אנו מודים בהכרת תודה לתמיכה של הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס &#39;21205078) וקרן המחקר לתכנית הדוקטורט להשכלה גבוהה של סין (No.20123120110002). עבודה זו נתמכה חלקית על ידי התוכנית הלאומית למחקר ופיתוח של סין (2016YFB1102303), התוכנית הלאומית למחקר בסיסי של סין (973Program, 2015CB352001), והקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (61378060).

1. עיצוב בסיסי של שבב SGE <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכל פלסטיק שקוף, כגון polymethylmethacrylate (PMMA) או פוליקרבונט. הערה: שבב SGE מודגם בתרשים 1B . שבב SGE מורכב חורים גלילי עבור חיץ TBE, ערוצי הפרדת DNA, ושני נתיבים מוטבע לאורך החורים של האלקטרודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייצרים מערכים של ערוצי SGE בלוק PMMA באמצעות לייזר מכונת חריטה. הערה: הפרמטרים הגיאומטריים של השבב תלויים בגודלו של הדנ&quot;א שיופרדו. לדוגמה, הפרמטרים אופטימלי ערוץ עבור שבב SGE הם 2.5 מ&quot;מ x 4.0 מ&quot;מ x 90 מ&quot;מ (רוחב x עומק x אורך) אם קטע ה- DNA הוא קטן מ 1000 bp. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתבסס על עיצוב SGE, לפברק מסרקים כדי ליצור את הבארות שבב לטעינת דגימת DNA. </li></ol> 2. הכנת ג&#39;ל Agarose <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 0.5 × TBE על ידי ערבוב 10 × TBE (1 × TBE =89 מ&quot;מ טריס, 89 מ&quot;מ חומצת בור, ו 2 מ&quot;מ EDTA; PH 8.4) ומים מזוקקים ביחס 1:19. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ג&#39;ל agarose 1.0% עבור ההפרדה של סולמות DNA 100-BP. הערה: ריכוז agarose במאגר TBE 0.5x תלוי בגדלים של שברי ה- DNA להיות מופרדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 0.1 גרם של agarose לתוך בקבוק להוסיף 10 מ&quot;ל של חיץ TBE 0.5x. הערה: נפח הפתרון מוכן צריך להיות פחות מ 1/3 קיבולת של הבקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את הבקבוק עם סרט משמר ולאחר מכן לחמם את תערובת agarose / חיץ במיקרוגל (בינוני, 1.0 דקות). לפני לשים את הבקבוק לתוך המיקרוגל, לעשות כמה חורים בסרט המשמר במקרה של פיצוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 2.7 מ&quot;ל של תמיסת agarose מומס לתוך 4 ערוצים של שבב SGE. מניחים את המסרק לתוך פתרון agarose כדי ליצור את הבארות. הערה: הפתרון agarose נמס יהיה להתקרר למצב ג&#39;ל בטמפרטורת החדר 3 דקות מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המסרק מ gEls להוסיף 0.9 מ&quot;ל של חיץ TBE 0.5x כדי לכסות את הג&#39;ל. </li></ol> 3. הפעלת אלקטרופורזה ב SGE שבב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מקור האור LED ו במקום 425 ל 505 ננומטר bandpass מסנן מעל מקור האור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 14.4 μL של סולם DNA 100 BP ו 1.6 μL של SYBR גרין באמצעות וורטקסר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 4 μL של תערובת לתוך כל טוב של ג&#39;ל agarose שבב SGE ( איור 2 ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את האלקטרודה לתוך שני נתיבים של שבב SGE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 550 עד 700 ננומטר bandpass מסנן מעל שבב SGE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מקור המתח. הגדר את המתח החשמלי ל - 180 וולט (20 V / cm). הפעל את הטלפון החכם כדי להקליט את תהליך הפרדת דנ&quot;א קטע ( איור 3 ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר אלקטרופורזה הוא סיים 10 דקות מאוחר יותר, לכבות את מקור החשמל ואת האור LED. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את שבב SGE. </li></ol>

<ol>
	<li>Carle, G. F., Olson, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+chromosomal+DNA+molecules+from+yeast+by+orthogonal-field-alternation+gel+electrophoresis.">Separation of chromosomal DNA molecules from yeast by orthogonal-field-alternation gel electrophoresis.</a> Nucleic. Acids. Res. 12 (14), 5647-5664 (1984).</li><li>McDonell, M. W., Simon, M. N., Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+restriction+fragments+of+T7+DNA+and+determination+of+molecular+weights+by+electrophoresis+in+neutral+and+alkaline+gels.">Analysis of restriction fragments of T7 DNA and determination of molecular weights by electrophoresis in neutral and alkaline gels.</a> J. Mol. Biol. 110 (1), 119-146 (1977).</li><li>Fangman, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+very+large+DNA+molecules+by+gel+electrophoresis.">Separation of very large DNA molecules by gel electrophoresis.</a> Nucleic. Acids. Res. 5 (3), 653-665 (1978).</li><li>Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+silver+staining+of+plant+proteins,+RNA+and+DNA+in+polyacrylamide+gels.">Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels.</a> Electrophoresis. 8 (2), 93-99 (1987).</li><li>G&#246;dde, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoresis+of+DNA+in+human+genetic+diagnostics-state-of-the-art,+alternatives+and+future+prospects.">Electrophoresis of DNA in human genetic diagnostics-state-of-the-art, alternatives and future prospects.</a> Electrophoresis. 27 (5-6), 939-946 (2006).</li><li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+bacteriophage+T7+early+RNAs+and+proteins+on+slab+gels.">Analysis of bacteriophage T7 early RNAs and proteins on slab gels.</a> J. Mol. Biol. 79 (2), 237-248 (1973).</li><li>Sugden, B., De Troy, B., Roberts, R. J., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+slab-gel+electrophoresis+equipment.">Agarose slab-gel electrophoresis equipment.</a> Anal. Biochem. 68 (1), 36-46 (1975).</li><li>Rabilloud, T., Chevallet, M., Luche, S., Lelong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+gel+electrophoresis+in+proteomics:+Past,+present+and+future.">Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: Past, present and future.</a> J. Proteomics. 73 (11), 2064-2077 (2010).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J. Vis. Exp. (62), e3923 (2012).</li><li>Gasser, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-strand+conformation+polymorphism+(SSCP)+for+the+analysis+of+genetic+variation.">Single-strand conformation polymorphism (SSCP) for the analysis of genetic variation.</a> Nat. Protoc. 1 (6), 3121-3128 (2006).</li><li>Matselyukh, B. P., Yarmoluk, S. M., Matselyukh, A. B., Kovalska, V. B., Kocheshev, I. O., Kryvorotenko, D. V., Lukashov, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+cyanine+dyes+with+nucleic+acids:+XXXI.+Using+of+polymethine+cyanine+dyes+for+the+visualization+of+DNA+in+agarose+gels.">Interaction of cyanine dyes with nucleic acids: XXXI. Using of polymethine cyanine dyes for the visualization of DNA in agarose gels.</a> J. Biochem. Biophys. Methods. 57 (1), 35-43 (2003).</li><li>Lunn, G., Sansone, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethidium+bromide:+destruction+and+decontamination+of+solutions.">Ethidium bromide: destruction and decontamination of solutions.</a> Anal. Biochem. 162 (2), 453-458 (1987).</li><li>Li, Z., Liu, C., Zhang, D., Luo, S., Yamaguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+electrophoresis+of+RNA+in+hydroxyethylcellulose+polymer+with+various+molecular+weights.">Capillary electrophoresis of RNA in hydroxyethylcellulose polymer with various molecular weights.</a> J. Chormatogr. B. 1011, 114-120 (2016).</li><li>Li, Z., Liu, C., Ma, S., Zhang, D., Yamaguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+inhibition+of+nucleic+acid+dyes+on+polymerase+chain+reaction+by+capillary+electrophoresis.">Analysis of the inhibition of nucleic acid dyes on polymerase chain reaction by capillary electrophoresis.</a> Anal. Methods-UK. 8 (11), 2330-2334 (2016).</li><li>Liu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+fluorescence-coupled+capillary+electrophoresis+based+method+to+probe+interactions+between+QDs+and+colorectal+cancer+targeting+peptides.">Developing a fluorescence-coupled capillary electrophoresis based method to probe interactions between QDs and colorectal cancer targeting peptides.</a> Electrophoresis. 37 (15-16), 2170-2174 (2016).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+capillary+electrophoresis+method+to+explore+the+self-assembly+of+a+novel+polypeptide+ligand+with+quantum+dots.">A capillary electrophoresis method to explore the self-assembly of a novel polypeptide ligand with quantum dots.</a> Electrophoresis. 37 (15-16), 2156-2162 (2016).</li><li>Miao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclease+assisted+target+recycling+and+spherical+nucleic+acids+gold+nanoparticles+recruitment+for+ultrasensitive+detection+of+microRNA.">Nuclease assisted target recycling and spherical nucleic acids gold nanoparticles recruitment for ultrasensitive detection of microRNA.</a> Electrochim. Acta. 190, 396-401 (2016).</li><li>Heller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+DNA+separation+with+capillary+electrophoresis.">Principles of DNA separation with capillary electrophoresis.</a> Electrophoresis. 22 (4), 629-643 (2001).</li></ol>

שום ניגוד אינטרסים לא הוכרז.

Agarose ג&#39;ל אלקטרופורזה מועסק נרחב עבור הפרדת DNA, RNA, וחלבון. עבודה זו מציעה שיטה חדשה להחליף את פרוטוקול אלקטרופורזה ג&#39;ל המסורתית. תוצאות מדגימות כי 50, 100, ו 1000 bp סולמות DNA ניתן להפריד היטב כזה מכשיר קטן התאספו. היתרון הגדול של שיטה זו הוא כי לא רק זה יכול להפריד בין חומצו...

<html> סלע ג&#39;ל אלקטרופורזה (SGE) היא השיטה היעילה ביותר עבור הפרדת קטע DNA 1 , 2 , 3 , 4 , 5 ולכן הוא נחשב כלי רב תכליתי ב ביוכימי וביולוגי מנתח 6 , 7 , 8 . עם זאת, ניסויים רבים מצביעים כי SGE מוגבל על ידי ארבע הבעיות הבאות: (1) ההפרדות לוקח שעות רבות, ואפילו ימים; (2) הצריכה הכימית גבוהה מאוד; (3) זה דורש מנגנון מסובך ( למשל, תא אלקטרופורזה 2D, ספק כוח אלקטרופורזה, מערכת ג &#39;ל הדמיה); (4) מערכת הדמיה ג&#39;ל יכול רק לראות את שברי ה- DNA מופרדים כאשר הניסוי הוא סיים. יתר על כן, ethidium bromide (EtBr), אשר נפוץ ב SGE 9 ,התחת = &quot;xref&quot;&gt; 10, הוא mutagenic ו סרטן 11 , 12 . לכן, כפפות תמיד צריך להיות משוחק כאשר מסירת ג&#39;לים המכילים EtBr. נימי אלקטרופורזה (CE) יש יתרונות רבים 13 , 14 , 15 , 16 , 17 לעומת SGE, כגון פעולה אוטומטית, זמן ההפרדה קצר, וצריכה נמוכה יותר. עם זאת, מכשיר CE הוא די יקר. לכן, כדי להתגבר על המגבלות הללו, פותחה מערכת ( איור 1 ) להפרדת הדנ&quot;א. מערכת כזו יכולה לא רק לצמצם באופן משמעותי את הצריכה הכימית ולשמור על זמן הניסוי SGE (&lt;8 דקות), אבל זה יכול גם לבצע מעקב בזמן אמת של תהליך ההפרדה DNA ב agarose ג&#39;ל על ידי הטלפון החכם. על ידי ביצוע ההליכים המתוארים בפרוטוקול זה, סטודנטים shouיהיה מסוגל לעצב לפברק את שבב SGE, להכין את הג&#39;ל agarose שבב, להקים מערכת פשוטה SGE עם הטלפון החכם, ולתעד את תהליך הגירה דנ&quot;א של agarose ג&#39;ל.

<table><tbody><tr><td>10&amp;times;TBE</td><td>Beijing Solarbio Science &amp;amp; Technology Co., Ltd.</td><td>T1051</td><td></td></tr><tr><td>50 bp DNA ladder</td><td>Takara Bio Inc.</td><td>3421A</td><td></td></tr><tr><td>100 bp DNA ladder</td><td>Takara Bio Inc.</td><td>3422A</td><td></td></tr><tr><td>1 kbp DNA ladder</td><td>Takara Bio Inc.</td><td>3426A</td><td></td></tr><tr><td>SYBR GREEN</td><td>Takara Bio Inc.</td><td>5760A</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich Corporate</td><td>V900510</td><td></td></tr></tbody></table>

real-time tracking of dna fragment separation by smartphone

ג&#39;ל אלקטרופורזה (SGE) היא השיטה הנפוצה ביותר להפרדת שברי דנ&quot;א; ולכן היא מיושמת באופן נרחב על תחום הביולוגיה ואחרים. עם זאת, פרוטוקול SGE המסורתי הוא די מייגע, ואת הניסוי לוקח זמן רב. יתר על כן, צריכת כימי בניסויים SGE הוא גבוה מאוד. עבודה זו מציעה שיטה פשוטה ההפרדה של שברי דנ&quot;א מבוסס על שבב SGE. השבב נעשה על ידי מכונת חריטה. שני סדינים מפלסטיק משמשים את אור גירוי ואת פליטה של ​​האות האופטי. אות הקרינה של להקות ה- DNA נאסף על ידי הטלפון החכם. כדי לאמת את השיטה, מופרדים 50, 100, ו- 1,000 bp DNA סולמות. התוצאות מראות כי סולם DNA קטן מ -5,000 BP ניתן לפתור תוך 12 דקות ועם רזולוציה גבוהה בעת שימוש בשיטה זו, המציין כי היא תחליף אידיאלי לשיטה המסורתית SGE.

<html> איור 4 , איור 5 , ואת איור 6 מייצגים תוצאה אופיינית לאחר ג&#39;ל אלקטרופורזה של 50, 100, ו 1000 bp DNA סולמות. לאחר הניסוי, שברי הדנ&quot;א היו מופרדים היטב. יתר על כן, דגימות אותו הופרדו 4 ערוצים של שבב SGE, מראה כי שברי DNA של אותו גודל ל?...

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone at JoVE.com

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

מעקב בזמן אמת של הפרדת ה- DNA הפרדה על ידי הטלפון החכם

ג &#39;ל מסורתי ג&#39; ל אלקטרופורזה (SGE) ניסויים דורשים מנגנון מסובך וצריכה כימית גבוהה. עבודה זו מציגה פרוטוקול המתאר שיטה זולה להפריד שברי DNA בתוך פרק זמן קצר.

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

real-time-tracking-of-dna-fragment-separation-by-smartphone

Research

JoVE Journal

Biochemistry

14.5K Views.  University of Shanghai for Science and Technology.  ג 'ל מסורתי ג' ל אלקטרופורזה (SGE) ניסויים דורשים מנגנון מסובך וצריכה כימית גבוהה. עבודה זו מציגה פרוטוקול המתאר שיטה זולה להפריד שברי DNA בתוך פרק זמן קצר. 

Video: Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

Modified Terminal Restriction Fragment Analysis for Quantifying Telomere Length Using In-gel Hybridization

There are several different techniques for measuring telomere length, each with their own advantages and disadvantages. The traditional approach, Telomere Restriction Fragment (TRF) analysis, utilizes a DNA hybridization technique whereby genomic DNA samples are digested with restriction enzymes, leaving behind telomere DNA repeats and some sub-telomeric DNA. These are separated by agarose gel electrophoresis, transferred to a filter membrane and hybridized to oligonucleotide probes tagged with either chemiluminescence or radioactivity to visualize telomere restriction fragments. This approach, while requiring a larger quantity of DNA than other techniques such as PCR, can measure the telomere length distribution of a population of cells and allows measurement expressed in absolute kilobases. This manuscript demonstrates a modified DNA hybridization procedure for determining telomere length. Genomic DNA is first digested with restriction enzymes (that do not cut telomeres) and separated by agarose gel electrophoresis. The gel is then dried and the DNA is denatured and hybridized in situ to a radiolabeled oligonucleotide probe. This in situ hybridization avoids loss of telomere DNA and improves signal intensity. Following hybridization, the gels are imaged utilizing phosphor screens and the telomere length is quantified using a graphing program. This procedure was developed by the laboratories of Drs. Woodring Wright and Jerry Shay at the University of Texas Southwestern1,2. Here, we present a detailed description of this procedure, with some modifications.

In this article, a detailed protocol for quantifying telomere length using a modified terminal restriction fragment analysis is discussed that provides fast and efficient direct measurement of telomere length. This technique can be applied to a variety of cell sources of DNA for quantifying telomere length.

שינוי מסוף הגבלת שבירת ניתוח לכימות אורך הטלומרים באמצעות הכלאה ב-ג&#39;ל

There are several different techniques for measuring telomere length, each with their own advantages and disadvantages. The traditional approach, Telomere ...

Cancer Research

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, glass coverslips are functionalized in a one-step reaction with silane-PEG-biotin. Flow cells are constructed by sandwiching an adhesive tape with pre-cut channels between a functionalized coverslip and a PDMS slab containing inlet and outlet holes. Multiple channels are integrated into one flow cell and the flow of reagents into each channel can be fully automated, which significantly increases the assay throughput and reduces hands-on time per assay. Inside each channel, biotin-&#955;-DNAs are immobilized on the surface and a laminar flow is applied to flow-stretch the DNAs. The DNA molecules are stretched to &#62;80% of their contour length and serve as spatially extended templates for studying the binding and transport activity of fluorescently labeled molecules. The trajectories of single molecules are tracked by time-lapse Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) imaging. Raw images are analyzed using streamlined custom single particle tracking software to automatically identify trajectories of single molecules diffusing along DNA and estimate their 1D diffusion constants.

This protocol demonstrates a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying one-dimensional (1D) diffusion of molecules along DNA.

מולקולה בודדת פשוטה, חסון וגבוה התפוקה זרימה מתיחה Assay יישום לימוד התחבורה של מולקולות לאורך הדנ א

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Real-time Observation of the DNA Strand Exchange Reaction Mediated by Rad51

The DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 is a critical step of homologous recombination. In this reaction, Rad51 forms a nucleoprotein filament on single-stranded DNA (ssDNA) and captures double-stranded DNA (dsDNA) non-specifically to interrogate it for a homologous sequence. After encountering homology, Rad51 catalyzes DNA strand exchange to mediate pairing of the ssDNA with the complementary strand of the dsDNA. This reaction is highly regulated by numerous accessary proteins in vivo. Although conventional biochemical assays have been successfully employed to examine the role of such accessory protein in vitro, kinetic analysis of intermediate formation and its progression into a final product has proven challenging due to the unstable and transient nature of the reaction intermediates. To observe these reaction steps directly in solution, fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based real-time observation systems of this reaction were established. Kinetic analysis of real-time observations shows that the DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 obeys a three-step reaction model involving the formation of a three-strand DNA intermediate, maturation of this intermediate, and the release of ssDNA from the mature intermediate. The Swi5-Sfr1 complex, an accessary protein conserved in eukaryotes, strongly enhances the second and third steps of this reaction. The FRET-based assays presented here enable us to uncover the molecular mechanisms through which recombination accessary proteins stimulate the DNA strand exchange activity of Rad51. The primary goal of this protocol is to enhance the repertoire of techniques available to researchers in the field of homologous recombination, particularly those working with proteins from species other than Schizosaccharomyces pombe, so that the evolutionary conservation of the findings presented herein can be determined.

Fluorescence resonance energy transfer-based real-time observation systems of the DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 were developed. Using the protocols presented here, we are able to detect the formation of reaction intermediates and their conversion into products, while also analyzing the enzymatic kinetics of the reaction.

תצפית בזמן אמת של התגובה Exchange גדיל DNA מתווכת על-ידי Rad51

The DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 is a critical step of homologous recombination. In this reaction, Rad51 forms a nucleoprotein filament ...

Application of DNA Fingerprinting using the D1S80 Locus in Lab Classes

In biological sciences, DNA fingerprinting has been widely used for paternity testing, forensic applications and phylogenetic studies. Here, we describe a reliable and robust method for genotyping individuals by Variable Number of Tandem Repeat (VNTR) analysis in the context of undergraduate laboratory classes. The human D1S80 VNTR locus is used in this protocol as a highly polymorphic marker based on variation in the number of repetitive sequences.
This simple protocol conveys useful information for teachers and the implementation of DNA fingerprinting in practical laboratory classes. In the presented laboratory exercise, DNA extraction followed by PCR amplification is used to determine genetic variation at the D1S80 VNTR locus. Differences in the fragment size of PCR products are visualized by agarose gel electrophoresis. The fragment sizes and repeat numbers are calculated based on a linear regression of the size and migration distance of a DNA size standard.
Following this guide, students should be able to:
&#8226;&#160; Harvest and extract DNA from buccal mucosa epithelial cells 
&#8226;&#160; Perform a PCR experiment and understand the function of various reaction components 
&#8226;&#160; Analyze the amplicons by agarose gel electrophoresis and interpret the results 
&#8226;&#160; Understand the use of VNTRs in DNA fingerprinting and its application in biological sciences

Application of DNA Fingerprinting using the D1S80 Locus in Lab Classes

Here we describe a simple protocol to generate DNA fingerprinting profiles by amplifying the VNTR locus D1S80 from epithelial cell DNA.

יישום של טביעת אצבע DNA באמצעות לוקוס D1S80 בשיעורי מעבדה

In biological sciences, DNA fingerprinting has been widely used for paternity testing, forensic applications and phylogenetic studies. Here, we describe a ...

Genetics

Single-Molecule Dwell-Time Analysis of Restriction Endonuclease-Mediated DNA Cleavage

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for hundreds of individual restriction endonuclease (REase) molecules in one experiment. This assay does not require protein labeling and can be carried out with a single imaging channel. In addition, the results of multiple individual experiments can be pooled to generate well-populated dwell-time distributions. Analysis of the resulting dwell-time distributions can help elucidate the DNA cleavage mechanism by revealing the presence of kinetic steps that cannot be directly observed. Example data collected using this assay with the well-studied REase, EcoRV - a dimeric Type IIP restriction endonuclease that cleaves the palindromic sequence GAT&#8595;ATC (where &#8595; is the cut site) - are in agreement with prior studies. These results suggest that there are at least three steps in the pathway to DNA cleavage that is initiated by introducing magnesium after EcoRV binds DNA in its absence, with an average rate of 0.17 s-1 for each step.

Using quantum-dot-labeled DNA and total internal reflection fluorescence microscopy, we can investigate the reaction mechanism of restriction endonucleases while using unlabeled protein. This single-molecule technique allows for massively multiplexed observation of individual protein-DNA interactions, and data can be pooled to generate well-populated dwell-time distributions.

ניתוח זמן שהייה של מולקולה בודדת של מחשוף DNA בתיווך אנדונוקלאז הגבלה

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for ...

סמארטפון כמכשיר אנליטי לכימות חלבון באמצעות בדיקת ברדפורד

RGBradford: Protein Quantitation with a Smartphone Camera

Protein quantitation is an essential procedure in life sciences research. Amongst several other methods, the Bradford assay is one of the most used. Because of its widespread, the limitations and advantages of the Bradford assay have been exhaustively reported, including several modifications of the original method to improve its performance. One of the alterations of the original method is the use of a smartphone camera as an analytical instrument. Taking advantage of the three forms of the Coomassie Brilliant Blue dye that exist in the conditions of the Bradford assay, this paper describes how to accurately quantify protein in samples using color data extracted from a single picture of a microplate. After performing the assay in a microplate, a picture is taken using a smartphone camera, and RGB color data is extracted from the picture using a free and open-source image analysis software application. Then, the ratio of blue to green intensity (in the RGB scale) of samples with unknown concentrations of protein is used to calculate the protein content based on a standard curve. No significant difference is observed between values calculated using RGB color data and those calculated using conventional absorbance data.

Author Spotlight: An Alternative Approach to Protein Quantification by Bradford Assay Using a Smartphone 

This paper provides a protocol for protein quantification using the Bradford assay and a smartphone as an analytical device. Protein levels in samples can be quantified using color data extracted from a picture of a microplate taken with a smartphone.

RGBradford: כימות חלבונים עם מצלמת סמארטפון

Protein quantitation is an essential procedure in life sciences research. Amongst several other methods, the Bradford assay is one of the most used. ...

<meta charset="utf8"></head><body>התרת DNA בתיווך CMG שנצפתה על ידי צמיחת דרכי ssDNA-RPA

Single-Molecule Real-Time Visualization of DNA Unwinding by CMG Helicase

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a dynamic complex of proteins termed the replisome. At the heart of the replisome is the&#160;CDC45-MCM2-7-GINS (CMG) helicase, which separates the two strands of the DNA double helix such that DNA polymerases can copy each strand. During genome duplication, replisomes must overcome a plethora of obstacles and challenges. Each of these threatens genome stability, as failure to replicate DNA completely and accurately can lead to mutations, diseases, or cell death. Therefore, it is of great interest to understand how CMG functions in the replisome during both normal replication and replication stress. Here, we describe a total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy assay using recombinant purified proteins, which allows for real-time visualization of surface-tethered stretched DNA molecules by individual CMG complexes. This assay provides a powerful platform to investigate CMG behavior at the single-molecule level, allowing helicase dynamics to be directly observed with real-time control over reaction conditions.

<meta charset="utf8"></head><body>מחבר זרקור: חשיפת הדינמיקה של שכפול דנ"א אאוקריוטי באמצעות הדמיה של מולקולה אחת

This protocol demonstrates performing a single-molecule assay for live visualization of DNA unwinding by CMG helicase. It describes (1) preparing a DNA substrate, (2) purifying fluorescently labeled Drosophila melanogaster CMG helicase, (3) preparing a microfluidic flow cell for total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy, and (4) the single-molecule DNA unwinding assay.

הדמיה בזמן אמת של מולקולה בודדת של שחרור DNA על ידי מנחת מסוקים CMG

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a ...

מעקב בזמן אמת של הפרדת ה- DNA הפרדה על ידי הטלפון החכם

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

שינוי מסוף הגבלת שבירת ניתוח לכימות אורך הטלומרים באמצעות הכלאה ב-ג'ל

מולקולה בודדת פשוטה, חסון וגבוה התפוקה זרימה מתיחה Assay יישום לימוד התחבורה של מולקולות לאורך הדנ א

תצפית בזמן אמת של התגובה Exchange גדיל DNA מתווכת על-ידי Rad51

יישום של טביעת אצבע DNA באמצעות לוקוס D1S80 בשיעורי מעבדה

ניתוח זמן שהייה של מולקולה בודדת של מחשוף DNA בתיווך אנדונוקלאז הגבלה

RGBradford: כימות חלבונים עם מצלמת סמארטפון

RGBradford: כימות חלבונים עם מצלמת סמארטפון

RGBradford: כימות חלבונים עם מצלמת סמארטפון

הדמיה בזמן אמת של מולקולה בודדת של שחרור DNA על ידי מנחת מסוקים CMG

הדמיה בזמן אמת של מולקולה בודדת של שחרור DNA על ידי מנחת מסוקים CMG