התמרת אותות היא אחד הנושאים החשובים ביותר במחקר ביולוגי ותרופות. זה דורש חלבוני קרום כדי להעביר אותות לחלבון השותף שלהם איתות תאיים. פרוטוקול זה נועד לבצע סינון דטרגנט שיטתי לקראת קומפלקס איתות שמטרתו קביעת מבנה.
פרוטוקול זה משתמש בטכניקות נפוצות במעבדה ביולוגית מבוססת היטב ומבוצע בקלות על ידי המתחילים בתחום. כללנו שיטות אלה כדי למצוא את הפרמטר הקריטי ביותר בהכנת קומפלקס חלבון קרום. כדי להתחיל, להפשיר 30 גרם של HEK293 GNT I-לקוי גלולת התא לטמפרטורת החדר ולהעביר אותו לסק.
הוסף 120 מיליליטר של חיץ PBS המכיל קוקטייל מעכב פרוטאז הומוגני באמצעות homogenizer Dounce או homogenizer חשמלי ב 13, 000 סל"ד במשך 30 שניות. כוונן את עוצמת הקול ל- 150 מיליליטר באמצעות מאגר PBS. מוסיפים בעדינות 10% DDM לתאים ההומוגניים כדי לתת ריכוז סופי של 1.25% מערבבים על הקרח במשך שעה.
לאחר מסיסות, צנטריפוגה התא lysate בארבע מעלות צלזיוס ו 150, 000 פעמים G במשך 45 דקות כדי להסיר את הפסולת unsolubilized. מעבירים את העל-טבעי לבקבוק 500 מיליליטר ומוסיפים 10 מיליליטר של 50%1D4 זיקה חיסונית agarose שרפין. מערבבים בעדינות את התא מנוצל lysate ושרף במשך ארבע שעות או לילה בארבע מעלות צלזיוס כדי לאפשר חלבון מחייב.
טען את תערובת שף לייסאט לעמודה פתוחה כדי לאסוף את הרף. לשטוף את הסירן עם 10 כרכים עמודה של חיץ לשטוף A כדי להסיר את מזהם החלבון. סגור את השסתום ולחץ מחדש על השדית עם שני כרכים עמודה של חיץ A.Next, תחת מצב אור אדום עמום, להוסיף 9-cis רשתית אל השדית המתווסת לריכוז הסופי של 50 micromolar.
מערבבים בעדינות בארבע מעלות צלזיוס במשך ארבע עד 16 שעות בחושך לכריכה רשתית. לאחר מכן, פתח את הערך והסר את המאגר מהעמודה. לשטוף את וסף עם 20 כרכים עמודה של מאגר A, ואחריו 15 אמצעי אחסון עמודה של מאגר B כדי להסיר רשתית לא מאוגדת.
בצע שימוש חוזר את וסף בשני אמצעי אחסון של עמודות של מאגר B ולאחר מכן חלק את ההשעיה של האם באופן שווה ל- 10 עמודות סילוק 10 מיליליטר. הסר את המאגר מ- 10 העמודות ולאחר מכן בצע שימוש חוזר בהסרה של כל אחת מהן במיליליטר אחד של מאגר C לצורך שינוי חומר ניקוי. דגירה במשך שעה אחת על קרח.
חזור על הכביסה ואת הדגירה במאגר C עוד פעם אחת. הסר את המאגר מהעמודות ולאחר מכן בצע שימוש חוזר ב- 0.8 מיליליטר של מאגר אלוטיון עבור כל עמודה. מערבבים בעדינות במשך שעתיים.
לאסוף את האלוטיון מכל עמוד לתוך צינור. תן שימוש חוזר ב- 0.7 מיליליטר של מאגר אלוטיון עבור כל עמודה. מערבבים בעדינות במשך שעה.
לאסוף את האלוטיון מכל עמודה לתוך אותם צינורות. בחושך, לטעון את החלבון חמק קובט קוורץ. למדוד את הספקטרום של דגימת החלבון.
להאיר את החלבון ישירות cuvette במשך שתי דקות עם אור לעבור דרך 495 ננומטר לעבור מסנן. למדוד את הספקטרום של המדגם המואר. בצע את אותה מדידה עבור כל דגימות החלבון מטוהרים בתשעת חומרי הניקוי האחרים.
גם מדינות אפלות וגם מוארות. תחת אור רגיל, עבור כל מצב דטרגנט להכין 100 microliters של rhodopsin ב 0.7 מיליגרם למיליליטר. תחת אור אדום עמום, להכין 100 microliters של תערובת של רודופסין ב 0.7 מיליגרם למיליליטר ומיני GO ב 0.2 מיליגרם למיליליטר.
משלימים את התערובת עם מגנזיום כלורי מילימולארי אחד. מאירים את התערובת באור ממסנן מעבר ארוך של 495 ננומטר ודגירה למשך 30 דקות. מעבירים את הדגימות לבקבוקונים של הדוגם האוטומטי ומ מניחים אותן במגש לדוגמה.
תכנת קובץ שיטה כדי להפוך ריצות SEC רציפות לאוטומטיות עבור כל דגימה כאשר המדגם האוטומטי טוען 77 מיקרוליטרים של המדגם לעמודה והמטהר חומק מ-25 מיליליטר של מאגר SEC לכל הפעלה. תקליט את הספיגה ב-280 ננומטר ו-380 ננומטר. לאסוף את שברי השיא של רודופסין רודופסין מיני GO קומפלקס בנפח השמירה סביב 12.9 מיליליטר.
לנתח את דגימות rhodopsin השמאלי ואת שברי השיא של מתחם rhodopsin-mini-GO על ארבעה עד 12% SDS denaturing ג'לים הדרגתיים עם כתמים כחולים קומאסי. הכינו תערובת של 200 מיקרוליטר של רודופסין במיליגרם אחד למיליליטר ו-PNGase F ב-0.01 מיליגרם למיליליטר. מערבבים היטב ו דגירה על קרח לילה.
הכינו תערובת של 200 מיקרוליטר של רודופסין במיליגרם אחד למיליליטר ואנדו F1-13 ב-0.01 מיליגרם למיליליטר. מערבבים היטב ו דגירה על קרח לילה. נתח את תוצאת העיכול על ידי SDS-Page וכתמים כחולים קומאסיים.
במחקר זה, הגדרת טיהור בקנה מידה קטן הניבה מספיק חלבון לניתוחים נוספים. ספקטרום גלוי אולטרה סגול של רודופסין להראות את המצב הכהה 9-cis רודופסין כבול רטינאלי בעקומות כחולות. לאחר התאורה, רשתית 9-cis הוא deproteinated והוא isomerizes לתוך כל טרנס-רשתית.
היחסים של סופגים ב 280 ננומטר מעל סופג 488 ננומטר וסופגים ב 280 ננומטר מעל סופגים ב 380 ננומטר מתארים את היציבות של רודופסין מטוהרים בכל חומר ניקוי. פרופילי כרומטוגרפיה של רודופסין ורודופסין-מיני-GO מטוהרים ב-10 חומרי ניקוי שונים מוצגים כאן. הפרופיל של חלבוני הסמן הסטנדרטיים מוצג כשכבות-על יחד עם דגימת DDM.
הפרשנות של פרופילי השיא מוצגת עבור DMNG עם התרחיש האידיאלי לראות עבור DDM, DM, Cymal-6, Cymal-5, ו OGNG. הפרופיל המוגדל של מדגם OGNG מראה גם רודופסין וגם מתחם רודופסין-מיני-GO חמק סביב אותו נפח שמירה. ניתוח SDS-Page של רודופסין ו- SEC דגימות מטוהרות של מתחם rhodopsin-mini-GO מוצג כאן.
נתון זה מציג את הניתוח SDS-Page של deglycosylation רודופסין עם אנדו F1 ואנזימי F PNGase. זה קריטי לבצע סינון דטרגנט באופן שיטתי, כך ההשפעה של כל חומר ניקוי בודד ניתן להשוות בבירור ללא עמימות. עבור חלבון בכמות רזה, ניתן להשתמש בהקשה לשינוי תרמי גם כדי לחקור את השפעת חומר הניקוי על יציבות החלבון.
הודות לשיטה זו, אנו מסוגלים להכין קומפלקס חלבון יציב ובסופו של דבר לפתור את מבנה הגביש שאבד בהרכבה גיאוגרפית. הוא סיפק תובנות חשובות לגבי ספציפיות האינטראקציה בין חלבון GPCR-G.
