This work was supported by National Institutes of Health grants GM 100201 to I.F.S, and GM 048071 and GM 065830 to I.P.

אנו מציגים נהלים מפורטים להדמית Ca 2 + אירועים מקומיים בתאי SH-SY5Y נוירובלסטומה האנושית. ניתן להתאים נהלים אלה ל2+ אותות תאיים תמונת Ca בסוגי תאים רבים 8-10. 1. הכנת תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות התאים להיות צילמו על פי הוראות המופיעות באתר האינטרנט של הספק שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמה ימים לפני ההדמיה, תאי קציר גדלו בבקבוק תרבות רקמות באמצעות 1 מיליליטר של 0.25% טריפסין / EDTA (2-3 דקות). בעקבות ניתוק, להוסיף נפח שווה של תקשורת בתרבות כדי להשבית טריפסין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ספירת תאים באמצעות hemocytometer וזרע תאים לתוך מנות הדמיה זכוכית תחתונה בצפיפות של 3-7 x 10 4 תאים לכל צלחת. בחרו את תאים לניסויי הדמיה כאשר הם מגיעים למפגש 60% (2-3 ימים). </li></ol> 2. הכנת פתרונות וריאגנטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן HEPES Ca 2 + המכיל נאגרתמיסת מלח (Ca 2 + -HBSS) מורכב מ( מ&quot;מ): 135 NaCl, 5.4 KCl, 2 CaCl 2, 1 MgCl 2, 10 HEPES, ו -10 גלוקוז; pH = 7.4 בטמפרטורת חדר (RT) עם NaOH. הכן -HBSS Ca 2 + ללא תוספת סוכר ובחנות ב 4 ° C; להוסיף גלוקוז לפתרון מייד לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Solubilize צורות קרום-permeant של Ca 2 + מחוון ניאון קאל-520 (1 מ&quot;מ), ci-IP 3 (200 מיקרומטר), וEGTA (100 מ&quot;מ) בsulfoxide דימתיל (DMSO) המכיל 20% F-127 pluronic. Aliquot ריאגנטים אלה לתוך צינורות Eppendorf וחנות, מוגנים מפני לחות והאור, ב -20 ° C. </li></ol> 3. תאי Loading עם ממברנה-permeant קאל-520, ci-IP 3 וEGTA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את &quot;מאגר הטעינה&quot; על ידי דילול פתרונות מניות של קרום-permeant קאל-520 וci-IP 3 לריכוז סופי של 5 מיקרומטר ו 1 מיקרומטר, בהתאמה, ב-HBSS Ca 2 +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב מ&quot;קתקשורת וlture לשטוף תאים על ידי החלפת מדיה עם Ca 2 + -HBSS שלוש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר Ca 2 + -HBSS דגירה תאים במאגר טעינה במשך 60 דקות ב RT בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מאגר טעינה ולשטוף תאים על ידי החלפת מדיה עם Ca 2 + -HBSS שלוש פעמים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם תרצה, בשלב זה, תאי עומס עם EGTA / AM על ידי דילול מניות הפתרון לריכוז סופי של 5 מיקרומטר Ca 2 + -HBSS ולאחר מכן דגירה תאים במשך 30-60 דקות ב RT בחושך. לאחר דגירה זה, לשטוף תאים שלוש פעמים עם -HBSS Ca 2 + לפני שתמשיך לשלב 3.5. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים ב-HBSS Ca 2 + למשך 30 דקות כדי לאפשר לדה-esterification של חומרים כימיים טעונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לפני ההדמיה, להחליף -HBSS Ca 2 + 2 + עם -HBSS &quot;הטרי&quot; Ca כדי להסיר כל צבע שאולי דלף לאמבטיה במהלך הדגירה הסופית. </li></ol> 4. Ca 2 + </sup&gt; רכישת תמונה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום טיפה קטנה של שמן טבילה על מטרת 100X APO TIRF (NA 1.49). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר צלחת ההדמיה על הבמה של מיקרוסקופ ההפוך ולהביא את התאים אל מוקד באמצעות אור מועבר. חשוב כדי להבטיח את צלחת ההדמיה כדי למנוע תנועה במהלך הקלטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להאיר תאים עם לייזר 488 ננומטר כדי לרגש את קאל-520 ולאסוף הקרינה נפלטת (λ&gt; 510 ננומטר) באמצעות מצלמה EMCCD במהירות גבוהה. הערה: חבילת התוכנה המפעילה את המיקרוסקופ מאפשרת למשתמש לתרגם עדשה מתמקדת המאפשרת את קרן הלייזר שהציגה גם בקצה הקיצוני של הצמצם חזרה האובייקטיבי (לעירור TIRF) או מרכזי יותר (לעירור &quot;WF&quot;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בתוכנת EMCCD, להפחית תחום ההדמיה מ512 x 512 פיקסלים מלאים על מנת לאסוף נתונים ברזולוציה של הזמן הדרוש כדי ללכוד Ca 2 + אירועים מקומיים. הערה: לדוגמא, quad מרכזרכישה של 256 x 256 פיקסלים מאיצה את קצב הרכישה ל -66 fps. אפשר גם להגדיל עוד יותר את קצב הפריימים של המצלמה EMCCD 500 fps באמצעות פונקצית מצב יבול מבודדת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיר את התוכנה כדי להקליט באופן אוטומטי כמה שניות של פעילות בסיסית, לספק הבזק UV לתאים ולהמשיך להקליט עוד שניות 10-30. הערה: פלאש UV מועבר באמצעות מקור אור קסנון הקשת הציג דרך UV משקף מראה dichroic ביציאה האחורית של המיקרוסקופ. המשך ועוצמת פלאש UV מותאם באופן אמפירי לעורר תדירות רצויה של Ca 2 + אירועים מקומיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור קבצים בתמונת ערימות לניתוח off-line. </li></ol> 5. ניתוח 2 + תמונה האוטומטית Ca הערה: ניתן להציג, תהליך ולנתח נתונים שנתפסו באמצעות הרבה חבילות תוכנה מסחריות. עם זאת, יש לנו פיתחנו אלגוריתם לאוטומציה זיהוי במהירותניתוח ד של Ca 2 + אותות מקומיים. תיאור מפורט של מסנני מרחב ובזמן בשימוש באלגוריתם זה, ניתן למצוא דור של ΔF / F 0 והזדהות / ניתוח שגרה ב -11. אלגוריתם זה פותח כדי לרוץ על Python פלטפורמת תוכנה בקוד הפתוח, וניתן להשיג, יחד עם מדגם נתוני ניסוי והוראות למשתמש מפורטים, על ידי המחבר המקביל בדואר אלקטרוני (ismith@uci.edu). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המרת קבצים ללהיות מיובא לתוך האלגוריתם אישית בכתב לפורמט קובץ .tiff רב המטוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר את התיקייה המכילה את אלגוריתם הניתוח ולחץ לחיצה כפולה על run.exe. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את קובץ .tiff להיות מנותח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר פרמטרים ניתוח בתיבת הדו-שיח הפתוחה. ראה איור 2 א לפרמטרים ברירת מחדל עבור נתוני המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את הרמה השחורה יש לקזז מהערימה התמונה או על ידי הזזת הסמן לחלק משדה הראייה שעושה not מכיל תא (ראה איור 2) או על ידי הזנת רמה שחורה באמצעות הפקודה &#39;רמת צבע השחורה בהגדרה&#39; ידני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב ארבעה חלונות במסך הבאים ניתוח על ידי התוכנה (איור 2C-F). C הוא תמונה בשחור-לבן של מנוחה הקרינה מהתאים להיות מנותחת. ריבועים לבנים על גבי תמונה זו הם מקומות אירוע, שנקבעו כעמדות centroid של פונקציות גאוס דו-ממדיות המותאמות לאירועים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על כל מיקום אירוע או לחץ על מקשי סמן למחזור בין אירועים. על כך מופחת רקע, גאוס החליק שינויי יחס הקרינה (ΔF / F 0) בכל אחד מהאתרים הללו העדכון בחלון ד הערה: אדום מודגש אירועים נחושים מקורן אתר מסוים ושלא מ&#39;לדמם דרך &quot;מפעילות המקומית לאתרים סמוכים. העקבות הכחולות התחתונות מציינת היכן אותות הקרינה באתר שנבחר חרגו מזיהויסף, ואילו הקו השחור מזהה אירועים שמקורם באתר מסוים ש( המקביל ל האדום מודגש אירועים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על אדום מודגש אירוע לעדכן E חלון המציגה את האבולוציה הזמנית של האירוע, וF חלון המציג את הפרופיל המרחבי של האירוע בממוצע לכל מהלך הזמן שלה, יחד עם הפרופיל המרחבי של פונקצית גאוס המצויד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן ידני לסקור את האירועים שזוהו כך שניתן לדחות ממצאים מניתוח. מחק אירועים כגון על ידי לחיצה ימנית האדום מודגש אירועים. הערה: בידיים שלנו, Ca 2 + שטף דרך ערוצי IP 3 R יחידים מעורר אותות עם ΔF / F 0 על 0.11, כך שכל &#39;אירועים&#39; זוהו קטנים יותר במידה ניכרת מזה צפויים להיות חיובי שגוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתוני יצוא על ידי בחירה &#39;שמור ל- Excel&#39; או לייצא נתונים על בסיס לכל תא על ידי ציור סביב התא של עניין ובחירה &#39;שמור CellR17 ;. הערה: הנתונים נשמרים באותה התיקייה כמו ערימת התמונה המקורית. </li></ol>

<ol>
	<li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling.">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).</li><li>Hill-Eubanks, D. C., Werner, M. E., Heppner, T. J., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+in+smooth+muscle.">Calcium signaling in smooth muscle.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (9), a004549 (2011).</li><li>Hagenston, A. M., Bading, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+in+synapse-to-nucleus+communication.">Calcium signaling in synapse-to-nucleus communication.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), a004564 (2011).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elementary+and+global+aspects+of+calcium+signalling.">Elementary and global aspects of calcium signalling.</a> J Physiol. 499 (Pt 2), 291-306 (1997).</li><li>Lipp, P., Niggli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hierarchical+concept+of+cellular+and+subcellular+calcium+signalling).">A hierarchical concept of cellular and subcellular calcium signalling).</a> Prog Biophys Mol Biol. 65 (3), 265-296 (1996).</li><li>Parker, I., Yao, Y., Ilyin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+kinetics+of+calcium+liberation+induced+in+Xenopus+oocytes+by+photoreleased+inositol+trisphosphate.">Fast kinetics of calcium liberation induced in Xenopus oocytes by photoreleased inositol trisphosphate.</a> Biophys J. 70 (1), 222-237 (1996).</li><li>Minta, A., Kao, J. P., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+cytosolic+calcium+based+on+rhodamine+and+fluorescein+chromophores.">Fluorescent indicators for cytosolic calcium based on rhodamine and fluorescein chromophores.</a> J Biol Chem. 264 (14), 8171-8178 (1989).</li><li>Demuro, A., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+activity+and+localization+of+single+voltage-gated+Ca(2+)+channels+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Imaging the activity and localization of single voltage-gated Ca(2+) channels by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophys J. 86 (5), 3250-3259 (2004).</li><li>Smith, I. F., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+quantal+substructure+of+single+inositol+trisphosphate+receptor+channel+activity+during+calcium+puffs+in+intact+mammalian+cells.">Imaging the quantal substructure of single inositol trisphosphate receptor channel activity during calcium puffs in intact mammalian cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (15), 6404-6409 (2009).</li><li>Reissner, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+postsynaptic+mechanism+for+heterosynaptic+sharing+of+short-term+plasticity.">A novel postsynaptic mechanism for heterosynaptic sharing of short-term plasticity.</a> J Neurosci. 30 (26), 8797-8806 (2010).</li><li>Ellefson, K. S., Parker, B., Smith, I., F, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+algorithm+for+automated+detection,+localization+and+measurement+of+local+calcium+signals+from+camera-based+imaging.">An algorithm for automated detection, localization and measurement of local calcium signals from camera-based imaging.</a> Cell Calcium. , (2014).</li><li>Smith, I. F., Wiltgen, S. M., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+puff+sites+adjacent+to+the+plasma+membrane:+Functional+and+spatial+characterization+of+calcium+signaling+in+SH-SY5Y+cells+utilizing+membrane-permeant+caged+inositol+trisphosphate.">Localization of puff sites adjacent to the plasma membrane: Functional and spatial characterization of calcium signaling in SH-SY5Y cells utilizing membrane-permeant caged inositol trisphosphate.</a> Cell Calcium. 45, 65-76 (2009).</li><li>Shuai, J., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+single-channel+recording+by+imaging+calcium+flux+through+individual+ion+channels:+theoretical+considerations+and+limits+to+resolution.">Optical single-channel recording by imaging calcium flux through individual ion channels: theoretical considerations and limits to resolution.</a> Cell Calcium. 37 (4), 283-299 (2005).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

אנו מתארים כאן פרוטוקולי הדמיה Ca 2 + אירועים מקומיים בתאי יונקים בתרבית באמצעות Ca 2 + אינדיקטורים ניאון. יתר על כן, אנו מתארים אלגוריתם עם ממשק משתמש אינטואיטיבי המאפשר אוטומצית זיהוי וניתוח של נתונים שנרכשו. ההליך המתואר כאן לנצל את Ca 2 + מחוון ניאון ק?...

יוני סידן (Ca 2 +) בכל מקום להסדיר במגוון רחב של תהליכים ביולוגיים, כוללים ביטוי גנים, הפרשה ושינויים ארוכי טווח בפלסטיות הסינפטית 1. אחת דרכים שבאמצעותו Ca 2 + יכול לפעול באופן שונה היא באמצעות דפוסי מרחב ובזמן השונים של Ca 2 + אותות תא יכול לייצר. לגבה דוגמא העולמיים בcytosolic התכווצות הדק [Ca 2 +] ברקמת שריר חלק 2 ואילו קטן יותר, גבהים חולפים מקומיים (Ca 2 + microdomains המקומי) לעורר ביטוי גנים חיוני ללמידה וזיכרון 3. cytosolic חינם [Ca 2 +] נשמר במנוחה ~ 100 ננומטר, אבל במהירות יכול לעלות לכמה מיקרו-טוחנת הבאות הזרם של Ca 2 + לcytosol דרך Ca 2 + תעלות יונים -permeable ממוקמות בקרום הפלזמה ועל ידי השחרור של Ca 2 + משל תאיתtores. המעבדה שלנו מתמקדת בקולט אינוסיטול 1,4,5-trisphosphate (IP 3 R), אשר מהווה ערוץ הפצת Ca 2 + הממוקם בקרום reticulum endoplasmic (ER). על הכריכה של שני IP 3 וCa 2 + לcytosolic הפעלת אתרים של הקולטן, ערוץ R IP 3 נפתח לשחרור Ca 2 + מוחרם בתוך לומן ER. שחרורו של Ca 2 + עשוי להישאר מוגבל מרחבית למקבץ קטן של IP 3 R כדי ליצור microdomain cytosolic מקומי של Ca 2 + (Ca 2 + נשיפה 4) או, בהתאם לקרבה של אשכולות הסמוכות של IP 3 Rs, רשאי להפיץ בכל תא על ידי גיוס אתרי נשיפה מרובים באמצעות תהליך של Ca 2 + -release Ca 2 + -induced (CICR) 5,6. ההקדמה של צבעי המחוון 2 + מולקולה קטנה ניאון Ca שפותחה על ידי רוג&#39;ר 7 Tsien, בשילוב עם imagi מיקרוסקופיה המתקדמת<html> ng טכניקות, יש להקל באופן משמעותי את ההבנה של Ca 2 + איתות שלנו. התקדמות שחלה באחרונה מצלמות המשמשות למיקרוסקופיה בחברה מאפשרת הדמיה Ca 2 + אירועים מקומיים חולפים כמו פחזנית עם רזולוציה מרחב ובזמן חסרת תקדים. כיום מצלמות זמינות EMCCD לאפשר הדמיה עם 128 x 128 פיקסלים ב&gt; 500 מסגרות לשנייה -1 (fps) והדור החדש של מוליכים למחצה תחמוצת מתכת משלימות מצלמות (CMOS) מספקות רזולוציה גבוהה יותר פיקסל, ומהירות אפילו מהר יותר על חשבון מעט גבוה יותר רמות רעש. בשיתוף עם מיקרוסקופיה הכוללת ההשתקפות פנימית (TIRF) ניתן כיום לתמונה Ca 2 + אחד אירועי ערוץ 8,9. גישה זו מאפשרת להדמיה של מאות ערוצים / אירועים בו זמנית, תוך יצירת קבוצות גדולות נתונים (בערך 1Gb לדקה) ההופכים את העיבוד ידני, זיהוי חזותי וניתוח מעשי ולמקם את אחריות על הפיתוח של אלגוריתמים אוטומטיים. s = &quot;jove_content&quot;&gt; כאן, אנו מציגים נהלים ופרוטוקולים להדמית Ca 2 + אותות מקומיים בתאי יונקים שלמים באמצעות Ca 2 + אינדיקטורים ניאון. בנוסף, אנו מראים אלגוריתם שפותח בפייתון סביבת הקוד הפתוח המאפשר אוטומצית זיהוי וניתוח של 2 + Ca אירועים המקומיים צילמו על ידי שני TIRF ומיקרוסקופיה עלית הקרינה שדה רחב קונבנציונלית (WF). למרות שאנו מתארים גישות אלה בהקשר של IP 3 -generated Ca 2 + אותות, הם ניתנים בקלות ללמוד שינויים מקומיים בcytosolic [Ca 2 +] הנובעים ממגוון רחב של Ca 2 + תעלות יונים -permeable ממוקמות באו המשטח קרום או אברונים תוך-תאיים 8-10.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1055">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:813px;">Name</td>
			<td style="width:124px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalogue No.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human Neuroblastoma SH-SY5Y cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2266</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cal-520/AM</td>
			<td>AAT Bioquest Inc.</td>
			<td>21130</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">ci-IP3 (D-23-O-Isopropylidene-6-O-(2-nitro-4.5-dimethoxy)benzyl-myo-Inositol 145-trisphosphate-Hexakis(propionoxymethyl)</td>
			<td>SiChem</td>
			<td>cag-iso-2-145-10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO/20% pluronic F127</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P-3000MP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA/AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E-1219</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35 mm glass-bottom imaging dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35-1.5-14-C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging local ca2+ signals in cultured mammalian cells

Cytosolic Ca 2 + יונים להסדיר היבטים רבים של פעילות סלולרית כמעט בכל סוגי תאים, שליטה תהליכים רחבה היקף כמו שעתוק הגנים, רגישות חשמל וחלוקה של תאים. הגיוון והסגוליות של Ca 2 + איתות נובעים ממנגנונים שבאמצעותם Ca 2 + אותות נוצרים לפעול על סולמות זמן ומרחב שונים, הנעים בין תנודות תא-רחב וגלים המתרחשים על פני תקופות של דקות לCa 2 + microdomains החולף המקומי (2 + Ca פחזנית) אלפיות שנייה קיימא. התקדמות שחלה באחרונה באלקטרון כפול CCD מצלמות (EMCCD) כעת לאפשר להדמיה של 2 + אותות Ca המקומיים עם רזולוציה מרחבית 128 x 128 פיקסלים בשיעורים של&gt; 500 מסגרות לשנייה -1 (fps). גישה זו היא מקבילה מאוד ומאפשרת ניטור סימולטני של מאות ערוצים או אתרי נשיפה בניסוי יחיד. (1 PE Gb בערך עם זאת, הכמויות עצומות של נתונים שנוצרודקות r) להבהיר זיהוי חזותי וניתוח של Ca 2 + אירועים המקומיים מעשי. כאן אנו מתארים ומדגימים את ההליכים לרכישה, האיתור, וניתוח של ה- IP המקומי 3 בתיווך Ca 2 + אותות בתאי יונקים שלמים עמוסים 2 + אינדיקטורים Ca באמצעות שתי עלית הקרינה רחב בתחום (WF) והשתקפות פנימית מוחלטת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (TIRF). יתר על כן, אנו מתארים אלגוריתם שפתח בתוך Python סביבת תוכנת הקוד הפתוח שממכן את זיהוי וניתוח של Ca 2 + אותות המקומיים אלה. אלגוריתם localizes אתרים של Ca 2 + שחרור עם רזולוציה תת-פיקסל; מאפשר סקירת משתמש של נתונים; ופלטי רצפים של אותות יחס הקרינה זמן יחד עם משרעת ונתונים הקינטית בשולחן Excel תואם.

איור 1 א מציג תמונת WF של מנוחה הקרינה קאל-520 בתאי נוירובלסטומה SH-SY5Y האנושיים טעונים גם עם ci-IP 3. חשיפה של תאים אלה לבזק 100 UV msec לתמונה-שחרור i-IP 3 עוררה Ca 2 + פחזניות חולפות באתרים בדידים (שצוין על ידי העיגולים הלבנים באיור 1 א). עקבות הקרינ?...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells at JoVE.com

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

ההדמיה המקומית Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; אותות בתאי יונקים בתרבית

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

imaging-local-ca2-signals-in-cultured-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

10.7K Views.  University of California, Irvine. Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Video: Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

לטווח ארוך הדמיה בתאי יונקים באמצעות מיקרוסקופית שדה רחב

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in live cells. Here we describe the method used in our laboratories for loading suspensions of human sperm with Ca2+-reporting dyes and measuring the fluorescence signal during physiological stimulation. Motile cells are isolated by direct swim-up and incubated under capacitating conditions for 0-24 h, depending upon the experiment. The cell-permeant AM (acetoxy methyl ester) ester form of the Ca2+-reporting dye is then added to a cell aliquot and a period of 1 h is allowed for loading of the dye into the cytoplasm. We use visible wavelength dyes to minimize photo-damage to the cells, but this means that ratiometric recording is not possible. Advantages and disadvantages of this approach are discussed. During the loading period cells are introduced into an imaging chamber and allowed to adhere to a poly-D-lysine coated coverslip. At the end of the loading period excess dye and loose cells are removed by connection of the chamber to the perfusion apparatus. The chamber is perfused continuously, stimuli and modified salines are then added to the perfusion header. Experiments are recorded by time-lapse acquisition of fluorescence images and analyzed in detail offline, by manually drawing regions of interest. Data are normalized to pre-stimulus levels such that, for each cell (or part of a cell), a graph showing the Ca2+ response as % change in fluorescence is obtained.

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Stimulus-evoked [Ca2+]i signals of individual human sperm are assessed. Motile cells are loaded with Ca2+-sensitive fluorescent dye (AM-ester method) and immobilised in a perfusable chamber. Cells are imaged by time-lapse fluorescence microscopy and stimulated via the perfusing medium. Responses of single cells (or regions) are analysed offline using Excel.

טכניקות הדמיה Ca 2 + איתות זרע אנושי

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

המשימה esiRNA עבור הקרנת RNAi בתאי יונקים

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

הקרינה מבוסס מדידה הכניסה חנות המופעל הסידן בתאים חיים: מתא הסרטן תרבותי כדי סיב שריר שלד

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

ניתוח של עמדת מחזור התא בתאי יונקים

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

ויזואליזציה של תחומי משנה reticulum endoplasmic בתאים בתרבית

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ imaging data is time consuming and subject to bias. Automated signal analysis algorithms based on region of interest (ROI) detection have been implemented for one-dimensional line scan measurements, but there is no current algorithm which integrates optimized identification and analysis of ROIs in two-dimensional image sequences. Here an algorithm for rapid acquisition and analysis of ROIs in image sequences is described. It utilizes ellipses fit to noise filtered signals in order to determine optimal ROI placement, and computes Ca2+ signal parameters of amplitude, duration and spatial spread. This algorithm was implemented as a freely available plugin for ImageJ (NIH) software. Together with analysis scripts written for the open source statistical processing software R, this approach provides a high-capacity pipeline for performing quick statistical analysis of experimental output. The authors suggest that use of this analysis protocol will lead to a more complete and unbiased characterization of physiologic Ca2+ signaling.

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Here a novel region of interest analysis protocol based on sorting best-fit ellipses assigned to regions of positive signal within two-dimensional time lapse image sequences is demonstrated. This algorithm may enable investigators to comprehensively analyze physiological Ca2+ signals with minimal user input and bias.

ניתוח האוטומטי של דינמי Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; אותות ברצפי תמונות

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

הקרנת siRNA לזיהוי יוביקוויטין ורגולטורים מערכת דמויות יוביקוויטין של מסלולים ביולוגיים בתאי יונקים בתרבית

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

מדידה של רמות הרן סינתזה בתאי יונקים

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.