Name: analysis of the c-kit ligand promoter using chromatin immunoprecipitation
Uploaded: 2017-06-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation at JoVE.com

Bu çalışma, Texas Üniversitesi MD Anderson Kanser Merkezi, Houston, TX (başlangıç ​​fonları, BB) tarafından desteklenmiştir.

1. Çözümlerin Hazırlanması <ol><li> Her bir deney için aşağıdaki çözeltileri hazırlayın. <ol><li> Sabitleme çözümü için % 37 formaldehit hazırlayın ve oda sıcaklığında saklayın. 1X Fosfat Tamponlu Tuz (PBS) içinde% 1.42&#39;lik bir nihai konsantrasyona kadar seyreltin. DİKKAT: Formaldehit tahriş edici, aşındırıcı, mutajenik, teratojenik ve kanserojen olarak sınıflandırılmıştır. Beslenmeyin. Gaz / duman / buhar / sprey solumayın. Havalandırmanın yetersiz olduğu durumda solunumla ilgili uygun ekipman giyin. Deri ve gözlerle temasından kaçınınız. Oksitleyici maddeler, indirgeyici maddeler, asitler, alkaliler ve nem gibi bağdaşmayan maddelerden uzak tutun. </li><li> Glisin durdurma çözeltisi çözeltisi için, 1x PBS solüsyonunda 0.125 M glisin hazırlayın ve oda sıcaklığında saklayın. </li><li> Hücre sıyırma çözeltisi için, dH20 içerisinde 1x PBS solüsyonu hazırlayın ve buz üzerinde saklayın. Kullanımdan hemen önce, proteinaz inhibitörü fenilmetilsülfonil fluorür (PMSF) t0.5 mM nihai konsantrasyon. DİKKAT: PMSF aşındırıcı ve toksik olarak sınıflandırılmıştır; Koruyucu giysiler giyin ve havalandırılan bir alanda kullanın. </li><li> Doğrudan hücre liziz tamponunu (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 85 mM KCI ve% 0.5 NP40) kullanmadan önce, 1X Proteaz İnhibitörü Kokteyl (PIC; dimetil sülfoksitte 100X stok solüsyonu (DMSO): 104 mM 4- 2-aminoetil) benzensülfonil fluorür hidroklorid (AEBSF), 80 uM aprotinin, 4 mM enzatin, 1.4 mM E-64, 2 mM leupeptin ve 1.5 mM pepstatin A) ve 0.5 mM PMSF. </li><li> Çekirdek liziz tamponunu (50 mM Tris-Cl, pH 8.0, 10 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ve% 1 SDS) kullanmadan önce doğrudan 1X PIC ve 0.5 mM PMSF ilave edin. </li></ol></li></ol> 2. Hücre Tespiti ve Kesme <ol><li> 10 cm doku kültürü plakaları üzerinde 70-80% konfluansa hücreleri büyütün. Hücreleri deneysel amaçlar doğrultusunda uyarırlar. </li><li> Doku kültürü ortamı çıkarın, 5 mL sabitleme solüsyonu ekleyin ve inkübe edin.Hücreleri titreşimli bir platformda oda sıcaklığında 10 dakika bekletin. </li><li> Sabitleme çözeltisini çıkarın ve hücreleri 10 mL buz soğukluğunda 1x PBS ile iki kez yıkayın. </li><li> 1x PBS&#39;yi çıkarın, 5 mL glisin durdurma çözeltisi ilave edin ve hücreleri sallanan bir platformda oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Glisin stop-fix çözeltisini çıkarıp hücreleri 10 mL buz soğukluğunda 1x PBS ile iki kez yıkayın. </li><li> 1x PBS&#39;yi çıkarın, 2 mL hücre kazıma çözeltisi ekleyin ve hücreleri bir kazıyıcı kullanarak hasat edin. Hasat edilen hücreleri buz üzerinde konik bir tüpe aktarın. </li><li> Örnekleri 600 xg ve 4 ° C&#39;de 10 dakika santrifüjleyin. </li><li> Süpernatantı çıkarın, pelleti 1 mL&#39;lik 1X hücre liziz tamponunda tekrar süspansiyon haline getirin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Alternatif olarak, pelet sıvıyı sıvı nitrojende hızlı bir şekilde dondurun ve -80 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Pellet hücre liziz tamponunda bir kez yeniden süspansiyon haline getirildiğinde, hücre süspansiyonunu buz gibi dounce homojenleştiriciye aktarın ve bir B tipi böcek kullanarak 10 vuruş boyunca atınE hücre parçalanması için. </li><li> Hücre süspansiyonunu bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 2,400 xg ve 4 ° C&#39;de 10 dakika santrifüjleyin. </li><li> Süpernatantı atın, 350 uL çekirdek sindirim tamponunda pellatı tekrar süspanse edin ve 37 ° C&#39;de 5 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Mikrokakal nükleaz (1 U / μL) ekleyin ve vorteksleme ile karıştırın. Numuneleri 37 ° C&#39;de 5-20 dakika inkübe edin; Numuneleri her 2 dakikada bir ters çevirerek karıştırın. NOT: Zaman ve enzim konsantrasyonu hücre çizgileri arasında farklıdır ve optimal olmayan enzimatik kesme durumunda optimizasyon gerektirebilir. </li><li> Alternatif olarak, piyasada bulunan sonikatörler kullanılarak sonikasyon ile kromatin makaslama elde edin. NOT: Sonication koşulları optimizasyon gerektirir. 300 uL&#39;lik bir örnek hacmi ve% 25&#39;lik bir örnek işleme gücü kullanılarak bir optimizasyon örnek protokolü aşağıda sağlanmaktadır. <ol><li> Adım 2.10&#39;ın ardından süpernatanı atın ve n&#39;yi tekrar süspanse edin1,0 mL ticari yılan tamponunda nükleer pellet. </li><li> Üç 1.7 mL mikrosantrifüj tübüne tekrar süspansiyon haline getirilmiş nükleer pelletden 300 uL alikot altına alın. Onları buz koyun. </li><li> Optimum sonikasyon koşullarını belirlemek için sabit renk kromatininin 3 kısımlarını% 25&#39;lik bir güçle 3 farklı koşul kullanarak kesilin: Her bir darbe arasında buz üzerinde 30 saniye dinlenme ile 20 sn&#39;lik 5 puls. Her puls arasında 10 saniye, buzda 30 saniye dinlenme. 20 puls, her biri 20 s, her nabız arasında buz üzerinde 30 s dinlenme ile. </li><li> Aşağıda özetlenen şekilde Adım 2.15 ile devam edin. </li></ol></li><li> Mikrokokal nükleaz ile kuluçkadan sonra reaksiyonu durdurmak için 7 uL buz soğukluğunda 0,5 M EDTA ilave edin. </li><li> Numuneleri kesilmiş DNA ile 16,200 xg ve 4 ° C&#39;de 10 dakika santrifüjleyin. </li><li> Kesilmiş DNA içeren süpernatanı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Onaylamak için ayrı bir mikrosantrifüj tüpüne 50 uL&#39;lik kısım ilave edinDNA&#39;nın ccessful makaslama (bölüm 3). İmmünopresipitasyon için hemen geri kalan hacmi kullanın (bölüm 4) veya -80 ° C&#39;de saklayın. </li></ol> 3. Kesme Verimliliğinin Doğrulanması <ol><li> Adım 2.16&#39;dan kesilmiş kromatin 50 mcL&#39;ye bölünene, 150 uL nükleazsız dH2O ve 10 uL 5 M NaCl ekleyin. </li><li> Çapraz bağları tersine çevirmek için numuneleri 65 ° C&#39;de 4 saat inkübe edin. </li><li> 2 μL RNase A (10 μg / μL) ekleyin ve numuneleri 37 ° C&#39;de 15 dakika inkübe edin. </li><li> 10 μL proteinaz K (0.5 μg / μL) ekleyin ve numuneleri 42 ° C&#39;de 90 dakika inkübe edin. </li><li> DNA&#39;nın saflaştırılması için bir fenol / kloroform ekstraksiyonu yapın 12 . <ol><li> 200 uL&#39;lik nihai bir hacme kadar nükleaz içermeyen su ekleyin. 200 μL fenol: kloroform: izoamil alkol (25: 24: 1) numuneye ekleyin ve 20 saniye vorteks ekleyin. </li><li> Oda sıcaklığında santrifüjleyin16.000 x g&#39;de 5 dakika süreyle kullanılır. Dikkatle üst sulu fazı çıkarın ve yeni bir tüpe aktarın. Pipetleme sırasında herhangi bir fenol taşımamaya dikkat edin. </li><li> 0.1 hacim 3 M sodyum asetat (NH4OAc), pH 5.2 ilave edin ve tüpü bir parmakla birkaç kez hafifçe vurarak karıştırın. 2.5 hacim buz soğukluğunda% 100 etanol ilave edin ve 5 saniye vorteksleyerek karıştırın. Örnek O / N&#39;yi -20 ° C&#39;de veya en az 1 saat süreyle -80 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> CDNA pelet için 4 ° C ve 16.000 xg&#39;de 30 dakika için numune santrifüjleyin. </li><li> Peleti bozmadan süpernatanı dikkatlice çıkarın. 1 mL RT,% 70 etanol ekleyin ve tüpü birkaç kez ters çevirin. </li><li> Numuneyi 4 ° C&#39;de ve 16.000 x g&#39;de 2 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice çıkarın. </li><li> Pelleti oda sıcaklığında 5-10 dakika boyunca kurutun. Pelleti 30 uL dH2O içinde tekrar süspanse edin. </li></ol></li><li> % 1 TAE ile jel elektroforezi için saflaştırılmış DNA&#39;nın 5 ve 10 uL&#39;lik kısımlarını kullanınAgaroz jeli. NOT: Başarılı bir kromatin makaslama, 200-1,500 bp&#39;lik DNA örüntüsü ile sonuçlanır. Kesme başarısız olursa, kesme aşamasının (aşama 2.12) inkübasyon süresini 5, 10 ve 15 dakika olarak değiştirerek, spesifik hücreler için optimum kesme koşullarını belirleyin. </li><li> Numunenin DNA konsantrasyonunu analiz etmek için kalan numuneyi kullanın. Kesilmiş kromatin örneğinde DNA konsantrasyonunu ters hesaplayın (basamak 2.16); Her bir tedavi grubu için immüno çökeltme için aynı DNA miktarlarını kullanın (bölüm 4). </li></ol> 4. İmmunopresipitasyon <ol><li> 25 μL ChIP dereceli protein G manyetik boncuklar, 10 μL immüno-çöktürme seyreltme tamponu (stok çözeltisi:% 0.01 SDS,% 1.1 Triton X-100, 16.7 mM) ile 10-25 μg kesilmiş, çapraz bağlanmış kromatin birleştirin (adım 2.16) Tris-HC1, pH 8.0, 1.2 mM EDTA ve 167 mM NaCl) ve 1 uL PIC. </li><li> 4 saat inkübasyondan sonra, 1-10 μg antikor (antikor konsantratıAntikorun afinitesine bağlı olarak değişecektir; Başlangıçta üretici önerileri uyarınca kullanılmalı ve gerekliyse deneysel olarak optimize edilmelidir) 1.5 mL&#39;lik bir mikrosantrifüj tüpüne uygulandı ve 100 uL&#39;lik bir son hacme dH20 eklendi. NOT: Yukarıda tarif edilen direkt immünopresipitasyon yöntemi yerine dolaylı immüno-çöktürme yöntemi, önce kromatin ile antikorları birleştirip daha sonra protein G manyetik boncuk ekleyerek kullanılabilir. </li><li> 4-12 saat boyunca 4 ° C&#39;de örnekleri uçtan uca bir rotatöre inkübe edin. </li></ol> 5. Elüsyon <ol><li> Tüpleri manyetik bir stand üzerine yerleştirin. Manyetik boncuklar tüpün yan tarafında biriktikçe, süpernatanı dikkatlice çıkarın ve atın. </li><li> Boncukları üç kez 800 μL yıkama tamponu 1 (% 0.1 SDS,% 1 Triton X-100, 2 mM EDTA pH 8, 20 mM Tris-HCl, pH 8 ve 150 mM NaCl) ile yıkayın; Tüp birkaç kez ters çevirerek karıştırın. Tüpü manyetik aya yerleştirin a.Manyetik boncuklar tüpün yan tarafında biriktikten sonra yıkama tamponunu dikkatlice çıkarın ve atın. </li><li> Boncukları bir kez 800 μL yıkama tamponu 2 (% 0.1 SDS,% 1 Triton X-100, 2 mM EDTA; pH 8, 20 mM Tris-HCI pH 8 ve 500 mM NaCl) ile yıkayın; Tüp birkaç kez ters çevirerek karıştırın. Tüpü manyetik standa yerleştirin ve manyetik boncuklar tüpün yan tarafında biriktikten sonra yıkama tamponunu dikkatlice çıkarın ve atın. </li><li> 50 μL elüsyon tamponu (% 1 SDS ve 100 mM NaHCO 3 ) içindeki boncukları tekrar süspansiyon haline getirin ve örnekleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca bir uçtan uca rotatörde inkübe edin. </li><li> Tüpleri manyetik bir stand üzerine yerleştirin ve manyetik boncuklar tüpün yanına bir kere toplandıktan sonra süpernatanı yeni bir tüpe aktarın. </li><li> Çapraz bağlanmayı tersine çevirmek için 6 μL 5 M NaCl ve 2 μL proteinaz K (0.5 μg / μL) ekleyin. Numuneleri karıştırdıktan sonra, numuneleri 2 saat 65 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> DNA&#39;nın saflaştırılması için bir phe gerçekleştirinNol / kloroform ekstraksiyonu 12 (adım 3,5) ve daha sonra peleti 30 uL dH20 ile tekrar süspanse edin. NOT: Numuneler, protein bağlama alanları için doğrudan analiz edilebilir (bölüm 5) veya -20 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol> 6. Bağlanma Sahası Analizi <ol><li> PCR veya qRT-PCR kullanarak bilinen bir nükleik asit dizisi içindeki spesifik bağlanma alanları için bir analiz yapın. Primer tasarım için, geleneksel PCR veya qRT-PCR protokollerini uygulayın. İlgilenen protein bağlanma sitesini köprüleyen 150-400 bp&#39;lik bir amplifikatı sentezlemek için primerleri tasarlayın ( Şekil 1 ). </li><li> Spesifikliği sağlamak için dört farklı DNA şablonu kullanarak PCR ayarlayın: i) ilgilenilen antikor ile immüno-çökeltilen immüno-çökelti ChIP&#39;den DNA, ii) spesifik olmayan bir IgG antikoru ile immüno-çöktürülmüş ChIP&#39;den DNA, iii) giriş DNA&#39;sı ve iv) H20 Kontaminasyonu dışarı atmak için PCR için negatif kontrol. Yol uyarma durumunda, Immüno çökeltilmiş proteinin bilinen bir bağlanma bölgesine özgü farklı primerler seti kullanılarak beşinci bir şablon seçin. NOT: c-KIT ligand yükseltici analizi durumunda, c-KIT ligand yükseltici bölgedeki SBE&#39;de TGF-β ile indüklenen SMAD bağlanmasını göstermek için klasik PCR kullanın. Pozitif bir kontrol olarak, TGF-β ile indüklenen SMAD bağlanmasının bilinen bir hedefi olarak plazminojen aktivatör inhibitörü-1 (PAI-1) üzerinde PCR gerçekleştirin. </li></ol>

<ol>
	<li>Brenowitz, M., Senear, D. F., Shea, M. A., Ackers, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+DNase+footprint+titration:+a+method+for+studying+protein-DNA+interactions.">Quantitative DNase footprint titration: a method for studying protein-DNA interactions.</a> Methods Enzymol. 130, 132-181 (1986).</li><li>Garner, M. M., Revzin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gel+electrophoresis+method+for+quantifying+the+binding+of+proteins+to+specific+DNA+regions:+application+to+components+of+the+Escherichia+coli+lactose+operon+regulatory+system.">A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system.</a> Nucleic Acids Res. 9 (13), 3047-3060 (1981).</li><li>Gilmour, D. S., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+protein-DNA+interactions+in+vivo:+distribution+of+RNA+polymerase+on+specific+bacterial+genes.">Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 81 (14), 4275-4279 (1984).</li><li>Gilmour, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lis+J.T.+In+vivo+interactions+of+RNA+polymerase+II+with+genes+of+Drosophila+melanogaster.">Lis J.T. In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster.</a> Mol Cell Biol. 5 (8), 2009-2018 (1985).</li><li>Mundade, R., Ozer, H. G., Wei, H., Prabhu, L., Lu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+ChIP-seq+in+the+discovery+of+transcription+factor+binding+sites,+differential+gene+regulation+mechanism,+epigenetic+marks+and+beyond.">Role of ChIP-seq in the discovery of transcription factor binding sites, differential gene regulation mechanism, epigenetic marks and beyond.</a> Cell Cycle. 13 (18), 2847-2852 (2014).</li><li>Mukhopadhyay, A., Deplancke, B., Walhout, A. J., Tissenbaum, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+(ChIP)+coupled+to+detection+by+quantitative+real-time+PCR+to+study+transcription+factor+binding+to+DNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Chromatin immunoprecipitation (ChIP) coupled to detection by quantitative real-time PCR to study transcription factor binding to DNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nat Protoc. 3 (4), 698-709 (2008).</li><li>Weinmann, A. S., Bartley, S. M., Zhang, T., Zhang, M. Q., Farnham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+chromatin+immunoprecipitation+to+clone+novel+E2F+target+promoters.">Use of chromatin immunoprecipitation to clone novel E2F target promoters.</a> Mol Cell Biol. 21 (20), 6820-6832 (2001).</li><li>Weinmann, A. S., Farnham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+unknown+target+genes+of+human+transcription+factors+using+chromatin+immunoprecipitation.">Identification of unknown target genes of human transcription factors using chromatin immunoprecipitation.</a> Methods. 26 (1), 37-47 (2002).</li><li>Weinmann, A. S., Yan, P. S., Oberley, M. J., Huang, T. H., Farnham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+human+transcription+factor+targets+by+coupling+chromatin+immunoprecipitation+and+CpG+island+microarray+analysis.">Isolating human transcription factor targets by coupling chromatin immunoprecipitation and CpG island microarray analysis.</a> GenesDev. 16 (2), 235-244 (2002).</li><li>Massague, J., Seoane, J., Wotton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smad+transcription+factors.">Smad transcription factors.</a> Genes Dev. 19 (23), 2783-2810 (2005).</li><li>Rojas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Positive+TGF-beta/c-KIT+Feedback+Loop+Drives+Tumor+Progression+in+Advanced+Primary+Liver+Cancer.">A Positive TGF-beta/c-KIT Feedback Loop Drives Tumor Progression in Advanced Primary Liver Cancer.</a> Neoplasia. 18 (6), 371-386 (2016).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+nucleic+acids+by+extraction+with+phenol:chloroform.">Purification of nucleic acids by extraction with phenol:chloroform.</a> CSH Protoc. 2006 (1), (2006).</li><li>Dennler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+binding+of+Smad3+and+Smad4+to+critical+TGF+beta-inducible+elements+in+the+promoter+of+human+plasminogen+activator+inhibitor-type+1+gene.">Direct binding of Smad3 and Smad4 to critical TGF beta-inducible elements in the promoter of human plasminogen activator inhibitor-type 1 gene.</a> EMBO J. 17 (11), 3091-3100 (1998).</li><li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+Smad+MH1+domain+bound+to+DNA:+insights+on+DNA+binding+in+TGF-beta+signaling.">Crystal structure of a Smad MH1 domain bound to DNA: insights on DNA binding in TGF-beta signaling.</a> Cell. 94 (5), 585-594 (1998).</li><li>Seidel, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spacing+of+palindromic+half+sites+as+a+determinant+of+selective+STAT+(signal+transducers+and+activators+of+transcription)+DNA+binding+and+transcriptional+activity.">Spacing of palindromic half sites as a determinant of selective STAT (signal transducers and activators of transcription) DNA binding and transcriptional activity.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 92 (7), 3041-3045 (1995).</li><li>Nelson, J. D., Denisenko, O., Bomsztyk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+the+fast+chromatin+immunoprecipitation+(ChIP)+method.">Protocol for the fast chromatin immunoprecipitation (ChIP) method.</a> Nat Protoc. 1 (1), 179-185 (2006).</li><li>Tian, B., Yang, J., Brasier, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+cross-linking+for+analysis+of+protein-chromatin+interactions.">Two-step cross-linking for analysis of protein-chromatin interactions.</a> Methods Mol Biol. 809, 105-120 (2012).</li><li>O'Neill, L. P., Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoprecipitation+of+native+chromatin:+NChIP.">Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP.</a> Methods. 31 (1), 76-82 (2003).</li><li>Horz, W., Altenburger, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+specific+cleavage+of+DNA+by+micrococcal+nuclease.">Sequence specific cleavage of DNA by micrococcal nuclease.</a> Nucleic Acids Res. 9 (12), 2643-2658 (1981).</li><li>Chung, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+micrococcal+nuclease+digestion+on+nucleosome+positioning+data.">The effect of micrococcal nuclease digestion on nucleosome positioning data.</a> PLoS One. 5 (12), 15754 (2010).</li></ol>

Yazarlar rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ettiler.

Bu raporda SMAD2&#39;nin c-KIT ligand yükselticisindeki bir SBE&#39;ye TGF-β1 ile indüklenen bağlanmasını ve STAT3&#39;ün TGF-β1 ligand geni içindeki tanıma dizisine TGF-β1 ile indüklenen bağlanmasını gösteriyoruz. Kromatin immüno çökeltme yöntemini kullanarak her iki transkripsiyon faktörünün sitokinle indüklenen bağlanmasını gösteriyoruz. Kromatin immüno çökeltme, bir proteinin DNA&#39;ya doğrudan bağlanmasını, protein ile DNA&#39;nın bağlanmasını sa?...

Ökaryotların çekirdeğinde DNA, histon proteinleri ve histolojik olmayan proteinler ile etkileşime girer ve kromatine yoğunlaştırılır. Fizyolojik, patofizyolojik ve hücre biyolojik bağlamında, hücresel fonksiyonlar mekansal olarak ve geçici olarak kromatin koordine edilmiş gen ifadesi ile kontrol edilir. DNA-protein etkileşimleri, DNA replikasyonu, rekombinasyon ve tamir gibi hücresel süreçlerin düzenlenmesinde ve protein ekspresyonunda önemli bir role sahiptir. Bu nedenle, DNA-protein etkileşimlerinin analizi, gen ekspresyonunun ve hücre fonksiyonunun değerlendirilmesinde vazgeçilmez bir araçtır. Elektroforez (jel) Hareketlilik Kaydırma Testi (EMSA) ve DNase I ayak izi 1 , 2 gibi in vitro DNA-protein etkileşimlerini değerlendirmek için çeşitli teknikler mevcuttur. Bununla birlikte, bu teknikler, kromatin ve hücresel bağlamda protein-DNA etkileşimini analiz etmez. ChIP iSa tekniği, spesifik DNA bağlama alanlarına bağlı proteinleri yakalar ve böylece kromatin bağlamında DNA-protein etkileşimlerinin tanımlanmasını kolaylaştırır. Bu teknik esas olarak Gimour ve Lis tarafından, Escherichia coli ve Drosophila melanogaster 3 , 4&#39;te spesifik genlere RNA polimeraz II&#39;nin bağlanmasının değerlendirilmesi için geliştirildi. DNA-protein komplekslerinin sabitlenmesiyle, bunu takiben kromatin ekstraksiyonu yapılarak DNA&#39;nın ~ 200 baz çifti (bp) parçalara kesilmesi ile yapılır. Daha sonra, ilgili DNA&#39;ya bağlı protein immüno çökeltme ile izole edilir. DNA-protein çapraz bağlantının tersine çevrilmesinden sonra, DNA arıtılır ve analiz edilir. Protein bağlama bölgelerinin analizi için çeşitli yöntemler kullanılabilir ve hedef gen 5 içindeki protein bağlama alanının nükleik asit dizisine bağlıdır. DNA dizisinin bilinmesi durumunda, standart PolYmeraz Zincir Reaksiyonları (PCR), bilinen bağlama alanına bitişik spesifik primer çiftleri kullanılarak uygulanabilir. Kantitatif Gerçek Zamanlı PCR (qRT-PCR) de kullanılabilir 6 . Dizinin bilinmediği durumlarda, ChIP, DNA mikrodizileri (ChIP-on-chip), DNA dizilimi (ChIP-seq) veya klonlama teknikleri 7 , 8 , 9 ile birleştirilebilir . TGF-β yolu güçlü tümör baskılayıcı işlevlere sahiptir ve hücre farklılaşmasında önemli bir yol oluşturmaktadır. TGF-β1 ligandının kognat reseptör kompleksine bağlanması yoluyla aktive edilir ve SMAD2 / 3 transkripsiyon faktörlerinin serin fosforilasyonuna neden olur. Ortak mediyatör olan SMAD4 ile olan ilişkisini takiben, SMAD kompleksi çekirdeğe translokasyon yapar ve hedef genlerin promotörü bölgesi içinde SBE&#39;ye bağlanır ve burada hücre döngüsü, apoptoz ve hücre farklılaşmasını kontrol eden genleri düzenlerüzerinde. TGF-β stimülasyonuna transkripsiyonel yanıt hücre tipi ve bağlam-spesifik 10&#39;dur . Son zamanlarda, TGF-β ve c-KIT yolu arasında olumlu bir geri besleme döngüsü tanımladık 11 . Bu modelde, TGF-β1 ile aktive olan SMAD2, c-KIT ligand yükselticisine bağlanır ve ekspresyonunu ve sekresyonunu indükler. Daha sonra, c-KIT ligandı, c-KIT reseptörünü otomatik ve para-kreynik biçimde aktive eder. C-KIT reseptör aktivasyonu, JAK1 / 2 yoluyla STAT3 Tyr 705 fosforilasyonuna neden olur. STAT3-aktivasyonu ve nükleer translokasyonu takiben STAT3, TGF-β1 ligand genine bağlanır ve ekspresyonunu düzenler. Burada SMAD2&#39;nin c-KIT reseptör ligand yükselticisine bağlanması ve Sinyal Transdüseri (ve) Aktivatörün (Transkripsiyon 3) (STAT3&#39;in TGF-β1&#39;e bağlanması) tanımlanması için ChIP analizinin temel rolünü gösteriyoruz gen).

<table><tbody><tr><td>HepG2 cells</td><td>ATCC</td><td>HB-8065</td><td></td></tr><tr><td>Hep3B cells</td><td>ATCC</td><td>HB-8064</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&amp;beta;1</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>101-B1</td><td>Used at a concentration of 10 ng/mL</td></tr><tr><td>Anti-SMAD2 antibody</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>5339</td><td>Amount used/IP: 3 &amp;micro;g</td></tr><tr><td>Anti-STAT3 antibody</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>4904</td><td>Amount used/IP: 3 &amp;micro;g</td></tr><tr><td>ChIP-IT Protein G Magnetic Beads</td><td>Active Motif</td><td>53033</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Active Motif</td><td>37490</td><td></td></tr><tr><td>Micrococcal Nuclease</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>10011</td><td></td></tr><tr><td>PCR forward primer: PAI-1</td><td></td><td></td><td>Sequence: 5&amp;rsquo;-GGAAGAGGATAAAGGACAAGCTG-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>PCR reverse primer: PAI-1</td><td></td><td></td><td>Sequence: 5&amp;rsquo;-TGCAGCCAGCCACGTGATTGTC-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>PCR forward primer: SCF</td><td></td><td></td><td>Sequence: 5&amp;rsquo;-CACTGATGTTAATGTTCAGC-3&amp;rsquo;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PCR reverse primer: SCF</td><td></td><td></td><td>Sequence: 5&amp;rsquo;-GCTCTAATTTAAACCTGGAGC-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>PCR forward primer: TGF-&amp;beta;1 (STB-1)</td><td></td><td></td><td>Sequence: 5&amp;rsquo;-GAGAGAGACGTGAGTGGCATGTT-3&amp;rsquo;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PCR reverse primer: TGF-&amp;beta;1 (STB-1)</td><td></td><td></td><td>Sequence: 5&amp;rsquo;-TAGCTTTCTCTGCCTTGGTCTCCCC-3&amp;rsquo;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PCR forward primer: TGF-&amp;beta;1 (STB-2)</td><td></td><td></td><td>Sequence: 5&amp;rsquo;-GTACTGGGGGAGGAGCGGCATC-3&amp;rsquo;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PCR reverse primer: TGF-&amp;beta;1 (STB-2)</td><td></td><td></td><td>Sequence: 5&amp;rsquo;-TGCCACTGTCTGGAGAGAGGTGTGTC-3&amp;rsquo;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

analysis of the c-kit ligand promoter using chromatin immunoprecipitation

DNA replikasyonu ve onarımı, DNA rekombinasyonu ve gen ekspresyonu dahil olmak üzere çoklu hücresel süreçler, proteinler ve DNA arasında etkileşim gerektirir. Bu nedenle, DNA-protein etkileşimleri, hücre farklılaşması, hücre proliferasyonu, hücre döngüsü kontrolü, kromozom stabilitesi, epigenetik gen düzenlenmesi ve hücre dönüşümü gibi çoklu fizyolojik, patofizyolojik ve biyolojik fonksiyonları düzenler. Ökaryotik hücrelerde DNA, histon ve histokonsuz proteinler ile etkileşime girer ve kromatine yoğunlaştırılır. Elektroforez (jel) Hareketlilik Kaydırma Deneyi (EMSA) ve DNase I ayak izi gibi DNA-protein etkileşimlerini analiz etmek için çeşitli teknik araçlar kullanılabilir. Bununla birlikte, bu teknikler protein-DNA etkileşimini in vitro olarak analiz eder, hücresel bağlam içinde değil. Kromatin immüno çökeltme (ChIP), proteinleri belirli DNA bağlama bölgelerinde yakalayan ve böylece DNA-protein etkileşimini tanımlayan bir tekniktirOnların kromatin bağlamı içinde. DNA-protein etkileşiminin sabitlenmesiyle, ardından ilgilenilen proteinin immüno çökmesi ile yapılır. Daha sonra, proteinin bağlı olduğu genomik bölge karakterize edilir. Burada, ÇIP&#39;yi tarif eder ve tartışır ve transkripsiyon faktörü SMAD2&#39;nin Transforma Edici Büyüme Faktörü-β (TGF-β) ile indüklenmiş SMAD2&#39;nin tirozin-bağışıklık sisteminin promotör bölgesi içindeki SMAD Bağlama Elemanları&#39;na (SBE) bağlanmasının tanımlanması için analitik değerini gösteririz Protein kinaz Kiti (c-KIT) reseptör ligandı Kök Hücre Faktörü (SCF).

TGF-β1 ligandının aynı kökenli reseptör kompleksine bağlanması, SMAD2 / 3 transkripsiyon faktörlerinin serin fosforilasyonunu ve bunun ardından ortak mediatör SMAD4&#39;le birleşmesini sağlar. SMAD kompleksi çekirdeğe taşır. TGF-β gen transkripsiyonunu hedef genlerin düzenleyici bölgelerindeki SBE&#39;lere direkt olarak SMAD ile bağlanarak veya dolaylı olarak ilgilenilen genin ekspresyonunu düzenleyen transkripsiyonel aktivatörlerin veya baskılayıcıların SMAD ...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation at JoVE.com

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

DNA-protein etkileşimleri, çoklu biyolojik işlemler için gereklidir. Hücresel işlevlerin değerlendirilmesi sırasında, DNA-protein etkileşimlerinin analizi, gen düzenlemesinin anlaşılması için vazgeçilmezdir. Kromatin immüno çökeltme (ChIP), böyle etkileşimleri in vivo olarak analiz etmek için güçlü bir araçtır .

Kromatin İmmunopresipitasyon Yöntemi Kullanılarak c-KIT Ligand Promotör Analizi

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

analysis-c-kit-ligand-promoter-using-chromatin

Research

JoVE Journal

Genetics

7.7K Görüntüleme.  The University of Texas MD Anderson Cancer Center.  DNA-protein etkileşimleri, çoklu biyolojik işlemler için gereklidir. Hücresel işlevlerin değerlendirilmesi sırasında, DNA-protein etkileşimlerinin analizi, gen düzenlemesinin anlaşılması için vazgeçilmezdir. Kromatin immüno çökeltme (ChIP), böyle etkileşimleri in vivo olarak analiz etmek için güçlü bir araçtır . 

Video: Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational modifications (PTMs) of histone tails, the exchange of canonical histones with histone variants, and nucleosome eviction. Such regulation requires the binding of signal-sensitive transcription factors (TFs) that recruit chromatin-modifying enzymes at regulatory elements defined as enhancers. Understanding how signaling cascades regulate enhancer activity requires a comprehensive analysis of the binding of TFs, chromatin modifying enzymes, and the occupancy of specific histone marks and histone variants. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays utilize highly specific antibodies to immunoprecipitate specific protein/DNA complexes. The subsequent analysis of the purified DNA allows for the identification the region occupied by the protein recognized by the antibody. This work describes a protocol to efficiently perform ChIP of histone proteins in a mature mouse T-cell line. The presented protocol allows for the performance of ChIP assays in a reasonable timeframe and with high reproducibility.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

This work describes a protocol for chromatin immunoprecipitation (ChIP) using a mature mouse T-cell line. This protocol is suitable to investigate the distribution of specific histone marks at specific promoter sites or genome-wide.

Fare T-hücresi Hatlarında Kromatin İmmünopresipitasyonu (ChIP)

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

Genetik

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for example, during cellular differentiation, morphogenesis, and functional stimulation (such as activation of immune cells), or after exposure to drugs and other factors from the local environment. Depending on the stimulus and cell type, these changes occur rapidly and at any possible level of gene regulation. Displaying all molecular processes of a responding cell to a certain type of stimulus/drug is one of the hardest tasks in molecular biology. Here, we describe a protocol that enables the simultaneous analysis of multiple layers of gene regulation. We compare, in particular, transcription factor binding (Chromatin-immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq)), de novo transcription (4-thiouridine-sequencing (4sU-seq)), mRNA processing, and turnover as well as translation (ribosome profiling). By combining these methods, it is possible to display a detailed and genome-wide course of action.
Sequencing newly transcribed RNA is especially recommended when analyzing rapidly adapting or changing systems, since this depicts the transcriptional activity of all genes during the time of 4sU exposure (irrespective of whether they are up- or downregulated). The combinatorial use of total RNA-seq and ribosome profiling additionally allows the calculation of RNA turnover and translation rates. Bioinformatic analysis of high-throughput sequencing results allows for many means for analysis and interpretation of the data. The generated data also enables tracking co-transcriptional and alternative splicing, just to mention a few possible outcomes.
The combined approach described here can be applied for different model organisms or cell types, including primary cells. Furthermore, we provide detailed protocols for each method used, including quality controls, and discuss potential problems and pitfalls.

This protocol describes the combinatorial use of ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq, and ribosome profiling for cell lines and primary cells. It enables tracking changes in transcription-factor binding, de novo transcription, RNA processing, turnover and translation over time, and displaying the overall course of events in activated and/or rapidly changing cells.

Gerçek zamanlı analiz bağlama, transkripsiyon, çeviri ve ciro hücresel etkinleştirme sırasında küresel olayları görüntülemek üzere transkripsiyon faktörü

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the spatio-temporal expression of their target genes through physical contact, often bridging considerable (in some cases hundreds of kilobases) genomic distances and bypassing nearby genes. The human genome harbors an estimated one million enhancers, the vast majority of which have unknown gene targets. Assigning distal regulatory regions to their target genes is thus crucial to understand gene expression control. We developed Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) to enable the genome-wide detection of distal promoter-interacting regions (PIRs), for all promoters in a single experiment. In PCHi-C, highly complex Hi-C libraries are specifically enriched for promoter sequences through in-solution hybrid selection with thousands of biotinylated RNA baits complementary to the ends of all promoter-containing restriction fragments. The aim is to then pull-down promoter sequences and their frequent interaction partners such as enhancers and other potential regulatory elements. After high-throughput paired-end sequencing, a statistical test is applied to each promoter-ligated restriction fragment to identify significant PIRs at the restriction fragment level. We have used PCHi-C to generate an atlas of long-range promoter interactions in dozens of human and mouse cell types. These promoter interactome maps have contributed to a greater understanding of mammalian gene expression control by assigning putative regulatory regions to their target genes and revealing preferential spatial promoter-promoter interaction networks. This information also has high relevance to understanding human genetic disease and the identification of potential disease genes, by linking non-coding disease-associated sequence variants in or near control sequences to their target genes.

DNA regulatory elements, such as enhancers, control gene expression by physically contacting target gene promoters, often through long-range chromosomal interactions spanning large genomic distances. Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) identifies significant interactions between promoters and distal regions, enabling the assignment of potential regulatory sequences to their target genes.

Organizatörü yakalama Merhaba-C: Yüksek çözünürlüklü, genom çapında organizatörü etkileşimlerin profil oluşturma

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western countries. The majority of CLL patients show an indolent course of the disease as well as an anergic phenotype of their leukemia cells, referring to a B cell receptor unresponsive to external stimulation. We have recently shown that the transcription factor NFAT2 is a crucial regulator of anergy in CLL. A major challenge in the analysis of the role of a transcription factor in different diseases is the identification of its specific target genes. This is of&#160;great significance for the elucidation of pathogenetic mechanisms and potential therapeutic interventions. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a classic technique to demonstrate protein-DNA interactions and can, therefore, be used to identify direct target genes of transcription factors in mammalian cells. Here, ChIP was used to identify LCK as a direct target gene of NFAT2 in human CLL cells. DNA and associated proteins are crosslinked using formaldehyde and subsequently sheared by sonication into DNA fragments of approximately 200-500 base pairs (bp). Cross-linked DNA fragments associated with NFAT2 are then selectively immunoprecipitated from cell debris using an &#945;NFAT2 antibody. After purification, associated DNA fragments are detected via quantitative real-time PCR (qRT-PCR). DNA sequences with evident enrichment represent regions of the genome which are targeted by NFAT2 in vivo. Appropriate shearing of the DNA and the selection of the required antibody are particularly crucial for the successful application of this method. This protocol is ideal for the demonstration of direct interactions of NFAT2 with target genes. Its major limitation is the difficulty to employ ChIP in large-scale assays analyzing the target genes of multiple transcription factors in intact organisms.

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is the most common leukemia in the western world. NFAT transcription factors are important regulators of development and activation in numerous cell types. Here, we present a protocol for the use of chromatin immunoprecipitation (ChIP) in human CLL cells to identify novel target genes of NFAT2.

Roman NFAT2 hedef genleri kronik lenfositik lösemi olarak tanımlamak için bir kromatin Immunoprecipitation tahlil

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

Kanser Araştırmaları

Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors

Lysine acetyltransferases (KATs) catalyze acetylation of lysine residues on histones and other proteins to regulate chromatin dynamics and gene expression. KATs, such as CBP/p300, are under intense investigation as therapeutic targets due to their critical role in tumorigenesis of diverse cancers. The development of novel small molecule inhibitors targeting the histone acetyltransferase (HAT) function of KATs is challenging and requires robust assays that can validate the specificity and potency of potential inhibitors.
This article outlines a pipeline of three methods that provide rigorous in vitro validation for novel HAT inhibitors (HATi). These methods include a test tube HAT assay, Chromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI) assay, and Chromatin Immunoprecipitation-quantitative PCR (ChIP-qPCR). In the HAT assay, recombinant HATs are incubated with histones in a test tube reaction, allowing for acetylation of specific lysine residues on the histone tails. This reaction can be blocked by a HATi and the relative levels of site-specific histone acetylation can be measured via immunoblotting. Inhibitors identified in the HAT assay need to be confirmed in the cellular environment.
The ChHAI assay uses immunoblotting to screen for novel HATi that attenuate the robust hyperacetylation of histones induced by a histone deacetylase inhibitor (HDACi). The addition of an HDACi is helpful because basal levels of histone acetylation can be difficult to detect via immunoblotting.
The HAT and ChHAI assays measure global changes in histone acetylation, but do not provide information regarding acetylation at specific genomic regions. Therefore, ChIP-qPCR is used to investigate the effects of HATi on histone acetylation levels at gene regulatory elements. This is accomplished through selective immunoprecipitation of histone-DNA complexes and analysis of the purified DNA through qPCR. Together, these three assays allow for the careful validation of the specificity, potency, and mechanism of action of novel HATi.

Inhibitors of histone acetyltransferases (HATs, also known as lysine acetyltransferases), such as CBP/p300, are potential therapeutics for treating cancer. However, rigorous methods for validating these inhibitors are needed. Three in vitro methods for validation include HAT assays with recombinant acetyltransferases, immunoblotting for histone acetylation in cell culture, and ChIP-qPCR.

Histon Asetiltransferaz Inhibitörlerinin Doğrulanması için tahliller

Lysine acetyltransferases (KATs) catalyze acetylation of lysine residues on histones and other proteins to regulate chromatin dynamics and gene ...

Kıt Hücrelerde Promotör İnteraktomunu İncelemek İçin Kapsamlı Bir Yaklaşım

An Integrated Workflow to Study the Promoter-Centric Spatio-Temporal Genome Architecture in Scarce Cell Populations

Spatiotemporal gene transcription is tightly regulated by distal regulatory elements, such as enhancers and silencers, which rely on physical proximity with their target gene promoters to control transcription. Although these regulatory elements are easy to identify, their target genes are difficult to predict, since most of them are cell-type specific and may be separated by hundreds of kilobases in the linear genome sequence, skipping over other non-target genes. For several years, Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) has been the gold standard for the association of distal regulatory elements to their target genes. However, PCHi-C relies on the availability of millions of cells, prohibiting the study of rare cell populations such as those commonly obtained from primary tissues. To overcome this limitation, low input Capture Hi-C (liCHi-C), a cost-effective and customizable method to identify the repertoire of distal regulatory elements controlling each gene of the genome, has been developed. liCHi-C relies on a similar experimental and computational framework as PCHi-C, but by employing minimal tube changes, modifying&#160;the reagent concentration and volumes, and swapping or eliminating steps, it accounts&#160;for minimal material loss during library construction. Collectively, liCHi-C enables the study of gene regulation and spatiotemporal genome organization in the context of developmental biology and cellular function.

Yazar Spotlight: Kıt Hücre Popülasyonlarında Promoter Merkezli Uzay-Zamansal Genom Mimarisini İncelemek İçin Entegre Bir İş Akışı  

Gene expression is regulated by interactions of gene promoters with distal regulatory elements. Here, we descirbe how low input Capture Hi-C (liCHi-C) allows the identification of these interactions in rare cell types, which were previously unmeasurable.

Kıt hücre popülasyonlarında promotör merkezli uzaysal-zamansal genom mimarisini incelemek için entegre bir iş akışı

Spatiotemporal gene transcription is tightly regulated by distal regulatory elements, such as enhancers and silencers, which rely on physical proximity ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited from their latent state in the cytoplasm to cell surface receptors where they are activated by phosphorylation at a single tyrosine residue1. They then dimerize and translocate to the nucleus to drive the transcription of target genes, affecting growth, differentiation, homeostasis and the immune response. Not surprisingly, given their widespread involvement in normal cell processes, dysregulation of STAT function contributes to human disease, particularly to cancers2 and autoimmune diseases3. It is well established that transcription is regulated by alterations to the chromatin template4,5. These alterations include the activities of ATP-dependent complexes, as well as covalent histone modifications and DNA methylation6. Because STAT activation of gene expression is both rapid and transient, it requires specific mechanisms for modulating the chromatin template at STAT-dependent gene loci. To define these mechanisms, we characterize the histone modifications and the enzymatic activities that generate them at gene loci that respond to STAT signaling. This protocol describes chromatin immunoprecipitation, a method that is valuable for the study of STAT signaling to chromatin in activated gene expression.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

This protocol describes how chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used to study the dynamic alterations to the chromatin template that regulate transcription induced by a signal transduction pathway.

Kromatin Immunoprecipitation İnsan Hücrelerinde Aktif Gen İfadesi Testi Dinamik Histon Modifikasyon (ChIP)

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

Biyoloji

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the protein domains that bind to specific histone modifications. One such domain is the plant homeodomain (PHD), found in several chromatin-binding proteins. The epigenetic factor RBP2 has multiple PHD domains, however, they have different functions (Figure 4). In particular, the C-terminal PHD domain, found in a RBP2 oncogenic fusion in human leukemia, binds to trimethylated lysine 4 in histone H3 (H3K4me3)1. The transcript corresponding to the RBP2 isoform containing the C-terminal PHD accumulates during differentiation of promonocytic, lymphoma-derived, U937 cells into monocytes2. Consistent with both sets of data, genome-wide analysis showed that in differentiated U937 cells, the RBP2 protein gets localized to genomic regions highly enriched for H3K4me33. Localization of RBP2 to its targets correlates with a decrease in H3K4me3 due to RBP2 histone demethylase activity and a decrease in transcriptional activity. In contrast, two other PHDs of RBP2 are unable to bind H3K4me3. Notably, the C-terminal domain PHD of RBP2 is absent in the smaller RBP2 isoform4. It is conceivable that the small isoform of RBP2, which lacks interaction with H3K4me3, differs from the larger isoform in genomic location. The difference in genomic location of RBP2 isoforms may account for the observed diversity in RBP2 function. Specifically, RBP2 is a critical player in cellular differentiation mediated by the retinoblastoma protein (pRB). Consistent with these data, previous genome-wide analysis, without distinction between isoforms, identified two distinct groups of RBP2 target genes: 1) genes bound by RBP2 in a manner that is independent of differentiation; 2) genes bound by RBP2 in a differentiation-dependent manner.
To identify differences in localization between the isoforms we performed genome-wide location analysis by ChIP-Seq. Using antibodies that detect both RBP2 isoforms we have located all RBP2 targets. Additionally we have antibodies that only bind large, and not small RBP2 isoform (Figure 4). After identifying the large isoform targets, one can then subtract them from all RBP2 targets to reveal the targets of small isoform. These data show the contribution of chromatin-interacting domain in protein recruitment to its binding sites in the genome.

Here we are presenting a chromatin immunoprecipitation (ChIP) procedure for genome-wide location analysis of protein isoforms that differ in a histone-binding domain. We are applying it to ChIP-Seq analysis to identify the targets of the KDM5A/JARID1A/RBP2 histone demethylase.

Izoform özel Gen Hedefler Belirlemek için ChIP kullanarak genom analizi

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

Kromatin İmmunopresipitasyon Yöntemi Kullanılarak c-KIT Ligand Promotör Analizi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Fare T-hücresi Hatlarında Kromatin İmmünopresipitasyonu (ChIP)

Gerçek zamanlı analiz bağlama, transkripsiyon, çeviri ve ciro hücresel etkinleştirme sırasında küresel olayları görüntülemek üzere transkripsiyon faktörü

Organizatörü yakalama Merhaba-C: Yüksek çözünürlüklü, genom çapında organizatörü etkileşimlerin profil oluşturma

Roman NFAT2 hedef genleri kronik lenfositik lösemi olarak tanımlamak için bir kromatin Immunoprecipitation tahlil

Histon Asetiltransferaz Inhibitörlerinin Doğrulanması için tahliller

Kıt hücre popülasyonlarında promotör merkezli uzaysal-zamansal genom mimarisini incelemek için entegre bir iş akışı

Kıt hücre popülasyonlarında promotör merkezli uzaysal-zamansal genom mimarisini incelemek için entegre bir iş akışı

Kıt hücre popülasyonlarında promotör merkezli uzaysal-zamansal genom mimarisini incelemek için entegre bir iş akışı

Kromatin Immunoprecipitation İnsan Hücrelerinde Aktif Gen İfadesi Testi Dinamik Histon Modifikasyon (ChIP)

Izoform özel Gen Hedefler Belirlemek için ChIP kullanarak genom analizi