This work was supported by National Institutes of Health grants GM 100201 to I.F.S, and GM 048071 and GM 065830 to I.P.

אנו מציגים נהלים מפורטים להדמית Ca 2 + אירועים מקומיים בתאי SH-SY5Y נוירובלסטומה האנושית. ניתן להתאים נהלים אלה ל2+ אותות תאיים תמונת Ca בסוגי תאים רבים 8-10. 1. הכנת תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות התאים להיות צילמו על פי הוראות המופיעות באתר האינטרנט של הספק שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמה ימים לפני ההדמיה, תאי קציר גדלו בבקבוק תרבות רקמות באמצעות 1 מיליליטר של 0.25% טריפסין / EDTA (2-3 דקות). בעקבות ניתוק, להוסיף נפח שווה של תקשורת בתרבות כדי להשבית טריפסין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ספירת תאים באמצעות hemocytometer וזרע תאים לתוך מנות הדמיה זכוכית תחתונה בצפיפות של 3-7 x 10 4 תאים לכל צלחת. בחרו את תאים לניסויי הדמיה כאשר הם מגיעים למפגש 60% (2-3 ימים). </li></ol> 2. הכנת פתרונות וריאגנטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן HEPES Ca 2 + המכיל נאגרתמיסת מלח (Ca 2 + -HBSS) מורכב מ( מ&quot;מ): 135 NaCl, 5.4 KCl, 2 CaCl 2, 1 MgCl 2, 10 HEPES, ו -10 גלוקוז; pH = 7.4 בטמפרטורת חדר (RT) עם NaOH. הכן -HBSS Ca 2 + ללא תוספת סוכר ובחנות ב 4 ° C; להוסיף גלוקוז לפתרון מייד לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Solubilize צורות קרום-permeant של Ca 2 + מחוון ניאון קאל-520 (1 מ&quot;מ), ci-IP 3 (200 מיקרומטר), וEGTA (100 מ&quot;מ) בsulfoxide דימתיל (DMSO) המכיל 20% F-127 pluronic. Aliquot ריאגנטים אלה לתוך צינורות Eppendorf וחנות, מוגנים מפני לחות והאור, ב -20 ° C. </li></ol> 3. תאי Loading עם ממברנה-permeant קאל-520, ci-IP 3 וEGTA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את &quot;מאגר הטעינה&quot; על ידי דילול פתרונות מניות של קרום-permeant קאל-520 וci-IP 3 לריכוז סופי של 5 מיקרומטר ו 1 מיקרומטר, בהתאמה, ב-HBSS Ca 2 +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב מ&quot;קתקשורת וlture לשטוף תאים על ידי החלפת מדיה עם Ca 2 + -HBSS שלוש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר Ca 2 + -HBSS דגירה תאים במאגר טעינה במשך 60 דקות ב RT בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מאגר טעינה ולשטוף תאים על ידי החלפת מדיה עם Ca 2 + -HBSS שלוש פעמים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם תרצה, בשלב זה, תאי עומס עם EGTA / AM על ידי דילול מניות הפתרון לריכוז סופי של 5 מיקרומטר Ca 2 + -HBSS ולאחר מכן דגירה תאים במשך 30-60 דקות ב RT בחושך. לאחר דגירה זה, לשטוף תאים שלוש פעמים עם -HBSS Ca 2 + לפני שתמשיך לשלב 3.5. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים ב-HBSS Ca 2 + למשך 30 דקות כדי לאפשר לדה-esterification של חומרים כימיים טעונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לפני ההדמיה, להחליף -HBSS Ca 2 + 2 + עם -HBSS &quot;הטרי&quot; Ca כדי להסיר כל צבע שאולי דלף לאמבטיה במהלך הדגירה הסופית. </li></ol> 4. Ca 2 + </sup&gt; רכישת תמונה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום טיפה קטנה של שמן טבילה על מטרת 100X APO TIRF (NA 1.49). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר צלחת ההדמיה על הבמה של מיקרוסקופ ההפוך ולהביא את התאים אל מוקד באמצעות אור מועבר. חשוב כדי להבטיח את צלחת ההדמיה כדי למנוע תנועה במהלך הקלטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להאיר תאים עם לייזר 488 ננומטר כדי לרגש את קאל-520 ולאסוף הקרינה נפלטת (λ&gt; 510 ננומטר) באמצעות מצלמה EMCCD במהירות גבוהה. הערה: חבילת התוכנה המפעילה את המיקרוסקופ מאפשרת למשתמש לתרגם עדשה מתמקדת המאפשרת את קרן הלייזר שהציגה גם בקצה הקיצוני של הצמצם חזרה האובייקטיבי (לעירור TIRF) או מרכזי יותר (לעירור &quot;WF&quot;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בתוכנת EMCCD, להפחית תחום ההדמיה מ512 x 512 פיקסלים מלאים על מנת לאסוף נתונים ברזולוציה של הזמן הדרוש כדי ללכוד Ca 2 + אירועים מקומיים. הערה: לדוגמא, quad מרכזרכישה של 256 x 256 פיקסלים מאיצה את קצב הרכישה ל -66 fps. אפשר גם להגדיל עוד יותר את קצב הפריימים של המצלמה EMCCD 500 fps באמצעות פונקצית מצב יבול מבודדת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיר את התוכנה כדי להקליט באופן אוטומטי כמה שניות של פעילות בסיסית, לספק הבזק UV לתאים ולהמשיך להקליט עוד שניות 10-30. הערה: פלאש UV מועבר באמצעות מקור אור קסנון הקשת הציג דרך UV משקף מראה dichroic ביציאה האחורית של המיקרוסקופ. המשך ועוצמת פלאש UV מותאם באופן אמפירי לעורר תדירות רצויה של Ca 2 + אירועים מקומיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור קבצים בתמונת ערימות לניתוח off-line. </li></ol> 5. ניתוח 2 + תמונה האוטומטית Ca הערה: ניתן להציג, תהליך ולנתח נתונים שנתפסו באמצעות הרבה חבילות תוכנה מסחריות. עם זאת, יש לנו פיתחנו אלגוריתם לאוטומציה זיהוי במהירותניתוח ד של Ca 2 + אותות מקומיים. תיאור מפורט של מסנני מרחב ובזמן בשימוש באלגוריתם זה, ניתן למצוא דור של ΔF / F 0 והזדהות / ניתוח שגרה ב -11. אלגוריתם זה פותח כדי לרוץ על Python פלטפורמת תוכנה בקוד הפתוח, וניתן להשיג, יחד עם מדגם נתוני ניסוי והוראות למשתמש מפורטים, על ידי המחבר המקביל בדואר אלקטרוני (ismith@uci.edu). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המרת קבצים ללהיות מיובא לתוך האלגוריתם אישית בכתב לפורמט קובץ .tiff רב המטוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר את התיקייה המכילה את אלגוריתם הניתוח ולחץ לחיצה כפולה על run.exe. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את קובץ .tiff להיות מנותח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר פרמטרים ניתוח בתיבת הדו-שיח הפתוחה. ראה איור 2 א לפרמטרים ברירת מחדל עבור נתוני המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את הרמה השחורה יש לקזז מהערימה התמונה או על ידי הזזת הסמן לחלק משדה הראייה שעושה not מכיל תא (ראה איור 2) או על ידי הזנת רמה שחורה באמצעות הפקודה &#39;רמת צבע השחורה בהגדרה&#39; ידני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב ארבעה חלונות במסך הבאים ניתוח על ידי התוכנה (איור 2C-F). C הוא תמונה בשחור-לבן של מנוחה הקרינה מהתאים להיות מנותחת. ריבועים לבנים על גבי תמונה זו הם מקומות אירוע, שנקבעו כעמדות centroid של פונקציות גאוס דו-ממדיות המותאמות לאירועים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על כל מיקום אירוע או לחץ על מקשי סמן למחזור בין אירועים. על כך מופחת רקע, גאוס החליק שינויי יחס הקרינה (ΔF / F 0) בכל אחד מהאתרים הללו העדכון בחלון ד הערה: אדום מודגש אירועים נחושים מקורן אתר מסוים ושלא מ&#39;לדמם דרך &quot;מפעילות המקומית לאתרים סמוכים. העקבות הכחולות התחתונות מציינת היכן אותות הקרינה באתר שנבחר חרגו מזיהויסף, ואילו הקו השחור מזהה אירועים שמקורם באתר מסוים ש( המקביל ל האדום מודגש אירועים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על אדום מודגש אירוע לעדכן E חלון המציגה את האבולוציה הזמנית של האירוע, וF חלון המציג את הפרופיל המרחבי של האירוע בממוצע לכל מהלך הזמן שלה, יחד עם הפרופיל המרחבי של פונקצית גאוס המצויד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן ידני לסקור את האירועים שזוהו כך שניתן לדחות ממצאים מניתוח. מחק אירועים כגון על ידי לחיצה ימנית האדום מודגש אירועים. הערה: בידיים שלנו, Ca 2 + שטף דרך ערוצי IP 3 R יחידים מעורר אותות עם ΔF / F 0 על 0.11, כך שכל &#39;אירועים&#39; זוהו קטנים יותר במידה ניכרת מזה צפויים להיות חיובי שגוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתוני יצוא על ידי בחירה &#39;שמור ל- Excel&#39; או לייצא נתונים על בסיס לכל תא על ידי ציור סביב התא של עניין ובחירה &#39;שמור CellR17 ;. הערה: הנתונים נשמרים באותה התיקייה כמו ערימת התמונה המקורית. </li></ol>

<ol>
	<li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling.">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).</li><li>Hill-Eubanks, D. C., Werner, M. E., Heppner, T. J., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+in+smooth+muscle.">Calcium signaling in smooth muscle.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (9), a004549 (2011).</li><li>Hagenston, A. M., Bading, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+in+synapse-to-nucleus+communication.">Calcium signaling in synapse-to-nucleus communication.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), a004564 (2011).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elementary+and+global+aspects+of+calcium+signalling.">Elementary and global aspects of calcium signalling.</a> J Physiol. 499 (Pt 2), 291-306 (1997).</li><li>Lipp, P., Niggli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hierarchical+concept+of+cellular+and+subcellular+calcium+signalling).">A hierarchical concept of cellular and subcellular calcium signalling).</a> Prog Biophys Mol Biol. 65 (3), 265-296 (1996).</li><li>Parker, I., Yao, Y., Ilyin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+kinetics+of+calcium+liberation+induced+in+Xenopus+oocytes+by+photoreleased+inositol+trisphosphate.">Fast kinetics of calcium liberation induced in Xenopus oocytes by photoreleased inositol trisphosphate.</a> Biophys J. 70 (1), 222-237 (1996).</li><li>Minta, A., Kao, J. P., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+cytosolic+calcium+based+on+rhodamine+and+fluorescein+chromophores.">Fluorescent indicators for cytosolic calcium based on rhodamine and fluorescein chromophores.</a> J Biol Chem. 264 (14), 8171-8178 (1989).</li><li>Demuro, A., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+activity+and+localization+of+single+voltage-gated+Ca(2+)+channels+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Imaging the activity and localization of single voltage-gated Ca(2+) channels by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophys J. 86 (5), 3250-3259 (2004).</li><li>Smith, I. F., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+quantal+substructure+of+single+inositol+trisphosphate+receptor+channel+activity+during+calcium+puffs+in+intact+mammalian+cells.">Imaging the quantal substructure of single inositol trisphosphate receptor channel activity during calcium puffs in intact mammalian cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (15), 6404-6409 (2009).</li><li>Reissner, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+postsynaptic+mechanism+for+heterosynaptic+sharing+of+short-term+plasticity.">A novel postsynaptic mechanism for heterosynaptic sharing of short-term plasticity.</a> J Neurosci. 30 (26), 8797-8806 (2010).</li><li>Ellefson, K. S., Parker, B., Smith, I., F, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+algorithm+for+automated+detection,+localization+and+measurement+of+local+calcium+signals+from+camera-based+imaging.">An algorithm for automated detection, localization and measurement of local calcium signals from camera-based imaging.</a> Cell Calcium. , (2014).</li><li>Smith, I. F., Wiltgen, S. M., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+puff+sites+adjacent+to+the+plasma+membrane:+Functional+and+spatial+characterization+of+calcium+signaling+in+SH-SY5Y+cells+utilizing+membrane-permeant+caged+inositol+trisphosphate.">Localization of puff sites adjacent to the plasma membrane: Functional and spatial characterization of calcium signaling in SH-SY5Y cells utilizing membrane-permeant caged inositol trisphosphate.</a> Cell Calcium. 45, 65-76 (2009).</li><li>Shuai, J., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+single-channel+recording+by+imaging+calcium+flux+through+individual+ion+channels:+theoretical+considerations+and+limits+to+resolution.">Optical single-channel recording by imaging calcium flux through individual ion channels: theoretical considerations and limits to resolution.</a> Cell Calcium. 37 (4), 283-299 (2005).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

אנו מתארים כאן פרוטוקולי הדמיה Ca 2 + אירועים מקומיים בתאי יונקים בתרבית באמצעות Ca 2 + אינדיקטורים ניאון. יתר על כן, אנו מתארים אלגוריתם עם ממשק משתמש אינטואיטיבי המאפשר אוטומצית זיהוי וניתוח של נתונים שנרכשו. ההליך המתואר כאן לנצל את Ca 2 + מחוון ניאון ק?...

יוני סידן (Ca 2 +) בכל מקום להסדיר במגוון רחב של תהליכים ביולוגיים, כוללים ביטוי גנים, הפרשה ושינויים ארוכי טווח בפלסטיות הסינפטית 1. אחת דרכים שבאמצעותו Ca 2 + יכול לפעול באופן שונה היא באמצעות דפוסי מרחב ובזמן השונים של Ca 2 + אותות תא יכול לייצר. לגבה דוגמא העולמיים בcytosolic התכווצות הדק [Ca 2 +] ברקמת שריר חלק 2 ואילו קטן יותר, גבהים חולפים מקומיים (Ca 2 + microdomains המקומי) לעורר ביטוי גנים חיוני ללמידה וזיכרון 3. cytosolic חינם [Ca 2 +] נשמר במנוחה ~ 100 ננומטר, אבל במהירות יכול לעלות לכמה מיקרו-טוחנת הבאות הזרם של Ca 2 + לcytosol דרך Ca 2 + תעלות יונים -permeable ממוקמות בקרום הפלזמה ועל ידי השחרור של Ca 2 + משל תאיתtores. המעבדה שלנו מתמקדת בקולט אינוסיטול 1,4,5-trisphosphate (IP 3 R), אשר מהווה ערוץ הפצת Ca 2 + הממוקם בקרום reticulum endoplasmic (ER). על הכריכה של שני IP 3 וCa 2 + לcytosolic הפעלת אתרים של הקולטן, ערוץ R IP 3 נפתח לשחרור Ca 2 + מוחרם בתוך לומן ER. שחרורו של Ca 2 + עשוי להישאר מוגבל מרחבית למקבץ קטן של IP 3 R כדי ליצור microdomain cytosolic מקומי של Ca 2 + (Ca 2 + נשיפה 4) או, בהתאם לקרבה של אשכולות הסמוכות של IP 3 Rs, רשאי להפיץ בכל תא על ידי גיוס אתרי נשיפה מרובים באמצעות תהליך של Ca 2 + -release Ca 2 + -induced (CICR) 5,6. ההקדמה של צבעי המחוון 2 + מולקולה קטנה ניאון Ca שפותחה על ידי רוג&#39;ר 7 Tsien, בשילוב עם imagi מיקרוסקופיה המתקדמת<html> ng טכניקות, יש להקל באופן משמעותי את ההבנה של Ca 2 + איתות שלנו. התקדמות שחלה באחרונה מצלמות המשמשות למיקרוסקופיה בחברה מאפשרת הדמיה Ca 2 + אירועים מקומיים חולפים כמו פחזנית עם רזולוציה מרחב ובזמן חסרת תקדים. כיום מצלמות זמינות EMCCD לאפשר הדמיה עם 128 x 128 פיקסלים ב&gt; 500 מסגרות לשנייה -1 (fps) והדור החדש של מוליכים למחצה תחמוצת מתכת משלימות מצלמות (CMOS) מספקות רזולוציה גבוהה יותר פיקסל, ומהירות אפילו מהר יותר על חשבון מעט גבוה יותר רמות רעש. בשיתוף עם מיקרוסקופיה הכוללת ההשתקפות פנימית (TIRF) ניתן כיום לתמונה Ca 2 + אחד אירועי ערוץ 8,9. גישה זו מאפשרת להדמיה של מאות ערוצים / אירועים בו זמנית, תוך יצירת קבוצות גדולות נתונים (בערך 1Gb לדקה) ההופכים את העיבוד ידני, זיהוי חזותי וניתוח מעשי ולמקם את אחריות על הפיתוח של אלגוריתמים אוטומטיים. s = &quot;jove_content&quot;&gt; כאן, אנו מציגים נהלים ופרוטוקולים להדמית Ca 2 + אותות מקומיים בתאי יונקים שלמים באמצעות Ca 2 + אינדיקטורים ניאון. בנוסף, אנו מראים אלגוריתם שפותח בפייתון סביבת הקוד הפתוח המאפשר אוטומצית זיהוי וניתוח של 2 + Ca אירועים המקומיים צילמו על ידי שני TIRF ומיקרוסקופיה עלית הקרינה שדה רחב קונבנציונלית (WF). למרות שאנו מתארים גישות אלה בהקשר של IP 3 -generated Ca 2 + אותות, הם ניתנים בקלות ללמוד שינויים מקומיים בcytosolic [Ca 2 +] הנובעים ממגוון רחב של Ca 2 + תעלות יונים -permeable ממוקמות באו המשטח קרום או אברונים תוך-תאיים 8-10.

<table><tbody><tr><td>Human Neuroblastoma SH-SY5Y cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-2266</td><td></td></tr><tr><td>Cal-520/AM</td><td>AAT Bioquest Inc.</td><td>21130</td><td></td></tr><tr><td>ci-IP&lt;sub&gt;3 &lt;/sub&gt;(D-23-&lt;em&gt;O&lt;/em&gt;-Isopropylidene-6-&lt;em&gt;O&lt;/em&gt;-(2-nitro-4,5-dimethoxy)benzyl-&lt;em&gt;myo&lt;/em&gt;-Inositol 1,4,5-trisphosphate-Hexakis(propionoxymethyl) Ester</td><td>SiChem</td><td>cag-iso-2-145-10</td><td></td></tr><tr><td>DMSO/20% pluronic F127</td><td>Invitrogen</td><td>P-3000MP</td><td></td></tr><tr><td>EGTA/AM</td><td>Invitrogen</td><td>E-1219</td><td></td></tr><tr><td>35 mm glass-bottom imaging dishes</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging local ca2+ signals in cultured mammalian cells

Cytosolic Ca 2 + יונים להסדיר היבטים רבים של פעילות סלולרית כמעט בכל סוגי תאים, שליטה תהליכים רחבה היקף כמו שעתוק הגנים, רגישות חשמל וחלוקה של תאים. הגיוון והסגוליות של Ca 2 + איתות נובעים ממנגנונים שבאמצעותם Ca 2 + אותות נוצרים לפעול על סולמות זמן ומרחב שונים, הנעים בין תנודות תא-רחב וגלים המתרחשים על פני תקופות של דקות לCa 2 + microdomains החולף המקומי (2 + Ca פחזנית) אלפיות שנייה קיימא. התקדמות שחלה באחרונה באלקטרון כפול CCD מצלמות (EMCCD) כעת לאפשר להדמיה של 2 + אותות Ca המקומיים עם רזולוציה מרחבית 128 x 128 פיקסלים בשיעורים של&gt; 500 מסגרות לשנייה -1 (fps). גישה זו היא מקבילה מאוד ומאפשרת ניטור סימולטני של מאות ערוצים או אתרי נשיפה בניסוי יחיד. (1 PE Gb בערך עם זאת, הכמויות עצומות של נתונים שנוצרודקות r) להבהיר זיהוי חזותי וניתוח של Ca 2 + אירועים המקומיים מעשי. כאן אנו מתארים ומדגימים את ההליכים לרכישה, האיתור, וניתוח של ה- IP המקומי 3 בתיווך Ca 2 + אותות בתאי יונקים שלמים עמוסים 2 + אינדיקטורים Ca באמצעות שתי עלית הקרינה רחב בתחום (WF) והשתקפות פנימית מוחלטת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (TIRF). יתר על כן, אנו מתארים אלגוריתם שפתח בתוך Python סביבת תוכנת הקוד הפתוח שממכן את זיהוי וניתוח של Ca 2 + אותות המקומיים אלה. אלגוריתם localizes אתרים של Ca 2 + שחרור עם רזולוציה תת-פיקסל; מאפשר סקירת משתמש של נתונים; ופלטי רצפים של אותות יחס הקרינה זמן יחד עם משרעת ונתונים הקינטית בשולחן Excel תואם.

איור 1 א מציג תמונת WF של מנוחה הקרינה קאל-520 בתאי נוירובלסטומה SH-SY5Y האנושיים טעונים גם עם ci-IP 3. חשיפה של תאים אלה לבזק 100 UV msec לתמונה-שחרור i-IP 3 עוררה Ca 2 + פחזניות חולפות באתרים בדידים (שצוין על ידי העיגולים הלבנים באיור 1 א). עקבות הקרינ?...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells at JoVE.com

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

ההדמיה המקומית Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; אותות בתאי יונקים בתרבית

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

imaging-local-ca2-signals-in-cultured-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

10.7K Views.  University of California, Irvine. Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Video: Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in intact spinal cord, brainstem, retina, cortex and dissociated neuronal culture preparations. During periods of spontaneous activity, neurons depolarize to fire single or bursts of action potentials, activating many ion channels. Depolarization activates voltage-gated calcium channels on dendrites and spines that mediate calcium influx. Highly synchronized electrical activity has been measured from local neuronal networks using field electrodes. This technique enables high temporal sampling rates but lower spatial resolution due to integrated read-out of multiple neurons at one electrode. Single cell resolution of neuronal activity is possible using patch-clamp electrophysiology on single neurons to measure firing activity. However, the ability to measure from a network is limited to the number of neurons patched simultaneously, and typically is only one or two neurons. The use of calcium-dependent fluorescent indicator dyes has enabled the measurement of synchronized activity across a network of cells. This technique gives both high spatial resolution and sufficient temporal sampling to record spontaneous activity of the developing network.
A key feature of newly-forming cortical and hippocampal networks during pre- and early postnatal development is spontaneous, synchronized neuronal activity (Katz &amp; Shatz, 1996; Khaziphov &amp; Luhmann, 2006). This correlated network activity is believed to be essential for the generation of functional circuits in the developing nervous system (Spitzer, 2006). In both primate and rodent brain, early electrical and calcium network waves are observed pre- and postnatally in vivo and in vitro (Adelsberger et al., 2005; Garaschuk et al., 2000; Lamblin et al., 1999). These early activity patterns, which are known to control several developmental processes including neuronal differentiation, synaptogenesis and plasticity (Rakic &amp; Komuro, 1995; Spitzer et al., 2004) are of critical importance for the correct development and maturation of the cortical circuitry.
In this JoVE video, we demonstrate the methods used to image spontaneous activity in developing cortical networks. Calcium-sensitive indicators, such as Fura 2-AM ester diffuse across the cell membrane where intracellular esterase activity cleaves the AM esters to leave the cell-impermeant form of indicator dye. The impermeant form of indicator has carboxylic acid groups which are able to then detect and bind calcium ions intracellularly.. The fluorescence of the calcium-sensitive dye is transiently altered upon binding to calcium. Single or multi-photon imaging techniques are used to measure the change in photons being emitted from the dye, and thus indicate an alteration in intracellular calcium. Furthermore, these calcium-dependent indicators can be combined with other fluorescent markers to investigate cell types within the active network.

Spontaneous activity of developing neuronal networks can be measured using AM-ester forms of calcium-sensitive indicator dyes. Changes in intracellular calcium, indicating neuronal activation, are detected as transient changes in indicator fluorescence with one- or two-photon imaging. This protocol can be adapted for a range of developmentally-dependent neuronal networks in vitro.

סידן הדמיה תפקודית בפיתוח רשתות קליפתיים

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

Neuroscience

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

בהדמיה עצבית סיד vivo ב C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological processes. In particular, appropriate regulation of calcium activity patterns during embryogenesis is necessary for many aspects of vertebrate neural development, including proper neural tube closure, synaptogenesis, and neurotransmitter phenotype specification. While the observation that calcium activity patterns can differ in both frequency and amplitude suggests a compelling mechanism by which these fluxes might transmit encoded signals to downstream effectors and regulate gene expression, existing population-level approaches have lacked the precision necessary to further explore this possibility. Furthermore, these approaches limit studies of the role of cell-cell interactions by precluding the ability to assay the state of neuronal determination in the absence of cell-cell contact. Therefore, we have established an experimental workflow that pairs time-lapse calcium imaging of dissociated neuronal explants with a fluorescence in situ hybridization assay, allowing the unambiguous correlation of calcium activity pattern with molecular phenotype on a single-cell level. We were successfully able to use this approach to distinguish and characterize specific calcium activity patterns associated with differentiating neural cells and neural progenitor cells, respectively; beyond this, however, the experimental framework described in this article could be readily adapted to investigate correlations between any time-series activity profile and expression of a gene or genes of interest.

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

We present a two-part protocol that combines fluorescent calcium imaging with in situ hybridization, allowing the experimenter to correlate patterns of calcium activity with gene expression profiles on a single-cell level.

סידן פלואורסצנטי הדמיה ובעקבות היברידיזציה באתרו לאפיון עצבי בלתי מבשר בקספוס זריזה

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Developmental Biology

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of individual cells. Since an increase of intracellular calcium (Ca2+) in the cytosol often occurs because of the electrical activity, or in response to a myriad of other stimuli, this process can be monitored by the imaging of cells loaded with fluorescent calcium-sensitive dyes.&#160; However, it is difficult to image this response in an individual cell type within whole tissue because these dyes are taken up by all cell types within the tissue. In contrast, genetically encoded calcium indicators (GECIs) can be expressed by an individual cell type and fluoresce in response to an increase of intracellular Ca2+, thus permitting the imaging of Ca2+ signaling in entire populations of individual cell types. Here, we apply the use of the GECIs GCaMP3/6 to the mouse neuromuscular junction, a tripartite synapse between motor neurons, skeletal muscle, and terminal/perisynaptic Schwann cells. We demonstrate the utility of this technique in classic ex vivo tissue preparations. Using an optical splitter, we perform dual-wavelength imaging of dynamic Ca2+ signals and a static label of the neuromuscular junction (NMJ) in an approach that could be easily adapted to monitor two cell-specific GECI or genetically encoded voltage indicators (GEVI) simultaneously. Finally, we discuss the routines used to capture spatial maps of fluorescence intensity. Together, these optical, transgenic, and analytic techniques can be employed to study the biological activity of distinct cell subpopulations at the NMJ in a wide variety of contexts.

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Here we present a protocol to image calcium signaling in populations of individual cell types at the murine neuromuscular junction.

לשעבר Vivo הדמיה של סידן לתא ספציפי איתות על הסינפסה התלת-צדדי של הסרעפת העכבר

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The coordination of two Ca2+ signal sources&#8212;&#8220;Ca2+ influx&#8221; from outside the cell and &#8220;Ca2+ release&#8221; from the intracellular Ca2+ store endoplasmic reticulum (ER)&#8212;is considered to underlie the diverse spatio-temporal patterns of Ca2+ signals that cause multiple biological functions in cells. The purpose of this protocol is to describe a new Ca2+ imaging method that enables monitoring of the very moment of &#8220;Ca2+ influx&#8221; and &#8220;Ca2+ release&#8221;. OER-GCaMP6f is a genetically encoded Ca2+ indicator (GECI) comprising GCaMP6f, which is targeted to the ER outer membrane. OER-GCaMP6f can monitor Ca2+ release at a higher temporal resolution than conventional GCaMP6f. Combined with plasma membrane-targeted GECIs, the spatio-temporal Ca2+ signal pattern can be described at a subcellular resolution. The subcellular-targeted Ca2+ indicators described here are, in principle, available for all cell types, even for the in vivo imaging of Caenorhabditis elegans neurons. In this protocol, we introduce Ca2+ imaging in cells from cell lines, neurons, and glial cells in dissociated primary cultures, and describe the preparation of frozen stock of rat cortical neurons.

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Here we present a protocol for Ca2+ imaging in neurons and glial cells, which enables the dissection of Ca2+ signals at subcellular resolution. This process is applicable to all cell types that allow the expression of genetically encoded Ca2+ indicators.

דיסקציה של Ca מקומי2 + אותות בתאים בתרבית על ידי קרום, ממוקדות Ca2 + אינדיקטורים

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The ...

הדמיית סידן של חד-שכבות אורגנואידים במעי אנושי נגועים בנגיף

Live Calcium Imaging of Virus-Infected Human Intestinal Organoid Monolayers Using Genetically Encoded Calcium Indicators

Calcium signaling is an integral regulator of nearly every tissue. Within the intestinal epithelium, calcium is involved in the regulation of secretory activity, actin dynamics, inflammatory responses, stem cell proliferation, and many other uncharacterized cellular functions. As such, mapping calcium signaling dynamics within the intestinal epithelium can provide insight into homeostatic cellular processes and unveil unique responses to various stimuli. Human intestinal organoids (HIOs) are a high-throughput, human-derived model to study the intestinal epithelium and thus represent a useful system to investigate calcium dynamics. This paper describes a protocol to stably transduce HIOs with genetically encoded calcium indicators (GECIs), perform live fluorescence microscopy, and analyze imaging data to meaningfully characterize calcium signals. As a representative example, 3-dimensional HIOs were transduced with lentivirus to stably express GCaMP6s, a green fluorescent protein-based cytosolic GECI. The engineered HIOs were then dispersed into a single-cell suspension and seeded as monolayers. After differentiation, the HIO monolayers were infected with rotavirus and/or treated with drugs known to stimulate a calcium response. An epifluorescence microscope fitted with a temperature-controlled, humidified live-imaging chamber allowed for long-term imaging of infected or drug-treated monolayers. Following imaging, acquired images were analyzed using the freely available analysis software, ImageJ. Overall, this work establishes an adaptable pipeline for characterizing cellular signaling in HIOs.

מחבר זרקור: חקירת הפרעה נגיפית של איתות אפיתל המעי – תובנות מחקר וכיוונים עתידיים 

This protocol describes an approach for performing calcium imaging in virus-infected human intestinal organoids and offers an approach to analysis.

הדמיית סידן חיה של חד-שכבות אורגנואידים במעי אנושי נגועים בנגיף באמצעות מדדי סידן מקודדים גנטית

Calcium signaling is an integral regulator of nearly every tissue. Within the intestinal epithelium, calcium is involved in the regulation of secretory ...

Immunology and Infection

Visualizing Shifts on Neuron-Glia Circuit with the Calcium Imaging Technique

Here, we report on selective in vitro models of circuits based on glia (astrocytes, oligodendrocytes, and microglia) and/or neurons from peripheral (dorsal root ganglia) and central tissues (cortex, subventricular zone, organoid) that are dynamically studied in terms of calcium shifts. The model chosen to illustrate the results is the retina, a simple tissue with complex cellular interactions. Calcium is a universal messenger involved in most of the important cellular roles. We explain in a step-by-step protocol how retinal neuron-glial cells in culture can be prepared and evaluated, envisioning calcium shifts. In this model, we differentiate neurons from glia based on their selective response to KCl and ATP. Calcium permeable receptors and channels are selectively expressed in different compartments. To analyze calcium responses, we use ratiometric fluorescent dies such as Fura-2. This probe quantifies free Ca2+ concentration based on Ca2+-free and Ca2+-bound forms, presenting two different peaks, founded on the fluorescence intensity perceived on two wavelengths.

Cell calcium imaging is a versatile methodology to study dynamic signaling of individual cells, on mixed populations in culture or even on awakened animals, based on the expression of calcium-permeable channels/receptors that gives unique functional signatures.

הדמיה של שינויים במעגל נוירון-גליה בטכניקת הדמיית הסידן

Here, we report on selective in vitro models of circuits based on glia (astrocytes, oligodendrocytes, and microglia) and/or neurons from peripheral ...

<meta charset="utf8"></head><body>טכניקת הדמיה ברזולוציה גבוהה לאיתור מיקרו-דומיינים Ca2+ בתאי T

Imaging Initial Ca2+ Microdomains in Primary T Cells

Local, sub-second Ca2+ signals, termed Ca2+ microdomains, are highly dynamic and short-lived Ca2+ signals, which result in a global [Ca2+]i elevation and might already determine the fate of a T cell. Upon T cell receptor activation, NAADP is formed rapidly, binding to NAADP binding proteins (HN1L/JPT2, LSM12) and their respective receptors (RyR1, TPC2) sitting on intracellular Ca2+ stores, like the ER and lysosomes, and leading to subsequent release and elevation of [Ca2+]i. To capture these fast and dynamically occurring Ca2+ signals, we developed a high-resolution imaging technique using a combination of two Ca2+ indicators, Fluo-4 AM and FuraRed AM. For postprocessing, an open-source, semi-automated Ca2+ microdomain detection approach was developed based on the programming language Python. Using this workflow, we are able to reliably detect Ca2+ microdomains on a subcellular level in primary murine and human T cells in high temporal and spatial resolution fluorescence videos. This method can also be applied to other cell types, like NK cells and murine neuronal cell lines.

<meta charset="utf8"></head><body>מחבר זרקור: חשיפת ההפעלה הראשונית של התגובה החיסונית הנרכשת להתערבות טיפולית

Here, we provide a comprehensive protocol to resolve initial local Ca2+ signals, known as Ca2+ microdomains, in primary murine and human T cells using fluorescence microscopy. This protocol serves as a valuable resource for researchers examining Ca2+ signaling pathways within immune cells and to further unravel their function.

הדמיה ראשונית של מיקרודומיינים Ca2+ בתאי T ראשוניים

Local, sub-second Ca2+ signals, termed Ca2+ microdomains, are highly dynamic and short-lived Ca2+ signals, which result in a global [Ca2+]i elevation and ...

ההדמיה המקומית Ca

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

סידן הדמיה תפקודית בפיתוח רשתות קליפתיים

בהדמיה עצבית סיד vivo ב C. elegans

סידן פלואורסצנטי הדמיה ובעקבות היברידיזציה באתרו לאפיון עצבי בלתי מבשר בקספוס זריזה

לשעבר Vivo הדמיה של סידן לתא ספציפי איתות על הסינפסה התלת-צדדי של הסרעפת העכבר

דיסקציה של Ca מקומי^{2 +} אותות בתאים בתרבית על ידי קרום, ממוקדות Ca^{2 +} אינדיקטורים

הדמיית סידן חיה של חד-שכבות אורגנואידים במעי אנושי נגועים בנגיף באמצעות מדדי סידן מקודדים גנטית

הדמיית סידן חיה של חד-שכבות אורגנואידים במעי אנושי נגועים בנגיף באמצעות מדדי סידן מקודדים גנטית

הדמיית סידן חיה של חד-שכבות אורגנואידים במעי אנושי נגועים בנגיף באמצעות מדדי סידן מקודדים גנטית

הדמיה של שינויים במעגל נוירון-גליה בטכניקת הדמיית הסידן

הדמיה ראשונית של מיקרודומיינים Ca²⁺ בתאי T ראשוניים