עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת טקסס MD אנדרסון סרטן המרכז, יוסטון, TX (startup קרנות, BB).

1. הכנת פתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרונות הבאים טריים עבור כל ניסוי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת פתרון קיבעון , להכין פורמלדהיד 37% ולאחסן אותו RT. לדלל אותו 1x פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) לריכוז סופי של 1.42%. זהירות: פורמלדהיד מסווג כגורם מגרה, קורוזיבי, מוטגני, טרטוגני ומסרטן. לא לבלוע. אין לנשום גז / אדי / אדים / ספריי. במקרה של אוורור לא מספיק, ללבוש ציוד נשימה מתאים. הימנע ממגע עם העור והעיניים. יש להרחיק מפני חומרים בלתי תואמים, כגון חומרים מחמצנים, צמצום סוכנים, חומצות, אלקליות ולחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור פתרון גליצין לתקן לתקן, להכין 0.125 M גליצין בפתרון 1x PBS ולאחסן אותו RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הפתרון שריטות התא, להכין פתרון PBS 1x ב dH 2 O ולאחסן אותו על הקרח. ממש לפני השימוש, להוסיף מעכב proteinase phenylmethylsulfonyl פלואוריד (PMSF) tOa הריכוז הסופי של 0.5 מ&quot;מ. זהירות: PMSF מסווגת כקורוזיבית ורעילה; ללבוש בגדים מגן ולהשתמש בו באזור מאוורר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ישירות לפני השימוש במאגר תמוגה התא (20 מ&quot;מ טריס HCl, pH 8.0, 85 מ&quot;מ KCl, ו 0.5% NP40), להוסיף 1X Protease קוקטייל inhibitor (PIC, פתרון מניות 100X ב dimethyl sulfoxide (DMSO): 104 מ&quot;מ 4- ( 2-aminoethyl) benzenesulfonyl פלואוריד הידרוכלוריד (AEBSF), 80 מיקרומטר aprotinin, 4 מ&quot;מ מ&quot;מטין, 1.4 מ&quot;מ E-64, 2 מ&quot;מ leupeptin, ו 1.5 מ&quot;מ pepstatin A) ו 0.5 מ&quot;מ PMSF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ישירות לפני השימוש במאגר תמוגה גרעיני (50 מ&quot;מ טריס- Cl, pH 8.0, 10 מ&quot;מ ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA), ו 1% SDS), להוסיף 1X PIC ו 0.5 מ&quot;מ PMSF. </li></ol></li></ol> 2. תא קיבוע וגז <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל את התאים מפגש 70-80% על 10 ס&quot;מ צלחות תרבות רקמה. לעורר את התאים לכל מטרות הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיום תרבות רקמה, להוסיף 5 מ&quot;ל של פתרון קיבוע, ו דגירההתאים למשך 10 דקות ב RT על פלטפורמה רועדת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פתרון קיבוע לשטוף את התאים פעמיים עם 10 מ&quot;ל של 1X קר כקרח PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את 1x PBS, להוסיף 5 מ&quot;ל של פתרון גליצין לתקן לתקן, דגירה התאים במשך 5 דקות ב RT על פלטפורמת רועד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון גליצין לתקן לתקן ולשטוף את התאים פעמיים עם 10 מ&quot;ל של 1X קר כקרח PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את 1x PBS, להוסיף 2 מ&quot;ל של פתרון שריטות התא, ומסיק את התאים באמצעות מגרד תא. מעבירים את התאים שנקטפו צינור חרוטי על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דגימות למשך 10 דקות ב 600 xg ו 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant, resuspend גלולה ב 1 מ&quot;ל של חיץ תמוגה תא 1X, ו דגירה על קרח במשך 30 דקות. לחלופין, הצמד להקפיא את גלולה בחנקן נוזלי ולאחסן אותו ב -80 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר גלולה resuspended במאגר תמוגה התא, להעביר את ההשעיה התא כדי homogenizer dounce קר dounce ו dounce עבור 10 משיכות באמצעות ב &#39;סוג ב&#39;E לשיבוש תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ההשעיה תא לצינור microcentrifuge ו צנטריפוגה דגימות במשך 10 דקות ב 2,400 xg ו 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק supernatant, resuspend גלולה μL 350 של חיץ עיכול גרעינים, דגירה דגימות 5 דקות על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף micrococcal nuclease (1 U / μL) ומערבבים על ידי vortexing. דגירה דגימות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5-20 דקות; מערבבים את הדגימות כל 2 דקות על ידי היפוך. הערה: זמן ריכוז האנזים נבדלים בין שורות תאים עשויים לדרוש אופטימיזציה במקרים של גז אנזימטית תת אופטימלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, להשיג גז הכרומטין ידי sonication באמצעות sonicators זמין מסחרית. הערה: תנאי סוניקציה ידרשו אופטימיזציה. דוגמה פרוטוקול אופטימיזציה מסופק להלן באמצעות נפח מדגם של 300 μL כוח עיבוד מדגם של 25%. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שלב 2.10, להשליך supernatant ו resuspend nגלולה uclear ב 1.0 מ&quot;ל של חיץ גז מסחרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 300 μL של גלולה גרעינית resuspended לשלושה צינורות microcentrifuge 1.7 מ&quot;ל. מניחים אותם על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזירה 3 aliquots של הכרומטין קבוע על 25% כוח באמצעות 3 תנאים שונים כדי לקבוע את תנאי sonication אופטימלי: 5 פעימות של 20 שניות כל אחד, עם 30 שניות מנוחה על הקרח בין כל הדופק. 10 פעימות של 20 שניות כל אחד, עם 30 שניות מנוחה על הקרח בין כל הדופק. 20 פעימות של 20 שניות כל אחד, עם 30 שניות מנוחה על הקרח בין כל הדופק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך עם שלב 2.15, כמפורט להלן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות הדגירה עם nuclease microococcal, להוסיף 7 μL של קר כקרח 0.5 M EDTA להפסיק את התגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דגימות עם ה- DNA המלוטש במשך 10 דקות ב XG 16,200 ו 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ה- DNA מכוסה המכיל supernatant לצינור microcentrifuge טרי. Aliquot 50 μL לתוך צינור microcentrifuge נפרד כדי לאשר את suגזיזת הדנ&quot;א (סעיף 3). השתמש נפח הנותרים מיד immunoprecipitation (סעיף 4) או לאחסן אותו ב -80 מעלות צלזיוס. </li></ol> 3. אישור יעילות הגז <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 150 μL של nuclease ללא D 2 O ו 10 μL של 5 Na NaCl אל 50 μL aliquot של הכרומטין מלוטש משלב 2.16. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה דגימות על 65 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות כדי להפוך את crosslinks. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 μL של RNase (10 מיקרוגרם / μL) ו דגירה דגימות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μL של proteinase K (0.5 מיקרוגרם / μL) ו דגירה דגימות ב 42 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטיהור של ה- DNA, לבצע פנול / כלורופורם מיצוי 12 . <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מים nuclease ללא לנפח סופי של 200 μL. הוסף 200 μL של פנול: כלורופורם: אלכוהול isoamyl (25: 24: 1) למדגם ו מערבולת במשך 20 s. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה בחדר החדרPerature עבור 5 דקות ב 16,000 x גרם. בזהירות להסיר את השלב מימית העליון ולהעביר אותו צינור טרי. הקפד לא לשאת על כל פנול במהלך pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.1 כרכים של 3 M סודיום אצטט (NH 4 OAc), pH 5.2, ומערבבים על ידי לחיצה על הצינור מספר פעמים עם אצבע. הוסף 2.5 כרכים של אתנול קר כקרח 100% ומערבבים על ידי vortexing עבור 5 s. דגירה המדגם O / N ב -20 מעלות צלזיוס, או לפחות 1 שעות ב -80 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה המדגם במשך 30 דקות ב 4 ° C ו 16,000 XG כדי גלולה cDNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בזהירות את supernatant מבלי לשבש את גלולה. הוסף 1 מ&quot;ל של RT, אתנול 70% ו להפוך את הצינור מספר פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה המדגם במשך 2 דקות ב 4 ° C ו 16,000 x גרם. הסר בזהירות את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש את גלולה עבור 5-10 דקות ב RT. Resuspend גלולה ב 30 μL של DH 2 O. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש aliquot 5 ו 10 μL של ה- DNA מטוהרים עבור ג&#39;ל אלקטרופורזה עם TAE 1%Agarose ג&#39;ל. הערה: מוצלח תוצאות הכרומטין גז בתבנית DNA 200-1,500 BP. אם הגז אינו מצליח, לקבוע את התנאים הגז אופטימלי עבור תאים ספציפיים על ידי שינוי זמן הדגירה של צעד הגז (צעד 2.12) ל 5, 10, ו 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במדגם הנותר כדי לנתח את ריכוז ה- DNA של המדגם. הפוך - לחשב את ריכוז ה- DNA במדגם הכרומטין שרוף (שלב 2.16); להשתמש בכמויות DNA זהה עבור כל קבוצת טיפול עבור immunoprecipitation (סעיף 4). </li></ol> 4. Immunoprecipitation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב 10-25 מיקרוגרם של הכרומטין crosslinked גזוז (צעד 2.16) עם 25 μL של חלבון שבב כיתה G חרוזים מגנטיים, 10 μL של חיץ דילול immunoprecipitation (פתרון המניה: 0.01% SDS, 1.1% Triton X-100, 16.7 מ&quot;מ Tris-HCl, pH 8.0, 1.2 מ&quot;מ EDTA, ו 167 mM NaCl), ו 1 μL של PIC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 4 שעות הדגירה, מוסיפים 1-10 מיקרוגרם של נוגדנים (ריכוז נוגדןאטיון ישתנה בהתאם לזיקה של הנוגדן; זה צריך בתחילה לשמש כל המלצות היצרן אופטימיזציה אופטימיזציה אם יש צורך) כדי צינור microcentrifuge 1.5 מ&quot;ל ולהוסיף dH 2 O לנפח סופי של 100 μL. הערה: במקום השיטה המתוארת לעיל immunoprecipitation, שיטת immunoprecipiation עקיף ניתן להשתמש על ידי שילוב הראשון של הכרומטין עם הנוגדנים ולאחר מכן הוספת חלבון G חרוזים מגנטיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה דגימות על רוטורטור מקצה לקצה עבור 4-12 שעות ב 4 ° C. </li></ol> 5. אלוטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינורות על מעמד מגנטי. לאחר חרוזים מגנטיים צובר בצד של הצינור, להסיר בזהירות להשליך supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את החרוזים שלוש פעמים עם 800 μL של חיץ לשטוף 1 (0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 מ&quot;מ EDTA pH 8, 20 מ&quot;מ טריס HCl, pH 8, ו 150 מ&quot;מ NaCl); לערבב על ידי הפיכת הצינור מספר פעמים. מניחים את הצינור על המעמד המגנטי אNd להסיר בזהירות להשליך את חיץ לשטוף פעם אחת חרוזים מגנטיים בצד של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את החרוזים פעם אחת עם 800 μL של חיץ לשטוף 2 (0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 מ&quot;מ EDTA, pH 8, 20 מ&quot;מ טריס HCl pH 8, ו 500 מ&quot;מ NaCl); לערבב על ידי הפיכת הצינור מספר פעמים. מניחים את הצינור על המעמד המגנטי להסיר בזהירות להשליך את חיץ לשטוף פעם אחת חרוזים מגנטיים בצד בצד של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את החרוזים μL 50 של חיץ elution (1% SDS ו 100 מ&quot;מ NaHCO 3 ) ו דגירה הדגימות על רוטורטור מקצה לקצה במשך 15 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינורות על מעמד מגנטי, ופעם חרוזים מגנטיים לאסוף בצד הצינור, להעביר את supernatant לצינור טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 6 μL של 5 Na NaCl, כדי להפוך את crosslinking, ו 2 μL של proteinase K (0.5 מיקרוגרם / μL). לאחר ערבוב דגימות, דגירה דגימות עבור 2 שעות ב 65 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטיהור ה- DNA, לבצע pheNol / כלורופורם מיצוי 12 (שלב 3.5) ולאחר מכן resuspend גלולה ב 30 μL של DH 2 O. הערה: דגימות ניתן לנתח ישירות עבור אתרי מחייב חלבון (סעיף 5) או ניתן לאחסן ב -20 מעלות צלזיוס. </li></ol> 6. אתר מחייב ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע ניתוח עבור אתרים מחייב ספציפי בתוך רצף חומצה גרעין ידוע באמצעות PCR או qRT-PCR. עבור עיצוב פריימר, בצע PCR קונבנציונאלי או qRT-PCR פרוטוקולים. עיצוב primers לסנתז amplicon 150-400 bp כי גשרים האתר מחייב חלבון עניין ( איור 1 ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את ה- PCR באמצעות ארבע תבניות DNA שונות כדי להבטיח ספציפיות: i) DNA מתוך שבב immunoprecipitated עם הנוגדן של עניין, ii) DNA מ CHIP immunoprecipitated עם נוגדן IgG ספציפי, iii) קלט DNA, ו IV) H 2 O שליטה שלילית עבור PCR לשלול זיהום. במקרה של גירוי מסלול, בחר תבנית החמישית באמצעות קבוצה שונה של primers ספציפיים לאתר מחייב ידוע של החלבון immunoprecipitated. הערה: במקרה של C-KIT ליגנד האמרגן ניתוח, להשתמש PCR קונבנציונלי להפגין TGF-β-Induced SMAD מחייב ב SBE בתוך C-KIT ליגנד באזור האמרגן. כבקרה חיובית, לבצע PCR על plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) כיעד ידוע של TGF-β-Induced SMAD מחייב. </li></ol>

<ol>
	<li>Brenowitz, M., Senear, D. F., Shea, M. A., Ackers, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+DNase+footprint+titration:+a+method+for+studying+protein-DNA+interactions.">Quantitative DNase footprint titration: a method for studying protein-DNA interactions.</a> Methods Enzymol. 130, 132-181 (1986).</li><li>Garner, M. M., Revzin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gel+electrophoresis+method+for+quantifying+the+binding+of+proteins+to+specific+DNA+regions:+application+to+components+of+the+Escherichia+coli+lactose+operon+regulatory+system.">A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system.</a> Nucleic Acids Res. 9 (13), 3047-3060 (1981).</li><li>Gilmour, D. S., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+protein-DNA+interactions+in+vivo:+distribution+of+RNA+polymerase+on+specific+bacterial+genes.">Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 81 (14), 4275-4279 (1984).</li><li>Gilmour, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lis+J.T.+In+vivo+interactions+of+RNA+polymerase+II+with+genes+of+Drosophila+melanogaster.">Lis J.T. In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster.</a> Mol Cell Biol. 5 (8), 2009-2018 (1985).</li><li>Mundade, R., Ozer, H. G., Wei, H., Prabhu, L., Lu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+ChIP-seq+in+the+discovery+of+transcription+factor+binding+sites,+differential+gene+regulation+mechanism,+epigenetic+marks+and+beyond.">Role of ChIP-seq in the discovery of transcription factor binding sites, differential gene regulation mechanism, epigenetic marks and beyond.</a> Cell Cycle. 13 (18), 2847-2852 (2014).</li><li>Mukhopadhyay, A., Deplancke, B., Walhout, A. J., Tissenbaum, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+(ChIP)+coupled+to+detection+by+quantitative+real-time+PCR+to+study+transcription+factor+binding+to+DNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Chromatin immunoprecipitation (ChIP) coupled to detection by quantitative real-time PCR to study transcription factor binding to DNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nat Protoc. 3 (4), 698-709 (2008).</li><li>Weinmann, A. S., Bartley, S. M., Zhang, T., Zhang, M. Q., Farnham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+chromatin+immunoprecipitation+to+clone+novel+E2F+target+promoters.">Use of chromatin immunoprecipitation to clone novel E2F target promoters.</a> Mol Cell Biol. 21 (20), 6820-6832 (2001).</li><li>Weinmann, A. S., Farnham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+unknown+target+genes+of+human+transcription+factors+using+chromatin+immunoprecipitation.">Identification of unknown target genes of human transcription factors using chromatin immunoprecipitation.</a> Methods. 26 (1), 37-47 (2002).</li><li>Weinmann, A. S., Yan, P. S., Oberley, M. J., Huang, T. H., Farnham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+human+transcription+factor+targets+by+coupling+chromatin+immunoprecipitation+and+CpG+island+microarray+analysis.">Isolating human transcription factor targets by coupling chromatin immunoprecipitation and CpG island microarray analysis.</a> GenesDev. 16 (2), 235-244 (2002).</li><li>Massague, J., Seoane, J., Wotton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smad+transcription+factors.">Smad transcription factors.</a> Genes Dev. 19 (23), 2783-2810 (2005).</li><li>Rojas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Positive+TGF-beta/c-KIT+Feedback+Loop+Drives+Tumor+Progression+in+Advanced+Primary+Liver+Cancer.">A Positive TGF-beta/c-KIT Feedback Loop Drives Tumor Progression in Advanced Primary Liver Cancer.</a> Neoplasia. 18 (6), 371-386 (2016).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+nucleic+acids+by+extraction+with+phenol:chloroform.">Purification of nucleic acids by extraction with phenol:chloroform.</a> CSH Protoc. 2006 (1), (2006).</li><li>Dennler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+binding+of+Smad3+and+Smad4+to+critical+TGF+beta-inducible+elements+in+the+promoter+of+human+plasminogen+activator+inhibitor-type+1+gene.">Direct binding of Smad3 and Smad4 to critical TGF beta-inducible elements in the promoter of human plasminogen activator inhibitor-type 1 gene.</a> EMBO J. 17 (11), 3091-3100 (1998).</li><li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+Smad+MH1+domain+bound+to+DNA:+insights+on+DNA+binding+in+TGF-beta+signaling.">Crystal structure of a Smad MH1 domain bound to DNA: insights on DNA binding in TGF-beta signaling.</a> Cell. 94 (5), 585-594 (1998).</li><li>Seidel, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spacing+of+palindromic+half+sites+as+a+determinant+of+selective+STAT+(signal+transducers+and+activators+of+transcription)+DNA+binding+and+transcriptional+activity.">Spacing of palindromic half sites as a determinant of selective STAT (signal transducers and activators of transcription) DNA binding and transcriptional activity.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 92 (7), 3041-3045 (1995).</li><li>Nelson, J. D., Denisenko, O., Bomsztyk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+the+fast+chromatin+immunoprecipitation+(ChIP)+method.">Protocol for the fast chromatin immunoprecipitation (ChIP) method.</a> Nat Protoc. 1 (1), 179-185 (2006).</li><li>Tian, B., Yang, J., Brasier, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+cross-linking+for+analysis+of+protein-chromatin+interactions.">Two-step cross-linking for analysis of protein-chromatin interactions.</a> Methods Mol Biol. 809, 105-120 (2012).</li><li>O'Neill, L. P., Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoprecipitation+of+native+chromatin:+NChIP.">Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP.</a> Methods. 31 (1), 76-82 (2003).</li><li>Horz, W., Altenburger, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+specific+cleavage+of+DNA+by+micrococcal+nuclease.">Sequence specific cleavage of DNA by micrococcal nuclease.</a> Nucleic Acids Res. 9 (12), 2643-2658 (1981).</li><li>Chung, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+micrococcal+nuclease+digestion+on+nucleosome+positioning+data.">The effect of micrococcal nuclease digestion on nucleosome positioning data.</a> PLoS One. 5 (12), 15754 (2010).</li></ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

בדוח זה, אנו מדגימים את TGF-β1 המושרה מחייב של SMAD2 ל SBE בתוך C-KIT ליגנד האמרגן ואת TGF-β1 המושרה מחייב STAT3 לרצף ההכרה שלה בתוך הגן TGF-β1 ליגנד. אנו מראים ציטוקינים- Induced מחייב של שני גורמים שעתוק באמצעות immunoprecipitation הכרומטין. הכרומטין immunoprecipit...

בגרעין של eukaryotes, DNA אינטראקציה עם חלבונים היסטון חלבונים nonhistone והוא מרוכז לתוך הכרומטין. בהקשר הביולוגי הפיזיולוגי, הפאתופיסיולוגי והתא, תפקודים תאיים נשלטים באופן מרחבי ומבוקר באופן זמני על ידי ביטוי גנים מתואם הכרומטין. אינטראקציות DNA- חלבון יש תפקיד חיוני ויסות של תהליכים תאיים, כגון שכפול דנ&quot;א, רקומבינציה, ותיקון, כמו גם ביטוי חלבון. לכן, ניתוח של אינטראקציות DNA חלבונים הוא כלי הכרחי בהערכת ביטוי גנים ותפקוד התא. קיימות מספר טכניקות כדי להעריך אינטראקציות DNA חלבונים במבחנה , כגון אלקטרופורזה (ג&#39;ל) ניידות משמרת Assay (EMSA) ו DNase אני footprinting 1 , 2 . עם זאת, טכניקות אלה לא לנתח את האינטראקציה DNA- חלבון בתוך הכרומטין הקשר הסלולר. שבב iטכניקה אשר לוכדת חלבונים קשורה לאתרים ספציפיים שלהם DNA מחייב ובכך מאפשר זיהוי של אינטראקציות DNA חלבונים בהקשר הכרומטין. הטכניקה פותחה במקור על ידי גימור וליס להערכת RNA פולימראז II מחייב גנים ספציפיים Escherichia coli ו תסיסנית melanogaster 3 , 4 . זה נעשה על ידי קיבוע של קומפלקסים DNA- חלבון, ואחריו ביצוע מיצוי הכרומטין וגזיזת DNA לתוך ~ 200 זוג בסיס (bp) שברי. לאחר מכן, חלבון ה- DNA קשור של עניין הוא מבודד על ידי immunoprecipitation. לאחר היפוך של ה- DNA חלבון crosslink, ה- DNA הוא מטוהרים ונותחו. מספר שיטות ניתן להשתמש לניתוח של אתרי מחייב חלבון תלויים ברצף חומצה גרעין של האתר מחייב חלבון בתוך הגן היעד 5 . במקרים שבהם רצף הדנ&quot;א ידוע, תקן PolYmerase תגובות שרשרת (PCR) ניתן ליישם, באמצעות זוגות פריימר ספציפיים צמודים לאתר מחייב ידוע. כמותי Real-Time PCR (qRT-PCR) יכול לשמש גם 6 . במקרים בהם הרצף אינו ידוע, ניתן לשלב את ה- CHIP עם מיקרוא-דנ&quot;א (שבב על שבב), רצף דנ&quot;א (שבב- seq), או טכניקות שיבוט 7 , 8 , 9 . מסלול TGF-β יש עוצמה דיכוי פונקציות מדכא והוא מסלול מפתח בידול תאים. זה מופעל באמצעות מחייב של ליגנד TGF-β1 לקולטן קולטן קוגנטי שלה, וכתוצאה מכך serine-fosphorylation של גורמי שעתוק SMAD2 / 3. בעקבות הקשר שלהם עם המתווך המשותף, SMAD4, מתרגם ה- SMAD אל הגרעין ונקשר ל- SBE בתוך אזור היזם של גני המטרה, שם הוא מווסת את הגנים השולטים במחזור התא, אפופטוזיס, ותא שונהעַל. תגובת ההעתקה לגירוי TGF-β היא סוג התא והקשר הספציפי 10 . לאחרונה, תיארנו לולאה משוב חיובי בין TGF-β לבין מסלול C-KIT 11 . במודל זה, TGF-β1 מופעל SMAD2 נקשר C-KIT ליגנד האמרגן ומעורר הביטוי שלה הפרשת. לאחר מכן, C-KIT ליגנד מפעיל את קולטן C-KIT באופן אוטומטי ו- para-crinic אופנה. C-KIT הפעלת קולטן תוצאות STAT3 Tyr 705- זרחון דרך JAK1 / 2. בעקבות STAT3- הפעלה טרנסלוקציה גרעינית, STAT3 נקשר לגן ליגנד TGF-β1 ו מסדיר את הביטוי שלה. כאן, אנו מדגימים את התפקיד המהותי של ניתוח שבב עבור זיהוי של SMAD2 מחייב את C-KIT קולטן ליגנד האמרגן ו עבור זיהוי של אותות מתמר (ו) Activator (של) שעתוק 3 (STAT3 מחייב את TGF-β1- גֵן).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="907">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">HepG2 cells</td>
			<td style="width:193px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">HB-8065</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">Hep3B cells</td>
			<td style="width:193px;">ATCC</td>
			<td>HB-8064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">TGF-&#946;1</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>101-B1</td>
			<td>Used at a concentration of 10 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">Anti-SMAD2 antibody</td>
			<td style="width:193px;">Cell Signalling Technology</td>
			<td style="width:119px;">5339</td>
			<td>Amount used per IP: 3 &#181;g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">Anti-STAT3 antibody</td>
			<td style="width:193px;">Cell Signalling Technology</td>
			<td style="width:119px;">4904</td>
			<td>Amount used per IP: 3 &#181;g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">ChIP-IT Protein G Magnetic Beads</td>
			<td style="width:193px;">Active Motif</td>
			<td style="width:119px;">53033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:193px;">Active Motif</td>
			<td style="width:119px;">37490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">Micrococcal Nuclease</td>
			<td style="width:193px;">Cell Signalling Technology</td>
			<td style="width:119px;">10011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">PCR forward primer: PAI-1</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence: 5&#8217;-GGAAGAGGATAAAGGACAAGCTG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">PCR reverse primer: PAI-1</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence: 5&#8217;-TGCAGCCAGCCACGTGATTGTC-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">PCR forward primer: SCF</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence: 5&#8217;-CACTGATGTTAATGTTCAGC-3&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">PCR reverse primer: SCF</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence: 5&#8217;-GCTCTAATTTAAACCTGGAGC-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:256px;">PCR forward primer: TGF-&#946;1 (STB-1)</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence: 5&#8217;-GAGAGAGACGTGAGTGGCATGTT-3&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:256px;">PCR reverse primer: TGF-&#946;1 (STB-1)</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence: 5&#8217;-TAGCTTTCTCTGCCTTGGTCTCCCC-3&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:256px;">PCR forward primer: TGF-&#946;1 (STB-2)</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence: 5&#8217;-GTACTGGGGGAGGAGCGGCATC-3&#8217;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:256px;">PCR reverse primer: TGF-&#946;1 (STB-2)</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence: 5&#8217;-TGCCACTGTCTGGAGAGAGGTGTGTC-3&#8217;&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of the c-kit ligand promoter using chromatin immunoprecipitation

תהליכים תאיים מרובים, כולל שכפול דנ&quot;א ותיקונם, recombination DNA, ביטוי גנים, דורשים אינטראקציות בין חלבונים ו- DNA. לכן, אינטראקציות דנ&quot;א חלבונים מסדירים פונקציות פיזיולוגיות, פתופיזיולוגיות וביולוגיות מרובות, כגון התמיינות תאים, התפשטות תאים, בקרת מחזור התא, יציבות כרומוזום, רגולציה של גנים אפיגנטיים ושינוי בתאים. בתאים אאוקריוטיים, ה- DNA מקיים אינטראקציה עם חלבונים היסטוניים ולא היסטוניים ומתעבה לכרומטין. כמה כלים טכניים ניתן להשתמש כדי לנתח אינטראקציות DNA חלבונים, כגון אלקטרופורזה (ג&#39;ל) ניידות Shift Assay (EMSA) ו DNase אני footprinting. עם זאת, טכניקות אלה לנתח את האינטראקציה DNA- חלבון במבחנה , לא בהקשר הסלולר. Chromatin immunoprecipitation (שבב) היא טכניקה לוכדת חלבונים באתרים ספציפיים שלהם DNA מחייב, ובכך מאפשר זיהוי של אינטראקציה DNA חלבוןS בהקשר הכרומטין שלהם. זה נעשה על ידי קיבוע של אינטראקציה DNA- חלבון, ואחריו immunoprecipitation של חלבון של עניין. לאחר מכן, האתר הגנומי שהחלבונים מאופיינים בו מאופיין. כאן, אנו מתארים ולדון צ&#39;יפ ולהפגין את הערך האנליטי שלה לזיהוי של שינוי גורם הצמיחה- β (TGF-β), מחייב המושרה של גורם שעתוק SMAD2 ל SMAD מחייב אלמנטים (SBE) בתוך אזור האמרגן של טירוזין, קינאז חלבון קיט (c-KIT) קולטן ליגנד תא גזע גורם (SCF).

הכריכה של ליגנד TGF-β1 לתרכובת הקולטן המובהקת שלו גורמת לזריחת הזרחן של גורמי שעתוק SMAD2 / 3, ולאחר מכן הקשר שלהם למתווך הפשוט, SMAD4. המתקן SMAD translocates לגרעין. TGF-β יכול להסדיר שעתוק גנים, בין אם ישירות דרך SMAD מחייב SBEs בתוך אזורים רגולטוריים של גנים היעד, או בעק...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation at JoVE.com

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

אינטראקציות DNA חלבון חיוניים עבור תהליכים ביולוגיים מרובים. במהלך הערכה של פונקציות הסלולר, ניתוח של אינטראקציות DNA חלבונים הוא הכרחי להבנת הרגולציה הגנטית. Chromatin immunoprecipitation (שבב) הוא כלי רב עוצמה לנתח אינטראקציות כאלה in vivo.

ניתוח של C-KIT ליגנד האמרגן באמצעות Immunoprecipitation הכרומטין

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

analysis-c-kit-ligand-promoter-using-chromatin

Research

JoVE Journal

Genetics

7.7K Views.  The University of Texas MD Anderson Cancer Center.  אינטראקציות DNA חלבון חיוניים עבור תהליכים ביולוגיים מרובים. במהלך הערכה של פונקציות הסלולר, ניתוח של אינטראקציות DNA חלבונים הוא הכרחי להבנת הרגולציה הגנטית. Chromatin immunoprecipitation (שבב) הוא כלי רב עוצמה לנתח אינטראקציות כאלה in vivo. 

Video: Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous nature of most mammalian chromatin-modifying complexes. In order to overcome these hurdles, we have adapted a sequential salt extraction (SSE) assay for evaluating the relative binding affinities of chromatin-bound complexes. This easy and straightforward assay can be used by non-experts to evaluate the relative difference in binding affinity of two related complexes, the changes in affinity of a complex when a subunit is lost or an individual domain is inactivated, and the change in binding affinity after alterations to the chromatin landscape. By sequentially re-suspending bulk chromatin in increasing amounts of salt, we are able to profile the elution of a particular protein from chromatin. Using these profiles, we are able to determine how alterations in a chromatin-modifying complex or alterations to the chromatin environment affect binding interactions. Coupling SSE with other in vitro and in vivo assays, we can determine the roles of individual domains and proteins on the functionality of a complex in a variety of chromatin environments.

Sequential salt extraction of chromatin bound proteins is a useful tool for determining the binding properties of large protein complexes. This method can be employed to evaluate the role of individual subunits or domains in the overall affinity of a protein complex to bulk chromatin.

עקירות מלח רציפים לניתוח של כרומטין בצובר מחייב מאפיינים של כרומטין שינוי מתחמי

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational modifications (PTMs) of histone tails, the exchange of canonical histones with histone variants, and nucleosome eviction. Such regulation requires the binding of signal-sensitive transcription factors (TFs) that recruit chromatin-modifying enzymes at regulatory elements defined as enhancers. Understanding how signaling cascades regulate enhancer activity requires a comprehensive analysis of the binding of TFs, chromatin modifying enzymes, and the occupancy of specific histone marks and histone variants. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays utilize highly specific antibodies to immunoprecipitate specific protein/DNA complexes. The subsequent analysis of the purified DNA allows for the identification the region occupied by the protein recognized by the antibody. This work describes a protocol to efficiently perform ChIP of histone proteins in a mature mouse T-cell line. The presented protocol allows for the performance of ChIP assays in a reasonable timeframe and with high reproducibility.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

This work describes a protocol for chromatin immunoprecipitation (ChIP) using a mature mouse T-cell line. This protocol is suitable to investigate the distribution of specific histone marks at specific promoter sites or genome-wide.

הכרומטין Immunoprecipitation (שבב) ב עכבר T-cell שורות

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution based analysis methodology (nucleosome density ChIP-seq; ndChIP-seq) that enables the generation of combined measurements of micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification genome-wide. Nucleosome position and local density, and the posttranslational modification of their histone subunits, act in concert to regulate local transcription states. Combinatorial measurements of nucleosome accessibility with histone modification generated by ndChIP-seq allows for the simultaneous interrogation of these features. The ndChIP-seq methodology is applicable to small numbers of primary cells inaccessible to cross-linking based ChIP-seq protocols. Taken together, ndChIP-seq enables the measurement of histone modification in combination with local nucleosome density to obtain new insights into shared mechanisms that regulate RNA transcription within rare primary cell populations.

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) methodology for the generation of sequence datasets suitable for a nucleosome density ChIP-seq analytical framework integrating micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification measurements.

דור של כרומטין יליד Immunoprecipitation רצף ספריות לניתוח צפיפות נוקלאוזום

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, transcription factors, or chromatin-modifying enzymes at a given locus or on a genome-wide scale. The combination of ChIP assays with next-generation sequencing (i.e., ChIP-Seq) is a powerful approach to globally uncover gene regulatory networks and to improve the functional annotation of genomes, especially of non-coding regulatory sequences. ChIP protocols normally require large amounts of cellular material, thus precluding the applicability of this method to investigating rare cell types or small tissue biopsies. In order to make the ChIP assay compatible with the amount of biological material that can typically be obtained in vivo during early vertebrate embryogenesis, we describe here a simplified ChIP protocol in which the number of steps required to complete the assay were reduced to minimize sample loss. This ChIP protocol has been successfully used to investigate different histone modifications in various embryonic chicken and adult mouse tissues using low to medium cell numbers (5 x 104 - 5 x 105 cells). Importantly, this protocol is compatible with ChIP-seq technology using standard library preparation methods, thus providing global epigenomic maps in highly relevant embryonic tissues.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Here, we describe a chromatin immunoprecipitation (ChIP) and ChIP-seq library preparation protocol to generate global epigenomic profiles from low-abundance chicken embryonic samples.

כרומטין פרוטוקול Immunoprecipitation (ChIP) עבור דגימות עובריים נמוך-שפע

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for spermatogenesis. These techniques allow for visualization of protein and DNA localization patterns during meiotic events such as homologous chromosome pairing, synapsis and DNA repair. While a few protocols have been described in the literature, general chromatin spread techniques using mammalian prophase oocytes are limited and difficult due to the timing of meiosis initiation in fetal ovaries. In comparison, prophase spermatocytes can be collected from juvenile male mice with higher yields without the need for microdissection. However, it is difficult to obtain a pure synchronized population of cells at specific stages due to the heterogeneity of meiotic and post-meiotic germ cell populations in the juvenile and adult testis. For later stages of meiosis, it is advantageous to assess oocytes undergoing meiosis I (MI) or meiosis II (MII), because groups of mature oocytes can be collected from adult female mice and stimulated to resume meiosis in culture. Here, methods for meiotic chromatin spread preparations using oocytes dissected from fetal, neonatal and adult ovaries are described with accompanying video demonstrations. Chromosome missegregation events in mammalian oocytes are frequent, particularly during MI. These techniques can be used to assess and characterize the effects of different mutations or environmental exposures during various stages of oogenesis. As there are distinct differences between oogenesis and spermatogenesis, the techniques described within are invaluable to increase our understanding of mammalian oogenesis and the sexually dimorphic features of chromosome and protein dynamics during meiosis.

Oogenesis in mammals is known to be error-prone, particularly due to chromosome missegregation. This manuscript describes chromatin spread preparation methods for mouse prophase, metaphase I and II-staged oocytes. These fundamental techniques allow for the study of chromatin-bound proteins and chromosome morphology throughout mammalian oogenesis.

כרומטין להפיץ את ההכנות לניתוח של העכבר Oocyte התקדמות מן Prophase כדי מפה של השני

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes that add or remove these marks in response to signals received by the cell. These PTMS are key contributors to the regulation of processes such as gene expression control and DNA repair. Chromatin immunoprecipitation (chIP) has been an instrumental approach for dissecting the abundance and localization of many histone PTMs throughout the genome in response to diverse perturbations to the cell. Here, a versatile method for performing chIP of post-translationally modified histones from the budding yeast Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is described. This method relies on crosslinking of proteins and DNA using formaldehyde treatment of yeast cultures, generation of yeast lysates by bead beating, solubilization of chromatin fragments by micrococcal nuclease, and immunoprecipitation of histone-DNA complexes. DNA associated with the histone mark of interest is purified and subjected to quantitative PCR analysis to evaluate its enrichment at multiple loci throughout the genome. Representative experiments probing the localization of the histone marks H3K4me2 and H4K16ac in wildtype and mutant yeast are discussed to demonstrate data analysis and interpretation. This method is suitable for a variety of histone PTMs and can be performed with different mutant strains or in the presence of diverse environmental stresses, making it an excellent tool for investigating changes in chromatin dynamics under different conditions.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Here, we describe a protocol for chromatin immunoprecipitation of modified histones from the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecipitated DNA is subsequently used for quantitative PCR to interrogate the abundance and localization of histone post-translational modifications throughout the genome.

Immunoprecipitation כרומטין (ChIP) של היסטון שינויים של האפייה

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the spatio-temporal expression of their target genes through physical contact, often bridging considerable (in some cases hundreds of kilobases) genomic distances and bypassing nearby genes. The human genome harbors an estimated one million enhancers, the vast majority of which have unknown gene targets. Assigning distal regulatory regions to their target genes is thus crucial to understand gene expression control. We developed Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) to enable the genome-wide detection of distal promoter-interacting regions (PIRs), for all promoters in a single experiment. In PCHi-C, highly complex Hi-C libraries are specifically enriched for promoter sequences through in-solution hybrid selection with thousands of biotinylated RNA baits complementary to the ends of all promoter-containing restriction fragments. The aim is to then pull-down promoter sequences and their frequent interaction partners such as enhancers and other potential regulatory elements. After high-throughput paired-end sequencing, a statistical test is applied to each promoter-ligated restriction fragment to identify significant PIRs at the restriction fragment level. We have used PCHi-C to generate an atlas of long-range promoter interactions in dozens of human and mouse cell types. These promoter interactome maps have contributed to a greater understanding of mammalian gene expression control by assigning putative regulatory regions to their target genes and revealing preferential spatial promoter-promoter interaction networks. This information also has high relevance to understanding human genetic disease and the identification of potential disease genes, by linking non-coding disease-associated sequence variants in or near control sequences to their target genes.

DNA regulatory elements, such as enhancers, control gene expression by physically contacting target gene promoters, often through long-range chromosomal interactions spanning large genomic distances. Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) identifies significant interactions between promoters and distal regions, enabling the assignment of potential regulatory sequences to their target genes.

יזם לכידת שלום-c: ברזולוציה גבוהה, הגנום כולו פרופיל של אינטראקציות יזם

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of a wide range of transcription factors (TFs) and cofactors mediating transcriptional activation or repression via changes in chromatin structure. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a useful molecular biology approach for mapping histone modifications and profiling transcription factors/cofactors binding to DNA, thus providing a snapshot of the dynamic nuclear changes occurring during different biological processes.
To study transcriptional regulation in adipose tissue, samples derived from in vitro cell cultures of immortalized or primary cell lines are often favored in ChIP assays because of the abundance of starting material and reduced biological variability. However, these models represent a limited snapshot of the actual chromatin state in living organisms. Thus, there is a critical need for optimized protocols to perform ChIP on adipose tissue samples derived from animal models.
Here we describe a protocol for efficient ChIP-seq of both histone modifications and non-histone proteins in brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. The protocol is optimized for investigating genome-wide localization of proteins of interest and epigenetic markers in the BAT, which is a morphologically and physiologically distinct tissue amongst fat depots.

Here we describe a protocol for efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) followed by high-throughput DNA sequencing (ChIP-seq) of brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. This protocol is suitable for both mapping histone modifications and investigating genome-wide localization of non-histone proteins of interest in vivo.

כרומטין Immunoprecipitation של רקמת שומן חום מאתר

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene expression. The cellular transcriptional machinery and its chromatin modification proteins coordinate to regulate transcription. To analyze transcriptional regulation at the molecular level, several experimental methods such as electrophoretic mobility shift, transient reporter and chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays are available. We describe a modified ChIP assay in detail in this article because of its advantages in directly showing histone modifications and the interactions between proteins and DNA in cells. One of the key steps in a successful ChIP assay is chromatin shearing. Although sonication is commonly used for shearing chromatin, it is difficult to identify reproducible conditions. Instead of shearing chromatin by sonication, we utilized enzymatic digestion with micrococcal nuclease (MNase) to obtain more reproducible results. In this article, we provide a straightforward ChIP assay protocol using MNase.

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool for understanding the molecular mechanisms of gene regulation. However, the method involves difficulties in obtaining reproducible chromatin fragmentation by mechanical shearing. Here, we provide an improved protocol for a ChIP assay using enzymatic digestion.

כרומטין Immunoprecipitation שימוש בנוקלאוסים מיקרוקוקל בתאי מיונקים

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

Mapping Alzheimer's Disease Variants to Their Target Genes Using Computational Analysis of Chromatin Configuration

Genome-wide association studies (GWAS) have successfully identified hundreds of genomic loci that are associated with human traits and disease. However, because the majority of the genome-wide significant (GWS) loci fall onto the non-coding genome, the functional impact of many remain unknown. Three-dimensional chromatin interactions identified by Hi-C or its derivatives can provide useful tools to annotate these loci by linking non-coding variants to their actionable genes. Here, we outline a protocol to map GWAS non-coding variants to their putative genes using Alzheimer&#39;s disease (AD) GWAS and Hi-C datasets from human adult brain tissue. Putative causal single-nucleotide polymorphisms (SNPs) are identified by application of fine-mapping algorithms. SNPs are then mapped to their putative target genes using enhancer-promoter interactions based on Hi-C. The resulting gene set represents AD risk genes, as they are potentially regulated by AD risk variants. To garner further biological insights into molecular mechanisms underlying AD, we characterize AD risk genes using developmental brain expression data and brain single-cell expression profiles. This protocol can be expanded to any GWAS and Hi-C datasets to identify putative target genes and molecular mechanisms underlying various human traits and diseases.

We present a protocol to identify functional implications of non-coding variants identified by genome-wide association studies (GWAS) using three-dimensional chromatin interactions.

מיפוי מחלת אלצהיימר משתנים גנים היעד שלהם באמצעות ניתוח חישובית של תצורת כרומטין

Genome-wide association studies (GWAS) have successfully identified hundreds of genomic loci that are associated with human traits and disease. However, ...