שיטה זו מדגימה את הכיול של כימות כמות החלבון בדגימה נוזלית עם תהליך מולקולה אחת לספירה. באופן ספציפי, זה יכול להמחיש כיצד אוכלוסיות חלבון ניתן לתייג באופן פלואורסצנטי בכל רמת מולקולה. שיטות קודמות ביצעו מדידות בתפזורת כדי לנתח את היחסים הטוחנות של מולקולות פלואורסצנטיות וחלבונים, אך הן אינן יכולות לחשוף כיצד אוכלוסיות חלבונים הטרוגניות מסומנות בפועל.
השיטות שלנו יכולות לעשות את זה ישירות ברמת המולקולה הבודדת. השיטה שלנו יכולה להיות מורחבת לכיוון בדיקות ריכוז מולקולריות רגישות ומתקדמות, שיובילו לשיטות אבחון עתידיות, ויאפשרו ממצאים יעילים של מולקולות פתוגניות בדגימות. השיטה שלנו יכולה להיות מיושמת על ניתוח מיני חלבון יחיד באמצעות נוגדנים פלואורסצנטיים, כמו גם ניתוח מינים מרובים באמצעות תוויות לא ספציפיות עבור כל החלבונים המופרדים על ידי אלקטרופורזה או כרומטוגרפיה.
הנקודה הקריטית ביותר של הטכניקה היא קבלת שכפול נתונים. אני ממליץ לשמור על אותו מצב ניסיוני ככל האפשר בעת מדידת דגימות מרובות. הדגמה חזותית של טכניקה זו תספק כיצד להפוך כל צעד ניסיוני ליציב ובלתי ניתן לשחזור.
זה גם יראה כמה צעד נדיר בפרוטוקולים ביוכימיה, כגון ספין ציפוי וכביסה של כיסויי מיקרוסקופ. כדי להתחיל בהליך זה, הכן את מאגר ה- lysing ואת 1%Tween-20 כמפורט בפרוטוקול הטקסט. השתמש נתרן הידרוקסידי כדי להתאים את ה- pH ל 12.
מערבבים 100 מיקרוליטרים של חיץ ליאזינג עם מיקרוליטר אחד של DDT טוחן אחד וארבעה מיקרוליטרים של 50% CHAPS. הוסף מיקרוליטר אחד של תרבות התאים המוכנים והומוגניזציה של הפתרון על ידי צינור איטי כדי למנוע בועות. דגירה בחושך בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות עם תסיסה עדינה.
לאחר מכן, rehomogenize הפתרון על ידי צינורות אותו למעלה ולמטה לאט. הוסף מיקרוגרם אחד של צבע אסתר NHS Cy3 ו homogenize הפתרון על ידי האטת צינורות כדי למנוע בועות. דגירה בחושך בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות עם תסיסה עדינה.
חזור על תהליך זה, הוספת אותה כמות של צבע דגירה המדגם פעם אחת. הוסף 100 microliters של 0.8 טוחן HEPES-נתרן הידרוקסיד כדי להתאים את ה- pH של הפתרון ל 7.2 ולהרוות את התגובה. לאט לאט פיפטה למעלה ולמטה כדי הומוגניזציה הפתרון.
לאחר מכן, להוסיף 20 microliters של ביוטין-2-אמין וחמישה microliters של EDC. הומוגניזציה הפתרון על ידי צינור למעלה ולמטה לאט. דגירה בחושך בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת עם תסיסה עדינה.
לאחר מכן, השתמש בעמודת סינון במיוחד עם ניתוק של 10 קילוDalton כדי להסיר את כל מגיבי התיוג שלא נתיגו ולרכז את הדגימה. לאחר ביצוע SDS-PAGE סטנדרטי עבור דגימת החלבון וסולם מולקולרי, תדמיין את הג'ל כדי לזהות את מיקום רצועות החלבון. השתמש בלהב חד כדי לחתוך את מנות הג'ל הכוללות שברי חלבון של עניין בהתבסס על מיקומי הלהקות.
ראשית, להגדיר כיסויים כי הם 22 מילימטרים על ידי 22 מילימטרים והם 0.15 מילימטרים עבה. השתמש מנקה פלזמה לחשוף את הכיסויים לפלזמה אוויר במשך דקה אחת כדי לנקות ולהפעיל את המשטחים שלהם. לאחר מכן, השתמש במעיל ספין כדי לסובב את הכיסויים עם 200 מיקרוליטרים של מאגר אוודין למשך חמש שניות ב- 500 סל"ד, ואחריו 30 שניות ב- 1000 סל"ד.
דגירה של כיסויים בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות כדי לאפשר להם אוויר יבש. להכנת כיסויים לדגימה של החלבון, השתמשו בדגימה חלבון שדוללה. מניחים 100 מיקרוליטרים של המדגם המדולל על מרכז כיסויים מצופים אוודין.
דגירה בחושך בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. כדי להכין את השליטה החיובית, מניחים 100 מיקרוליטרים של ביוטין פלואורסצנטי מטוהר בחמישה מיקרומולרים HEPES-נתרן הידרוקסיד ב pH 7.2 במרכז כיסוי מצופה אוודין. דגירה בחושך בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות.
כדי להכין את השליטה השלילית, פלזמה מעיל ספין מכסה עם 200 microliters של חמישה הידרוקסיד HEPES-נתרן עם שני מיליגרם למיליליטר של BSA ללא אוודין. הוסף 100 microliters ביוטין פלואורסצנטי מטוהרים בחמישה micromolar HEPES-נתרן הידרוקסיד ב pH 7.2. דגירה בחושך במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, לשטוף כל coverslip עם 200 microliters של מים מזוקקים על ידי צינורות בקצוות, הקפדה לא לגעת באמצע coverslip עם קצה פיפטה. חזור על שטיפה זו שלוש פעמים. לאחר מכן, לחשוף מספר שווה של כיסויים חדשים לפלזמה אוויר לדקה אחת.
מניחים כיסוי מנוקה על גבי כל כיסוי כרוך מדגם, כדי למנוע ייבוש. התחל מיקרוסקופ פלואורסצנטי שדה רחב או אוונסנטי. הגדר כיסוי על המיקרוסקופ ולמצוא את המוקד.
לאחר מכן, בצע סריקת אריחים כדי להשיג לפחות 100 תמונות. במחקר זה, הומוגניות התיוג של כל מין חלבון שכותרתו בתאים הוא לכמת לאחר ההפרדה עם SDS-PAGE. נתוני התמונה הגולמית עבור שברי משקל מולקולריים שונים של חלבונים מ ליזאט תא HeLa, כמו גם את הפקדים החיוביים ושליליים, נראים כאן.
בעוד שגם דגימת החלבון וגם תערוכת הבקרה החיובית בין 100 ל-500 כתמים לתמונה, הבקרה השלילית מציגה מעט מאוד עד אף אחד. זה מראה כי התהליך מספיק מעכב כריכה לא ספציפית של צבעים על פני השטח coverslip. היסטוגרמות עוצמת ספוט עבור דגימות החלבון ואת השליטה החיובית להציג פסגות מרובות, המייצגים את הכריכה סטוכססטית של צבעים אמינים ראשוניים חלבונים ומבנים טטרמר אוודין בהתאמה.
כל הכתמים הראו מהבהבים ו photobleaching צעד עם עירור לייזר מתמשך, הדגשת תצפית ברמת מולקולה אחת. לאחר מכן מחושבת תפוסת התיוג, או LO, מיחס בין מספר הנקודות בכל דגימת חלבון לזה שבבקרה החיובית. LO נמדד מן תא HeLa ליסאט מדגם נע בין 50% עבור שבר משקל מולקולרי קטן יותר, כדי 90% עבור שבר משקל מולקולרי גבוה יותר.
LO עבור מדגם פרוטיום כולו ללא הפרדה נתפסת להיות 72%זה קריטי להשתמש reagents טריים כדי למנוע כל אבק, במיוחד במהלך הכנת coverslips. בעקבות הליך זה, ניתוח ספירת מולקולות בודדות בנפח מסוים יכול להתבצע כדי לכמת את הריכוזים של כל חלבון. לדוגמה, ניתוח על כל מוצר גלם, או ג'ל ומוצרי אלקטרופורזה נימי, ניתן לבצע.
טכניקה זו סוללת את הדרך לניצול הדמיית פלואורסצנטיות של מולקולה יחידה לרפואה מולקולרית, כימיה אורגנית וניתוח אומיקה. על ידי גישור המושג בין ריכוז למספרים. נתרן הידרוקסידי מרוכז הוא מאכל, ויש ללבוש הגנה נאותה בעת הטיפול בו.
כמו כן, קרינת לייזר בה הספק גבוה עלולה לגרום נזק לעיניים, ולכן ניתן ללבוש משקפי מגן.
