.">Autophagy is required for stem cell mobilization by G-CSF.</a> Blood. 125 (19), 2933-2936 (2015).</li><li>Watson, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+limits+proliferation+and+glycolytic+metabolism+in+acute+myeloid+leukemia.">Autophagy limits proliferation and glycolytic metabolism in acute myeloid leukemia.</a> Cell Death Discov. 1, 15008 (2015).</li><li>Stranks, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+Controls+Acquisition+of+Aging+Features+in+Macrophages.">Autophagy Controls Acquisition of Aging Features in Macrophages.</a> J Innate Immun. 7 (4), 375-391 (2015).</li><li>Clarke, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+is+activated+in+systemic+lupus+erythematosus+and+required+for+plasmablast+development.">Autophagy is activated in systemic lupus erythematosus and required for plasmablast development.</a> Ann Rheum Dis. 74 (5), 912-920 (2015).</li><li>Warnes, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+assays+for+the+study+of+autophagy.">Flow cytometric assays for the study of autophagy.</a> Methods. 82, 21-28 (2015).</li><li>Bj&#248;rk&#248;y, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p62/SQSTM1+forms+protein+aggregates+degraded+by+autophagy+and+has+a+protective+effect+on+huntingtin-induced+cell+death.">p62/SQSTM1 forms protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect on huntingtin-induced cell death.</a> J Cell Biol. 171 (4), 603-614 (2005).</li><li>Phadwal, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+autophagy+detection+in+primary+cells:+Impaired+levels+of+macroautophagy+in+immunosenescent+T+cells.">A novel method for autophagy detection in primary cells: Impaired levels of macroautophagy in immunosenescent T cells.</a> Autophagy. 8 (4), 677-689 (2012).</li><li>Rajan, R., Karbowniczek, M., Pugsley, H. R., Sabnani, M. K., Astrinidis, A., La-Beck, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+autophagosomes+and+autolysosomes+in+cells+using+imaging+flow+cytometry.">Quantifying autophagosomes and autolysosomes in cells using imaging flow cytometry.</a> Cytometry A. 87 (5), 451-458 (2015).</li><li>Kwok, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HspB8+mutation+causing+hereditary+distal+motor+neuropathy+impairs+lysosomal+delivery+of+autophagosomes.">HspB8 mutation causing hereditary distal motor neuropathy impairs lysosomal delivery of autophagosomes.</a> J Neurochem. 119 (6), 1155-1161 (2011).</li><li>Lopez-Herrera, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deleterious+Mutations+in+LRBA+Are+Associated+with+a+Syndrome+of+Immune+Deficiency+and+Autoimmunity.">Deleterious Mutations in LRBA Are Associated with a Syndrome of Immune Deficiency and Autoimmunity.</a> Am J Hum Genet. 90 (6), 986-1001 (2012).</li><li>Pike, L. R., Phadwal, K., Simon, A. K., Harris, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATF4+orchestrates+a+program+of+BH3-only+protein+expression+in+severe+hypoxia.">ATF4 orchestrates a program of BH3-only protein expression in severe hypoxia.</a> Mol Biol Rep. 39 (12), 10811-10822 (2012).</li><li>Pike, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+up-regulation+of+ULK1+by+ATF4+contributes+to+cancer+cell+survival.">Transcriptional up-regulation of ULK1 by ATF4 contributes to cancer cell survival.</a> Biochem J. 449 (2), 389-400 (2013).</li><li>Pugsley, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+autophagy:+Measuring+LC3+puncta+and+autolysosome+formation+in+cells+using+multispectral+imaging+flow+cytometry.">Quantifying autophagy: Measuring LC3 puncta and autolysosome formation in cells using multispectral imaging flow cytometry.</a> Methods. 112, 147-156 (2017).</li><li>IDEAS. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Image Data Exploration and Analysis Software User's Manual Version 6.2. , (2015).</li></ol>

Bu çalışmada kullanılan Amnis markası ImageStream&#39;in yapımcısı MilliporeSigma tarafından istihdam edildim.

Bu analiz yapılırken göz önüne alınması gereken birkaç nokta var. Uygun kontrol örneklerine sahip olmak önemlidir. Bu deney için iki farklı kontrol kullanıldı: Kontrol ve Kontrol + Klorokin. Bölgeler için eşik değeri belirlemek için Kontrol örneği kullanıldı. Otofajinin temel seviyesini lizozomal bozunmayı durdurmadan gösterir ve Starved örneğinin kontrolüdür. Bununla birlikte, Kontrol örneği, Starved + Chloroquine örneğindeki sonuçlar ile karşılaştırmak için uygun bir kontrol değildir; çünkü klorokin kontrol numunesini etkiler. Dolayısıyla, bir Control + Chloroquine örneği almak gerekiyordu. Otofaj için herhangi bir analiz yapmadan önce, yalnızca odaklanan tek hücre ( yani, RMS, 60&#39;dan büyük gradyan) üzerinde analiz etmek / kapamak önemlidir, çünkü birden fazla hücre varsa veya görüntüler etkilenebilir odak dışı. OtofagosomunEs ve lizozomlar uygun nokta sayımı ve BDC3 analizi için odaklanmaktadır. Otofaji analizinden önce apoptotik hücreler çıkartılmalıdır, çünkü sonuç çarpıtabilir ve eklenmemelidir. Her üç belirteç için de uygun boyama yapılmalıdır ( yani, LC3, p62 ve LAMP1). Örneğin, üç belirteçin tümü hücrelerarasıdır ve noktalamalı bir işaret içermelidir; Sinyal işaretli değilse veya hücrenin yüzeyinde bulunuyorsa boyama uygun olmayacak ve deney / boyanma yeniden yapılmalıdır. Buna ek olarak, BDC3&#39;ün doğru olması için, ilgilenilen üç flüoresan markeri için parlak olan hücreleri kaplamak gereklidir. Olumlu olaylar üzerinde geçiş, BDC3&#39;ün spesifik olmayan bağlanma, görüntüleme eserleri ve / veya gürültü üzerindeki ölçümünü önlemek için gereklidir. BDC3, gerçek sinyaller olmayan eserleri potansiyel olarak artırabildiği için bu çok önemlidir. BDC3 yalnızca parlak olumlu olaylar üzerinde gerçekleştirilebildiğinden, birçok hücre son analizde yer almayabilir; Bu especLC3, p62 ve / veya LAMP1 birikimine sahip olmayan kontrol hücreleri için geçerlidir. Bu nedenle, bu tahlilde bir sınırlama, BDC3&#39;ün yalnızca üç markör için de pozitif olan hücreleri inceler, bu da tüm otofajy deneyleri için uygun olmayabilir. Daha önce 15 , 16 , 17 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 olarak bildirilen BDS gibi, BDC3 tek başına, birlikte lokalize olan otofaji organellerin sayısını hesaba katmaz, bu da büyük bir dereceye neden olur Otofagozom sayısındaki değişkenlik. Bu nedenle, Rajan ve ark. Tarafından sunulan iki değişkenli yaklaşım ; kullanılmıştır. İki değişkenli parsele baktığımızda,Hücreler LC3, p62 ve LAMP1 için pozitif olmalıdır; Neden 0 noktalı çok fazla hücre var? Bunun nedeni, LC3 sinyalinin birlikte lokalizasyon için yeterince parlak olabilmesidir, ancak bunun dikkate alınması için gerekli olan tepe maskesinin (Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Parlak, 4)) belirlediği eşiğe gelmeyebilir yer. Burada sunulan protokol, otofajik akıyı ölçmek için LC3 noktalamasını saymak için MIFC&#39;yi ve üç otofaji belirteçinin birlikte lokalizasyonunu kullandı. Bazal şartlar altında (kontrol örneği), otofagozom sayısı düşük ve &quot;Yüksek Noktalar&quot; ile çok az hücre bulundu. Otofagozom / lizozom füzyonunu inhibe eden klorokin ilavesi ile LC3 lekelerinin sayısında bir artış olmuştur. Lizozom otofagozomu ve otofagozomda bulunan p62&#39;yi parçalayamadığından, LC3, p62 ve LAMP1 otolizozom birikiminin birlikte lokalizasyonunda artışa neden olur. Bu etki, besleyici starvatIyon, otofajiye neden olur. Bununla birlikte, klorokin ilavesi olmaksızın, büyük olasılıkla otofajik döngü oranındaki artıştan ötürü otofogozom sayısındaki belirgin bir artış görülmemiştir. Hücreler klorokin varlığında aç bırakıldığında, açlığın otofajik akıyı arttırdığı sonucunu destekleyen otofagozomların birlikte lokalizasyonunda ve sayısında bir artış oldu. EBSS, otofajinin güçlü bir uyarıcısı olarak bilinir. Dolayısıyla, artışın büyük olması bekleniyor. Otofajiyi indüklemek için uyuşturucu indüksiyonu gibi başka bir yöntem kullanılırsa, kontrol ve muamele edilmiş numuneler arasındaki fark daha ince olabilir. Bu özel protokol, insan hücre dizilerindeki otofajiyi ölçmek üzere tasarlanmıştı, ancak tahlil, bu türler için antikora geçiş yaparak diğer türlere adapte edilebilir. Buna ek olarak, analiz yöntemi, birlikte lokalizasyonu gerektiren herhangi bir hücre içi uygulama için kullanılabilirÜç prob / belirteçten oluşur.

Bundan sonra otofajinin olarak anılacaktır Macroautophagy, zarar görmüş ya da işlevsel parçalar, uzun ömürlü proteinler ve organeller lizozom ile parçalanan ve 1 geri dönüştürülür edildiği bir katabolik geçiş yoludur. Otofaji, bir otofagosom oluşumunu içeren dinamik, çok aşamalı bir süreçtir; Otoflikozomun lizozom ile kaynaşması, otolizozomun oluşturulması; Ve otolizozomun içeriğinin bozunması 2 . Membran sistemlerinde otofajiyi tanımlamak için kullanılan kritik biyolojik belirteç otofajozomal membranı oluşturan mikrotübüle bağlı protein 1A / 1B-hafif zincir 3 (LC3) &#39;dur. Otofaji sırasında sitosolik LC3-1, LC3-II oluşturmak üzere fosfatidiletanolamine konjüge edilir; Daha sonra LC3-II, otofajozomal zar 3 içine dahil edilir. Otofajik akı için yaygın olarak kullanılan bir diğer marker, otofaj reseptör sekestozomu 1 (SQSTM1, p62) olup, bunlar fiziksel olarak liAutophagic membran 4 , 5&#39;e otofajik yük getirir. Geleneksel olarak otofajiyi ölçmek için kullanılan yöntemler Western lekeleri ve floresan mikroskobu 7&#39;dir . Ancak bu yöntemlerin hiçbirinin &quot;altın standart&quot; olarak kabul edilir 2, bu tekniklerin her ikisi ile ilişkili zorluklar vardır 6 olarak. Western lekeleri ortalama verir çünkü homojen bir örnek kullandıklarından, gözlemciler tek tek hücrelerde neler olduğunu göremezler. Öte yandan, flüorür mikroskobu, tek hücre seviyesinde bir gözlemci bilgi verir, ancak, objektif ve istatistiksel olarak titiz değerlendirmelerin elde edilmesini zorlaştıran üretim kapasitesinden yoksundur. Son yıllarda, multispektral görüntüleme akış sitometrisi (MIFC, Malzeme Tablosuna bakınız) ile LC3 ve p62 ölçümü popülasyon kazanmaktadırNiceliksel gücü, yüksek işleme kapasitesi, çoklama potansiyeli ve her hücrenin imajını oluşturma yeteneği nedeniyle çok sayıda. Otofaji kendi kendine analiz yazılımıyla (bkz . Malzemelerin Tablosu ) birlikte kullanarak otofajiyi ölçmek için en yaygın kullanılan yöntemlerden biri, LC3 punktasının veya otofagozomların 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14&#39;ün nokta sayımı yoluyla yapılır , 15 , 16 , 17 . Bununla birlikte, otofagozomlarda bir artış, mutlaka, otofajide bir artış olduğu anlamına gelmez çünkü süreçte bir blokaj da gösterebilir 2 . LC3-II cirosu, varlıklardaki hücreleri analiz ederek otofajik akıyı ölçmek için yararlı bir parametredir veKlorosin gibi bir lizozomal bozunma önleyicisinin bulunmaması. Klorokuin, böylece 18 oluşabilir lizozomal bozulması önce otofajik akı durdurulması ile otofajinin derecesinin bir ölçüsü olarak, otofagozom oluşumunun miktarının belirlenmesine izin veren lizozoma otofagozom füzyonunu inhibe eder. Buna ek olarak, p62 öncelikle otofaji ile bozundur ve otofagozomun ve içeriğinin lizozomal parçalanması engellendiğinde, p62&#39;nin birikimi 17 , 19 olması beklenir. Otofaji çok aşamalı bir süreçtir ve LC3 veya p62&#39;nin tek başına ölçümü, hücrelerde olup bitenenin tam bir resmini vermez. Yakın tarihli yayınlar, otolizozomun eşzamanlı oluşumunu inceleme ihtiyacını vurgulamıştır 2 , 17 , 20 , 21 . MIFC17, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 - lizozom 15 otofagozom ko-lokalizasyonunu görüntüleme ile autolysosome oluşumunu ölçmek için benzersiz mümkün. Buna ek olarak, P62 ve MIFC kullanılarak LC3 eş yerleşimi de otofajik akı 5 ölçmek için incelenmiştir. Referans analiz yazılımında, birlikte yerelleştirmeyi ölçen &quot;özellik&quot;, &quot;Parlak Detay Benzerliği R3&quot; (BDS) olarak adlandırılır ve iki görüntünün küçük, parlak görüntü ayrıntılarını karşılaştırmak için özel olarak tasarlanmıştır. BDS, 3 piksel veya daha düşük bir yarıçapa sahip lokalize parlak noktaların log dönüşümlü Pearson korelasyon katsayısıdır; Başka bir deyişle, BDS hesaplar o derecesiİki farklı flüoresan kanalından pikseller verlapping. Parlak noktalar ya birbiriyle ilişkilendirilir (diğer bir deyişle, aynı uzaysal konum) veya ilişkisizdir ( yani, farklı uzaysal yerler). Bu nedenle korelasyon katsayısı 0 (korelasyonsuz) ile 1 (mükemmel korelasyon) arasında değişir. Katsayı aralığı sıfırdan sonsuza 26 , 27&#39;ye çıkarmak için log dönüşümlüdür. BDS tek başına yeterli olmayabilir; Rajan ve ark. Sadece BDS&#39;nin kullanılması yanlış-pozitif veya yanlış-negatif sonuçlara neden olabileceğini bulmuştur 21 . BDS, otofajinin iki belirteçinin birlikte lokalizasyonunu değerlendirir, ancak otofagozom sayısını dikkate almaz. Otofagozom sayısını açıklamak için Rajan ve ark. LC3 puncta 21&#39;in nokta sayımını içermektedir. Rajan ve ark. BDS&#39;ye karşı LC3 nokta sayımının bir iki değişkenli dağılım grafiğini kullanarak önerdi. Bu iki değişkenli arsa kullanılarak iki popülasyonİlk tanımlanan: biri yüksek seviyede LC3 lekelerine sahip hücreler ve diğeri düşük seviyeli LC3 lekelerine sahip hücreler. Yüksek eş-lokalizasyonu (yani otolizozomlara birikmesi), düşük (diğer bir deyişle, otofagozomların birikmesi) eş-lokalizasyonu ve hücreler ile hücrelerin: Yüksek LC3 nokta popülasyonu ayrıca iki popülasyona sınıflandırılmıştır. Bu iki değişkenli arsa, az sayıda otofagozomlu hücreler ile otofagozom birikimi ve / veya otolizozomlar 21 olan hücreleri ayırt etmeyi sağlar. Şimdiye kadar, LC3, p62 ve LAMP1&#39;in (lizozomal markör) eş zamanlı birlikte lokalizasyonu, MIFC tamamlayıcı analiz yazılımında tek bir &quot;Özellik Türü&quot; kullanarak mümkün değildi (Malzeme Tablosuna bakın). Bununla birlikte, kısa süre önce 6.1 sürümünde tanıtılan yeni bir özellik, Parlak Ayrıntı Ayrıntılı Yerleştirme 3 (BDC3) olarak adlandırılır. BDC3, üç görüntünün her birinden parlak ayrıntı resimlerini karşılaştırır (bu durumda, LC3, p62 ve LAMP1) ve üç sondanın birlikte lokalizasyonunu niceleştirir ( yani, LC3, p62 ve LAMP1). BDC3 özelliği, Pearson korelasyon katsayısını üç görüntüye kadar genişletmek için hesaplar. Üç görüntünün parlak noktaları ya korelasyonlu ya da korelasyonsuz olduğundan, korelasyon katsayısı 0 (korelasyonsuz) ile 1 (mükemmel korelasyon) arasında değişir. Katsayı, 0 ile sonsuz arasındaki dinamik aralığı arttırmak için günlüğe dönüştürülür. BDS özelliğini BDC3 özelliğiyle değiştirerek, Rajan ve ark. Tarafından sunulan analiz yöntemi, Autophagy&#39;yi aynı anda bir sistemde ölçmek için en çok kullanılan üç markörü bir araya getirebilir. Otofajinin bu üç belirteçinin tek bir deneyde birlikte lokalize edilmesi, otofajinin indüksiyonunda ve düzenlenmesinde yeni anlayışlara yol açabilir. Aşağıdaki protokol, Jurkat hücrelerinde otofaji indirecek adımları özetlemektedir; Hücreleri LC3, p62 ve LAMP1 antikorları ile etiketleyin; Multisp hakkında veri edininEktral görüntüleme akış sitometresi; Ve otofajik akıyı değerlendirmek için verileri analiz eder.

<table><tbody><tr><td>15 mL centrifuge tube</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>50 mL centrifuge tube</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>AF647 labeled Donkey anti-Mouse - IgG&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-31571</td><td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647. Concntration 2 mg/mL. https://www.thermofisher.com/antibody/product/Donkey-anti-Mouse-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-31571</td></tr><tr><td>anti-human CD107a-PE (LAMP1)</td><td>BioLegend</td><td>328607</td><td>Clone H4A3. Concentration 400 &amp;micro;g/mL. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html</td></tr><tr><td>anti-human CD45- AF488</td><td>BioLegend</td><td>304017</td><td>Clone HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-488-anti-human-cd45-antibody-2738.html</td></tr><tr><td>anti-human CD45- PE&amp;nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>304008</td><td>Clone HI30.&amp;nbsp; http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd45-antibody-708.html</td></tr><tr><td>anti-human CD45-AF647&amp;nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>304018</td><td>Clone HI30.&amp;nbsp; http://www.biolegend.com/alexa-fluor-647-anti-human-cd45-antibody-2739.html</td></tr><tr><td>Anti-LC3 (Human) mAb clone 4E12</td><td>MBL International Corporation</td><td>M152-3</td><td>Clone 4E+12.&amp;nbsp; Concentration 2 mg/mL.&amp;nbsp; https://www.mblintl.com/products/m152-3</td></tr><tr><td>Anti-SQSTM1 / p62 antibody [EPR4844] - Autophagosome Marker (Alexa Fluor 488)</td><td>abcam</td><td>ab185015</td><td>Clone EPR4844.&amp;nbsp; Concentration 0.5 mg/mL.&amp;nbsp; http://www.abcam.com/sqstm1-p62-antibody-epr4844-autophagosome-marker-alexa-fluor-488-ab185015.html</td></tr><tr><td>Chloroquine diphosphate Salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6628-25G</td><td></td></tr><tr><td>Cleanser - Coulter Clenz&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>8546931</td><td>Fill container with 200 mL of Cleanser.&amp;nbsp; https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/</td></tr><tr><td>DAPI Stain 5 mg/mL</td><td>MilliporeSigma</td><td>508741</td><td>http://www.emdmillipore.com/US/en/product/DAPI-Stain---CAS-28718-90-3---Calbiochem,EMD_BIO-508741</td></tr><tr><td>Debubbler - 70% Isopropanol</td><td>MilliporeSigma</td><td>1.3704</td><td>Fill container with 200 mL of Debubbler.&amp;nbsp; http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline 10x</td><td>MilliporeSigma</td><td>BSS-2010-B</td><td>&amp;nbsp;Ca++Mg++ Free&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline 1x</td><td>MilliporeSigma</td><td>BSS-1006-B</td><td>PBS Ca++Mg++ Free&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Earle&#039;s Balanced Salt Solution 1x</td><td>Gibco</td><td>14155</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>04018</td><td>This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed.&amp;nbsp; Irritating to the eyes, respiratory systems and skin.&amp;nbsp; May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes.&amp;nbsp; Potential cancer hazard.&amp;nbsp; http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/</td></tr><tr><td>Hanks&#039; Balanced Salt Solution 1x</td><td>Gibco</td><td>14175</td><td></td></tr><tr><td>Jurkat, Clone E6-1 (ATCC TIB-152)</td><td>ATCC</td><td>TIB-152</td><td>https://www.atcc.org/products/all/TIB-152.aspx</td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids 100x</td><td>HyClone</td><td>SH30238.01</td><td></td></tr><tr><td>MIFC - ImageStreamX Mark II</td><td>MilliporeSigma</td><td>100220</td><td>A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405nm, 488nm, and 642nm lasers was used. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006</td></tr><tr><td>MIFC analysis software - IDEAS 6.2</td><td>MilliporeSigma</td><td>100220</td><td>The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII).&amp;nbsp; IDEAS version 6.2</td></tr><tr><td>MIFC software - INSPIRE</td><td>MilliporeSigma</td><td>100220</td><td>This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII). INSPIRE version 200.1.388.0</td></tr><tr><td>PE anti-human CD107a (LAMP-1) Antibody clone H4A3</td><td>BioLegend</td><td>328608</td><td>http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html</td></tr><tr><td>Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100x</td><td>HyClone</td><td>SV30082.1</td><td></td></tr><tr><td>Rinse - Ultrapure water or deionized water</td><td>NA</td><td>NA</td><td>You can use any ultrapure water or deionized water.&amp;nbsp; Fill container with 900 mL of Rinse.</td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium 1x</td><td>HyClone</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>Sheath - PBS</td><td>MilliporeSigma</td><td>BSS-1006-B</td><td>This is the same as Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline 1X&amp;nbsp; Ca++MG++ free.&amp;nbsp; Fill container with 900 mL of Sheath.</td></tr><tr><td>Siliconized polypropylene microcentrifuge tubes</td><td>Fisherbrand</td><td>02-681-320</td><td>Fisherbran Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5 mL. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-siliconized-low-retention-microcentrifuge-tubes-8/p-193936</td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate solution (100 mM)</td><td>HyClone</td><td>SH30239.01</td><td></td></tr><tr><td>Sterilizer - 0.4 - 0.7% Hypochlorite</td><td>VWR</td><td>JT9416-1</td><td>This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water.&amp;nbsp; Fill container with 200 mL of Sterilzer.</td></tr><tr><td>System Calibration Reagent - SpeedBead</td><td>MilliporeSigma</td><td>400041</td><td>Each tube holds ~10 mL.&amp;nbsp; https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>T75 flask</td><td>Falcon</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>TRITON X-100, PROTEIN GRADE Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered</td><td>MilliporeSigma</td><td>648463-50ML</td><td>http://www.emdmillipore.com/US/en/product/TRITON-X-100,-PROTEIN-GRADE-Detergent,-10%25-Solution,-Sterile-Filtered---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648463</td></tr><tr><td>Water, Cell Culture Grade&amp;nbsp;</td><td>HyClone</td><td>SH30529.03</td><td></td></tr></tbody></table>

assessing autophagic flux by measuring lc3, p62, and lamp1 co-localization using multispectral imaging flow cytometry

Otofaji, büyüme ve farklılaşma esnasında biriken normal veya işlevsel olmayan hücresel bileşenlerin lizozom ile parçalanması ve geri dönüşüme tabi tutulduğu katabolik bir yoludur. Otofaji sırasında, sitoplazmik LC3 proteini lipidize edilir ve otofagosomatik membranlara işe alır. Otofagozom daha sonra autosfosome vezikülün parçalanması ve içeriğinin bulunduğu otolizozomu oluşturmak için lizozom ile birleşir. LC3&#39;e bağlanan ubiquitin ile ilişkili protein p62, otofajik akıyı izlemek için de kullanılır. Otofajyondan geçen hücreler, p62, LC3 ve lizozomal belirteçlerin birlikte lokalizasyonunu göstermelidir. İmmünofloresan mikroskobu, LC3 punktasını, p62&#39;yi ve / veya lizozomları hücre başına bazında görsel olarak tanımlamak için kullanılmıştır. Bununla birlikte, objektif ve istatistiksel olarak titiz bir değerlendirme yapmak zor olabilir. Bu problemlerin üstesinden gelmek için multispektral görüntüleme akım sitometrisi ve parlak de-Üç otofaji belirteçlerinden (LC3, p62 ve lizozomal LAMP1) kuyruk görüntüleri üretir ve otofajiyi objektif, kantitatif ve istatistiksel olarak sağlam bir şekilde ölçmek için LC3 nokta sayımı ile kombinasyon halinde birlikte lokalizasyonunu nicelendirir.

Bu analiz metodu, otofajik akışını değerlendirmek için birden fazla özellik kullanmaktadır. Nihai iki yönlü çizimi tam olarak anlamak için, önce bireysel analiz özellikleri araştırılmalıdır. Otofagozomların sayımı, otofajiyi ölçmek için mantıklı bir yöntemdir; Bununla birlikte, LC3 noktalannın boyutu / şekli / parlaklığı, hücreler arasında büyük ölçüde değişebilir. Varyasyon, otofagozomları manuel olarak veya analiz yazılımında bir nokta sayımı özelliği kullanarak saymayı zorlaştırabilir. Bu nedenle, otofagosomlardaki bu büyük değişkenlik nedeniyle nokta sayma özelliği mükemmel olmayacaktır. Bununla birlikte, çoğu nokta hücresinde iyi bir nokta sayımı özelliği çalışacaktır 26 . Şekil 3 , farklı spot maskeleri kullanan Jurkat hücrelerinde LC3 punktasının spot maskeleme örneğini göstermektedir. Bu veri seti için seçilen nokta sayımı özelliği, Spot Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Parlak, 4) _4&#39;tür; bu, nokta sayımı özelliğinin nokta(Parlak, 4) nokta-hücre arka plan oranıyla 11 kanalında (Ch11-LC3-AF647) varsayılan kanal 11 maskesinde (M11) tanımlanan ak maskesi. Şekil 4 , anti-LC3-AF647 ile etiketlenmiş Kontrol, Kontrol + Klorokin, Starved + Kloroquin Jurkat hücreleri için ortalama nokta sayısı için nokta sayım histogramlarını ve temsili görüntüleri göstermektedir. Kontrol ve Açlık ortalaması spot sayıları önemli ölçüde farklı değildir; Klorokuin ilavesi ile, Starved + Chloroquine&#39;e kıyasla Control + Chloroquine ortalamasında büyük bir fark vardır. Araştırılacak bir sonraki özellik BDC3&#39;tür. BDC3, bu durumda, LC3, p62 ve LAMP1 olmak üzere üç belirteç / probun ortak lokalizasyonunun bir ölçümüdür. Şekil 5A - 5D , anti-p62-AF488 ile etiketlenmiş Kontrol, Kontrol + Klorokin, Starved ve Starved + Chloroquine Jurkat hücreleri için BDC3 histogramlarını göstermektedir, Anti-LAMP1-PE ve anti-LC3-AF647. Kontrol ortalama ile Açlığa ortalam arasında bir kayma vardır, bunun yanında Kontrol + Klorokin ortalama + Klorokin ortalaması anlamına gelir. Bununla birlikte, Şekil 5E ortalama BDC3 puanlardan hücre görüntüleri bakarak - 5H, inanmak için bir neden olabilir histogramlar daha örnekler arasında büyük bir fark vardır. Bunun nedeni, BDC3&#39;ün aynı lokalize olduğu otofaji organellerin sayısını göz önünde bulundurmaması ve aynı BDC3 skoru için otofagosom sayısının büyük ölçüde değişmesine neden olmasıdır. Çoğu durumda, üç prob arasında da çakışma vardır, çünkü bazal seviyelerde bile, p62, LAMP1 ve LC3, belirli bir seviyede, hücrelerdeki benzer bölgelerde birlikte lokalize olmalı veya kalmalıdır. Aksine, birlikte lokalize edilmemesi gereken üç probun bir örneği, Şekil 6&#39;da gösterilen Starved + Chloroquine örneği için anti-p62-AF488, anti-LC3-AF647 ve DAPI nükleer boyadır. &lt;/ P&gt; Nokta sayımı özelliği ve BDC3 özelliği birleştirildiğinde, çeşitli örnek / koşulları ayırt etme becerisini geliştiren farklı alt popülasyonların varlığı belirgindir. Şekil 7 , dört örnek için BDC3 p62 / LAMP1 / LC3&#39;e karşı LC3 spot sayımının iki değişkenli grafiğini göstermektedir: Kontrol, Kontrol + Klorokin, Starved ve Starved + Chloroquine. Kontrol örneği üç popülasyon için geçiş stratejisini belirlemek için kullanıldı: Düşük Noktalar, Yüksek Nokta / Düşük BDC3 ve Yüksek Nokta / Yüksek BDC3. Kontrol örnekleri, hücrelerin% 98&#39;den fazlasının 1 veya daha az noktaya sahip olduğunu göstermiştir. Yüksek Nokta / Düşük BDC3 ve Yüksek Nokta / Yüksek BDC3 arasındaki sınır, BDC3 skoru 1 olarak ayarlandı, çünkü Kontrol örneğinin% 91&#39;den fazlası bir BDC3 puanı 1&#39;den daha düşüktü. İki değişkenli parseller için sonuçların özeti Tablo 1&#39;de gösterilmektedir. yaş = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Şekil 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig1.jpg" /> Şekil 1: MIFC Enstrüman Ayarı. Protokolün 8. adımında özetlenen, bu deney için kullanılan MIFC cihaz ayarlarının bir ekran görüntüsü. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig2.jpg" /> Şekil 2: Analiz Yazılımı Geçitleme Stratejisi. Protokolün 9. adımında ana hatlarıyla verilen analiz yazılımları geçiş planının bir ekran görüntüsü. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> Fig3.jpg &quot;/&gt; Şekil 3: LC3 Nokta Maskelemesi. Jurkat hücre görüntüleri ve maskeleri, nokta sayımı özelliğini oluşturmak için kullanılıyordu. Gösterilen BrightField (BF), LC3-AF647, Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Parlak, 2), Zirve (M11, Ch11-LC3-AF647, Parlak, 4), Zirve (M11, Ch11-LC3-AF647 , Parlak, 5), Spot (M11, Ch11-LC3-AF647, Parlak, 5,3,1) ve Nokta (M11, Ch11-LC3-AF647, Parlak, 6,2,1). Gösterilen tüm hücreler için en iyi sonucu veren maske Peak&#39;ti (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig4.jpg" /> Şekil 4: LC3 Spot-sayımlı Histogramlar. Nokta sayımı özelliği Spot Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Parlak, 4) _4 ve LC3-AF647 Kontrol ( A , açık mavi), Kontrol + Klorokin için spot-sayım histogramları kullanılarakE ( B , mavi), Starved ( C , pembe) ve Starved + Chloroquine ( D , kırmızı). Kontrol, Kontrol + Klorokin, Starved ve Starved + Chloroquine için ortalama nokta sayısı sırasıyla 0.07, 1.13, 0.10 ve 2.77&#39;dir. BF, LC3-AF647 (kırmızı), DAPI nükleer boya (mavi) ve ortalama nokta sayımı için temsili hücrelerin LC3-AF647 ve DAPI görüntüsünün bir bileşimi Kontrol ( E , 0 noktalar), Kontrol + Klorokin F , 1 nokta), Starved ( G , 0 lekeler) ve Starved + Chloroquine ( H , 3 lekeler). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig5.jpg" /> Şekil 5: p62 / LAMP1 / LC3&#39;ün BDC3 Histogramları. BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 histogramlarıKontrol ( A , açık mavi), Kontrol + Klorokin ( B , mavi), Starved ( C , pembe) ve Starved + Chloroquine ( D , kırmızı). Kontrol, Kontrol + Klorokin, Starved ve Starved + Chloroquine için ortalama BDC3 skoru sırasıyla 0.57, 0.82, 0.74 ve 0.98&#39;dir. BF; P62-AF488 (yeşil); LAMP1-PE (sarı); LC3-AF647 (kırmızı); Ve ortalama BDC3 için temsili hücrelerin p62-AF488, LAMP1-PE ve LC3-AF647 görüntülerinin bir bileşimi, Kontrol ( E ), Kontrol + Kloroquin ( F ), Starved ( G ) ve Starved + Chloroquine H ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig6.jpg" /> Şekil 6: p62 / L&#39;nin BDC3 HistogramlarıStarved + Chloroquine Örneği için C3 / DAPI. ( A ) Starved + Chloroquine örneği için BDC3 p62 / LC3 / DAPI histogramı gösterilmektedir. BDC3 ortalama puanı 0.07&#39;dir. ( B ) BF; P62-AF488 (yeşil); LC3-AF647 (kırmızı); DAPI (mavi); Ve Starved + Chloroquine örneği için ortalama BDC3 için temsili hücrelerin p62-AF488, LC3-AF647 ve DAPI görüntülerinin bir bileşimi gösterilmiştir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig7.jpg" /> Şekil 7: LC3 Nokta Sayısı ile BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 arasındaki İki Değişkenli Grafikler. ( A ) Control, Control + Chloroquine, Starved ve Starved + Chloroquine Jurkat hücreleri için LC3 spot sayısına karşılık BDC3 p62 / LAMP1 / LC3&#39;ün iki değişkenli parselleri. ( B ) BF; P62-AF488 (yeşil); LAMP1-PE (sarı); LC3-AF647 (kırmızı); Ve Starved + Chloroquine örneği için üç bölgeden ( yani, Düşük Noktalar, Yüksek Noktalar / Düşük BDC3 ve Yüksek Nokta / Yüksek BDC3) p62-AF488, LAMP1-PE ve LC3-AF647 görüntülerinin bir bileşimi gösterilmiştir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Hücre Sayısı </td><td> Parlak Ayrıntılı Kolokalizasyon 3 Ortalama </td><td> Nokta Sayısı LC3 Ortalama </td><td> Düşük Nokta </td><td> Yüksek Spot / Düşük BDC3 </td><td> Yüksek Spot / Yüksek BDC3 </td></tr><tr><td> Kontrol </td><td> 439 </td><td> 0.57 </td><td> 0.07 </td><td> 98.2 </td><td> 1.8 </td><td> 0.0 </td></tr><tr><td> Kontrol + Klorokin </td><td> 1432 </td><td> 0,82 </td><td> 1.13 </td><td> 68.9 </td&gt; <td> 19.5 </td><td> 11.7 </td></tr><tr><td> hasret </td><td> 1204 </td><td> 0.74 </td><td> 0.10 </td><td> 98.4 </td><td> 0.6 </td><td> 1.0 </td></tr><tr><td> Starved + Chloroquine </td><td> 1811 </td><td> 0.98 </td><td> 2.77 </td><td> 32.1 </td><td> 36.9 </td><td> 31.0 </td></tr></tbody></table> Tablo 1: Jurkat LC3 Noktası Özeti BDC3 P62 / LAMP1 / LC3 değişkenli grafiği Sayısı

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry at JoVE.com

Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

Burada, otofajiyi objektif, kantitatif ve istatistiksel olarak sağlam bir şekilde ölçmek için, 3 autofagy markörün parlak detaylı görüntülerini karşılaştıran ve LC3 nokta sayımı ile birlikte lokalizasyonunu niceleyen analitik bir özelliğe sahip multispektral görüntüleme akış sitometrisi kullanılmıştır.

Multifektral Görüntüleme Akış Sitometrisi Kullanılarak LC3, p62 ve LAMP1 Birlikte Lokalizasyonu Ölçülerek Otofajik Fluxın Değerlendirilmesi

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via ...

assessing-autophagic-flux-measuring-lc3-p62-lamp1-co-localization

Research

JoVE Journal

Biology

31.0K Görüntüleme.  MilliporeSigma.  Burada, otofajiyi objektif, kantitatif ve istatistiksel olarak sağlam bir şekilde ölçmek için, 3 autofagy markörün parlak detaylı görüntülerini karşılaştıran ve LC3 nokta sayımı ile birlikte lokalizasyonunu niceleyen analitik bir özelliğe sahip multispektral görüntüleme akış sitometrisi kullanılmıştır. 

Video: Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to antigen presenting cells1-5. Internalization of nanoparticles (NP) by antigen presenting cells is a critical step in generating an effective immune response to the encapsulated antigen. To determine how changes in nanoparticle formulation impact function, we sought to develop a high throughput, quantitative experimental protocol that was compatible with detecting internalized nanoparticles as well as bacteria. To date, two independent techniques, microscopy and flow cytometry, have been the methods used to study the phagocytosis of nanoparticles. The high throughput nature of flow cytometry generates robust statistical data. However, due to low resolution, it fails to accurately quantify internalized versus cell bound nanoparticles. Microscopy generates images with high spatial resolution; however, it is time consuming and involves small sample sizes6-8. Multi-spectral imaging flow cytometry (MIFC) is a new technology that incorporates aspects of both microscopy and flow cytometry that performs multi-color spectral fluorescence and bright field imaging simultaneously through a laminar core. This capability provides an accurate analysis of fluorescent signal intensities and spatial relationships between different structures and cellular features at high speed.
	Herein, we describe a method utilizing MIFC to characterize the cell populations that have internalized polyanhydride nanoparticles or Salmonella enterica serovar Typhimurium. We also describe the preparation of nanoparticle suspensions, cell labeling, acquisition on an ImageStreamX system and analysis of the data using the IDEAS application. We also demonstrate the application of a technique that can be used to differentiate the internalization pathways for nanoparticles and bacteria by using cytochalasin-D as an inhibitor of actin-mediated phagocytosis.

In this article, we describe a method utilizing multi-spectral imaging flow cytometry to quantify the internalization of polyanhydride nanoparticles or bacteria by RAW 264.7 cells.

Çoklu-spektral Görüntüleme Akım Sitometri tarafından Nanopartiküller ve Bakterilerin Hücresel İçselleştirilmesi Analizi

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Biyomühendislik

Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy (ATOM)

Scaling the number of measurable parameters, which allows for multidimensional data analysis and thus higher-confidence statistical results, has been the main trend in the advanced development of flow cytometry. Notably, adding high-resolution imaging capabilities allows for the complex morphological analysis of cellular/sub-cellular structures. This is not possible with standard flow cytometers. However, it is valuable for advancing our knowledge of cellular functions and can benefit life science research, clinical diagnostics, and environmental monitoring. Incorporating imaging capabilities into flow cytometry compromises the assay throughput, primarily due to the limitations on speed and sensitivity in the camera technologies. To overcome this speed or throughput challenge facing imaging flow cytometry while preserving the image quality, asymmetric-detection time-stretch optical microscopy (ATOM) has been demonstrated to enable high-contrast, single-cell imaging with sub-cellular resolution, at an imaging throughput as high as 100,000 cells/s. Based on the imaging concept of conventional time-stretch imaging, which relies on all-optical image encoding and retrieval through the use of ultrafast broadband laser pulses, ATOM further advances imaging performance by enhancing the image contrast of unlabeled/unstained cells. This is achieved by accessing the phase-gradient information of the cells, which is spectrally encoded into single-shot broadband pulses. Hence, ATOM is particularly advantageous in high-throughput measurements of single-cell morphology and texture &#8211; information indicative of cell types, states, and even functions. Ultimately, this could become a powerful imaging flow cytometry platform for the biophysical phenotyping of cells, complementing the current state-of-the-art biochemical-marker-based cellular assay. This work describes a protocol to establish the key modules of an ATOM system (from optical frontend to data processing and visualization backend), as well as the workflow of imaging flow cytometry based on ATOM, using human cells and micro-algae as the examples.

Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy ATOM

This protocol describes the implementation of an asymmetric-detection time-stretch optical microscopy system for single-cell imaging in ultrafast microfluidic flow and its applications in imaging flow cytometry.

Asimetrik Algılama Zaman-Streçi Optik Mikroskopi (ATOM) ile Mikroakışkan Görüntüleme Akış Sitometresi

Scaling the number of measurable parameters, which allows for multidimensional data analysis and thus higher-confidence statistical results, has been the ...

Mühendislik

Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, senescence is a fundamentally different machinery restraining&#160;propagation of cancer cells. Decades of scientific studies have revealed the complex pathological effects of senescent cancer cells in tumors and microenvironments that modulate cancer cells and stromal cells. New evidence suggests that senescence is a potent prognostic factor during cancer treatment, and therefore rapid and accurate detection of senescent cells in cancer samples is essential. This paper presents a method to visualize and detect therapy-induced senescence (TIS) in cancer cells. Diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) cell lines were treated with mafosfamide (MAF) or daunorubicin (DN) and examined for the senescence marker, senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-gal), the DNA synthesis marker 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU), and the DNA damage marker gamma-H2AX (&#947;H2AX). Flow cytometer imaging can help generate high-resolution single-cell images in a short period of time to simultaneously visualize and quantify the three markers in cancer cells.

Here we present a flow cytometry-based method for visualization and quantification of multiple senescence-associated markers in single cells.

Tedaviye Bağlı Yaşlanan Kanser Hücrelerinde Çoklu Floresan Yaşlanma Belirteçlerinin Eşzamanlı Görüntüleme ve Akış Sitometrisine Dayalı Tespiti

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, ...

Kanser Araştırmaları

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

Retina Mikroglial Fagositik Fonksiyonu değerlendirilmesi<em&gt; İn Vivo</em&gt; A Akış Sitometri bazlı analiz kullamlarak

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and introduces uncertainty in results due to variability between scorers. To remedy this, automated slide-scanning microscopy as well as conventional flow cytometry methods have been introduced in an attempt to remove scorer bias and improve throughput. However, these methods have their own inherent limitations such as inability to visualize the cytoplasm of the cell and the lack of visual MN verification or image data storage with flow cytometry. Multispectral Imaging Flow Cytometry (MIFC) has the potential to overcome these limitations. MIFC combines the high resolution fluorescent imagery of microscopy with the statistical robustness and speed of conventional flow cytometry. In addition, all collected imagery can be stored in dose-specific files. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the MN assay on MIFC. Human lymphoblastoid TK6 cells were enlarged using a hypotonic solution (75 mM KCl), fixed with 4% formalin and the nuclear content was stained with Hoechst 33342. All samples were run in suspension on the MIFC, permitting acquisition of high resolution images of all key events required for the assay (e.g. binucleated cells with and without MN as well as mononucleated and polynucleated cells). Images were automatically identified, categorized and enumerated in the MIFC data analysis software, allowing for automated scoring of both cytotoxicity and genotoxicity. Results demonstrate that using MIFC to perform the in vitro MN assay allows statistically significant increases in MN frequency to be detected at several different levels of cytotoxicity when compared to solvent controls following exposure of TK6 cells to Mitomycin C and Colchicine, and that no significant increases in MN frequency are observed following exposure to Mannitol.

The in vitro micronucleus assay is a well-established method for evaluating genotoxicity and cytotoxicity but scoring the assay using manual microscopy is laborious and suffers from subjectivity and inter-scorer variability. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the assay using multispectral imaging flow cytometry.

Multispectral görüntüleme akışı sitometrisi kullanarak In vitro micronucleus assay gerçekleştirmek için otomatik bir yöntem

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular components responsible for supplying cell energy; however, excess mitochondria also produce reactive oxygen species (ROS) that could cause cell death. Therefore, the number of mitochondria must constantly be adjusted to fit the needs of the cells. This dynamic regulation is achieved in part through the function of lysosomes that remove surplus/damaged organelles and macromolecules. Hence, cellular mitochondrial and lysosomal contents are key indicators to evaluate the metabolic adjustment of cells. With the development of probes for organelles, well-characterized lysosome or mitochondria-specific dyes have become available in various formats to label cellular lysosomes and mitochondria. Multicolor flow cytometry is a common tool to profile cell phenotypes, and has the capability to be integrated with other assays. Here, we present a detailed protocol of how to combine organelle-specific dyes with surface markers staining to measure the amount of lysosomes and mitochondria in different T cell populations on a flow cytometer.

This article illustrates a powerful method to quantify mitochondria or lysosomes in living cells. The combination of lysosome- or mitochondria-specific dyes with fluorescently conjugated antibodies against surface markers allows the quantification of these organelles in mixed cell populations, like primary cells harvested from tissue samples, by using multicolor flow cytometry.

Çok renkli akış sitometresi tabanlı Quantification mitokondri ve T hücrelerde organellerin

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Identification of a Murine Erythroblast Subpopulation  Enriched in Enucleating Events by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Erythropoiesis in mammals concludes with the dramatic process of enucleation that results in reticulocyte formation. The mechanism of enucleation has not yet been fully elucidated. A common problem encountered when studying the localization of key proteins and structures within enucleating erythroblasts by microscopy is the difficulty to observe a sufficient number of cells undergoing enucleation.&#160;We have developed a novel analysis protocol using multiparameter high-speed cell imaging in flow (Multi-Spectral Imaging Flow Cytometry), a method that combines immunofluorescent microscopy with flow cytometry, in order to identify efficiently a significant number of enucleating events, that allows to obtain measurements and perform statistical analysis.
We first describe here two in vitro erythropoiesis culture methods used in order to synchronize murine erythroblasts and increase the probability of capturing enucleation at the time of evaluation.&#160;Then, we describe in detail the staining of erythroblasts after fixation and permeabilization in order to study the localization of intracellular proteins or lipid rafts during enucleation by multi-spectral imaging flow cytometry.&#160;Along with size and DNA/Ter119 staining which are used to identify the orthochromatic erythroblasts, we utilize the parameters &#8220;aspect ratio&#8221; of a cell in the bright-field channel that aids in the recognition of elongated cells and &#8220;delta centroid XY Ter119/Draq5&#8221; that allows the identification of cellular events in which the center of Ter119 staining (nascent reticulocyte) is far apart from the center of Draq5 staining (nucleus undergoing extrusion), thus indicating a cell about to enucleate.&#160;The subset of the orthochromatic erythroblast population with high delta centroid and low aspect ratio is highly enriched in enucleating cells.

The present protocol describes a novel method of identifying a population of enucleating orthochromatic erythroblasts by multi-spectral imaging flow cytometry, providing a visualization of the erythroblast enucleation process.

Multi-spektral Görüntüleme Sitometrisi ile Enucleating Olaylar bir Kemirgen erythroblast ICSI&#39;nin Zenginleştir tanımlanması

Erythropoiesis in mammals concludes with the dramatic process of enucleation that results in reticulocyte formation. The mechanism of enucleation has not ...

Biyoloji

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

Spektral Sitometrisi ile Katı Dokular İzole Hücre Cezalar Analizi

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Sensitive Measurement of Mitophagy by Flow Cytometry Using the pH-dependent Fluorescent Reporter mt-Keima

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between defective mitophagy and various human diseases, including neurodegenerative diseases, cancer, and metabolic diseases. In addition, recent studies have shown that mitophagy is involved in normal cellular processes, such as differentiation and development. However, the precise role of and molecular mechanisms underlying mitophagy require further study. Therefore, it is critical to develop a robust and convenient method for measuring changes in mitophagy activity. Here, we describe a detailed protocol for quantitatively assessing mitophagy activity through flow cytometry using the mitochondria-targeted fluorescent protein Keima (mt-Keima). This flow cytometry assay can analyze mitophagy activity more rapidly and sensitively than conventional microscopy- or immunoblotting-based methods. This protocol can be applied to analyze mitophagy activity in various cell types.

Mitophagy, the selective degradation of mitochondria, has been implicated in mitochondrial homeostasis and is deregulated in various human diseases. However, convenient experimental methods for measuring mitophagy activity are very limited. Here, we provide a sensitive assay for measuring mitophagy activity using flow cytometry.

Hassas ölçüm Mitophagy floresan muhabir akış sitometresi kullanarak pH bağımlı mt-Keima tarafından

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between ...

Flux-Based Assay for the Identification of Autophagy Modulators for Osteoarthritis

Autophagy is a central mechanism to regulate homeostasis. Alterations of autophagy contribute to aging-related diseases. Phenotypic methods to identify regulators of autophagy could be used for the identification of novel therapeutics. This article describes a cell-based imaging screening workflow developed to monitor autophagic flux using LC3 as a reporter of autophagic flux (mCherry-EGFP-LC3B) in human chondrocytes. Data acquisition is performed using an automated High Content Imaging Screening System microscope. An algorithm-based automated image analysis protocol was developed and validated to identify molecules activating autophagic flux. Critical steps, explanatory notes, and improvements over current autophagy monitoring protocols are reported. Physiologically relevant phenotypic screening approaches to target hallmarks of aging can facilitate more effective drug discovery strategies for age-related musculoskeletal diseases.

This paper details monitoring autophagy flux to identify new molecules by cell-based imaging screening.

Autophagy is a central mechanism to regulate homeostasis. Alterations of autophagy contribute to aging-related diseases. Phenotypic methods to identify ...

Multifektral Görüntüleme Akış Sitometrisi Kullanılarak LC3, p62 ve LAMP1 Birlikte Lokalizasyonu Ölçülerek Otofajik Fluxın Değerlendirilmesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler