אנו אסירי תודה P. Käse ו T. Schmidt-Wöll לעזרה טכנית מעולה. עבודה זו נתמכה על ידי מענק המחקר המשותף TRR81 ותוכנית הייזנברג (BO 1639 / 5-1) של DFG (קרן המחקר הגרמנית), חברת מקס פלנק ו- EXC 294 בפרייבורג, ואשכול הצטיינות של מערכת ריאתי לב ריאה (ECCPS) ב Giessen כדי שחפת

הערה: כל המאגרים והאמצעים המשמשים בפרוטוקול זה מפורטים בטבלה 1 . ימים 1 ו -2 1. Crosslinking התאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את העכבר תאים T מ צלחת 6-היטב לצינור 50 מ&quot;ל ו צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 4 ° C ו ~ 271 x גרם. Resuspend תא גלולה ב 30 מ&quot;ל של תרבות IMDM תא תאים לספור את התאים באמצעות תא Neubauer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף aliquots של 20 x 10 6 תאים לתוך צינורות 50 מ&quot;ל חדשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת פורמלדהיד (FMA) לריכוז סופי 1% ישירות בינוני תרבות התא דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. זהירות: FMA הוא רעיל אם בשאיפה, כך לעבוד תחת מכסה המנוע קטר ללבוש ציוד מגן נאות. כמו כן, אנא לטפל בזבוז FMA על פי הכללים של המוסד המארחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1/8 נפח של 1 גליצין M, pH 7.0, ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה התאים על ידי צנטריפוגה עבור 5דקות ב 4 ° C ו ~ 271 xg ולשטוף עם 10 מ&quot;ל של פוספט שנאגרו מלוחים (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את גלולה תא עם 1 מ&quot;ל של PBS ולהעביר צינורות 1.5 מ&quot;ל. </li></ol> 2. תא תמוגה ו הכרומטין גז <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תא גלולה ב 1 מ&quot;ל של חיץ תמוגה SDS ו דגירה על הקרח במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת כל מדגם לצינור sonication ולבצע גז באמצעות ultrasonicator ממוקד בהתאם להגדרות המצוין בטבלה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הגז, להעביר את דגימות צינורות 1.5 מ&quot;ל ו צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 4 ° C ~ 18,000 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את supernatant צינורות חדשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף 50 μL כדי לקבוע את יעילות הגז על פי צעד 3 ו הצמד להקפיא lysate גז בחנקן נוזלי. חנות Lysate ב aliquots לשימוש יחיד ב -80 מעלות צלזיוס. </li></ol> 3. קביעת יעילות הגז <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μL של חיץ elution כדי 50 &amp; #181; L של כל lysate גז ו לדגור על 65 מעלות צלזיוס למשך הלילה, עם רועד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 μL של חיץ TE ו 4 μL של 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​RNase A (0.2 מיקרוגרם / ריכוז סופי μL). מערבבים ו לדגור על 2 שעות ב 37 ° C, עם רועד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 μL של 20 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​proteinase K (0.2 מיקרוגרם / ריכוז μL הסופי) לכל מדגם ו דגירה של 2 שעות ב 55 מעלות צלזיוס, עם רעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת כל מדגם לצינור ג&#39;ל מתאים פנול / כלורופורם / אלכוהול isoamyl החילוץ; ידית בהתאם להוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μL של פנול / chloroform / אלכוהול isoamyl (25: 24: 1) ולנער את צינורות. צנטריפוגה 5 דקות ב 24 ° C ו ~ 16,000 XG ולהעביר את השלב העליון צינורות חדשים. זהירות: פנול, כלורופורם, אלכוהול איזואמי הם רעילים אם הם בשאיפה והם קורוזיביים; לעבוד תחת מכסה המנוע קטר ללבוש ציוד מגן אישי ראוי. כמו כן, לטפל פנול, כלורופורם, וכן אלכוהול isoamyl פסולת acבהתאם לכללי המוסד המארח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור פעם אחת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיהור ה- DNA באמצעות עמודות טיהור על פי הוראות היצרן, עם השינויים הבאים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הקרום פעמיים. לאחר לשטוף האחרון, להשאיר את הצינור פתוח למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר להתאדות אתנול שיורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור elution, להוסיף 50 μL של H 2 O, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 1 דקות, לסובב את הצינור עבור 1 s כדי רטוב כראוי את הממברנה, ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 1 דקות לפני eluting DNA על ידי צנטריפוגה דקות 1 ב 24 ° C ו ~ 17,900 x גרם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את ה- DNA מטוהרים על פלואורמטר באמצעות ערכת רגישות גבוהה על פי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח כ 500 ng של ה- DNA מטוהרים על ג&#39;ל agarose 1.8% ו כ 1 ng על מערכת אלקטרופורזה באמצעות ערכת רגישות גבוהה. הערה: הגודל הצפויE של שברי ה- DNA הוא בין 200 ל 500 bp. </li></ol> ימים 3 ו -4 4. Immunoprecipitation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל 1 נפח של lysate גז עם 5 כרכים של חיץ דילול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Preclear עם 30 μL μL / חלבון מ&quot;ל אגרוס agarose (מוכן על פי נספח א ) במשך 30 דקות תוך סיבוב בחדר קר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ב ~ 750 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף 10% קלט קלט את זה ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot את הסכום הרצוי של lysate לתוך צינורות חדשים (ראה טבלה 3 לפרטים). הוסף את הנוגדנים הרצויים לכל צינור (ראה טבלה 3 לפרטים) וסובב בן לילה ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 40 μL של חלבון חרוזים לדגור על 1 שעות ב 4 ° C תוך סיבוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את החרוזים עם 1 מ&quot;ל של חיץ מלח נמוך, חיץ מלח גבוהה, חיץ LiCl, חיץ TE (עבור כל לשטוף, דגירה של 5 דקות ב 4 ° C תוך סיבוב צנטריפוגהבמשך 3 דקות ב 4 ° C ו ~ 950 xg). ראה טבלה 3 לפרטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 110 μL של חיץ elution ו דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, vortexing כל 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במשך 3 דקות ב 4 ° C ו ~ 950 xg ולהעביר 100 μL של supernatant לצינור 1.5-מ&quot;ל חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 4.7-4.8 עם 100 μL של חיץ elution ולשלב eluates. הוסף חיץ אלוטי עד 200 μL כדי להזין את הדגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה כל הדגימות לילה ב 65 מעלות צלזיוס, עם רועד. </li></ol> יום 5 5. טיהור דנ&quot;א <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μL למאגר TE כדי eluate כל 8 μL של 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​RNase A (0.2 מיקרוגרם / ריכוז סופי μL). מערבבים ו לדגור על 2 שעות ב 37 ° C, עם רועד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4 μL של 20 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​proteinase K (0.2 מיקרוגרם / ריכוז μL הסופי) כדי כל eluate ו דגירה של 2 שעות ב 55 מעלות צלזיוס, עם רועד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים כל מדגם לג&#39;לצינור מתאים פנול / כלורופורם / אלכוהול isoamyl החילוץ; ידית בהתאם להוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 400 μL של פנול / כלורופורם / אלכוהול isoamyl (25: 24: 1) ולנער את צינורות. צנטריפוגה 5 דקות ב 24 ° C ו ~ 16,000 x גרם. מעבירים את השלב העליון צינורות חדשים. זהירות: פנול, כלורופורם, אלכוהול איזואמי הם רעילים אם הם בשאיפה והם קורוזיביים; לעבוד תחת מכסה המנוע קטר ללבוש ציוד מגן אישי ראוי. כמו כן, לטפל פנול, כלורופורם, פסולת אלכוהול isoamyl על פי הכללים של המוסד המארחת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור פעם אחת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיהור ה- DNA באמצעות עמודות טיהור על פי הוראות היצרן, עם השינויים הבאים: </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הקרום פעמיים. לאחר לשטוף האחרון, להשאיר את צינורות פתוחים במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר להתאדות אתנול שיורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור elution, להוסיף 50 μL של H 2 O, דגירה בחדר temperatuמחדש עבור 1 דקות, לסובב את צינורות 1 s כדי רטוב כראוי את הממברנה, ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 1 דקות לפני eluting DNA על ידי צנטריפוגה דקות 1 ב 24 ° C ~ 17,900 x גרם. </li></ol>

<ol>
	<li>Rothenberg, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromatin+landscape+and+transcription+factors+in+T+cell+programming.">The chromatin landscape and transcription factors in T cell programming.</a> Trends Immunol. 35 (5), 195-204 (2014).</li><li>Zhang, J. A., Mortazavi, A., Williams, B. A., Wold, B. J., Rothenberg, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+transformations+of+genome-wide+epigenetic+marking+and+transcriptional+control+establish+T+cell+identity.">Dynamic transformations of genome-wide epigenetic marking and transcriptional control establish T cell identity.</a> Cell. 149 (2), 467-482 (2012).</li><li>Cauchy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+recruitment+of+Ets1+to+both+nucleosome-occupied+and+-depleted+enhancer+regions+mediates+a+transcriptional+program+switch+during+early+T-cell+differentiation.">Dynamic recruitment of Ets1 to both nucleosome-occupied and -depleted enhancer regions mediates a transcriptional program switch during early T-cell differentiation.</a> Nucl Acids Res. 44 (8), 3567-3585 (2016).</li><li>Koch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+initiation+platforms+and+GTF+recruitment+at+tissue-specific+enhancers+and+promoters.">Transcription initiation platforms and GTF recruitment at tissue-specific enhancers and promoters.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (8), 956-963 (2011).</li><li>Pekowska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H3K4+tri-methylation+provides+an+epigenetic+signature+of+active+enhancers.">H3K4 tri-methylation provides an epigenetic signature of active enhancers.</a> EMBO J. 30 (20), 4198-4210 (2011).</li><li>Vanhille, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+and+quantitative+assessment+of+enhancer+activity+in+mammals+by+CapStarr-seq.">High-throughput and quantitative assessment of enhancer activity in mammals by CapStarr-seq.</a> Nat Commun. 6, 6905 (2015).</li><li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome.">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129 (4), 823-837 (2007).</li><li>Heintzman, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+modifications+at+human+enhancers+reflect+global+cell-type-specific+gene+expression.">Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression.</a> Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).</li><li>Ernst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+analysis+of+chromatin+state+dynamics+in+nine+human+cell+types.">Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types.</a> Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).</li><li>Ostuni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latent+enhancers+activated+by+stimulation+in+differentiated+cells.">Latent enhancers activated by stimulation in differentiated cells.</a> Cell. 152 (1-2), 157-171 (2013).</li><li>Giaimo, B. D., Oswald, F., Borggrefe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+chromatin+regulation+at+Notch+target+genes.">Dynamic chromatin regulation at Notch target genes.</a> Transcription. 8 (1), 61-66 (2017).</li><li>Liefke, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+demethylase+KDM5A+is+an+integral+part+of+the+core+Notch-RBP-J+repressor+complex.">Histone demethylase KDM5A is an integral part of the core Notch-RBP-J repressor complex.</a> Genes Dev. 24 (6), 590-601 (2010).</li><li>Jung, C., Mittler, G., Oswald, F., Borggrefe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+helicase+Ddx5+and+the+noncoding+RNA+SRA+act+as+coactivators+in+the+Notch+signaling+pathway.">RNA helicase Ddx5 and the noncoding RNA SRA act as coactivators in the Notch signaling pathway.</a> Biochim Biophys Acta. 1833 (5), 1180-1189 (2013).</li><li>Oswald, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phospho-dependent+mechanism+involving+NCoR+and+KMT2D+controls+a+permissive+chromatin+state+at+Notch+target+genes.">A phospho-dependent mechanism involving NCoR and KMT2D controls a permissive chromatin state at Notch target genes.</a> Nucl Acids Res. 44 (10), 4703-4720 (2016).</li><li>Arrigoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardizing+chromatin+research:+a+simple+and+universal+method+for+ChIP-seq.">Standardizing chromatin research: a simple and universal method for ChIP-seq.</a> Nucl Acids Res. 44 (7), e67 (2016).</li><li>Essen, D., Dullforce, P., Brocker, T., Gray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+interactions+involved+in+Th+cell+memory.">Cellular interactions involved in Th cell memory.</a> J Immunol. 165 (7), 3640-3646 (2000).</li><li>White, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+better+cell+lines+for+making+hybridomas+expressing+specific+T+cell+receptors.">Two better cell lines for making hybridomas expressing specific T cell receptors.</a> J Immunol. 143 (6), 1822-1825 (1989).</li><li>Ghisletti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+enhancers+controlling+the+inflammatory+gene+expression+program+in+macrophages.">Identification and characterization of enhancers controlling the inflammatory gene expression program in macrophages.</a> Immunity. 32 (3), 317-328 (2010).</li><li>Egelhofer, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assessment+of+histone-modification+antibody+quality.">An assessment of histone-modification antibody quality.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).</li><li>Rothbart, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Interactive+Database+for+the+Assessment+of+Histone+Antibody+Specificity.">An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity.</a> Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).</li><li>Fenouil, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CpG+islands+and+GC+content+dictate+nucleosome+depletion+in+a+transcription-independent+manner+at+mammalian+promoters.">CpG islands and GC content dictate nucleosome depletion in a transcription-independent manner at mammalian promoters.</a> Genome Res. 22 (12), 2399-2408 (2012).</li><li>Hein, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+methylation+of+Notch1+controls+the+amplitude+and+duration+of+the+Notch1+response.">Site-specific methylation of Notch1 controls the amplitude and duration of the Notch1 response.</a> Sci Signal. 8 (369), ra30 (2015).</li></ol>

למחברים אין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

שבב הוא טכניקה חוקית כדי לחקור אם חלבונים או PTM שלהם מועשרים באזורים גנומיים ספציפיים. תוצאות שבב assay לעתים קרובות מאתגר לפרש בשל סיבות ביולוגיות או טכניות. הסיבות הביולוגיות הן רבות וכוללות חיבור חלש או עקיף של חלבונים לדנ&quot;א. יש גם מגבלות טכניות, כגון סגוליות נוגדן מוגבל ותאי תא לא יעיל או גז הכרומטין. מדריך לפתרון בעיות ( טבלה 5 ) יכול לסייע לקורא לפתור את הבעיות שעשויות להיתקל בבדיקות צ&#39;יפ. פרוטוקול זה, תוך שימוש במכשיר ultrasonicator הקירור ממוקד, מאפשר אחד לגזז ביעילות את הכרומטין של קו T העכבר התא הבוגר. השלב הקריטי העיקרי של הפרוטוקול מיוצג על ידי גז של הכרומטין, אשר חייב תמיד להיות מותאם לכל סוג תא. מומלץ לשנות את מספר התאים ואת מספר מחזורי sonication. יתר על כן, היא<html> יעילות aring מושפעת לרעה על ידי נוכחות של משקעים SDS בדגימות, אשר עשויים להיווצר במהלך תמוגה של תאים על הקרח עם חיץ תמוגה SDS. במקרה זה, עדיף לדגור את המדגם לאחר תמוגה בטמפרטורת החדר למשך כמה דקות כדי להפחית את נוכחותם של משקעים SDS. מומלץ לייעל את הפרוטוקול כדי להשיג שברי גזעים בין 200 ל 500 BP ו תמיד להעריך את איכות הגז של הדגימות לפני שתמשיך עם immunoprecipitation. בנוסף, זמן קיבוע, כמות נוגדנים ו / או תאים, ואת תנאי כביסה חייב להיות מותאם לכל נוגדנים. צעד אחד קריטי יותר בהפיכת הליך שבב מוצלח הוא הבחירה של הנוגדנים, כמו נוגדנים ספציפיות נמוכה להפחית באופן משמעותי את היעילות של immunoprecipitation. בעבר, הליך מבחן איכות אחיד מותר להעריך את הספציפיות של נוגדנים מספר זמין בשוק<html> Ss = &quot;xref&quot;&gt; 19. צינור ההקרנה התבסס על כתם נקודה, כתם מערבי וצ&#39;יפ, המספק רשימה של ריאגנטים באיכות גבוהה המתאימים ל- CHIP 19 . לאחרונה, הספציפיות של מספר נוגדן זמין מסחרית הוערך באמצעות צפיפות גבוהה היסטון פפטיד microarray פלטפורמות, המאפשר להקמת מסד נתונים על ספציפיות נוגדן 20 . הקורא יכול להשתמש בכלי זה שימושי כדי לזהות את הנוגדנים הספציפיים ביותר שניתן להשתמש בהם עבור ניסויים שבב. פרוטוקול זה לא נבדק עבור תאי T ראשוניים, במקרה זה, הקורא צריך להתייחס פרוטוקולים שפורסמו אחרים בהצלחה לבצע שבב על T- 3 תאים ראשוניים 3 , 4 , 21 . יש לציין, פרוטוקול זה שימש בהצלחה לביצוע שבב על שורה תא העכבר תא, כמו גם על קו תא אנדותל העכבר. Ove_content &quot;&gt; 5 x 10 6 תאים יש להשתמש עבור כל immunoprecipitation לניתוח של סימני היסטון, כי פרוטוקול זה יכול גם להיות מתאים, עם אופטימיזציה כלשהי, לבצע שבב על TFs או cofactors, עדיף להגדיל את מספר התאים המשמשים את immunoprecipitation במקרים אלה.על מנת להגיע למספר הנדרש של תאים עבור כל ניסוי, aliquots יותר של lysate גזרו ניתן להרכיב יחד לפני דילול הכרומטין במאגר דילול. פרוטוקול זה יכול גם להיות שונה כדי לבצע שבב על חלבונים אנדוגניים שאינם קשורים ישירות ל- DNA. במקרה זה, טרום קביעה עם crosslinkers חלבון חלבון ( למשל, dimethyl adipimidate, DMA) עשוי להידרש (ראה נספח B לקבלת מידע נוסף). ביצועים מוצלחים של שבב על cofactors נעשה בעבר על ידי overexpressing חלבונים כי הם התמזגו תג ביוטין. במקרה זה, חלבון היה מטוהרים עם streptavidin-conjugaTed חרוזים מגנטיים, וכן קיבוע מראש עם DMA בוצע 22 .

פיתוח, דיפרנציאציה והומיאוסטזיס תלויים בתכניות ספציפיות לביטוי גנים, אשר נקבעו על ידי אירועים איתותים המווסתים את מבנה הכרומטין, ולכן קובעים אם גן מסוים מופעל או מודחק בצורה תאית וזמנית. במהלך פיתוח תאי T, יש להגדיר תוכניות ספציפיות לביטוי גנים כדי לקבוע כראוי את ההבשלה של מבשרי תא-תא מהמצב הדו-שלילי (DN) למצב החיובי (SP), העובר דרך שלבי ביניים אחדים. כיצד התוכנית ביטוי גנים הוא מוסדר באופן דינמי במהלך התפתחות תא T כבר נחקר בשנים האחרונות על ידי כמה מעבדות 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . על ידי שינויים שלאחר טרנסלוציאציה (PTM) של היסטונים, חילופיהיסטונים קנוניים עם גרסאות היסטון, פינוי נוקלאוזום, ומתילציה של דנ&quot;א מסדירים את מתג ה- ON / OFF של הגנים. מספר קבוצות חקרו את התפלגות גנום רחב של PTMs וריאנטים היסטון כדי לקבוע סימנים הקשורים למצבים הכרומטין שונים באזורי פרוקסימלי ו דיסטלי 7 , 8 , 9 , 10 . איתות cascades תזמון דינמי הכרומטין רגולציה באמצעות חילופי של אנזימים חיוביים ושליליים chromatin- שינוי (הידוע גם בשם כרום מחליפים) על אלמנטים משפר ספציפיים. אלה מכפילי הכרומטין לווסת את המבנה הכרומטין ובכך פלט תעתיק על ידי, למשל, מתילציה דינמית היסטון acetylation. זה המקרה ב Notch איתות המסלול 11 , 12 , 13 ,14. דינמי היסטון PTMs; חילופים עם גרסאות היסטון; ואת התפוסה הדינמית של היסטונים, גורמי שעתוק, cofactors ניתן לחקור על ידי מבחני immunoprecipitation הכרומטין (שבב). נוגדנים ספציפיים במיוחד משמשים לטהר מתחמי DNA ייחודיים, ואת ה- DNA מטוהרים מנותח על ידי PCR כמותי (qPCR); עמוק רצף (שבב- Seq); או, בתדירות נמוכה יותר בימינו, הכלאה כדי microarray (שבב שבב). מבחני שבב הם לפעמים מאתגר בשל סיבוכים עם תמוגה של תאים, גז של הכרומטין, ו / או ספציפיות נמוכה של הנוגדנים. מספר אסטרטגיות אומצו כדי לשפר את הפרוטוקול, כמו במקרה של NEXSON 15 . השימוש במקררים קירור מים אמבטיה נמנע חימום המדגם שעלולים לפגוע epitopes הנוכחי על החלבון הנחקר, אבל האנרגיה הדרושה הגז של דגימות מקבל מפוזרים לתוך המים.שיפור נוסף נעשה עם פיתוח של מכשירי ultrasonication ממוקדים המונעים פיזור של האנרגיה. לכן, התקנים ultrasonicator ממוקד לאפשר שיפורים תמוגה התא ואת הכרומטין גז, ביטול וריאציות המושרה על ידי מפעיל ו להגדיל באופן משמעותי את reproducibility. עבודה זו מתארת ​​פרוטוקול (סקירה סכמטית באיור 1 ) ביעילות לבצע את שבב של חלבונים היסטון בקו עכבר T- תא הבוגר שנקרא E2-10HA 16 , 17 . T- תאים הם בדרך כלל קשה lyse, ואת הגז של הכרומטין שלהם התגלה להיות יעיל. בפרוטוקול זה, אשר עושה שימוש ultrasonicator ממוקד קירור, מספר תאים, המאגר תמוגה, והגז ההגדרה היו אופטימיזציה עבור העכבר E2-10HA העכבר תא. פרוטוקול זה מאפשר אחד לבצע שבב עם reproducibility גבוה ובזמן סביר. למעשה, זה requirEs בערך יומיים כדי לגזום את הכרומטין כדי להעריך את איכות הגז, ושלושה ימים לבצע immunoprecipitation, להפוך את crosslink, ולטהר את ה- DNA.

<table><tbody><tr><td>Agilent High Sensitivity D5000 Reagents</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5593</td><td></td></tr><tr><td>Agilent High Sensitivity D5000 ScreenTape</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5592</td><td></td></tr><tr><td>Agilent Tapestation 4200</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2991AA</td><td></td></tr><tr><td>Covaris S220 AFA System</td><td>Covaris</td><td>500217</td><td></td></tr><tr><td>dimethyl adipimidate (DMA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20660</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Pan-Biotech</td><td>1502-P121301</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde (FMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Insulin solution human&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Iscove&#039;s modified Dulbecco&#039;s medium (IMDM)</td><td>Gibco</td><td>21980-032</td><td></td></tr><tr><td>Minimum essential medium non-essential amino acids (MEM NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>nProtein A Sepharose 4 Fast Flow</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5280-02</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin&lt;br /&gt;(10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Peptone primatone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4963-100G</td><td></td></tr><tr><td>Phase Lock Gel Heavy 2&amp;nbsp;mL</td><td>5 Prime</td><td>2302830</td><td></td></tr><tr><td>Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1)</td><td>Roth</td><td>A156.2</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>GIBCO</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25530049</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit (250)</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Fluorometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Qubit assay tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>RNase A, DNase and protease-free (10&amp;nbsp;mg/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Tube AFA Fiber &amp;amp; Cap</td><td>Covaris</td><td>520081</td><td></td></tr></tbody></table>

chromatin immunoprecipitation (chip) in mouse t-cell lines

מסלולי האיתור מסדירים את תוכניות הביטוי של גנים באמצעות אפנון של מבנה הכרומטין ברמות שונות, כגון על ידי שינויים פוסט-טרנסלציוניים (PTM) של זנבות היסטון, החלפת היסטונים קנוניים עם גרסאות היסטוניות ופינוי נוקלאוזום. תקנה כזו דורשת מחייב של גורמים שעתוק אותות רגישים (TF) כי לגייס אנזימים שינוי הכרומטין על אלמנטים רגולטוריים שהוגדרו משפר. ההבנה כיצד איתות איתותים מסדירים פעילות משופרת דורשת ניתוח מקיף של קשירת TFs, אנזימים שינוי הכרומטין, ואת התפוסה של סימני היסטון ספציפיים וריאנטים היסטון. Chromatin immunoprecipitation (שבב) מבחני לנצל נוגדנים ספציפיים במיוחד immunoprecipitate חלבון ספציפי / מתחמי DNA. הניתוח הבא של הדנ&quot;א המטוהרים מאפשר לזהות את האזור הכבוש על ידי חלבון מוכר על ידי הנוגדן. עבודה זו מתארת ​​פרוטוקול ביעילות peRform צ&#39;יפ של חלבונים היסטון בשורת עכבר T-cell בוגרת. הפרוטוקול המוצג מאפשר את הביצועים של מבחני שבב במסגרת זמן סבירה עם reproducibility גבוהה.

בתאי T מורין בוגרים הוכנסו לבדיקת שבב כדי לחקור את העשרה של ההיסטונוס של סמן ההיסטון של ליזין 4 על היסטון 3 (H3K4me1), תלת-מתילציה של ליזין 4 על היסטון 3 (H3K4me3) ואצטילציה של ליזין 27 היסטון 3 (H3K27ac), כמו גם תפוסה nucleosome, כפי שנחשף על ידי שבב panH3. איכות הגז הוערך על ידי ניתוח על ג&#39;ל agarose 1.8% ( איור 2 א ) ועל מערכת אלקטרופורזה ( איור 2 ב ). H3K4me1 ו H3K4me3 משמשים בדרך כלל כדי לזהות אתרים משפר ומקדמים, בהתאמה ( איור 3 א ). למעשה, H3K4me3 בולט אך לא מועשר באופן בלעדי על היזמים 5 , 8 , 14 . מאפיין של משפרי פעיל הוא להיות מועשר מאוד עבור H3K4me1 ו H3K27ac ו מועשר כראוי עבור H3K4me3 (&lt;(איור 3 א &#39;, פאנל עליון), בעוד ששיפורים לא פעילים מציגים רמות נמוכות של H3K4me3 ו- H3K27ac, אך רמות גבוהות של H3K4me1 ( איור 3 א&#39; , לוח תחתון). כפי שמוצג באיור 3 ב , Glyceraldehyde 3-פוספט dehydrogenase ( Gapdh ) הגן הוא נציג של ניתוח של היזמים פעיל גן ( האמרגן Gapdh ). למעשה, זה מראה רמות גבוהות של H3K4me3 ו H3K27ac ורמות נמוכות של H3K4me1. באיור 3 ב , Deltex1 ( Dtx1 ) הוא נציג של משפרי פעיל ( Dtx1 משפר ), כפי שהוא מועשר מאוד עבור H3K4me1 מועשר היטב עבור H3K4me3 ו H3K27ac. המדבר הגנטי הוא נציג של אזור חסר גנים קידוד והוא נתבע בדרך כלל כביקורת שלילית עבור סימני הכרומטין פעיל. התצפית כי H3K4me1, מקובל היטב סימן משפר 4 , 5 , </sup&gt; 7 , 14 , 18 , אינו מועשר במדבר ג &#39;ין עולה כי באזור זה חסרים משפרי. <img alt="איור 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55907/55907fig1.jpg" /> איור 1: סקירה סכמטית של פרוטוקול שבב שהוצג. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55907/55907fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55907/55907fig2.jpg" /> איור 2: בקרת איכות הגז של בשורת עכבר T- התא הבוגר. ( A ) שני aliquots שונים של העכבר הבוגר T-Cell תא E2-10HA היו גזוז, כ 500 ng של DNA מטוהרים נותחו על ג &#39;ל agarose 1.8% כדי להעריך את הגזירה שלהםהאיכות. ( ב ) 1 ng של DNA מטוהרים מדגם 2 נותח על ידי אלקטרופורזה כדי להעריך את איכות הגז שלה. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55907/55907fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55907/55907fig3.jpg" /> איור 3: סימני הכרומטין המאפיינים משפרי ומקדמי. ( A ) משפרי פעיל (פאנל עליון) מאופיינים H3K4me1 גבוהה, נמוך H3K4me3, גבוה H3K27ac, בעוד משפרי לא פעיל (פאנל התחתון) הנוכחי גבוה H3K4me1, נמוך H3K4me3, ו H3K27ac נמוך. ( ב ) הדגימות שהוצגו בתרשים 2 א היו משולבים יחד המשמשים ניתוח שבב לעומת סימני היסטון H3K4me1, H3K4me3, ו H3K27ac תפוסה היסטון, כפי שנחשף על ידי שבב panH3. ניתוח זה מראה כי thE מקדם של Ghyceraldehyde Geneceraldehyde גופרלדהיד 3-פוספט ( Gapdh האמרגן ) מועשר מאוד עבור H3K4me3 ו H3K27ac מועשר נמוך עבור H3K4me1. מצד שני, משפר את הגן הלא פעיל Deltex1 ( Dtx1 משפר ) מועשר מאוד עבור H3K4me1 אבל מועשר היטב עבור H3K4me3 ו H3K27ac. שבב באמצעות נוגדן panH3 שימש לבדיקת תפוסה של נוקלאוזום. המדבר הגנטי שימש כבקרה שלילית. ניסוי נציג אחד מוצג. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55907/55907fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המאגר </td><td> מֵגִיב </td><td> ריכוז סופי </td></tr><tr><td rowspan="5"> חיץ דילול </td><td> נתרן dodecייל סולפט (SDS) </td><td> 0.01% (w / v) </td></tr><tr><td> טריטון X-100 </td><td> 1.1% (v / v) </td></tr><tr><td> חומצה ethylenediaminetetraetic (EDTA) pH 8.0 </td><td> 1.2 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> Tris-HCl pH 8.1 </td><td> 16.7 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> סודיום כלורי (NaCl) </td><td> 167 מ&quot;מ </td></tr><tr><td rowspan="2"> פתרון DMA </td><td> דימתיל אדיפימיט (DMA) </td><td> 10 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) </td><td> 1x </td></tr><tr><td rowspan="3"> חיץ אלוטי </td><td> סודיום dodecyl סולפט (SDS) </td><td> 1% (w / v) </td></tr><tr><td> חומצה ethylenediaminetetraetic (EDTA) pH 8.0 </td><td> 10 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> Tris-HCl pH 8.0 </td><td> 50 מ&quot;מ </td></tr><tr><td rowspan="5"> חיץ מלח גבוה </td><td> סודיום dodecyl סולפט (SDS) </td><td> 0.1% (w / v) </td></tr><tr><td> טריטון X-100 </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td> Ethylenediamiחומצה Netetraacetic (EDTA) pH 8.0 </td><td> 2 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> Tris-HCl pH 8.1 </td><td> 20 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> סודיום כלורי (NaCl) </td><td> 500 מ&quot;מ </td></tr><tr><td rowspan="6"> IMDM בינוני </td><td> IScove שונה של Dulbecco בינוני (IMDM) </td><td> 1x </td></tr><tr><td> בסרום שור עוברית (FBS) </td><td> 2% (v / v) </td></tr><tr><td> פניצילין / סטרפטומיצין </td><td> 1x </td></tr><tr><td> פפטון פרימטון </td><td> 0.3 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td></tr><tr><td> תמיסת אינסולין אנושית </td><td> 4.8 mg / mL </td></tr><tr><td> חומצות אמינו חיוניות בינוניות לא חיוניות (MEM NEAA) </td><td> 1x </td></tr><tr><td rowspan="4"> חיץ מלח LiCl </td><td> ליתיום כלורי (LiCl) </td><td> 0.25 M </td></tr><tr><td> IGEPAL-CA630 </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td> חומצה ethylenediaminetetraetic (EDTA) pH 8.0 </td><td> 1 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> Tris-HCl pH 8.1 </td><td> 10 מ&quot;מ </td></tr><tr><td rowspan="5"> חיץ מלח נמוך </td><td> סודיום dodecyl סולפט (SDS) </td><td> 0.1% (w / v) </td></tr><tr><td> טריטון X-100 </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td> חומצה ethylenediaminetetraetic (EDTA) pH 8.0 </td><td> 2 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> Tris-HCl pH 8.1 </td><td> 20 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> סודיום כלורי (NaCl) </td><td> 150 מ&quot;מ </td></tr><tr><td rowspan="5"> פרוטאין חרוזי ספרוס מכבסים חיץ </td><td> Tris-HCl pH 8.0 </td><td> 20 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> סודיום כלורי (NaCl) </td><td> 500 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> חומצה ethylenediaminetetraetic (EDTA) pH 8.0 </td><td> 2 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> סודיום dodecyl סולפט (SDS) </td><td> 0.1% (w / v) </td></tr><tr><td> IGEPAL-CA630 </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td rowspan="3"> SDS חיץ תמוגה </td><td> סודיום dodecyl סולפט (SDS) </td><td> 1% (w / v) </td></tr><tr><td> אתילנדי<html> חומצה אמינטראצטית (EDTA) pH 8.0 </td><td> 10 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> Tris-HCl pH 8.1 </td><td> 50 מ&quot;מ </td></tr><tr><td rowspan="2"> חיץ TE </td><td> Tris-HCl pH 8.0 </td><td> 10 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> חומצה ethylenediaminetetraetic (EDTA) pH 8.0 </td><td> 1 מ&quot;מ </td></tr></tbody></table> טבלה 1: רשימת המאגרים והמדיום המשמש בפרוטוקול זה. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> עַל </td><td> כבוי </td></tr><tr><td> כוח שיא </td><td> 150.0 </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> גורם חובה </td><td> 15.0 </td><td> 15.0 </td></tr><tr><td> מחזורים / התפוצצות </td><td> 500 </td><td> 500 </td></tr><tr><td> מס &#39;מחזורי </td><td colspan="2"> 28 </td></tr></tbody></table>: Keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; טבלה 2: הגדרות הגז המשמשות בפרוטוקול זה. תנאים אלה כבר מותאם במיוחד עבור T-T העכבר התא הבוגר. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> נוֹגְדָן </td><td> ספק </td><td> כמות נוגדנים / immunoprecipitation </td><td> כמות של תאים / immunoprecipitation </td><td> תנאי כביסה </td></tr><tr><td> H3 </td><td> Abcam (ab1791) </td><td> 2.5 מ&quot;ג </td><td> 5 x 10 6 </td><td> פעם למאגר מלח נמוך, פעמיים למאגר מלח גבוהה, פעמיים למאגר מלח LiCl ושלוש פעמים TE חיץ </td></tr><tr><td> H3K4me1 </td><td> Abcam (ab8895) </td><td> 2.5 מ&quot;ג </td><td> 5 x 10 6 </td><td> פעם למאגר מלח נמוך, פעמיים למאגר מלח גבוהה, פעמיים למאגר מלח LiCl ושלוש פעמים TE חיץ </td></tr><html><tr><td> H3K4me3 </td><td> Diagnode (pAb-003-050) </td><td> 2.5 מ&quot;ג </td><td> 5 x 10 6 </td><td> פעם למאגר מלח נמוך, פעמיים למאגר מלח גבוהה, פעמיים למאגר מלח LiCl ושלוש פעמים TE חיץ </td></tr><tr><td> H3K27ac </td><td> Diagnode (pAb-174-050) </td><td> 2.5 מ&quot;ג </td><td> 5 x 10 6 </td><td> Oce במאגר מלח נמוך, פעמיים למאגר מלח גבוהה, פעמיים למאגר מלח LiCl ושלוש פעמים TE חיץ </td></tr><tr><td> IgG </td><td> Diagnode (C15410206) </td><td> מִשְׁתַנֶה* </td><td> מִשְׁתַנֶה* </td><td> מִשְׁתַנֶה* </td></tr><tr><td colspan="5"> * במקרה של שליטה IgG, כמות הנוגדנים הן תאים, כמו גם את השלבים כביסה, יש לשקף את התנאים של immunoprecipitations אחרים. </td></tr></tbody></table> טבלה 3: נוגדנים ותנאי כביסה המשמשים במחקר זה. <table border="1" fo:ke</html style=";text-align:right;direction:rtl"><html> Ep-together.within-page = &quot;1&quot; עבור: Keep-with-next.within-page = &quot;always&quot;&gt; <tbody><tr><td> גֵן </td><td> קדימה </td><td> פריימר הפוך </td><td> בְּדִיקָה </td></tr><tr><td> מקדם Gapdh (0 kb) </td><td> 5-GGG TTC CTA TAA ATA CGG ACT GC-3 &#39; </td><td> 5-CTG GCA CTG CAC AAG AAG A-3 &#39; </td><td> 68 </td></tr><tr><td> משפר Dtx1 (+26 kb) </td><td> 5-CTC GGG GGG GAC AG-3 &#39; </td><td> 5-GCA TGG GAA CTG TGT TAC AGA A-3 &#39; </td><td> 27 </td></tr><tr><td> מדבר ג &#39;ין </td><td> 5-CAA TGC ATG GGT CCA GAT TT-3 &#39; </td><td> 5-ATG GGC ACG GAA GTA GTG CT-3 &#39; </td><td> 94 </td></tr></tbody></table> טבלה 4: פריימרים וחיישנים המשמשים את QPCR במחקר זה. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with</html style=";text-align:right;direction:rtl">-next.within-page = &quot;always&quot;&gt; <tbody><tr><td> בְּעָיָה </td><td> גורם ל </td><td> פִּתָרוֹן </td></tr><tr><td rowspan="3"> הכרומטין נמצא מתחת לגזעים ושברים גדולים מדי. </td><td> נעשה שימוש בתאים רבים מדי. </td><td> הפחת את מספר התאים. </td></tr><tr><td rowspan="2"> הגז הוא נמוך מדי. </td><td> הגדל את מספר מחזורי הגז. </td></tr><tr><td> להגדיל את כוח שיא הגז, את גורם החובה ו / או מחזורים / פרץ. </td></tr><tr><td rowspan="3"> הכרומטין נגמר ושברים קטנים מדי. </td><td> נעשה שימוש במספר קטן מדי של תאים. </td><td> הגדל את מספר התאים. </td></tr><tr><td rowspan="2"> הגז גבוה מדי. </td><td> הפחת את מספר מחזורי הגז. </td></tr><tr><td> להפחית את כוח שיא גז, גורם חובה ו / או מחזורים / פרץ. </td></tr><tr><td rowspan="11"> התאוששות נמוכה מדיGG שליטה ו / או שליטה שלילית (רקע גבוה). </td><td> לא מספיק הכרומטין המשמש לניסוי. </td><td> להגדיל את כמות הכרומטין. </td></tr><tr><td> כמות הנוגדן נמוכה מדי. </td><td> הגדל את כמות הנוגדן. </td></tr><tr><td> כמות הנוגדן גבוהה מדי. </td><td> צמצום כמות הנוגדן. </td></tr><tr><td> לנוגדן יש סגוליות נמוכה. </td><td> לשנות את הנוגדן. </td></tr><tr><td rowspan="2"> תנאי כביסה מחמירים מדי. </td><td> צמצום מספר הכביסה. </td></tr><tr><td> צמצום החומרה של מאגרי הכביסה. </td></tr><tr><td rowspan="2"> תנאי כביסה אינם מחמירים מספיק. </td><td> הגדל את מספר הכביסה. </td></tr><tr><td> להגביר את החומרה של מאגרים כביסה. </td></tr><tr><td> יותר מדי DNA היה pipetted ב qPCR. </td><td> להקטין את כמות DNA pipetted ב qPCR. </td></tr><tr><td rowspan="2"> QPCR התנאים אינם אופטימליים. </td><td> מטב את התנאים qPCR. </td></tr><tr><td> הפחת את מספר המחזורים. </td></tr><tr><td rowspan="4"> אין מוצר או מוצר נמוך מדי בתגובה qPCR של מדגם קלט. </td><td> לא מספיק DNA היה pipetted ב qPCR. </td><td> להגדיל את כמות DNA pipetted ב qPCR. </td></tr><tr><td rowspan="2"> QPCR התנאים אינם אופטימליים. </td><td> מטב את התנאים qPCR. </td></tr><tr><td> הגדל את מספר המחזורים. </td></tr><tr><td> לא מספיק הכרומטין המשמש לניסוי. </td><td> להגדיל את כמות הכרומטין. </td></tr><tr><td rowspan="4"> אין אות שליטה חיובית ו / או panh3 שבב. </td><td> לא מספיק הכרומטין המשמש לניסוי. </td><td> להגדיל את כמות הכרומטין. </td></tr><tr><td> כמות הנוגדן נמוכה מדי. </td><td> הגדל את כמות הנוגדן. </td></tr><tr><td> האנטילגוף יש סגוליות נמוכה. </td><td> לשנות את הנוגדן. </td></tr><tr><td> אלוטיון הוא תת אופטימלי. </td><td> הקפד לעתים קרובות מערבולת דגימות כדי לשמור על חרוזים בפתרון. </td></tr></tbody></table> טבלה 5: פתרון בעיות.

Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines at JoVE.com

Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

עבודה זו מתארת ​​פרוטוקול לכרומטין immunoprecipitation (שבב) באמצעות קו עכבר T- התא הבוגר. פרוטוקול זה מתאים לחקור את ההפצה של סימני היסטון ספציפיים באתרי מקדם ספציפי או גנום רחב.

הכרומטין Immunoprecipitation (שבב) ב עכבר T-cell שורות

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

chromatin-immunoprecipitation-chip-in-mouse-t-cell-lines

Research

JoVE Journal

Genetics

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

18.3K Views.  University of Giessen.  עבודה זו מתארת ​​פרוטוקול לכרומטין immunoprecipitation (שבב) באמצעות קו עכבר T- התא הבוגר. פרוטוקול זה מתאים לחקור את ההפצה של סימני היסטון ספציפיים באתרי מקדם ספציפי או גנום רחב. 

Video: Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a high content of structural proteins. Dissected limb muscles from adult mice are physically disrupted by mechanical homogenisation, or a combination of mincing and douncing, in a hypotonic buffer before formaldehyde fixation of the cell lysate. The fixed nuclei are purified by further cycles of mechanical homogenisation or douncing and sequential filtrations to remove cell debris. The purified nuclei can be sonicated immediately or at a later stage after freezing. The chromatin can be efficiently sonicated and is suitable for chromatin immunoprecipitation experiments, as illustrated by the profiles obtained for transcription factors, RNA polymerase II, and covalent histone modifications. The binding events detected using chromatin prepared by this protocol are predominantly those taking place in the muscle fiber nuclei despite the presence of chromatin from other fiber-associated satellite and endothelial cells. This protocol is therefore adapted to study gene regulation in the adult mouse skeletal muscle.

A novel protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle adapted to the study of gene regulation in muscle fibers by chromatin immunoprecipitation is presented.

פרוטוקול משופרת עבור כרומטין Immunoprecipitation של שרירי השלד העכבר

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a ...

Biochemistry

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of a wide range of transcription factors (TFs) and cofactors mediating transcriptional activation or repression via changes in chromatin structure. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a useful molecular biology approach for mapping histone modifications and profiling transcription factors/cofactors binding to DNA, thus providing a snapshot of the dynamic nuclear changes occurring during different biological processes.
To study transcriptional regulation in adipose tissue, samples derived from in vitro cell cultures of immortalized or primary cell lines are often favored in ChIP assays because of the abundance of starting material and reduced biological variability. However, these models represent a limited snapshot of the actual chromatin state in living organisms. Thus, there is a critical need for optimized protocols to perform ChIP on adipose tissue samples derived from animal models.
Here we describe a protocol for efficient ChIP-seq of both histone modifications and non-histone proteins in brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. The protocol is optimized for investigating genome-wide localization of proteins of interest and epigenetic markers in the BAT, which is a morphologically and physiologically distinct tissue amongst fat depots.

Here we describe a protocol for efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) followed by high-throughput DNA sequencing (ChIP-seq) of brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. This protocol is suitable for both mapping histone modifications and investigating genome-wide localization of non-histone proteins of interest in vivo.

כרומטין Immunoprecipitation של רקמת שומן חום מאתר

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

הכרומטין immunoprecipitation מן בתאי גזע עובריים אנושיים

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Biology

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene expression. The cellular transcriptional machinery and its chromatin modification proteins coordinate to regulate transcription. To analyze transcriptional regulation at the molecular level, several experimental methods such as electrophoretic mobility shift, transient reporter and chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays are available. We describe a modified ChIP assay in detail in this article because of its advantages in directly showing histone modifications and the interactions between proteins and DNA in cells. One of the key steps in a successful ChIP assay is chromatin shearing. Although sonication is commonly used for shearing chromatin, it is difficult to identify reproducible conditions. Instead of shearing chromatin by sonication, we utilized enzymatic digestion with micrococcal nuclease (MNase) to obtain more reproducible results. In this article, we provide a straightforward ChIP assay protocol using MNase.

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool for understanding the molecular mechanisms of gene regulation. However, the method involves difficulties in obtaining reproducible chromatin fragmentation by mechanical shearing. Here, we provide an improved protocol for a ChIP assay using enzymatic digestion.

כרומטין Immunoprecipitation שימוש בנוקלאוסים מיקרוקוקל בתאי מיונקים

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

Identification of specific protein-DNA interactions on the genome is important for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation coupled with high-throughput sequencing (ChIP-seq) is widely used to identify genome-wide binding locations of DNA-binding proteins. However, the ChIP-seq method is limited by its heterogeneity in length of sonicated DNA fragments and non-specific background DNA, resulting in low mapping resolution and uncertainty in DNA-binding sites. To overcome these limitations, the combination of ChIP with exonuclease digestion (ChIP-exo) utilizes 5&#8217; to 3&#8217; exonuclease digestion to trim the heterogeneously sized immunoprecipitated DNA to the protein-DNA crosslinking site. Exonuclease treatment also eliminates non-specific background DNA. The library-prepared and exonuclease-digested DNA can be sent for high-throughput sequencing. The ChIP-exo method allows for near base-pair mapping resolution with greater detection sensitivity and reduced background signal. An optimized ChIP-exo protocol for mammalian cells and next-generation sequencing is described below.

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease ChIP-Exo

Precise determination of protein-binding locations across the genome is important for understanding gene regulation. Here we describe a&#160;genomic mapping method that treats chromatin-immunoprecipitated DNA with exonuclease digestion (ChIP-exo) followed by high-throughput sequencing. This method detects protein-DNA interactions with near base-pair mapping resolution and high signal-to-noise ratio in mammalian neurons.

מיפוי ברזולוציה גבוהה של אינטראקציות חלבון-DNA בתאי גזע עכבר נוירונים באמצעות כרומטין Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

Identification of specific protein-DNA interactions on the genome is important for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation coupled ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This technique has been widely exploited in tissue culture cells, and to a lesser extent, in primary tissue. The application of ChIP to rodent embryonic tissue, especially at early times of development, is complicated by the limited amount of tissue and the heterogeneity of cell and tissue types in the embryo. Here we present a method to perform ChIP using a dissociated embryonic day 8.5 (E8.5) embryo. Sheared chromatin from a single E8.5 embryo can be divided into up to five aliquots, which allows the investigator sufficient material for controls and for investigation of specific protein:chromatin interactions.
We have utilized this technique to begin to document protein:chromatin interactions during the specification of tissue-specific gene expression programs. The heterogeneity of cell types in an embryo necessarily restricts the application of this technique because the result is the detection of protein:chromatin interactions without distinguishing whether the interactions occur in all, a subset of, or a single cell type(s). However, examination of tissue-specific genes during or following the onset of tissue-specific gene expression is feasible for two reasons. First, immunoprecipitation of tissue specific factors necessarily isolates chromatin from the cell type where the factor is expressed. Second, immunoprecipitation of coactivators and histones containing post-translational modifications that are associated with gene activation should only be found at genes and gene regulatory sequences in the cell type where the gene is being or has been activated. The technique should be applicable to the study of most tissue-specific gene activation events.
In the example described below, we utilized E8.5 and E9.5 mouse embryos to examine factor binding at a skeletal muscle specific gene promoter. Somites, which are the precursor tissues from which the skeletal muscles of the trunk and limbs will form, are present at E8.5-9.54,5. Myogenin is a regulatory factor required for skeletal muscle differentiation 6-9. The data demonstrate that myogenin is associated with its own promoter in E8.5 and E9.5 embryos. Because myogenin is only expressed in somites at this stage of development 6,10, the data indicate that myogenin interactions with its own promoter have already occurred in skeletal muscle precursor cells in E8.5 embryos.

We demonstrate a chromatin immunoprecipitation (ChIP) method to identify factor interactions at tissue-specific genes during or after the onset of tissue-specific gene expression in mouse embryonic tissue. This protocol should be widely applicable for the study of tissue-specific gene activation as it occurs during normal embryonic development.

הכרומטין Assay immunoprecipitation עבור גנים ספציפיים רקמות באמצעות שלבים מוקדמים של עוברי עכברים

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used method for determining the interactions of different proteins with DNA in chromatin of living cells. Examples include sequence-specific DNA binding transcription factors, histones and their different modification states, enzymes such as RNA polymerases and ancillary factors, and DNA repair components. Despite its ubiquity, there is a lack of up-to-date, detailed methodologies for both bench preparation of material and for accurate analysis allowing quantitative metrics of interaction. Due to this lack of information, and also because, like any immunoprecipitation, conditions must be re-optimized for new sets of experimental conditions, the ChIP assay is susceptible to inaccurate or poorly quantitative results.
Our protocol is ultimately derived from seminal work on transcription factor:DNA interactions1,2 , but incorporates a number of improvements to sensitivity and reproducibility for difficult-to-obtain cell types. The protocol has been used successfully3,4 , both using qPCR to quantify DNA enrichment, or using a semi-quantitative variant of the below protocol.
This quantitative analysis of PCR-amplified material is performed computationally, and represents a limiting factor in the assay. Important controls and other considerations include the use of an isotype-matched antibody, as well as evaluation of a control region of genomic DNA, such as an intergenic region predicted not to be bound by the protein under study (or anticipated not to show changes under the experimental conditions). In addition, a standard curve of input material for every ChIP sample is used to derive absolute levels of enrichment in the experimental material. Use of standard curves helps to take into account differences between primer sets, regardless of how carefully they are designed, and also efficiency differences throughout the range of template concentrations for a single primer set. Our protocol is different from others that are available5-8 in that we extensively cover the later, analysis phase.

We describe a robust method for chromatin immunoprecipitation using primary T cells. The method is founded on standard approaches, but uses a specific set of conditions and reagents that improve efficiency for limited a quantities of cells. Importantly, a detailed description of the data analysis phase is presented.

הכרומטין immunoprecipitation יעיל באמצעות כמויות מגבילות של ביומסה

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological functions have been extensively studied. Indeed, the advent of next-generation deep sequencing and chromatin immunoprecipitation (ChIP) via specific histone modification antibodies has revolutionized our view of epigenetic regulation across the genome. Conversely, tissues typically consist of diverse cell types, and their complex mixture poses analytic challenges to investigating the epigenome in a particular cell type. To address the cell type-specific chromatin state in a genome-wide manner, we recently developed tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq), which is based on the selective purification of chromatin by tagged core histone proteins from cell types of interest, followed by ChIP-Seq. The goal of this protocol is the introduction of best practices of tChIP-Seq. This technique provides a versatile tool for tissue-specific epigenome investigation in diverse histone modifications and model organisms.

We describe a step-by-step protocol for tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) that enables the analysis of cell-type-specific genome-wide histone modification.

TChIP-Seq: יצירת פרופילים ייחודיים לסוג התא Epigenome

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

Chromatin Extraction from Frozen Chimeric Liver Tissue for Chromatin Immunoprecipitation Analysis

Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) is a widely used technique to assess levels of histone marks and occupancy of transcription factors on host and/or pathogen chromatin. Chromatin preparation from tissues creates additional challenges that need to be overcome to obtain reproducible and reliable protocols comparable to those used for cell culture. Tissue disruption and fixation are critical steps to achieve efficient shearing of chromatin. Coexistence of different cell types and clusters may also require different shearing times to reach optimal fragment size and hinders shearing reproducibility. The purpose of this method is to achieve reliable and reproducible host chromatin preparations from frozen tissue (liver) suitable for both ChIP-qPCR and next generation sequencing (NGS) applications. We observed that the combination of liquid nitrogen tissue pulverization followed by homogenization leads to increased reproducibility compared to homogenization only, since it provides a suspension consisting mostly of dissociated single cells that can be efficiently sheared. Moreover, the fixation step should be performed under mild rotation to provide homogeneous crosslinking. The fixed material is then suitable for buffer-based nuclei isolation, to reduce contamination of cytoplasmic protein and pathogen DNAs and RNAs (when applicable), avoiding time-consuming centrifugation gradients. Subsequent sonication will complete nuclear lysis and shear the chromatin, producing a specific size range according to the chosen shearing conditions. The size range should fall between 100 and 300 nt for NGS applications, while it could be higher (300-700 nt) for ChIP-qPCR analysis. Such protocol adaptations can greatly improve chromatin analyses from frozen tissue specimens.

This protocol focuses on chromatin preparation from snap frozen tissues and it is suitable for Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) followed by either quantitative PCR analysis (X-ChIP-qPCR) or next generation sequencing approaches (X-ChIP-seq).

מיצוי כרומטין מרקמת כבד כימרית קפואה לניתוח משקעים חיסוניים של כרומטין

Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) is a widely used technique to assess levels of histone marks and occupancy of transcription factors on ...

Chromatin Immunoprecipitation

Histones are proteins that help organize DNA in eukaryotic nuclei by serving as &#8220;scaffolds&#8221; around which DNA can be wrapped, forming a complex called &#8220;chromatin&#8221;. These proteins can be modified through the addition of chemical groups, and these changes affect gene expression. Researchers use a technique called chromatin immunoprecipitation (ChIP) to better understand which DNA regions associate with specific histone modifications or other gene regulatory proteins. Antibodies are used to isolate the protein of interest, and the bound DNA is extracted for analysis. Here, JoVE presents the principles behind ChIP, discussing specific histone modifications and their relationship to gene expression and DNA organization. We then review how to perform a ChIP protocol, and explore the ways scientists are currently using this technique.

כרומטין אימונופרציפיטציה

Histones are proteins that help organize DNA in eukaryotic nuclei by serving as &#8220;scaffolds&#8221; around which DNA can be wrapped, forming a complex ...