אנו מודים לעובדים במתקני הליבה במכון פרנסיס קריק (מתקן מחקר ביולוגי, בויו דימות והיסטופתולוגיה ניסיונית) ויולנדה סאבדרה-טורס ומרצדס סאנצ&#39;ס-גרזון, הווטרינרים בקריק וב- LRI בהתאמה, על עזרתם החשובה. אנו מודים לד&quot;ר וו גריי על קריאת כתב היד. DP נתמך על ידי עמית מחקר קליני של EHA. עבודה זו נתמכה על ידי מכון פרנסיס קריק, שמקבל את המימון הליבה שלו ממחקר הסרטן בבריטניה (FC001045), המועצה למחקר רפואי בבריטניה (FC001045), ואת Welcome Trust (FC001045).

למחברים אין מה לחשוף.

<html> משמעות ביחס לשיטות הקיימות: בפרוטוקול זה, תיארנו שיטה ליצירת microenvironments אנושית שונים בעכברים כדי לדמיין את הארכיטקטורה שלהם באמצעות מיקרוסקופ שני פוטון היסטולוגיה. הנתונים המייצגים שסופקו מראים את ההיתכנות של הגישה, תוך שימוש בתאים סטרומה שונים להנדסת רקמות אנושיות. הפרוטוקול יש יישומים ספציפיים לחקר תאים hematopoietic האדם תאים מוח העצם נגזרות בתנאים נורמליים ופתולוגיים. יישומים אלה כוללים את המחקר של האבולוציה המשובצת, בדיקות סמים, crosstalk בין HSCs האדם רכיבים סטרומה. בתחום המתפתח של הנדסת רקמות, כמה גישות חלופיות הוצעו. גישות של הערה כוללים את הפיתוח של מבנים תלת מימדיים בבני אדם במבחנה 55 , 56 , 57 ,S = &quot;xref&quot;&gt; 58 , 59 , 60 , 61 , 62 , 63 ואת השתל אורתופוטיק של פיגומי BM אנושיים בעכברים 64 . הגישה שלנו יש את היתרון של שילוב הן המורכבות של מערכת vivo עם נגישות אנטומית קלה של שתל רקמות אנושית. שינויים ופתרון בעיות: מקור השתנות בפרוטוקול זה ניתן למצוא את הבחירה של תאים המשמש זרע את הפיגומים. בעבודה שלנו, השתמשנו BM- נגזר hMSCs. עם זאת, תאים mesenchymal ניתן להשיג מספר רקמות, אשר עשוי להראות מאפיינים ייחודיים בהתאם למקור. לכן, השימוש hMSCs נגזר איברים שונים יכולים להיחשב. עם זאת, היכולת שלהם ליצור רקמת עצם in vivo יש לבדוק לפני השימוש זה עמ &#39;פרוטוקול rotocol.This משתמשת מסחרית זמין בתא האדם האנדותל ( כלומר, E4ORF1-transduced HUVEC). לאחרונה, השימוש בתאי האנדותל ספציפיים עבור איברים למטרות שונות כבר דיווח 65 , 66 . יתר על כן, השימוש hECs העיקרי נגזר BM יכול לייצג שיפור מעניין לפרוטוקול. לכן, השימוש במקורות שונים של תאים אנדותל עשוי לייצר תוצאות שונות vivo . השתמשנו NSG immunocompromised עכברים המקבל לטובת השתלת פיגומים אנושיים כדי למנוע דחייה רקמות. אנחנו לא שוללים את האפשרות של שימוש בפרוטוקול זה כדי להנדס רקמות מוח עצם ectopic זנים העכבר אחרים. ואכן, rhBMP-2 יכול לעורר היווצרות עצם במודלים שונים של יונקים 47 , 48 , 49 , 50 <sup&gt;, 52. עם זאת, הבדלים הכדאיות התא השתלות לטווח ארוך צפויים להיות נצפו באמצעות זנים שונים / דגמים. עיתוי התאוששות הפיגומים יכול גם להיות גמיש, בהתאם המטרה הסופית של הניסוי. בפרוטוקול המוצג, אנו לשחזר דגימות ב 8-12 שבועות לאחר ההשתלה להעריך engraftment hematopoietic לטווח ארוך. כדי לחקור את השלבים המוקדמים של היווצרות האדם בנישה BM ( למשל, היווצרות רקמות אוסטאוכונדרל 47 או התפתחות כלי הדם), נקודות זמן שונות ניתן לבחור. טכניקת הדמיה חיה שתיארנו בפרוטוקול זה מסומן עבור הדמיה לטווח קצר של explants. השימוש בתא equilibrated לשמירה על טמפרטורה פיזיולוגית, מתח חמצן, ריכוז CO 2 צריך להיחשב במקרים של הדמיה לטווח ארוך, כגון ללמוד התנהגות התנהגויות. רחוב קריטיאפס בתוך הפרוטוקול: בין האתגרים הקשורים בפרוטוקול, היינו להדגיש את הכישורים הטכניים הדרושים כמה צעדים. Mesenchymal ותאי האנדותל יש להשתמש במספר נמוך תא המעבר; אחרת, הם לא יוכלו לתמוך engraftment hematopoietic תא in vivo או להשתתף wasculature נובו דה עצם היווצרות in vivo . אנו ממליצים להשתמש hMSCs ו hECs על מעברים 1 - 5. הכנת הפיגום ושלבים זריעת תאים דורשים בסיסי התרבות תאים מיומנויות וידע של המאפיינים של תאים ספציפיים בשימוש בהליך. פרוטוקול הניתוח הוא פשוט למדי, אבל דורש קצת תרגול. תחזוקה של סביבה aseptic כדי למנוע זיהום של פיגומים מושתלים בעכברים immunodeficient חיוני כדי להבטיח את הצלחת הניסוי. לדוגמה explant ו הדמיה לחיות דורשים כירורגית בפועל (במיוחד עבור השימוש של microdrill) וידע שלמערכת מיקרוסקופ. לבסוף, עיבוד דגימה והיסטולוגיה דורשים ידע בסיסי של הטכניקות לשימוש. מגבלות הטכניקה: הגישה שאנו מתארים מאפשרת הדמיה של תאים חיים hematopoietic חיים האדם זריעת microenvironment מוח העצם האנושית, עם תאים האנדותל האנושי ויוצרים מבנים וסקולריים תאים mesenchymal ויצירת העצם / מרחב מוח העצם. כמו הרקמה נוצרת in vivo , הפיגום הסופי מהונדסים עדיין יהיה chimeric (האדם ואת Murine). בעיה זו צריכה להילקח בחשבון, כמו רקמה chimeric לא יכול לחקות באופן מלא המורכבות מוח העצם האנושי והסביבה. פיגומים מושתלים יש גודל מוגבל (ניסינו מקסימלית של 6.6 x 7.5 x 7 מ&quot;מ), ולכן, הם יכולים לארח מספר מוגבל של תאים xenotransplantation. המספר המוחלט של תאים התאושש יהיה גם מוגבל; ולכן, מספר פיגומים מושתל צריךיחושב כפונקציה של מספר התאים הנדרשים לניסוי. יישום הדמיה שתיארנו הוא שימושי במיוחד עבור תצפית על שטחים גדולים של רקמה חיה בעומקים של 150-200 מיקרומטר מפני השטח מבלי לשבש את הארכיטקטורה ופגיעה בתאים. לכן, הוא אינו מאפשר הדמיה של כל הפיגום. אם סריקה מלאה של הרקמה נדרשת, גישות immunofluorescence תקן יהיה מתאים יותר. יישומים עתידיים: הכיוון העתידי של המודל הביו-הנדסי הזה יהיה להגדיל את המורכבות של המרכיבים האנושיים ברקמה. הידע והאפיון של גומחת האדם האנושי התקדמו בשנים האחרונות 67 , והפרוטוקול המתואר יכול להיות פלטפורמה מעניינת לחקור את תפקודם של מרכיבים אלה של תאים חדשים ושל גורמים מסיסים, כמו גם את תפקידם בתמיכה נורמלית /HSCs נמלים. יתר על כן, טכניקת הדמיה מספקת את הפוטנציאל הדמיה intravital של הפיגומים במחקרים אורך, אשר ידרוש שיפורים טכניים הדמיה הפיגומים בעכברים חיים, הרדים, עם ההתאוששות שלאחר הניתוח. גישה זו תידרש צעדים נוספים והיא נמצאת כעת במעבדה במעבדה.

החלטות גורל תאים שנצפו תאי תא גזע מוסדרים בחוזקה על ידי גורמים פנימיים חיצוניים. בפרט, עכשיו הוא זיהה נרחב כי microenvironment BM משחק תפקיד בסיסי בשליטה על הבורר ב- HSCs מן שקט אל מדינה פעילה, כמו גם שלהם התחדשות עצמית או הבדל ההחלטה גורל 1 . יתר על כן, הממצאים האחרונים מראים כי ממאירות המטולוגיות משפיעות על תפקוד המיקרו-סביבה של BM, ומצביעות על קיומו של crosstalk פעיל בין שני תאים 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . למרות ההתקדמות האחרונות, שאלות מפתח רבות נותרו על האופן שבו פעילותם של מרכיבי BM-Niche ספציפיים תורמת להתנהגות HSC ולטרנספורמציה ממאירה. Microenvironment BM הוא הטרוג מאוד<html> תערובת קנאית ומורכבת של סוגי תאים שונים, כל אחד עם פונקציות מיוחדות. האנדותל השופע (EC) ורכיב כלי הדם מסדירים מחזור חומרים תזונתיים ומטבוליטים, החדירה והמעבר של תאים שונים ל- BM וממנו, וכמה פונקציות HSC 7 , 8 . תאים ממאנצ&#39;ימלים סטרומלים (MSC), אוכלוסייה הטרוגנית של תאי גזע לא מובחנים ואבות שבוצעו באמצעות שלוש שושלות שונות ( כלומר, אוסטאוגני, chondrogenic, adipogenic), הם מרכיב בסיסי נוסף של נישה BM. אלה MSCs להתמקם הן באזורים מרכזיים של BM ו בקרבה לאזור endosteal. הם עשויים להיות קשורים עם מבנים וסקולריים והם מעורבים הרגולציה של הפונקציה HSC 9 , 10 , 11 , 12 , 13 ,&quot;&gt; 14 , 15 . דיווחים רבים מציעים כי HSCs מתגוררים באתרים מוגדרים שונים בתוך המוח, וכי תפקידם עשוי להיות תלוי לוקליזציה המדויק שלהם. רוב הידע הנוכחי לגבי HSCs ואת האינטראקציה שלהם עם microenvironment BM נובע ממחקרים Murine 1 . השימוש מודלים xenograft הרחיב את הידע הזה כדי HSCs נורמלי וממאיר אדם, engrafting בתוך BM Murine של עכברים immunodeficient 16 , 17 , 18 , 19 , 20 . למרות שזה מייצג מודל חוקי, הוא עדיין מציג אתגרים רבים, כגון הצורך התנאי העכבר הנמען ברוב המקרים כדי לאפשר הומאניות HSC האנושי engraftment או מחסום בין המינים והשפעתו הבינו היטב על אינטראקציות התא התא פונקציות. השימוש בנטרול נוגדנים ועכברים מהונדסים גנטית, יחד עם xenotransplantation, היה אינסטרומנטלי להדגיש את הדיאלוג המורכב כי HSCs האדם להקים עם microenvironments שלהם. ההקדמה והתפתחות של מיקרוסקופיה intravital two-photon confocal יש עבר מחקרים אלה צעד קדימה, המאפשר ישיר, ברזולוציה גבוהה, דימות דינמי של מוח העצם 19 , 20 , 21 , 22 ומספק כלי רב עוצמה עבור תפקודית אפיון של microenvironment BM ותפקידה בוויסות פונקציה HSC. על מנת לעקוף חלק מהבעיות המתעוררות במודלים קסנו-טרנסלנטליים קלאסיים, המושג הנדסה מבנה BM אנושי הובא לידי ביטוי. מיזוג בין biomaterials ו מושתל תא מושגים, דוחות הראו את הכדאיות של מחקה את עצם האדםחץ מיקרו-סביבה באזורים ההטרוטופיים 23 , 24 , 25 , 26 , 27 . זה פותח את האפשרות של שימוש bioengineering במודלים עכבר ללמוד hematopoiesis רגיל וממאיר 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , tumorigenesis, וגרורות 40 , 41 , 42 , 43 , 44 . בהתבסס על ניסיון קודם בהנדסת רקמות עצם ובדמיית vivo 19 , 22 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50 , 51 , 52 , אנו מתארים פרוטוקול של bioengineer ו- live-image organotypic BM tissues אנושיים. מבנים אלה מקורם בהשתלה של תאים אנושיים המופקעים על ידי BM- אדם לתוך פיגומים מבוססי קולגן תת עורית מורכבים בעכברים החיסוניים. בדו&quot;ח הקודם, הראינו כי MSCs אנושי להבטיח את הקמתה של microenvironment האדם מתאים engraftment של תאים hematopoietic האדם 45 . יתר על כן, כאן אנו מתארים כיצד שיתוף ההשתלה של מרכיבי האדם האחרים סלולרS, כגון תאי אנדותל אנושיים (hEC) ו / או ציטוקינים חשובים להיווצרות עצם ( למשל, hBMP2), משתפים פעולה עם hMSC כדי ליצור microenvironments אנושיים שונים, אשר ניתן לחיות הדמיה באתרם .

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>Ge Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>Cd34 positive selection Kit</td><td>Stemcell</td><td>18056</td><td>Store a 4&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Magnet</td><td>Stemcell</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human CD3 antibody, clone OKT-3</td><td>Bioxcell</td><td>BE0001-2</td><td>Store at 4&amp;deg;C. Used for T cell depletion in primary AML samples.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Cytokines (IL3, G-CSF, and TPO)</td><td>PeproTech</td><td>200-03, 300-23 and 300-18</td><td>For doing the stock: Dilute each one of the cytokines in 100 &amp;mu;L of water and mix them. Add 200 &amp;mu;L, do alicuots of 45 &amp;mu;L and Store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life technologies</td><td>10270106</td><td>Heat-inactivate at 56 &amp;deg;C during 30 min, do aliquots and freeze down. Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use.</td></tr><tr><td>MEM-&amp;alpha;</td><td>Invitrogen</td><td>32571-028</td><td>Store at 4 &amp;deg;C. Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use.</td></tr><tr><td>Myelocult H5100</td><td>corning</td><td>5100</td><td>Store at 4 &amp;deg;C. Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use.</td></tr><tr><td>199</td><td>Gibco</td><td>41150-020</td><td>Store at 4 &amp;deg;C. Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use.</td></tr><tr><td>hMSC-FBS, Heat-inactivated</td><td>Gibco</td><td>12662-029</td><td>Store at -20 &amp;deg;C. Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use.</td></tr><tr><td>P/S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td>Store at -20 &amp;deg;C. Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use.</td></tr><tr><td>ECGS</td><td>Millipore</td><td>02-102</td><td>Dilute in culture media and use 0.22 mm filter.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1558-50ML</td><td>Store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td>Store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td>Store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Collagen 1 coated cell culture plate</td><td>corning</td><td>354505</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA solution</td><td>Thermo-Fisher</td><td>25200056</td><td>Store at -20 &amp;deg;C. Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use.</td></tr><tr><td>hMSC</td><td>Lonza</td><td>PT-2501</td><td>Alternatively, hMSCs we also kindly provided by Dr. Dosquet (University Paris Diderot, Paris) from human bone marrow obtained during orthopaedic surgery under ethical approval 10-038 from IRB00006477.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>VeraVec HUVEC endothelial cells</td><td>Angiocrine bioscience</td><td>hVera101</td><td>Alternatively, other human endothelial cell source may be used.</td></tr><tr><td>Human hematopoietic cells</td><td></td><td></td><td>Umbilical Cord blood or primary Acute Myeloid Leukemia (AML) samples were obtained from the Royal London Hospital (London, UK) after informed consent and protocol of use was approved by the East London Ethical Committee and carried out in accordance with the Declaration of Helsinki.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Gelfoam, Size 12 - 7mm</td><td>Pfizer</td><td>00009-0315-08</td><td>Alternative supplier: Febelco</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo-Fisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Surgical material</td><td>Multiple</td><td></td><td>Sterile forceps, tweezers and sharp scissors.</td></tr><tr><td>Sterile tissues</td><td></td><td></td><td>Heat-sterilize paper tissues.</td></tr><tr><td>1 mL Syringe with needle of 25G</td><td>Terumo</td><td>SS+01H25161</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Low Attachment Multiple Well Plates</td><td>Corning</td><td>3473 or 3471</td><td></td></tr><tr><td>BMP2</td><td>Noricum</td><td>rhBMP-2</td><td>Dilute at 5 mg/mL in acetic acid 50 mM and store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Sigma</td><td>T8885</td><td>Dilute in CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 2%, 500 mL per vial, and store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Fibrinogen</td><td>Sigma</td><td>F3879</td><td>Dilute at 4 mg/100 mL in PBS. Store at -20 &amp;deg;C. Warm before use.</td></tr><tr><td>Tissue-culture dishes 35 mm x 10 mm</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>U-Botton 96 well plate</td><td>Falcon</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>NSG mice</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>5557</td><td>NSG mice were a kind gift from Dr Leonard Shultz (The Jackson Laboratory).</td></tr><tr><td>Chlorhexidine</td><td>G9</td><td></td><td>Dilute 1:10 before use</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Pfizer</td><td>Rimadyl</td><td>5 mg/kg of mouse</td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>Alstoe</td><td>Vetergesic</td><td>0.1 mg/kg of mouse body weight</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Abbott</td><td>B506</td><td>Induction of anaesthesia 2%, maintenance 1%</td></tr><tr><td>Trimmer</td><td>Wella</td><td>Contura HS61</td><td></td></tr><tr><td>Surgical glue</td><td>3M</td><td>Vetbond</td><td></td></tr><tr><td>carbomer (polyacrylic acid) as Ophthalmic gel</td><td>Novartis</td><td>Viscotears Liquid Gel</td><td></td></tr><tr><td>Human Normal Immunoglobulin</td><td>Gammaplex</td><td>10g vial</td><td>100 mL/mouse intravenously, 30 min before infusion of specific antibody.</td></tr><tr><td>NT-QTracker</td><td>Invitrogen</td><td>Q21021MP</td><td>Vessel-pooling agent. Administrate 15 mL/mouse intravenously 5 min before imaging.</td></tr><tr><td>AF488-hCD45</td><td>Biolegend</td><td>304017</td><td>100 mL/mouse intravenously, 30 min before imaging.</td></tr><tr><td>FITC-hCD31</td><td>BD Pharmigen</td><td>555445</td><td>100 mL/mouse intravenously, 30 min before imaging.</td></tr><tr><td>Super glue</td><td>Loctite</td><td>Super Glue</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Drill Kit</td><td>IDEAL - Fisher Scientific</td><td>NC9010016</td><td></td></tr><tr><td>Microsurgical microscope</td><td></td><td></td><td>No specific brand/company is adviced.</td></tr><tr><td>LSM 710 NLO</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Upright confocal microscope with motorized stage, two-photon laser and 20X 1.0 NA water immersion lens. Alternatively, a microscope with similar specifications could be used.</td></tr><tr><td>MaiTai &amp;ldquo;High Performance&amp;rdquo; fully automated 1-box 517 mode-locked Ti:Sapphire laser with DeepSee dispersion compensation</td><td>Spectra-Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formalin solution, neutral buffered, 10%&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32294</td><td></td></tr><tr><td>Osteosoft</td><td>Millipore</td><td>1.01728.1000</td><td></td></tr><tr><td>Polysine slices</td><td>Thermo scientific</td><td>J2800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Antigen unmasking solution</td><td>Vector</td><td>H-3300</td><td>Store at 4 &amp;deg;C. Dilute 1:100 in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O for working solution.</td></tr><tr><td>Triton 100x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A96470</td><td>Store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Normal Goat serum (NGS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td>Store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Endomucin Antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-65495</td><td>Store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>hVimentin antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-6260</td><td>Store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>hCD31 antibody</td><td>DAKO</td><td>M0823</td><td>Store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>hCD45 antibody</td><td>DAKO</td><td>M0701</td><td>Store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>ADRP (Perilipin2)</td><td>antibodies-online</td><td>ABIN283918</td><td>Store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Goat anti mouse secondary antibodies</td><td>Invitrogen</td><td>A11029 or A11005</td><td>Store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Goat anti Rabbit secondary antibodies</td><td>Invitrogen</td><td>A11037 or A11008</td><td>Store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Goat anti Rat secondary antibodies</td><td>Invitrogen</td><td>A11007 or A21247</td><td>Store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Sudan Black</td><td>Sigma</td><td>S2380</td><td>Prepare a stock of 1% sudan black in ethanol 70%. Store at RT. Prepare working solution of 0.1% sudan black in ethanol 70% and filter using filter-paper before use.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D8417</td><td>Prepare stock in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0 at 100 mg/mg. Store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Fluorescent mounting media</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td>Add DAPI before use (1:400 from DAPI stock).</td></tr><tr><td>Cover glass</td><td>VWR</td><td>631-0147</td><td></td></tr></tbody></table>

bioengineering of humanized bone marrow microenvironments in mouse and their visualization by live imaging

תאי גזע ההמטופויטים (HSCs) מתגוררים בגומחה של מח עצם (BM), רשת מורכבת ומורכבת של רכיבים המרכיבים ציטוקינים, גורמי גדילה ומטריצה ​​חוץ-תאית. היכולת של HSCs להישאר שקטים, לחדש את עצמם או להבדיל, ולרכוש מוטציות ולהפוך ממאיר תלוי אינטראקציות מורכבות שהם מקימים עם רכיבים סטרומה שונים. כדי לבחון את crosstalk בין HSCs האדם ואת גומחה BM האדם בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים, עיצבנו פרוטוקול מודל ectopically ותמונה גומחה BM האנושית בעכברים immunodeficient. אנו מראים כי השימוש של רכיבים סלולריים שונים מאפשר להיווצרות מבנים אנושיים הזדמנות לקיים engraftment hematopoietic לטווח ארוך האדם. באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים, אנו יכולים לחיות את התמונה מבנים אלה באתרו ברזולוציה תא יחיד, מתן כלי חדש עוצמה עבור אפיון פונקציונלי של האדם BMIcroenvironment ותפקידה בוויסות hematopoiesis נורמלי וממאיר.

באיור 1 , תמונות נציג של זריעת תאים פיגום ותהליכי ההשתלה מוצגים. בתרשים 1C , שים לב תאים מוזרקים ישירות לתוך הפיגום. בתרשים 1G , שים לב כי חתך נעשה בחלק האחורי של העכבר, שם נוצר כיס תת עורית ואת הפיגום הוא מושתל. איור 2 מציג את המורפולוגיה ברוטו של פיגומים שונים מושתלים בעכברים NSG ואחזר לאחר 8 שבועות. הערה וסקולריזציה קלה hMSC פיגומים פיגומים ( איור 2 א ). שיתוף זריעת של ECs אנושיים עם hMSCs ב פיגום מאפשר להיווצרות של כלי הדם הרלוונטיים יותר פיגומים ( איור 2 ב ). לבסוף, הנוכחות של rhBMP-2 מעוררת היווצרות עצם. את הפיגומים אחזור הם גדולים יותר במקרה זה, והם מיוצרים על ידיעצם הדומה לרקמה קשה. איור 3 מציג את הגדרת תצורת הערוץ על המיקרוסקופ עבור הדמיה חיה עם NDD (פרטים באגדה דמות). איור 4 ווידאו 1 להראות תאים hematopoietic האדם himsc מצופה פיגומים. פיגומים היו explanted 8 שבועות לאחר ההשתלה ואחרי חיסון תוך ורידי של נוגדן AF488-hCD45 ו 655-VPA. הליך זה מאפשר הדמיה של תאים hematopoietic מושתל האדם ואת מבנה כלי הדם על ידי מיקרוסקופ שני photon confocal. במקרה זה, התמונות מראות כלי דם (655-VPA) בפיגומים ואת engraftment לטווח ארוך של תאים hematopoietic האדם (AF488-hCD45) ב parenchyma הפיגום. איור 5 ווידאו 2 מתאימות פיגומים האדם seeded עם hECs ו hMSCs. 8 שבועות לאחר הניתוח, פיגומים היו explanted לאחר intravenחיסון ous של FITC-hCD31 נוגדן ו 655-VPA, ותמונות נרכשו עם מיקרוסקופ confocal שני פוטון, כאמור לעיל. תמונות להראות את ההשתתפות של hecs במבנה כלי שיט בתוך הפיגום, וכתוצאה מכך וסקולטור chimeric האדם Murine. איור 6 א מציג נתונים נציג של הגישה המשמשים לעורר היווצרות עצם פיגומים MSC. בדומה לנתונים קודמים, 8 שבועות לאחר ההשתלה, בוצעה חיסון תוך ורידי של 655-VPA, פיגומים נלקחו, ותמונות נרכשו עם מיקרוסקופ שני פוטון confocal. RhBMP-2-פיגומים מעוררים לגרום להיווצרות רקמות עצם, אשר יכול להיות דמיינו בשל SHG (צבע ציאן בתמונות) המסופקים על ידי סידן בעצם. התמונות שסופקו גם מראים את היווצרות חללים ורקמות אנדוסקטל וסקולרי, אשר דומה מאוד לרקמה endosteal BM. באיור 6 ב </sTrong&gt; ו וידאו 3 , hECs היו שיתוף implanted עם hmscs. פיגומים נלקחו לאחר חיסון תוך ורידי של נוגדנים FITC-hCD31 ו 655-VPA, ו -2 פוטון תמונות מיקרוסקופיה confocal להראות את השתתפותם של hECs ב neovascularization ב פיגום העצם להרכיב. איור 7 מציג תמונות מייצגות של היסטולוגיה, הליך המבוצע כדי לאשש תוצאות שתוארו לעיל. תמונות Immunofluorescent להראות vasculature העכבר, hECs, hMSCs, ו לטווח ארוך engrafted תאים hematopoietic האדם במבנים פיגומים. פיגומים שנלקחו עכברים היו קבועים המשמשים immunofluorescence. ב rhBMP-2 נושאת עצם הפיגום פיגומים ( איור 7D -F ), לציין את המורפולוגיה של הרקמה, הדומה מוח העצם בוגרת עם רקמת השומן. ב פיגום זה עצם ליצירת, אנו מראים כי hMSCs הם fibroblasts, אשר יציין tהם תורמים לרקמה שזה עתה נוצרה כתאי סטרומה. כמו כן, אנו מראים ביטוי סמן אדיפוציטים אנושיים, אשר יציין כי hMSCs גם לתרום היווצרות רקמות השומן. <img alt="איור 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55914/55914fig1.jpg" /> איור 1. נציג תמונות של זריעת תאים ותהליכי ההשתלה. א) פיגום ראשוני ושיטת חיתוך שלה באמצעות איזמל. ב) 24 חתיכות המתקבל פיגום הראשוני. ג) פיגומים תא הזרוע בשיטה באמצעות מזרק. D) פיגומים Cell seeded עם בינוני תרבות, מוכן להיות מושתל. EF) צעדים ספציפיים עבור הפיגום העצמות: E) הפיגום מועבר צלחת 96-well, U- התחתון ו F) נציג תמונה של השיטה המשמשת כדי להוסיף rhBMP2, thrombin, ופיברינוגן על הפיגום. GJ)<html> הליך ההשתלה Cal תחת הרדמה כללית: G) הפצע נוצר בהשתלת העור ואת פיגום, H) שיטת ההשתלה, IJ) הפצע הליך הסגירה באמצעות דבק כירורגי. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55914/55914fig2.jpg" /> איור 2. פיגומים שונים מאוחזרים עכברים. תמונות נציג של MSC פיגומים (משמאל), MSC + EC פיגומים (באמצע), MSC + EC + BMP פיגומים (מימין). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> 4 / 55914fig3.jpg &quot;/&gt; איור 3. תצורת ערוץ. המסנן מיקרוסקופ ההתקנה מוצג. א) ישנם ארבעה מודולים NDD גלאי: במודול הראשון, יש שני קוביות מסנן; המודולים השני והשלישי יש קובייה אחת מסנן כל; ואת המודול האחרון אין קובייה (לא בשימוש). צינור מכפיל ראשון (PMT) הוא עבור ערוץ אדום רחוק (640 - 690 ננומטר), המשקף את אורכי הגל התחתון; אלה הם 380 - 485 ננומטר, 500 - 550 ננומטר, ו 555 - 625 ננומטר (הסדר הוא תמיד מן הגל התחתון עד גבוה). ב) פליטות fluorophore לגילוי עם תצורות לעיל (מקודד צבע). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55914/55914fig4.jpg" /> איור 4. MSC פיגום<html> S לאפשר גיבוש של נישה עבור תאים heatopoietic האדם. A) ו- B) השחזור 3D של Z- ערימות נלקח שלאחר אקספלנט, לאחר חיסון תוך ורידי עם AF488-hCD45 (ירוק), כדי התווית תאים hematopoietic האדם, ו 655-VPA (מגנטה) מ כדי תווית כלי הדם. סולם ברים מייצגים 20 מיקרומטר A ו- B (לוחות העליונים) ו 5 מיקרומטר ב (לוחות התחתון). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="סרטון 1" src="/files/ftp_upload/55914/55914video1.jpg" /> וידאו 1. MSC פיגומים לאפשר לגיבוש של נישה עבור תאים heatopoietic האדם . שחזור 3D של תאים hematopoietic האדם (AF488-hCD45) הקשורים עם כלי הדם (655-VPA) ב MSC פיגום (מבנים קולגן: SHG, ציאן). כל ערימה אמצעים 140 x 140 מיקרומטר.Ef = &quot;http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914video1.mov&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה. (לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי להוריד). <img alt="איור 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55914/55914fig5.jpg" /> איור 5. ECs האדם להשתתף בהצבת כלי רכב הומאניים ב MSC פיגומים. שחזור 3D של כלי הדם (655-VPA) בשורה של ECS ממוצא אנושי (FITC-hCD31) ב MSC + EC פיגומים. פסי סולם מייצגים 20 מיקרומטר. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="סרטון 2" src="/files/ftp_upload/55914/55914video2.jpg" /> וידאו 2. אנושי ECs להשתתף בעיצוב של כלי אנושי ב MSC פיגומים. שחזור 3D של ECs האדם (FITC-hCD31) רירית VA<html> Sculature (655-VPA) ב MSC + EC פיגומים. כל ערימה אמצעים 240 x 240 מיקרומטר. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914video2.mov" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה. (לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי להוריד).</a> <img alt="איור 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55914/55914fig6.jpg" /> איור 6. rhBMP-2 פיגומים נושאות יש משטחי העצם וסקולטור אנושי דומה מח עצם. א) שחזור 3D של MSC + BMP פיגומים מראה את היווצרותם של מבנים עצם (SHG- ציאן) ו כלי הדם (655-VPA). סולם ברים מייצגים 100 מיקרומטר (משמאל), 70 מיקרומטר (באמצע), ו 50 מיקרומטר (מימין). ב) שחזור 3D של MSC + EC + BMP פיגומים מראה כלי אנושיים (655-VPA) בשורה עם ECs האדם (FITC-hCD31). סולם ברים מייצגים 50 מיקרומטר (משמאל) ו 30 מיקרומטר (באמצע וימין).14 / 55914fig6large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="וידאו 3" src="/files/ftp_upload/55914/55914video3.jpg" /> וידאו 3. rhBMP-2 המוביל פיגומים יש משטחי העצם וסקולטור אנושי דומה מח עצם. שחזור 3D של MSC + VERA + BMP פיגום (העצם: SHG; כלי: 655-VPA, ECs האדם: FITC-hCD31). כל ערימה אמצעים 600 x 600 מיקרומטר. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914video3.mov" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה. (לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי להוריד).</a> <img alt="איור 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55914/55914fig7.jpg" /> איור 7. נציג תמונות של Immunofluorescence מבוצע על פיגומים קבועים. AF) מחקרים Immunofluorescence לבצע לאיתור תאים אנושיים מושתל אניN פיגומים. AC) פיגומים מושתלים עם HECs, hMSCs, ו hHSCs. DF) עצם פיגומים המושתלים עם hECs, hMSCs, ו hHSCs. ערוצי הצבע הם כדלקמן: AD) האדם EC (hed31) ומבנה כלי הדם העכבר (endomucin, ENDOM), BE) hMSCs (hVimentin, hVIM) ואת תאי כלי הדם העכבר (endomucin, ENDOM), C) תאים hematopoietic האדם (hCD45) ו vasculature העכבר (endomucin, ENDOM), ו F) האדם שומן השונה חלבון הקשורים (hADRP) ו vasculature העכבר (endomucin, ENDOM). סולם ברים מייצגים 10 מיקרומטר (A ו- C), 20 מיקרומטר (B ו- E), ו 40 (D ו- F) מיקרומטר. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging at JoVE.com

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

שיטה ליצור ולחיות תמונות שונים מוח העצמות נישות בעכברים מוצג. בהתבסס על נישה תומכת שנוצרו על ידי תאים mesenchymal האדם, תוספת של תאים אנדותל האדם גורם להיווצרות של כלי אדם, ואילו תוספת של rhBMP-2 גורם להיווצרות של רקמת העצם של המוח האנושי.

הנדסת ביו-הנדסה של Microenvironments מוח העצם של עכבר ויזואליזציה שלהם על ידי הדמיה חיה

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

bioengineering-humanized-bone-marrow-microenvironments-mouse-their

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.6K Views.  The Francis Crick Institute.  שיטה ליצור ולחיות תמונות שונים מוח העצמות נישות בעכברים מוצג. בהתבסס על נישה תומכת שנוצרו על ידי תאים mesenchymal האדם, תוספת של תאים אנדותל האדם גורם להיווצרות של כלי אדם, ואילו תוספת של rhBMP-2 גורם להיווצרות של רקמת העצם של המוח האנושי. 

Video: Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Combining Intravital Fluorescent Microscopy (IVFM) with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Increasing evidence indicates that normal hematopoiesis is regulated by distinct microenvironmental cues in the BM, which include specialized cellular niches modulating critical hematopoietic stem cell (HSC) functions1,2. Indeed, a more detailed picture of the hematopoietic microenvironment is now emerging, in which the endosteal and the endothelial niches form functional units for the regulation of normal HSC and their progeny3,4,5. New studies have revealed the importance of perivascular cells, adipocytes and neuronal cells in maintaining and regulating HSC function6,7,8. Furthermore, there is evidence that cells from different lineages, i.e. myeloid and lymphoid cells, home and reside in specific niches within the BM microenvironment. However, a complete mapping of the BM microenvironment and its occupants is still in progress.
Transgenic mouse strains expressing lineage specific fluorescent markers or mice genetically engineered to lack selected molecules in specific cells of the BM niche are now available. Knock-out and lineage tracking models, in combination with transplantation approaches, provide the opportunity to refine the knowledge on the role of specific &#34;niche&#34; cells for defined hematopoietic populations, such as HSC, B-cells, T-cells, myeloid cells and erythroid cells. This strategy can be further potentiated by merging the use of two-photon microscopy of the calvarium. By providing in vivo high resolution imaging and 3-D rendering of the BM calvarium, we can now determine precisely the location where specific hematopoietic subsets home in the BM and evaluate the kinetics of their expansion over time. Here, Lys-GFP transgenic mice (marking myeloid cells)9 and RBPJ knock-out mice (lacking canonical Notch signaling)10 are used in combination with IVFM to determine the engraftment of myeloid cells to a Notch defective BM microenvironment.

Combining Intravital Fluorescent Microscopy IVFM with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Intravital fluorescence microscopy (IVFM) of the calvarium is applied in combination with genetic animal models to study the homing and engraftment of hematopoietic cells into bone marrow (BM) niches.

שילוב של מיקרוסקופ פלואורסצנטי Intravital (IVFM) עם דגמים גנטיים בחקר דינמיקה Engraftment Hematopoietic תאים במח העצם נישות

Increasing evidence indicates that normal hematopoiesis is regulated by distinct microenvironmental cues in the BM, which include specialized cellular ...

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional co-culture systems are frequently used to explicate tumor-stroma interactions, including their role in drug responses. However, many of the interactions that occur in vivo in the intact microenvironment cannot be completely replicated in these in vitro settings. Thus, direct visualization of these processes in real-time has become an important tool in understanding tumor responses to therapies and identifying the interactions between cancer cells and the stroma that can influence these responses. Here we provide a method for using spinning disk confocal microscopy of live, anesthetized mice to directly observe drug distribution, cancer cell responses and changes in tumor-stroma interactions following administration of systemic therapy in breast cancer models. We describe procedures for labeling different tumor components, treatment of animals for observing therapeutic responses, and the surgical procedure for exposing tumor tissues for imaging up to 40 hours. The results obtained from this protocol are time-lapse movies, in which such processes as drug infiltration, cancer cell death and stromal cell migration can be evaluated using image analysis software.

We describe a method for imaging response to anti-cancer treatment in vivo and at single cell resolution.

חי הדמיה של תגובות סמים בmicroenvironment הגידול במודלים עכבריים של סרטן השד

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

Medicine

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal environment. Biological activities of immune cells mainly rely on their motility capacities. Blood monocytes have short half-life in the bloodstream; they originate in the bone marrow and are constitutively released from it. In inflammatory condition, this process is enhanced, leading to blood monocytosis and subsequent infiltration of the peripheral inflammatory tissues. Identifying the biomechanical events controlling monocyte trafficking from the bone marrow towards the vascular network is an important step to understand monocyte physiopathological relevance. We performed in vivo time-lapse imaging by two-photon microscopy of the skull bone marrow of the Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue) mouse. The MacBlue mouse expresses the fluorescent reporters enhanced cyan fluorescent protein (ECFP) under the control of a myeloid specific promoter 1, in combination with vascular network labelling. We describe how this approach enables the tracking of individual medullar monocytes in real time to further quantify the migratory behaviour within the bone marrow parenchyma and the vasculature, as well as cell-to-cell interactions. This approach provides novel insights into the biology of the bone marrow monocyte subsets and allows to further address how these cells can be influenced in specific pathological conditions.

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Monocytes are key regulators of innate immunity and play a critical role in the renewal of the peripheral mononuclear phagocytic system and in case of inflammation. This manuscript describes the procedure of real time imaging of the mouse calvaria bone marrow to study the monocyte mobilisation mechanism.

מעקב עכבר מח עצם המונוציטים<em&gt; In vivo</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

Immunology and Infection

Femoral Bone Marrow Aspiration in Live Mice

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed step-by-step technical procedure for an analogous procedure in live mice which allows for serial characterization of cells present in the BM. This procedure facilitates studies aimed to detect the presence of exogenously administered cells within the BM of mice as would be done in xenograft studies for instance. Moreover, this procedure allows for the retrieval and characterization of cells enriched in the BM such as hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) without sacrifice of mice. Given that the cellular composition of peripheral blood is not necessarily reflective of proportions and types of stem and progenitor cells present in the marrow, procedures which provide access to this compartment without requiring termination of the mice are very helpful. The use of femoral bone marrow aspiration is illustrated here for cytological analysis of marrow cells, flow cytometric characterization of the hematopoietic stem/progenitor compartment, and culture of sorted HSPCs obtained by femoral BM aspiration compared with conventional marrow harvest.

This protocol describes a procedure for serial sampling of femoral bone marrow (BM) without requiring the sacrifice of mice. This procedure facilitates longitudinal studies of the BM composition of mice over time and provides serial access to cells within the BM for ex vivo and transplantation studies.

הירך מח עצם שאיפה בעכברים חיים

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed ...

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, including hematopoiesis, immune regulation and tumor regulation. Commonly used methods for understanding cellular actions in the bone marrow, such as histology and blood counts, provide static information rather than capturing the dynamic action of multiple cellular components in vivo. To complement the standard methods, a window chamber (WC)-based model was developed to enable serial in vivo imaging of cells and structures in the murine bone marrow. This protocol describes a surgical procedure for installing the WC in the femur, in order to facilitate long-term optical access to the femoral bone marrow. In particular, to demonstrate its experimental utility, this WC approach was used to image and track neutrophils within the vascular network of the femur, thereby providing a novel method to visualize and quantify immune cell trafficking and regulation in the bone marrow. This method can be applied to study various biological processes in the murine bone marrow, such as hematopoiesis, stem cell transplantation, and immune responses in pathological conditions, including cancer.

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

The protocol describes a novel murine femur window chamber model that can be used to track movement of cells in the femoral bone marrow in vivo. Intravital multiphoton fluorescence microscopy is used to image three components of the femoral bone marrow (vasculature, collagen matrix, and neutrophils) over time.

חלון ירך דגם קאמרי<em&gt; In vivo</em&gt; מעקב תא Murine מח עצם

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, ...

Bioengineering Human Microvascular Networks in Immunodeficient Mice

The future of tissue engineering and cell-based therapies for tissue regeneration will likely rely on our ability to generate functional vascular networks in vivo. In this regard, the search for experimental models to build blood vessel networks in vivo is of utmost importance 1. The feasibility of bioengineering microvascular networks in vivo was first shown using human tissue-derived mature endothelial cells (ECs) 2-4; however, such autologous endothelial cells present problems for wide clinical use, because they are difficult to obtain in sufficient quantities and require harvesting from existing vasculature. These limitations have instigated the search for other sources of ECs. The identification of endothelial colony-forming cells (ECFCs) in blood presented an opportunity to non-invasively obtain ECs 5-7. We and other authors have shown that adult and cord blood-derived ECFCs have the capacity to form functional vascular networks in vivo 7-11. Importantly, these studies have also shown that to obtain stable and durable vascular networks, ECFCs require co-implantation with perivascular cells. The assay we describe here illustrates this concept: we show how human cord blood-derived ECFCs can be combined with bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) as a single cell suspension in a collagen/fibronectin/fibrinogen gel to form a functional human vascular network within 7 days after implantation into an immunodeficient mouse. The presence of human ECFC-lined lumens containing host erythrocytes can be seen throughout the implants indicating not only the formation (de novo) of a vascular network, but also the development of functional anastomoses with the host circulatory system. This murine model of bioengineered human vascular network is ideally suited for studies on the cellular and molecular mechanisms of human vascular network formation and for the development of strategies to vascularize engineered tissues.

Here, we describe a methodology to deliver human cord blood-derived endothelial colony-forming cells (ECFCs) and bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs), embedded in a collagen/fibronectin gel, subcutaneously into immunodeficient mice. This cell/gel combination generates a human vascular network that connects with the mouse vasculature.

האדם Bioengineering רשתות כלי הדם של עכברים Immunodeficient

The future of tissue engineering and cell-based therapies for tissue regeneration will likely rely on our ability to generate functional vascular networks ...

Biology

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

במשובט מעקב vivo של גזע hematopoietic ובתאים המסומנים על ידי חמישה חלבונים ניאון באמצעות Confocal וmultiphoton מיקרוסקופית

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

<meta charset="utf8"></head><body>הזרקה תוך עצם הירך לחקר מח עצם בעכברים חיים

Simplified Intrafemoral Injections Using Live Mice Allow for Continuous Bone Marrow Analysis

Despite the complexity of hematopoietic cell transplantation in humans, researchers commonly perform intravenous or intrafemoral (IF) injections in mice. In murine models, this technique has been adapted to enhance the seeding efficiency of transplanted hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs). This paper describes a detailed step-by-step technical procedure of IF injection and the following bone marrow (BM) aspiration in mice that allows for serial characterization of cells present in the BM. This method enables the transplantation of valuable samples with low cell numbers that are particularly difficult to engraft by intravenous injection. This procedure facilitates the creation of xenografts that are critical for pathological analysis. While it is easier to access peripheral blood (PB), the cellular composition of PB does not reflect the BM, which is the niche for HSPCs. Therefore, procedures providing access to the BM compartment are essential for studying hematopoiesis. IF injection and serial BM aspiration, as described here, allow for the prospective retrieval and characterization of cells enriched in the BM, such as HSPCs, without sacrificing the mice.

<meta charset="utf8"></head><body>הזרקות תוך עצם הירך הפשוטות באמצעות עכברים חיים מאפשרות ניתוח רציף של מח עצם

This protocol describes the intrafemoral injection of a few hematopoietic or leukemic stem cells, including gene-edited cells, in murine xenograft models, which will not only enable the quick and safe transplantation of cells but also serial analyses of the bone marrow.

הזרקות תוך עצם הירך הפשוטות באמצעות עכברים חיים מאפשרות ניתוח רציף של מח עצם

Despite the complexity of hematopoietic cell transplantation in humans, researchers commonly perform intravenous or intrafemoral (IF) injections in mice. ...

הנדסת ביו-הנדסה של Microenvironments מוח העצם של עכבר ויזואליזציה שלהם על ידי הדמיה חיה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

שילוב של מיקרוסקופ פלואורסצנטי Intravital (IVFM) עם דגמים גנטיים בחקר דינמיקה Engraftment Hematopoietic תאים במח העצם נישות

חי הדמיה של תגובות סמים בmicroenvironment הגידול במודלים עכבריים של סרטן השד

מעקב עכבר מח עצם המונוציטים

הירך מח עצם שאיפה בעכברים חיים

חלון ירך דגם קאמרי

האדם Bioengineering רשתות כלי הדם של עכברים Immunodeficient

במשובט מעקב vivo של גזע hematopoietic ובתאים המסומנים על ידי חמישה חלבונים ניאון באמצעות Confocal וmultiphoton מיקרוסקופית

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

הזרקות תוך עצם הירך הפשוטות באמצעות עכברים חיים מאפשרות ניתוח רציף של מח עצם

הזרקות תוך עצם הירך הפשוטות באמצעות עכברים חיים מאפשרות ניתוח רציף של מח עצם