이 작품은 NIH GM62999, NIH EB007268, NIH AG15820, B &amp; B Seed Grant 및 NIH Supplemental Grant, FR, BB Fellowship to CM, RG CDT Fellowship에서 지원되었습니다.

1. 슬라이드 준비 <ol><li> 장소 당 22cm x 40mm 유리 현미경 슬라이드 6cm 세포 문화 요리, 접시 당 1 슬라이드. </li><li> 멸균 후드에서 살균하기 위해 15-20 분 동안 자외선 (UV) 빛에 각 슬라이드뿐만 아니라 6cm 요리의 각 측면을 노출. </li><li> parafilm으로 내부 슬라이드로 접시를 덮고 4 ° C에서 사용할 준비가 될 때까지 보관하십시오. </li></ol> 2. 배지, 완충액, 용액 및 시약의 준비 <ol><li> 탈 이온수에 행크의 균형 소금 용액 (HBSS) 1 L를 준비하고 10 MM HEPES, 5 MM NaHCO 3 및 1 MM EGTA를 추가합니다. NaOH로 pH 7.2-7.3으로 조정한다. 0.22 μm 필터를 가진 완충액을 오토 클레이브 한 병에 넣습니다. </li><li> 탈 이온수에서 고 포도당 Dulbecco Modified Eagle &#39;s Medium (DMEM) 900 mL를 준비한다. 44 MM NaHCO 3 를 첨가하고 HCl로 pH 7.2-7.3을 조정한다. Autoclaved 병에 0.22 μm의 필터와 미디어를 필터링합니다. 태아 보비 100 mL를 넣는다.(FBS)을 첨가하여 FBS 농도를 10 %로 만든다. 4 ° C에서 보관하십시오. </li><li> 탈 이온수에서 세포 내 버퍼 (125 MM KCl, 25 MM NaCl, 10 MM HEPES, 0.2 MM CaCl 2 , 0.5 MM EGTA, 0.2 MM MgCl 2 )의 1 L을 준비하고 7.25로 산도를 조정합니다. 최종 [칼슘 2+ ]는 ~ 100nM입니다. 사용하기 전에 0.5 mM ATP를 첨가하십시오. 실내 온도에 보관하십시오. </li><li> 탈 이온수에 링거 완충액 (121 MM NaCl, 2.4 MM K 2 HPO 4 , 0.4 MM KH 2 PO 4 , 10 MM HEPES 및 1.2 MM MgCl 2 ) 1 L를 준비하고 pH를 7.2로 조정합니다. 실내 온도에 보관하십시오. 50 ML 튜브로 나누어지는 50 ML을 사용하고 1.8 MM 칼슘 2 + 및 10 MM 포도당을 추가하십시오. </li><li> 탈 이온수에서 1L의 KCl 헹굼 용액 (125mM KCl, 25mM NaCl, 10mM HEPES, 0.2mM MgCl 2 )을 준비하고 pH를 7.25로 맞 춥니 다. </li><li> 디메틸 술폭 사이드 (DMSO) 1 mL에 이오 노마 이신 5 mg을 녹인다. Microtubes에 나누어지는 30 μL 및 -20에 저장6; C. </li><li> CPA를 DMSO에 녹여 시클로 피아 존산 (CPA) 스톡을 준비하십시오. apoptosis를 방지하기 위해 세포에 첨가 된 CPA에 대해 DMSO의 최종 비율이 1 % 이하인지 확인하십시오. 여과 된 H 2 O에 용해시켜 37 ℃에서 밤새 녹인 후 20 mM 4- 클로로 -m- 크레졸 (4-cmc)을 준비한다. 100mM로 여과 된 H 2 O에 용해시켜 ATP 스톡을 준비한다. </li><li> 원위치 K d 를 결정하기 위해, 1 mM EGTA, 0.2 mM, 0.6 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 50 mM 및 100 mM Ca 2+ 를 각각 100 mL mM EGTA 스톡 및 1M CaCl2 스톡을 탈 이온수에 용해시켰다. </li></ol> 3. 세포 배양 <ol><li> 문화 C2C12 myoblast 및 HEK293 세포 멸균 자외선 후드에있는 10cm 세포 배양 접시를 사용하여 각각에 대한 ATCC 프로토콜. 참고 : C2C12 세포는 myoblast가 differentia 시작하기 때문에 ~ 70 % 이상의 합류보다 성장 허용해서는 안됩니다te로 myotubes. HEK293과 C2C12 세포는 쉽게 자라며 세포의 완전성을 유지하기 위해 100 % 이상의 농도로 성장하지 않아야합니다. 또한, 세포 건강을 보존하기 위해 실험을 위해 사용하기 전에 세포를 10 배 이상 통과 시켜서는 안됩니다. </li></ol> 4. HEK293 세포의 형질 감염 <ol><li> HEK293 세포를 멸균 된 22mm x 40mm 유리 현미경 슬라이드에 6cm 접시에 넣어서 형질 감염 당일 ~ 70 %의 합류가되도록하십시오. </li><li> 다음날, 감소 된 혈청 배지 ( 예 : Opti-MEM)에서 2 μg의 CatchER + cDNA와 1 : 3 (중량 / 부피) DNA : 형질 전환 시약 비율을 사용하여 세포를 형질 감염시키는 형질 전환 시약에 대한 제조업체의 프로토콜을 따르십시오. </li><li> 접시에서 DMEM 미디어를 비우고 감소 혈청 미디어 3 ML을 추가합니다. DNA : transfection 시약 혼합물을 접시에 넣고 37 ℃에서 4 ~ 6 시간 동안 배양합니다. </li><li> 인큐베이션 후, 세포를 HBSS 5-6 mL로 세척한다. HBSS f 삭제ROM 접시를 교체하고 신선한 DMEM 3 ML로 교체하고 GECI의 표현을 허용하기 위해 48 시간 동안 37 ° C에서 그들을 품어. </li><li> C2C12 myoblast 세포의 형질 감염 <ol><li> C2C12 myoblast 세포의 경우, 접시 (1-2 mL)의 바닥을 덮을만큼 충분한 trypsin을 첨가하여 세포를 트립신 처리하십시오. 접시의 바닥에서 세포를 느슨하게 트립신 수 있도록 2-6 분 37 ° C 배양기에 접시를 놓습니다. </li><li> 부화가 완료되면 트립신을 제거하고 DMEM 8 ML에있는 세포를 대기음. DMEM으로 철저히 피펫 세포를 고르게 분산시키고 재현 탁하고 최종 합류가 60 %가되도록 DMEM 3 mL가 들어있는 6 cm 세포 배양 접시에 멸균 된 coverslips 위에 뿌린다. </li><li> 4.2-4.3 단계에서 설명한대로 세포를 transfect하십시오. 37 ° C에서 24 시간 동안 품어 낸다. </li><li> 4.4 단계를 반복하십시오. </li></ol></li></ol> 5. 슬라이드 및 형광 현미경의 제작 <ol><li> m을 켭니다.icroscope 및 광원을 선택한 다음 Simple PCI 프로그램을 엽니 다. 현미경이 15-20 분 동안 또는 전하 결합 소자 (CCD) 카메라가 -65 ° C까지 냉각 될 때까지 기다립니다. 기다리는 동안 챔버를 준비하고 세포와 함께 슬라이드. </li><li> 면봉으로 얇은 층의 실런트로 로우 프로파일 오픈 다이아몬드 욕조 영상 실을 덮으십시오. </li><li> 인큐베이터에서 transfected 세포를 포함하는 슬라이드를 가져 가라. 37 ℃로 예열 된 10 mM 포도당과 1.8 mM Ca 2+ 가있는 링거 완충액 1 mL로 부드럽게 3 회 씻어 낸다. </li><li> 세포가 말라는 것을 막기 위해 접시에 링거 완충액 1 mL를 놓고 접시에서 슬라이드를 꺼내기 위해 집게를 사용하십시오. 슬라이드의 가장자리를 실험실 조직에 접촉하여 과도한 용액을 실험실 조직에 흡수시킵니다. 그런 다음 셀이 그리스를 향하게하여 그리스가 들어있는 챔버의 측면에 놓고 드라이버를 사용하여 스테이지 마운트 위에 챔버를 고정시킵니다. </li><li> 1 추가챔버에 스테이지를 장착하고 나머지 현미경 셋업을 완료하는 동안 세포가 건조되는 것을 방지하기 위해 챔버에 링거 완충액 (mL)을 넣었다. 일단 진공 흡입 호스가 챔버에 부착되면 챔버가 보유하는 최종 용적은 ~ 450 μL입니다. </li><li> 현미경 대물 렌즈를 40X 오일 침지 대물 렌즈로 전환하십시오. </li><li> 렌즈 종이와 렌즈 세정액을 사용하여 세척하고 건조시킵니다. 목적을 문지르지 마십시오. 표면이 깨끗해질 때까지 살살하십시오. </li><li> 1 방울의 침지 오일을 목표물에 첨가하십시오. </li><li> 현미경 스테이지에 마운트를 놓고 진공 팁을 챔버에 추가하십시오. 일단 진공 흡입 호스가 챔버에 부착되고 켜지면 챔버가 보유하는 최종 용적은 ~ 450 μL입니다. 이 최종 볼륨은 챔버의 측면과 수평입니다. 과충전으로 인해 용액이 목표로 쏟아지는 것을 막기 위해 실험 중에 챔버 용액이 수평을 유지하는 것이 필수적입니다. </li><li&gt; 목표물을 높이고 목표물의 오일이 슬라이드의 바닥에 닿을 때까지 거친 조정을 사용하십시오. </li><li> 명 시야 모드를 사용하여 게인을 175로 조정하고 노출 시간을 0.03 초로 조정하여 셀을 초점에 맞 춥니 다. </li><li> 세포가 집중되면 488 nm 여기를 사용하여 형광 모드로 전환합니다. 노출 시간을 0.07 초로 변경하십시오. 이미지에 적절한 형광으로 건강한 세포가 충분한 시야를 찾습니다. </li><li> 시야가 선택되면 형광 및 명 시야 모드로 사진을 찍습니다. </li><li> 셀에서 관심 영역 (ROI)에 동그라미를 치거나 전체 셀을 선택 영역에서 강도를 기록합니다. </li></ol> 6. 이미징 약물 유발 칼슘 2 + 과도 및 현장 K d 보정 <ol><li> 5 초마다 1로 설정된 프레임 속도로 강도 측정을 시작하십시오. </li><li> 베이스 라인 강도가 20-30 프레임 (100-150 초) 동안 안정되도록하십시오. 필요한 경우 fr을 줄입니다.ames / s이 단계 동안 photobleaching을 방지합니다. </li><li> 200 μM의 최종 농도를 만들기 위해 ~ 450 μL의 최종 챔버 볼륨을 기반으로 20 MM 주식에서 필요한 4-cmc의 금액을 계산합니다. 필요에 따라 주식을 희석하십시오. </li><li> 조심스럽게 챔버에서 링어 완충액 60 μL를 취하여 미세 원심 분리 튜브에 넣으십시오. 이 용액으로 계산 된 4-cmc의 양을 희석하고 챔버에 다시 추가하여 이미지화되는 세포로부터 의도 된 반응을 유발하십시오. </li><li> 계산 된 양의 4-cmc를 미세 원심 분리 관에 넣고 피펫 팅으로 혼합하십시오. </li><li> 시야각 위에 솔루션을 부드럽게 추가하는 동시에 강도 측정에서 이벤트 마커를 추가하십시오. </li><li> 약물이 수용체에 결합하고 신호가 감소 할 때까지 기다린 다음 1.8mM Ca 2+ 와 10mM 포도당이 포함 된 3-6mL의 링거 완충액으로 동시에 닦으십시오. 동시에 이벤트 마커를 추가하십시오. 챔버 체적이 450 &amp; lt;# 181; L이고 진공 상태로 연결되어 있으며 3-6 mL의 완충액을 첨가하여 이전 약물이 함유 된 용액을 씻어 내고 새롭게 첨가 된 용액으로 교체합니다. </li><li> 각 분석에 대해 transfected 세포의 새로운 슬라이드를 사용하여 100 μM ATP 및 15 μM CPA에 대해 6.1-6.7을 반복하십시오. </li><li> 측정이 완료되면 Simple PCI 프로그램의 강도 측정 창에서 데이터 수집을 종료하십시오. </li><li> 세포의 형광 및 명 시야 사진을 찍습니다. </li><li> 실험을 위해 데이터 파일을 엽니 다. 필요한 경우 강도 값을 다시 계산하기 위해 관심있는 셀 또는 영역을 다시 표시하십시오. </li><li> C2C12 myoblast 세포 에서 in situ K d 를 결정하기 위해서는 section 4.2와 section 5에 명시된 protocol을 따르고 chamber에 0 mM Ca 2+ Ringer &#39;s buffer 1 mL를 넣는다. <ol><li> 15-30 초 동안 세포 내 완충액에 0.002-0.005 % saponin으로 세포를 침투시켜 모든 세포를 비우십시오.CatchER + 는 세포질에있을 수 있습니다. 10 μm의 ionomycin와 KCl 버퍼에 1 ML EGTA 3 ~ 6 ML로 세포를 씻으십시오. 고원에 도달 할 때까지 강도를 줄이십시오. </li><li> 10 μm의 ionomycin와 KCl 버퍼 3 ~ 6 ML로 씻어 강도가 안정되도록, 다음 각 칼슘 2 + 단계 2.7에서 자세한 솔루션을 추가합니다. 각 추가 사이의 강도가 고원에 도달하도록 허용하십시오. </li></ol></li><li> 기초 [Ca 2+ ] 정량을 위해 센서를 보정하려면 단계 6.12를 따르십시오. 최소 및 최대 형광 강도를 얻으려면 단계 2.7에서 EGTA와 100 MM 칼슘 2 + 버퍼를 사용하십시오. </li></ol> 7. 데이터 처리 <ol><li> 강도 측정 데이터의 스프레드 시트 파일을 다운로드하십시오. </li><li> 각 셀의 데이터를 기준 강도 (F / F 0 )로 표준화합니다. 모든 그래프 프로그램에서 정규화 된 데이터 대 시간을 플롯합니다. </li><li> % 변화를 계산하려면 표준화 된 피크 값을 빼십시오.1을 곱하고 100을 곱합니다. 여러 셀을 이미징 한 경우 평균 및 표준 편차를 계산합니다. </li><li> 신호대 잡음비, SNR을 계산하려면 실험에서 저장 한 이미지 파일을 ImageJ와 같은 이미지 처리 소프트웨어에서 열고 시그널, 감염된 세포 및 노이즈, 배경을 측정합니다. 방정식 SNR = 신호 / 잡음을 사용하여 SNR을 계산하십시오. </li><li> 수집 된 형광 이미징 데이터 에서 현장 K D 를 계산하려면 각 칼슘 2 + 농도와 EGTA (0 MM 칼슘 2 + )의 추가 후 평원을 포함하는 평균 데이터를 평균. θ = (F - F min ) / (F max - F min )을 사용하여 분수 채도 (상대 강도)를 계산하십시오. 여기서 θ는 상대 강도, F는 임의 지점에서의 형광, F min 은 최소 형광 강도, Fmax는 최대 형광 강도이며, t의 강도 변화를 확인합니다.그는 최소 강도와 비교하여 칼슘 2+를 첨가하여 탐침한다. 모든 그래프 및 곡선 피팅 프로그램에서 [Ca 2+ ]에 대한 상대 강도 데이터를 플롯합니다. 임의의 그래프 및 곡선 적합 프로그램에 대해 변환 된 1 : 1 결합 방정식 θ = [M T ] / (K d + [M T ])를 사용하여 K d 를 계산하십시오. M T 는 총 금속 농도이다. </li><li> 6.13에 요약 된 보정에서 기본 칼슘을 정량하기 위해 1 mM EGTA (F min ) 및 100 mM Ca 2+ (F max )를 첨가 한 후 평형을 구성하는 강도 데이터를 평균화합니다. 기본 칼슘을 계산하기 위해 교정 공식 [Ca 2+ ] = K d ([F - F min ) / (F max - F)]를 사용하십시오. </li></ol>

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R., Golbik, R., Sever, R., Haseloff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+that+suppress+the+thermosensitivity+of+green+fluorescent+protein.">Mutations that suppress the thermosensitivity of green fluorescent protein.</a> Current Biology. 6 (12), 1653-1663 (1996).</li><li>Reddish, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Design Of Genetically-Encoded Ca2+ Probes With Rapid Kinetics for Sub-Cellular Application [dissertation]. , (2016).</li><li>Seo, M. D., Enomoto, M., Ishiyama, N., Stathopulos, P. B., Ikura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+endoplasmic+reticulum+stored+calcium+regulation+by+inositol+1,4,5-trisphosphate+and+ryanodine+receptors.">Structural insights into endoplasmic reticulum stored calcium regulation by inositol 1,4,5-trisphosphate and ryanodine receptors.</a> Biochim. Biophys. Acta-Mol. Cell Res. 1853 (9), 1980-1991 (2015).</li><li>Lambert, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Calcium signaling protocols. , (1999).</li><li>Stephens, D. J., Allan, V. 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CatchER + 와 같은 형광 프로브의 라이브 싱글 셀 이미징은 수용체 아고 니스트 또는 길항제에 대한 반응으로 각 세포에서 복잡한 ER / SR Ca 2+ 신호 전달 프로세스를 분석하는 효과적인 기술입니다. 이 기술은 Fura-2에 필요하거나 CatchER + 와 Rhod-2를 함께 사용하여 ER과 cytosolic calcium change를 동시에 모니터링하는 것과 같이 동시에 여러 파장을 사용하여 이미징하는 데 유용합니다...

세포 내 칼슘 (Ca 2+ ) 과도의 시공간적 특성은 다양한 생물학적 기능을 활성화시킨다 1 . 이러한 Ca 2+ 신호 전달 사건은 다른 자극을 통해 세포 외적으로 유발되어 주요 Ca 2+ 저장 기관과 수많은 Ca 2+ 펌프, 채널 및 Ca 2+ 결합 단백질에 의해 세포 내로 조절됩니다. Ca 2+ 과도 현상은 신호 변조로 인한 결함으로 인해 크게 달라질 수있어 다른 질병을 유발할 수 있습니다 2 . Ca 2+ 시그널링 시스템의 속도와 복잡성 때문에, 중심에서 endo- (ER)와 sarcoplasmic reticulum (SR)을 이용하여 빠른 속도론으로 포유류 발현을 위해 최적화 된 유 전적으로 암호화 된 Ca 2+ 프로브가 필요합니다 다른 세포에서 전지구 및 국부적 인 Ca 2+ 변화를 관찰 3 . ER과 SR, 근육 세포의 대응, 주요 세포 내 칼슘 2 + 저장 organelles 있으며 칼슘 2 + 싱크대 역할을 칼슘 2 + 신호 4 증폭하는 데 도움이됩니다. ER / SR은 신호의 송수신기 역할을하는 Ca 2+ 시그널링에서 필수적인 부분입니다. 리아 노딘 수용체 (RyR)와 이노시톨 1,4,5- 트리 포스페이트 수용체 (IP 3 R)는 Ca 2+ 6 에 의해 조절되는 ER / SR 막에 위치한 Ca 2+ 방출 수용체이다. 다른 약제는 이러한 수용체의 기능을 직접 또는 간접적으로 자극합니다. 4- 클로로 -m- 크레졸 (4-cmc)은 RyR의 강력한 효능 제이며, SRCa2 방출을 유도하기 위해 카페인보다 10 배 더 높은 감도를 가지며,이 둘 모두 RyR- 중재 된 Ca2 + 방출을 연구하는데 규칙적으로 사용된다 건강하고 병든 세포 7 . ATP는 IP 3 중재 된 칼슘 2+를 증가시킵니다.IP 3 R 8 을 통해 임대하십시오. ATP는 purinergic receptor P2YR, G-protein coupled receptor (GPCR)와 결합하여 IP 3 R에 결합하여 ER 3 , 10 으로부터 Ca 2+ 를 유리시키는 IP 3 의 생산을 촉발한다. sarco-endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) 펌프는 세포 내 Ca 2+ 를 감소시키고 ER / SR 루멘으로 이온을 능동적으로 펌핑하여 ER / SR을 재충전하는 ER / SR 막에 위치한 P 형 ATPase 펌프입니다 11 . SERCA 펌프의 특이적인 억제제는 아스 페르 길 루스 (Aspergillus ) 및 페니실린 (Penicillium)으로부터의 Thapsigargin , Thapsia garganica 및 CPA (cyclopiazonic acid)를 포함 한다. CPA는 펌프에 대한 친 화성이 낮고 Ca 2+ 액세스 포인트 12를 가역적으로 차단합니다. 다른 한편, aps시 가르 긴은 M3 헬릭스에서 나노 몰과 함께 F256 잔기의 칼슘 2+ 프리 펌프에 돌이킬 수 없게 결합한다ar 친화 도 11 . Ca 2+ 자극 사건과 관련된 변화를 분석하고 정량화하는 것은 여전히 ​​도전 과제입니다. ER / SR은 Ca 2+ 신호의 전파에 중요한 역할을하는 주요한 세포 내 Ca 2+ 함유 구획이기 때문에 많은 연구가 ER / SR Ca 2+ 신호 전달 5 에 초점을 맞추고 있습니다. 합성 Ca 2+ 염료의 생성은 칼슘 2 + 영상의 현장 및 실습을 발전시키는 데 도움이되었습니다. Mag-Fura-2와 같은 염료가 다른 세포에서 구획화 된 Ca 2+ 를 측정하는 데 널리 사용되었지만 13,14,15 염색 불균일 로딩, 광 표백 및 특정 세포 소기관을 타깃으로 할 수없는 것과 같은 한계가 있습니다 . 녹색 형광 단백질 (GFP)의 발견과 형광 단백질 -기반의 칼슘 2 + 프로브는 칼슘 2 + 전진 16 의 분야를 추진하고 있습니다. 기존 GECI의 일부는 황색 형광 단백질 (YFP), 시안 형광 단백질 (CFP), 칼 모듈 린 및 M13 결합 펩타이드 17 , 18을 포함 하는 포스터 공명 에너지 전달 (FRET) 쌍입니다. 트로포 닌 C 기반 GECI는 CFP와 Citrine의 FRET 쌍과 단일 형광 단 프로브 19 , 20 , 21로 사용할 수 있습니다. GCaMP2와 R-GECO와 같은 다른 것들은 calmodulin과 관련된 단 하나의 형광 단 센서이다 22 , 23 . Ca 2+ 결합 도메인 24 에서 발견되는 여러 Ca 2+ 결합 부위와 관련된 K d 와 협동 결합의 좁은 튜닝의 한계를 극복하기 위해 새로운 종류의 칼슘 원sors는 향상된 녹색 형광 단백질 (EGFP) 25 , 26 의 발색단 민감한 위치에서 베타 배럴의 표면에 칼슘 2 + 바인딩 사이트를 설계하여 만들어졌습니다. CatchER라고 불리는이 고도의 센서는 ~ 0.18 mM의 Kd, 확산 한계 근처의 아크 및 700 s -1 의 아크 오프 를 가지고 있습니다. CatchER는 HeLa, HEK293 및 C2C12와 같은 다른 포유류 세포주에서 수용체 매개 ER / SR 칼슘 방출을 모니터링하는 데 사용되었습니다. 그것의 빠른 동력학 때문에, CatchER는 FDB에서 탈분극 2 초 후에 더 많은 칼슘 2+ 가 SR에 남아 있음을 밝히기 위해 젊고 오래된 Friend Virus B NIH Jackson (FVB) 생쥐의 flexor digitorum brevis (FDB) 근육 섬유에 사용되었습니다. 젊은 쥐의 섬유와 비교 한 늙은 쥐의 섬유 27 . 포유 동물의 칼슘 이미징에서 그 적용을 방해하는 37 ° C에서 낮은 형광을 극복하기 위해우리는 CatchER + 라는 CatchER의 개선 된 버전을 개발했습니다. CatchER + 는 포유류 세포에서 더 잘 응용되기 위해 37 ℃에서 향상된 형광성을 나타냅니다. 추가적인 돌연변이가 CatchER에 통합되어 37 ° C 28 , 29 ° C에서 열 안정성과 형광성을 향상시켜 CatchER + 를 만들 수 있습니다. CatchER + 는 CatchER 30 보다 신호 대 잡음비 (SNR)가 6 배 증가합니다. 여기에서 CatchER + 를 이용한 HEK293 및 C2C12 세포의 배양 및 형질 감염에 대한 프로토콜과 ER / SR 수용체 매개 형 과도 현상을 모니터링하는 방법이 제시됩니다. 대표적인 결과는 4-cmc, CPA 및 ATP로 처리 된 HEK293 세포에서 발현 된 CatchER + 에 대해 나타내었다. 우리는 또한 C2C12 myoblast 세포와 qua에서 CatchER + 의 in situ Kd를 결정하기위한 프로토콜을 제공한다기초 [Ca 2+ ]의 함량.

<table><tbody><tr><td>4-Chloro-3-methylphenol (4-CmC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C55402</td><td></td></tr><tr><td>515DCXR dichroic mirror</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>NC338059</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&amp;prime;-triphosphate disodium salt hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A26209</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate</td><td>EMD Millipore</td><td>102382</td><td></td></tr><tr><td>Corning tissue-culture treated culture dishes (100 mm)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430167</td><td></td></tr><tr><td>Corning tissue-culture treated culture dishes (60 mm)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430166</td><td></td></tr><tr><td>Cyclopiazonic Acid (CPA)</td><td>EMD Millipore</td><td>239805</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucose</td><td>ACROS Organics</td><td>41095-0010</td><td></td></tr><tr><td>Dow Corning 111 Valve Lubricant &amp;amp; Sealant</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0275</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle&amp;rsquo;s Medium (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7777</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenebis(oxyethylenenitrilo)&lt;br/&gt; tetraacetic Acid (EGTA)</td><td>ACROS Organics</td><td>409911000&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>26140087</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Cover Glasses 22x40 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>&amp;nbsp;12-544B</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; Balanced Salts (HBSS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4891</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, Free Acid, Molecular Biology Grade</td><td>EMD Millipore</td><td>391340</td><td></td></tr><tr><td>Immersion Oil without autofluorescence</td><td>Leica</td><td>11513859</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin, Free Acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-230-5804</td><td></td></tr><tr><td>Leica DM6100B inverted microscope with a cooled EM-CCD camera</td><td>Hamamatsu</td><td>C9100-13</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td><td>ThermoFisher</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td><td>ThermoFisher</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26GLP</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>ThermoFisher</td><td>51985034</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>EMD Millipore</td><td>PX1405</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate, Dibasic</td><td>EMD Millipore</td><td>PX1570</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate, Monobasic</td><td>EMD Millipore</td><td>PX1565</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>SimplePCI Image Analysis Software</td><td>Hamamatsu</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-3</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>Sterivex-GV 0.22 &amp;micro;m filter</td><td>EMD Millipore</td><td>SVGVB1010</td><td></td></tr><tr><td>Till Polychrome V Xenon lamp</td><td>Till Photonics</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin (2.5%), no phenol red (10x)</td><td>ThermoFisher</td><td>15090046</td><td></td></tr></tbody></table>

monitoring er/sr calcium release with the targeted ca2+ sensor catcher+

세포 외 자극에 의해 유발 된 세포 내 칼슘 (Ca 2+ ) 과도 현상은 살아있는 유기체에서 수많은 생물학적 과정을 일으킨다. 세포 내 칼슘 방출의 중심에는 주요 세포 내 칼슘 저장 소기관, 소포체 (endoplasmic reticulum, ER) 및 근육 세포에서보다 특이적인 소구엽 (sarcoplasmic reticulum, SR)이있다. 이러한 세포 소기관에서 칼슘의 동적 방출은 raranodine 수용체 (RyR)와 이노시톨 1,4,5- 트리 포스페이트 수용체 (IP 3 R)에 의해 매개되며, sarco / endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) 펌프를 통해 재충전이 일어납니다. ER / SR에서 급속한 칼슘 방출을 모니터링하기 위해 유 전적으로 코딩 된 칼슘 센서 (GECI) 인 CatchER를 만들었습니다. 여기에서 HEK293 및 C2C12 세포에서 개선 된 ER / SR 표적 GECI CatchER + 의 형질 감염 및 발현에 대한 상세한 프로토콜 및 IP 3 R, RyR 및 SERCA 펌프 매개 형 과도 단백질의 모니터링에 대한 적용s가 형광 현미경을 사용하여 HEK293 세포에서 설명됩니다. 수용체 작용제 또는 선택 억제제를 챔버 용액에 분산시키고 강도 변화를 실시간으로 기록한다. 이 방법으로 ER 칼슘의 감소는 4- 클로로 -m- 크레졸 (4-cmc)에 의한 RyR 활성화, 아데노신 트리 포스페이트 (ATP)에 의한 IP 3 R의 간접적 활성화, 사이클로 피아 조 닉성을 지닌 SERCA 펌프의 억제 산 (CPA). 우리는 또한 in situ K d 를 결정하고 C2C12 세포에서 기저 [Ca 2+ ]를 정량화하기위한 프로토콜을 논의한다. 요약하면, CatchER + 와 함께 사용되는이 프로토콜은 ER / SR 칼슘 관련 병리학을 연구 할 때 ER에서 수용체 매개 칼슘 방출을 유도 할 수 있습니다.

이 섹션은 다른 수용체 매개 경로를 통해 ER / SR 칼슘 2 +의 변화를 모니터링하기 위해 최적화 된 ER / SR 타겟 GECI CatchER + 를 사용하여 이전에 설명한 방법을 사용하여 달성 된 결과를 설명합니다. 그림 1 은 200 μM 4-cmc로 자극 된 RyR을 통한 ER 비우기를 보여줍니다. 4-cmc는 RyR의 항진제입니다....

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Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

우리는 실시간 형광 현미경을 사용하여 HEK293 및 골격근 C2C12 세포의 소포체 / sarcoplasmic reticulum (ER / SR)에서 빠른 칼슘 과도 현상을 모니터링하기위한 우리의 표적 유전자 코딩 칼슘 지시약 (GECI) CatchER +의 적용 을위한 프로토콜을 제시합니다. 현장 K d 측정 및 교정을위한 프로토콜도 논의됩니다.

표적화 된 Ca를 이용한 ER / SR 칼슘 방출 모니터링<sup&gt; 2+</sup&gt; 센서 캐쳐<sup&gt; +</sup

Intracellular calcium (Ca2+) transients evoked by extracellular stimuli initiate a multitude of biological processes in living organisms. At the center of ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

14.8K 조회수.  Georgia State University.  우리는 실시간 형광 현미경을 사용하여 HEK293 및 골격근 C2C12 세포의 소포체 / sarcoplasmic reticulum (ER / SR)에서 빠른 칼슘 과도 현상을 모니터링하기위한 우리의 표적 유전자 코딩 칼슘 지시약 (GECI) CatchER +의 적용 을위한 프로토콜을 제시합니다. 현장 K d 측정 및 교정을위한 프로토콜도 논의됩니다. 

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In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

C.의 생체 Neuronal 칼슘 이미징에서 elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

연구

신경과학

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, differentiation, and apoptosis1. During apoptosis, calcium accumulation in mitochondria promotes the release of pro-apoptotic factors from the mitochondria into the cytosol2. It is therefore of interest to directly measure mitochondrial calcium in living cells in situ during apoptosis. High-resolution fluorescent imaging of cells loaded with dual-excitation ratiometric and non-ratiometric synthetic calcium indicator dyes has been proven to be a reliable and versatile tool to study various aspects of intracellular calcium signaling. Measuring cytosolic calcium fluxes using these techniques is relatively straightforward. However, measuring intramitochondrial calcium levels in intact cells using synthetic calcium indicators such as rhod-2 and rhod-FF is more challenging. Synthetic indicators targeted to mitochondria have blunted responses to repetitive increases in mitochondrial calcium, and disrupt mitochondrial morphology3. Additionally, synthetic indicators tend to leak out of mitochondria over several hours which makes them unsuitable for long-term experiments. Thus, genetically encoded calcium indicators based upon green fluorescent protein (GFP)4 or aequorin5 targeted to mitochondria have greatly facilitated measurement of mitochondrial calcium dynamics. Here, we describe a simple method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes in response to different stimuli. The method is based on fluorescence microscopy of 'ratiometric-pericam' which is selectively targeted to mitochondria. Ratiometric pericam is a calcium indicator based on a fusion of circularly permuted yellow fluorescent protein and calmodulin4. Binding of calcium to ratiometric pericam causes a shift of its excitation peak from 415 nm to 494 nm, while the emission spectrum, which peaks around 515 nm, remains unchanged. Ratiometric pericam binds a single calcium ion with a dissociation constant in vitro of ~1.7 &mu;M4. These properties of ratiometric pericam allow the quantification of rapid and long-term changes in mitochondrial calcium concentration. Furthermore, we describe adaptation of this methodology to a standard wide-field calcium imaging microscope with commonly available filter sets. Using two distinct agonists, the purinergic agonist ATP and apoptosis-inducing drug staurosporine, we demonstrate that this method is appropriate for monitoring changes in mitochondrial calcium concentration with a temporal resolution of seconds to hours. Furthermore, we also demonstrate that ratiometric pericam is also useful for measuring mitochondrial fission/fragmentation during apoptosis. Thus, ratiometric pericam is particularly well suited for continuous long-term measurement of mitochondrial calcium dynamics during apoptosis.

This protocol describes a method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes by fluorescent imaging. The method takes advantage of a circularly permutated YFP-based dual-excitation ratiometric calcium sensor (ratiometric pericam-mt) selectively expressed in mitochondria.

유전자 변형으로 인코딩된 칼슘 센서를 사용하여 Apoptosis 동안 Mitochondrial 칼슘 레벨에서 동적 변경 사항 모니터링

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

생물학

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 complex in the ER membrane provides an aqueous path for newly-synthesized polypeptides into the lumen of the ER. Recent work from various laboratories suggested that this heterotrimeric complex may also form transient Ca2+ leak channels2-8. The key observation for this notion was that release of nascent polypeptides from the ribosome and Sec61 complex by puromycin leads to transient release of Ca2+ from the ER. Furthermore, it had been observed in vitro that the ER luminal protein BiP is involved in preventing ion permeability at the level of the Sec61 complex9,10. We have established an experimental system that allows us to directly address the role of the Sec61 complex as potential Ca2+ leak channel and to characterize its putative regulatory mechanisms11-13. This system combines siRNA mediated gene silencing and live cell Ca2+ imaging13. Cells are treated with siRNAs that are directed against the coding and untranslated region (UTR), respectively, of the SEC61A1 gene or a negative control siRNA. In complementation analysis, the cells are co-transfected with an IRES-GFP vector that allows the siRNA-resistant expression of the wildtype SEC61A1 gene. Then the cells are loaded with the ratiometric Ca2+-indicator FURA-2 to monitor simultaneously changes in the cytosolic Ca2+ concentration in a number of cells via a fluorescence microscope. The continuous measurement of cytosolic Ca2+ also allows the evaluation of the impact of various agents, such as puromycin, small molecule inhibitors, and thapsigargin on Ca2+ leakage. This experimental system gives us the unique opportunities to i) evaluate the contribution of different ER membrane proteins to passive Ca2+ efflux from the ER in various cell types, ii) characterize the proteins and mechanisms that limit this passive Ca2+ efflux, and iii) study the effects of disease linked mutations in the relevant components.

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

The endoplasmic reticulum plays a key role in protein biogenesis and in calcium homeostasis. We have established an experimental system that allows us to address the role of Ca2+ leak channels and to characterize their putative regulatory mechanisms. This system involves siRNA mediated gene silencing and live cell Ca2+ imaging.

siRNA의 중재 진 입을와 결합 라이브 세포 칼슘 영상은 CA를 나타냅니다 2 + ER 막의 누출 채널과 규제 메커니즘

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 ...

Assessment of Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve and Intracellular Diastolic Calcium Removal in Isolated Ventricular Cardiomyocytes

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Cardiac sarcoplasmic reticulum (SR) serves as a Ca2+ reservoir for contraction, which reuptakes intracellular Ca2+ during relaxation. The SR Ca2+ reserve available for beats is determinate for cardiac contractibility, and the removal of intracellular Ca2+ is critical for cardiac diastolic function. Under some pathophysiological conditions, such as diabetes and heart failure, impaired calcium clearance and SR Ca2+ store in cardiomyocytes may be involved in the progress of cardiac dysfunction. Here, we describe a protocol to evaluate SRCa2+ reserve and diastolic Ca2+ removal. Briefly, a single cardiomyocyte was enzymatically isolated, and the intracellular Ca2+ fluorescence indicated by Fura-2 was recorded by a calcium imaging system. To employ caffeine for inducing total SR Ca2+ release, we preset an automatic perfusion switch program by interlinking the stimulation system and the perfusion system. Then, the mono-exponential curve fitting was used for analyzing decay time constants of calcium transients and caffeine-induced calcium pulses. Accordingly, the contribution of the SR Ca2+-ATPase (SERCA) and Na+-Ca2+ exchanger (NCX) to diastolic calcium removal was evaluated.

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Here, we describe a protocol to evaluate sarcoplasmic reticulum Ca2+ reserve and diastolic calcium removal function in cardiomyocytes by a calcium imaging system.

격리 된 심 실 Cardiomyocytes에 Sarcoplasmic 그물 칼슘 예비 및 세포내 확장기 칼슘 제거의 평가

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Cardiac sarcoplasmic reticulum ...

의학

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The coordination of two Ca2+ signal sources&#8212;&#8220;Ca2+ influx&#8221; from outside the cell and &#8220;Ca2+ release&#8221; from the intracellular Ca2+ store endoplasmic reticulum (ER)&#8212;is considered to underlie the diverse spatio-temporal patterns of Ca2+ signals that cause multiple biological functions in cells. The purpose of this protocol is to describe a new Ca2+ imaging method that enables monitoring of the very moment of &#8220;Ca2+ influx&#8221; and &#8220;Ca2+ release&#8221;. OER-GCaMP6f is a genetically encoded Ca2+ indicator (GECI) comprising GCaMP6f, which is targeted to the ER outer membrane. OER-GCaMP6f can monitor Ca2+ release at a higher temporal resolution than conventional GCaMP6f. Combined with plasma membrane-targeted GECIs, the spatio-temporal Ca2+ signal pattern can be described at a subcellular resolution. The subcellular-targeted Ca2+ indicators described here are, in principle, available for all cell types, even for the in vivo imaging of Caenorhabditis elegans neurons. In this protocol, we introduce Ca2+ imaging in cells from cell lines, neurons, and glial cells in dissociated primary cultures, and describe the preparation of frozen stock of rat cortical neurons.

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Here we present a protocol for Ca2+ imaging in neurons and glial cells, which enables the dissection of Ca2+ signals at subcellular resolution. This process is applicable to all cell types that allow the expression of genetically encoded Ca2+ indicators.

로컬 Ca2 + 신호 막 대상 Ca2 + 지표에 의해 경작된 한 세포에의 해 부

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The ...

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent Ca2+ indictors have become popular. Here we demonstrate TED (= targeted-esterase induced dye loading), a method to improve the release of Ca2+ indicator dyes in the ER lumen of different cell types. To date, TED was used in cell lines, glial cells, and neurons in vitro. TED bases on efficient, recombinant targeting of a high carboxylesterase activity to the ER lumen using vector-constructs that express Carboxylesterases (CES). The latest TED vectors contain a core element of CES2 fused to a red fluorescent protein, thus enabling simultaneous two-color imaging. The dynamics of free calcium in the ER are imaged in one color, while the corresponding ER structure appears in red. At the beginning of the procedure, cells are transduced with a lentivirus. Subsequently, the infected cells are seeded on coverslips to finally enable live cell imaging. Then, living cells are incubated with the acetoxymethyl ester (AM-ester) form of low-affinity Ca2+ indicators, for instance Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, or Mag-Fura2-AM. The esterase activity in the ER cleaves off hydrophobic side chains from the AM form of the Ca2+ indicator and a hydrophilic fluorescent dye/Ca2+ complex is formed and trapped in the ER lumen. After dye loading, the cells are analyzed at an inverted confocal laser scanning microscope. Cells are continuously perfused with Ringer-like solutions and the ER calcium dynamics are directly visualized by time-lapse imaging. Calcium release from the ER is identified by a decrease in fluorescence intensity in regions of interest, whereas the refilling of the ER calcium store produces an increase in fluorescence intensity. Finally, the change in fluorescent intensity over time is determined by calculation of &Delta;F/F0.

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading TED

Targeted-esterase induced dye loading (TED) supports the analysis of intracellular calcium store dynamics by fluorescence imaging. The method bases on targeting of a recombinant Carboxylesterase to the endoplasmic reticulum (ER), where it improves the local unmasking of synthetic low-affinity Ca2+ indicator dyes in the ER lumen.

대상 - 에스테르 가수 분해 효소와 ER 칼슘의 직접 이미징 유발 염료 로딩 (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

이미징 로컬 CA<sup&gt; 2 +</sup&gt; 배양 된 포유 동물 세포에서 신호

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic levels. Tight control over ER calcium is imperative for protein folding, modification and trafficking. Perturbations to ER calcium can result in the activation of the unfolded protein response, a three-prong ER stress response mechanism, and contribute to pathogenesis in a variety of diseases. The ability to monitor ER calcium alterations during disease onset and progression is important in principle, yet challenging in practice. Currently available methods for monitoring ER calcium, such as calcium-dependent fluorescent dyes and proteins, have provided insight into ER calcium dynamics in cells, however these tools are not well suited for in vivo studies. Our lab has demonstrated that a modification to the carboxy-terminus of Gaussia luciferase confers secretion of the reporter in response to ER calcium depletion. The methods for using a luciferase based, secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) for in vitro and in vivo applications are described herein. This video highlights hepatic injections, pharmacological manipulation of GLuc-SERCaMP, blood collection and processing, and assay parameters for longitudinal monitoring of ER calcium.

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.

사용 소포체 칼슘 항상성 모니터링<em&gt; Gaussia</em&gt; 루시 페라 제 SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...

High-Throughput Optical Controlling and Recording Calcium Signal in iPSC-Derived Cardiomyocytes for Toxicity Testing and Phenotypic Drug Screening

Understanding how excitable cells work in health and disease and how that behavior can be altered by small molecules or genetic manipulation is important. Genetically encoded calcium indicators (GECIs) with multiple emission windows can be combined (e.g., for simultaneous observation of distinct subcellular events) or used in extended applications with other light-dependent actuators in excitable cells (e.g., combining genetically encoded optogenetic control with spectrally compatible calcium indicators). Such approaches have been used in primary or stem cell-derived neurons, cardiomyocytes, and pancreatic beta-cells. However, it has been challenging to increase the throughput, or duration of observation, of such approaches due to limitations of the instruments, analysis software, indicator performance, and gene delivery efficiency. Here, a high-performance green GECI, mNeonGreen-GECO (mNG-GECO), and red-shifted GECI, K-GECO, is combined with optogenetic control to achieve all-optical control and visualization of cellular activity in a high-throughput imaging format using a High-Content Imaging System. Applications demonstrating cardiotoxicity testing and phenotypic drug screening with healthy and patient-derived iPSC-CMs are shown. In addition, multi-parametric assessments using combinations of spectral and calcium affinity indicator variants (NIR-GECO, LAR-GECO, and mtGCEPIA or Orai1-G-GECO) are restricted to different cellular compartments are also demonstrated in the iPSC-CM model.

The present protocol describes all-optical control and observation of triggered cellular activity in iPSC-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs) for high throughput drug screening and toxicity testing. Multi-parametric quantification of phenotypic patterns in time, and space, are shown. Long-term effects of drugs over hours, or sequential measurements over days, are demonstrated.

독성 테스트 및 표현형 약물 스크리닝을 위해 iPSC 유래 심근 세포에서 칼슘 신호를 고처리량 광학 제어 및 기록

Understanding how excitable cells work in health and disease and how that behavior can be altered by small molecules or genetic manipulation is important. ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall health. A significant portion of intracellular Ca2+ content is found within the SR stores in VSMCs. As the only intracellular organelle with a close association to the surrounding extracellular space through plasma membrane-SR junctions, the SR can be considered to constitute the first line of response to any irregularity in Ca2+ transients, or stress experienced by the cell. Among its many functions, one of the most important is its role in the transmission of Ca2+-regulated signals throughout the cell to induce further cell-wide reactions downstream. The more common use of cytoplasmic Ca2+ indicators in this regard is overall insufficient for research into the highly dynamic changes to the intraluminal SR Ca2+ store that have yet to be fully characterized. Here, we provide a detailed protocol for the direct and clear measurement of luminal SR Ca2+. This tool is useful for investigation into the nuanced changes in SR Ca2+ that have significant subsequent effects on the normal function and health of the cell. Fluctuations in SR Ca2+ content specifically can provide us with a significant amount of information pertaining to cellular responses to disease or stress conditions experienced by the cell. In this method, a modified version of a SR-targeted Ca2+ indicator, D1SR, is used to detect Ca2+ fluctuations in response to the introduction of agents to cultured rat aortic smooth muscle cells (SMCs). Following incubation with the D1SR indicator, confocal fluorescence microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based imaging are used to directly observe changes to intraluminal SR Ca2+ levels under control conditions and with the addition of agonist agents that function to induce intracellular Ca2+ movement.

Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

배양 된 평활근 세포의 근질 그물 자리 내 칼슘 변동 FRET 측정을 기반으로 공 촛점 이미지

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

표적화 된 Ca를 이용한 ER / SR 칼슘 방출 모니터링

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

C.의 생체 Neuronal 칼슘 이미징에서 elegans

유전자 변형으로 인코딩된 칼슘 센서를 사용하여 Apoptosis 동안 Mitochondrial 칼슘 레벨에서 동적 변경 사항 모니터링

siRNA의 중재 진 입을와 결합 라이브 세포 칼슘 영상은 CA를 나타냅니다^{2 +} ER 막의 누출 채널과 규제 메커니즘

격리 된 심 실 Cardiomyocytes에 Sarcoplasmic 그물 칼슘 예비 및 세포내 확장기 칼슘 제거의 평가

로컬 Ca^{2 +} 신호 막 대상 Ca^{2 +} 지표에 의해 경작된 한 세포에의 해 부

대상 - 에스테르 가수 분해 효소와 ER 칼슘의 직접 이미징 유발 염료 로딩 (TED)

이미징 로컬 CA

사용 소포체 칼슘 항상성 모니터링

독성 테스트 및 표현형 약물 스크리닝을 위해 iPSC 유래 심근 세포에서 칼슘 신호를 고처리량 광학 제어 및 기록

배양 된 평활근 세포의 근질 그물 자리 내 칼슘 변동 FRET 측정을 기반으로 공 촛점 이미지